Gambaran Toksikopatologi Organ Hati dan Ginjal Mencit C3H Pasca Pemberian Capsaicin
GAMBARAN TOKSIKOPATOLOGI ORGAN HATI DAN GINJAL
MENCIT C3H PASCA PEMBERIAN CAPSAICIN
FITRIAH IDRIS
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Gambaran
Toksikopatologi Organ Hati dan Ginjal Mencit C3H Pasca Pemberian Capsaicin
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Fitriah Idris
NIM B04100201
ABSTRAK
FITRIAH IDRIS. Gambaran Toksikopatologi Organ Hati dan Ginjal Mencit C3H
Pasca Pemberian Capsaicin. Dibimbing oleh MAWAR SUBANGKIT dan
ANDRIYANTO.
Capsaicin adalah senyawa utama yang ditemukan dalam cabai genus
Capsicum. Capsaicin secara in vitro terbukti bersifat antiproliferatif terhadap sel
kanker pada lambung, usus besar, hati, prostat, dan leukosit. Organ hati dan ginjal
merupakan organ sasaran utama dari efek toksik. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui efek pemberian capsaicin terhadap gambaran toksikopatologi organ
hati dan ginjal mencit C3H. Sebanyak 12 ekor mencit galur C3H dibagi dalam 3
kelompok. Kelompok 1 sebagai kontrol negatif tidak diberi capsaicin. Kelompok
2 diberi capsaicin selama dua minggu. Kelompok 3 diberi capsaicin selama empat
minggu. Pemberian capsaicin dilakukan dengan rute peroral dengan dosis 10
mg/kgBB. Pengamatan gejala klinis dilakukan sepanjang periode perlakuan.
Setelah itu, mencit dieutanasi dan diambil organnya untuk diamati dan dibuat
sediaan histopatologi dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dan
imunohistokimia (IHK) menggunakan antibodi TNF-α. Hasil pengamatan patologi
anatomi dan histopatologi menunjukkan bahwa mencit yang diberikan capsaicin
selama 2 minggu menunjukkan kerusakan sedang pada hati dan ginjal sedangkan
mencit yang diberikan capsaicin selama 4 minggu mengalami kerusakan berat
pada hati dan ginjal. Hal ini menunjukkan tingkat keamanan capsaicin yang
rendah terhadap organ hati dan ginjal.
Kata kunci: capsaicin, ginjal, hati, mencit C3H, toksikopatologi
ABSTRACT
FITRIAH IDRIS. Toxicopathology of liver and kidney of C3H Mice PostCapsaicin Administration. Supervised by MAWAR SUBANGKIT and
ANDRIYANTO.
Capsaicin is the mayor compound founds in chilli peppers of the Capsicum
genus. Capsaicin has been shown to have antiproliferative activity to intestine,
liver, prostate, and leucocytes cancer cells in vitro. The liver and kidney are the
main target of toxic effect. The research was conducted to know the effect of
capsaicin to liver and kidney toxicopathology of C3H mice. Twelve mice strain
C3H were divided into 3 groups. Groups 1 as a negative control were not
administered capsaicin. Groups 2 were administered capsaicin for 2 weeks.
Groups 3 were administered capsaicin for 4 weeks. The capsaicin was
administered perorally with 10 mg/kgBW dose. Clinical observations made
throughout the treatment period. Then, the mice euthanized and their organs were
observed and preparated for histopathology stained hematoxylin-eosin (HE) and
immunohistochemistry (CPI) using TNF-α antibody. The gross anatomy and
histopathology showed that the mice treated capsaicin for 2 weeks showed
average damage to the liver and kidney, while mice treated capsaicin for 4 weeks
suffered severe damage to the liver and kidney. This shows the lack of security
levels of capsaicin to the liver and kidneys.
Keywords: capsaicin, C3H mice, kidney, liver, toxicopathology
GAMBARAN TOKSIKOPATOLOGI ORGAN HATI DAN GINJAL
MENCIT C3H PASCA PEMBERIAN CAPSAICIN
FITRIAH IDRIS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2013 sampai Juli 2014 ini ialah
Gambaran Toksikopatologi Organ Hati dan Ginjal Mencit C3H Pasca Pemberian
Capsaicin.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Drh Mawar Subangkit, MSi
APVet dan Bapak Drh Andriyanto, MSi selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan banyak pengarahan kepada penulis. Terima kasih pula penulis
sampaikan kepada Ibu Dr Drh Anita Esfandiari, MSi selaku pembimbing
akademik yang telah memberi bimbingan kepada penulis. Ungkapan terima kasih
kepada Bapak Endang, Bapak Kasnadi dan Bapak Sholeh serta seluruh staf
Bagian Patologi yang telah memberikan banyak bantuan selama penulis
melakukan penelitian. Penulis juga berterima kasih kepada Metrizal Abdi Taufik
selaku teman seperjuangan penulis selama penelitian. Terima pula penulis
sampaikan kepada Bapak M Idris Nur, Ibu Nur Alam, Muhammad Juwaini,
Pahimah, dan Muhammad Fuad yang telah melimpahkan kasih sayang dan
bantuan materiil maupun moril kepada menulis. Terima kasih kepada Keluarga
Besar Maddeppungeng, Keluarga Cendana 53, Keluarga Ikami SulSelBar,
Acromion 47, Andalas 12, serta seluruh pihak yang telah memberikan banyak
bantuan dan dukungan kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2014
Fitriah Idris
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
Manfaat Penelitian
1
TINJAUAN PUSTAKA
2
Capsaicin
2
Organ Hati
2
Organ Ginjal
3
METODOLOGI
3
Waktu dan Tempat
3
Hewan Percobaan
3
Alat dan Bahan
3
Metode Penelitian
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Gejala Klinis
6
Patologi Anatomi Organ Hati dan Ginjal
6
Histopatologi Organ Hati dan Ginjal
7
Pengamatan Pewarnaan Imunohistokimia
11
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
12
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1 Gambaran gejala klinis kelompok kontrol (K1), capsaicin 2 minggu
(K2), dan capsaicin 4 minggu (K3)
2 Lesio patologi anatomi pada organ hati dan ginjal mencit C3H
kelompok kontrol (K1), capsaicin 2 minggu (K2), capsaicin 4 minggu
(K3)
3 Hasil rataan skoring pengamatan organ hati dan ginjal mencit C3H
pada kelompok kontrol (K1), pemberian capsaicin 2 minggu (K2),
pemberian capsaicin 4 minggu (K3)
4 Hasil pengamatan IHK organ hati dan ginjal mencit C3H pada
kelompok kontrol (K1), pemberian capsaicin 2 minggu (K2),
pemberian capsaicin 4 minggu (K3)
6
6
8
8
DAFTAR GAMBAR
1 Gambaran patologi anatomi organ hati mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ hati pada
K3 mengalami hemoragi ditandai dengan permukaan berwarna hitam
dan belang (tanda panah)
2 Gambaran patologi anatomi organ ginjal mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ ginjal pada
K3 mengalami kongesti ditandai dengan warna kehitaman yang
menyebar merata pada korteks dan medula
3 Lesio histopatologi (A) organ hati K3 (pemberian capsaicin 4
minggu). Adanya lesio kongesti (panah hitam), degenerasi lemak
(panah hijau), sel radang (kepala panah), nekrosa (asterik), dan
anisositosis (panah merah) (B) organ ginjal K3 (pemberian capsaicin
4 minggu). Terlihat lesio kongesti (panah) dan nekrosa (asterik).
Pewarnaan HE perbesaran 400x
4 Hasil pewarnaan IHK yang bersifat imunoreaktif positif (panah)
terhadap antibodi anti TNF-α pada (A) hepatosit dan (B) sel tubulus
proksimal ginjal. Pewarnaan IHK metode LSAB perbesaran 400x
7
7
10
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Capsaicin adalah senyawa utama yang ditemukan dalam tanaman cabai
(Bode dan Dong 2011). Capsaicin dikonsumsi oleh hampir seluruh masyarakat di
dunia. Rasa pedas yang ditimbulkan oleh capsaicin pada cabai dimanfaatkan
sebagai penyedap makanan karena dapat menimbulkan nafsu makan.
Capsaicin berperan membantu pasien dengan beberapa kondisi seperti tukak
lambung. Zat ini juga berperan sebagai obat gangguan pencernaan. Selain itu,
capsaicin dapat meningkatkan sekresi saliva dan asam lambung serta
meningkatkan aktivitas saluran pencernaan. Studi terakhir menemukan bahwa
capsaicin berpotensi sebagai antikanker (Kautsar 2009). Capsaicin secara in vitro
terbukti memiliki efek antiproliferatif terhadap kanker prostat (Mori et al. 2006;
Sa'nchez et al. 2006), kanker usus besar (Kim et al. 2004), kanker lambung (Lo et
al. 2005), kanker hati (Jung et al. 2001) dan kanker leukemia (Ito et al. 2004)
tanpa menimbulkan efek samping signifikan pada sel-sel normal. Anandakumar et
al. (2009) telah membuktikan capsaicin yang diberikan peroral dengan dosis 10
mg/kgBB bersifat kemporeventif terhadap tumor paru-paru.
Hati dan ginjal merupakan organ penting dalam tubuh yang berfungsi
sebagai organ detoksifikasi. Ginjal merupakan organ ekskresi utama yang
berperan untuk mengeluarkan toksikan. Oleh karena itu, hati dan ginjal menjadi
organ sasaran utama dari efek toksik. Berdasarkan hal tersebut, penelitian
mengenai efek samping capsaicin terhadap organ hati dan ginjal menjadi penting
untuk dilakukan.
Penelitian ini menggunakan mencit C3H sebagai hewan coba. Menurut
Jaxmice (2014), mencit C3H digunakan sebagai strain dengan tujuan umum dalam
berbagai bidang penelitian termasuk penelitian kanker, penyakit menular,
sensorineural, dan biologi kardiovaskular. Sebuah mutasi spontan terjadi pada
mencit C3H membuat mencit ini lebih tahan terhadap endotoksin.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran toksikopatologi organ
hati dan ginjal mencit C3H pasca pemberian capsaicin dengan pewarnaan
Hematoksilin-Eosin (HE) dan imunohistokimia (IHK).
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat dibidang farmakologi,
toksikologi, dan patologi, khususnya mengetahui toksisitas capsaicin terhadap
organ hati dan ginjal sehingga dapat dijadikan bahan pertimbangan dalam
penggunaannya sebagai obat antikanker.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Capsaicin
Capsaicin (8-methyl-N-vanillyl1trans-6-nonenamide) termasuk dalam
capsaicinoid (Sanatombik 2008). Capsaicinoid berasal dari tanaman famili
Solanaceae dan diproduksi sebagai metabolit sekunder oleh cabai. Capsaicin
merupakan komponen aktif cabai yang menghasilkan panas yang bersifat iritan
terhadap mamalia termasuk manusia dan menimbulkan rasa terbakar dan panas
pada jaringan manapun yang tersentuh.
Capsaicin murni bersifat hidrofobik, tidak berwarna, tidak berbau, dan
bentuk kristal bahan digunakan sebagai bahan campuran lilin. Capsaicin disintesis
pada septa interlokular buah cabai dengan penambahan cabang rantai asam lemak
ke vanillyalamine. Biosintesis capsaicin tergantung pada gen AT3 (Stewart et al.
2005). Capsaicin termasuk senyawa Fenilpropanoid dengan rumus molekul
C18H27NO3 yang memiliki berat molekul 305.41 g/mol dengan titik lebur 62-65°C
dan titik didih 210-220°C (Chhabra et al. 2012).
Capsaicin memiliki aktifitas biologis yang tinggi diantaranya sebagai
antioksidan, iron-binding, dan efek hypolipidemic (Dairam et al. 2008;
Manjunatha dan Srinivasan 2007; Srinivasan et al. 2004). Capsaicin dapat
meredakan rasa nyeri dan peradangan (Sancho et al. 2002).
Kemampuan capsaicin menghambat pertumbuhan sel-sel kanker terletak
pada kemampuannya menginduksi terjadinya apoptosis, penangkapan
pertumbuhan siklus sel, regulasi faktor ekspresi transkripsi, dan penghambatan
terhadap growth signal transduction pathways (Lin et al. 2013).
Organ Hati
Hati adalah organ terbesar kedua dalam tubuh manusia setelah kulit. Hati
berbentuk segitiga yang memanjang melintasi rongga perut di kaudal diafragma.
Sebagian besar massa hati terletak di sisi kanan tubuh. Hati terdiri dari jaringan
merah muda kecokelatan yang sangat lunak yang dibalut oleh kapsul jaringan ikat
yang diperkuat oleh peritoneum yang melindungi dan memfiksasi hati di dalam
rongga perut. Organ hati berperan dalam banyak proses tubuh, diantaranya proses
digesti, metabolisme, detoksifikasi, imunitas, dan penyimpanan nutrisi (Taylor
2014).
Struktur mikroskopis dari hati dibagi menjadi sinusoid, lobulus, hepatosit,
dan triad portal. Sinusoid memiliki empati jenis sel yaitu sel Kupffer, sel endotel,
sel Ito, dan sel pit. Lobulus yaitu unit kecil berbentuk heksagonal dengan venule
terminal hepatik pada bagian tengah dan triad portal pada bagian ujung
heksagonal. Hepatosit merupakan parenkim organ hati yang tersusun radial dalam
lobulus hati yang tergabung satu sama lain dalam anastomosis plate yang dibatasi
oleh sinusoid. Triad portal terdiri dari cabang terminal vena porta, arteriol yang
merupakan cabang dari arteri hepatika, dan bile ductules (Lumongga 2008).
3
Organ Ginjal
Ginjal adalah suatu organ yang secara struktural kompleks dan berkembang
untuk beberapa fungsi, diantaranya ekskresi produk sisa metabolisme,
pengendalian air dan garam, pemeliharaan keseimbangan asam dan basa, serta
sekresi berbagai hormon dan autokoid (Cotran et al. 2007). Ginjal menjadi salah
satu organ sasaran utama dari efek toksik karena merupakan organ ekskresi utama
yang berperan untuk mengeluarkan toksikan.
Ginjal terdiri dari struktur internal berupa hilus, sinus, pelvis, parenkim, dan
lobus. Unit fungsional ginjal yaitu nefron yang terdiri dari glomerulus, tubulus
kontortus proksimal, ansa henle, tubulus kontortus distal, tubulus kolektivus, dan
duktus kolektivus (Slonane 2004).
METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada Maret 2013 sampai Juli 2014 di Bagian
Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran
Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Hewan Percobaan
Mencit dengan galur C3H berjenis kelamin betina, sebanyak 12 ekor
dengan berat badan rata-rata 20 g dipelihara dalam kotak plastik berukuran 20 x
30 cm, dalam ruangan dengan suhu berkisar antara 25-27°C, kelembapan relatif
antara 58-63%, dan pengondisian cahaya 12 jam terang dan 12 jam gelap. Mencit
diberi pakan pelet dan minum ad libitum. Mencit dibagi dalam 3 kelompok sama
rata sebagai berikut:
1. Kelompok 1 (K1), variabel kontrol negatif, tidak diberi capsaicin.
2. Kelompok 2 (K2), variabel kelompok perlakuan, diberi capsaicin selama dua
minggu dengan dosis 10 mg/kgBB.
3. Kelompok 3 (K3), variabel kelompok perlakuan, diberi capsaicin selama
empat minggu dengan dosis 10 mg/kgBB.
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan adalah kandang, syringe, timbangan, sonde
lambung, peralatan bedah minor, peralatan pembuatan sediaan histopatologi, dan
mikroskop cahaya. Bahan yang digunakan adalah pakan mencit crude protein
(CP) 14%, albendazole, amoxicillin, metronidazole, fraksi aktif capcaisin (Sigma
Life Science®), NaCl fisiologis, Tween 80, Lithium Karbonat, buffered neutral
formalin (BNF) 10%, etanol dengan konsentrasi 70%, 80%, 90%, 96%, etanol
4
absolut (Merck®), xylene, parafin, akuades, pewarna Mayer’s hematoksilin dan
eosin, Permount®, poly-L-lysine, phosphate buffered saline (PBS), asam sitrat,
antibodi primer anti TNF-α (Santa Cruz Biotechnology®), dan fetal bovine serum
1% (FBS 1%). Pewarnaan IHK menggunakan kit produksi Dako LSAB HRP
K0679® yang berisi H2O2 0.3%, biotin, streptavidin, dan diaminobenzidin
(DAB).
Metode Penelitian
Aklimatisasi Mencit
Mencit diaklimatisasi selama 7 hari untuk menyamakan status kesehatan,
adaptasi kandang, dan pemberian pakan. Selama masa aklimatisasi, tiap mencit
diberi anthelmentik (albendazole 25 mg/kgBB), antibiotik (amoxicillin 25
mg/kgBB), dan antiprotozoa (metronidazole 25 mg/kgBB), yang dilarutkan
dalam air minum mencit.
Persiapan dan Pemberian Capsaicin
Sebanyak 250 mg serbuk capsaicin murni dicampur dengan 1.25 mL etanol
100%. Setelah campuran homogen, ditambahkan 1.25 mL Tween 80 dan 22.5 mL
saline 0.9% (Ohara Lab® 2013). Larutan stok kemudian diencerkan dengan
aquades hingga mencapai 0.1%. Pemberian capsaicin dilakukan dengan
pencekokan dengan dosis 10 mg/kgBB selama dua minggu (K2) dan empat
minggu (K3) dengan interval pemberian dua hari sekali.
Pengamatan Gejala Klinis
Selama perlakuan, diamati gejala klinis dengan parameter berupa temperatur
tubuh, nafsu makan, diare, tampilan klinis, dan bobot badan.
Pengambilan Organ Hati dan Ginjal
Pada akhir perlakuan, semua kelompok mencit dieuthanasia menggunakan
ketamin HCl dengan dosis 15 mg/kgBB dengan rute intraperitoneal. Setelah
tertidur, dilakukan laparotomi medianus untuk mengambil organ hati dan ginjal.
Organ tersebut diamati keadaan patologi dan anatominya, kemudian difiksasi
dalam larutan BNF 10% selama ± 48 jam.
Pembuatan Sediaan Histopatologi
Organ hati dan ginjal dipotong dengan ketebalan kurang lebih 3 mm,
dimasukkan ke dalam tissue casette, kemudian dimasukkan ke dalam automatic
tissue processor untuk proses dehidrasi, clearing, dan infiltrasi. Proses dehidrasi
dimulai dengan merendam organ secara berturut-turut ke dalam etanol 70%, 80%,
90%, 96%, etanol absolut I, etanol absolut II, dan etanol absolut III. Proses
clearing dilakukan dengan merendam organ pada larutan xylene I dan xylene II,
dan proses infiltrasi dilakukan dengan merendam organ pada parafin I dan parafin
II yang bersuhu 58°C, dengan waktu masing-masing selama 2 jam.
Selanjutnya organ dimasukkan ke dalam cetakan berisi parafin cair
menggunakan paraffin embedding console dan dibiarkan mengeras hingga
terbentuk blok parafin. Organ dalam parafin kemudian dipotong menggunakan
mikrotom dengan ketebalan 3 µm. Hasil potongan berbentuk pita tipis diletakkan
5
di atas air pada waterbath bersuhu 45°C untuk menghilangkan lipatan-lipatan.
Sediaan kemudian diangkat dari permukaan air dengan gelas objek yang telah
diulas larutan albumin kemudian dikeringkan semalam dalam inkubator bersuhu
60°C.
Proses Deparafinisasi dan Rehidrasi
Sediaan direndam dalam xylene dua kali selama 2 menit, kemudian
direhidrasi menggunakan etanol bertingkat (absolut III, absolut II, absolut I, 96%,
80%) masing-masing 2 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1
menit dan dikeringkan.
Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)
Sediaan direndam dalam pewarna Mayer’s hematoksilin 8 menit, kemudian
dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan Lithium Karbonat 15 sampai 30 detik,
dan dibilas dengan air mengalir kembali. Selanjutnya sediaan dicelup ke dalam
pewarna eosin 2 menit, dibilas dengan air selama 30 sampai 60 detik, dicelup ke
dalam etanol 90% sebanyak 10 kali, etanol absolut I 10 kali, etanol absolut II
selama 2 menit, xylene I selama 1 menit, dan xylene II selama 2 menit. Kemudian
dikeringkan, diteteskan Permount® dan ditutup dengan gelas penutup.
Pembuatan Sediaan Imunohistokimia (IHK)
Sebelum digunakan, dilakukan proses coating slide menggunakan poly-Llysine. Sediaan kemudian direndam dalam larutan PBS sitrat dan dimasukkan ke
dalam microwave selama 5 menit. Selanjutnya sediaan didinginkan mencapai
25°C. Kemudian dilakukan proses rinsing (pencucian sediaan dengan larutan PBS
I, II, dan III masing-masing selama 5 menit). Proses selanjutnya adalah blocking
endogenous peroxidase dengan meneteskan H2O2 0.3% pada sediaan dan
dibiarkan selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan rinsing, blocking normal serum
menggunakan FBS 1% selama 30 menit, rinsing, penetesan antibodi primer pada
sediaan dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 4°C.
Keesokan harinya, dilakukan rinsing, kemudian diinkubasi dengan antibodi
sekunder yang telah dilabel dengan biotin selama 30 menit, dan dilakukan rinsing.
Selanjutnya inkubasi streptavidin selama 30 menit yang diikuti dengan rinsing,
kemudian sediaan diberi DAB selama 15 detik. Selanjutnya dilakukan
counterstain dengan pewarnaan Mayer’s hematoksilin sebanyak 5 kali celupan,
dehidrasi (etanol 70%, 80%, 90%, 96%, absolut I, absolut II, dan absolut III),
clearing (xylene I, II, dan III) masing-masing selama 2 menit. Selanjutnya sediaan
ditetesi Permount® dan diamati dengan mikroskop cahaya. Hasil dinyatakan
positif jika ditemukan warna cokelat tua pada jaringan.
Pengamatan dan Analisis Data
Data pengamatan gambaran histopatologi hati dan ginjal dijelaskan
menggunakan skoring dengan skala 0 sampai 3. Skor 0 menyatakan tidak ada
lesio pada organ. Skor 1 menyatakan terjadi kongesti dan degenerasi (khusus
organ hati). Skor 2 menyatakan terjadi kongesti, degenerasi, dan peradangan. Skor
3 menyatakan terjadi kongesti, degenerasi, peradangan, dan nekrosa. Skor tiap
individu kemudian dijumlahkan dan ditentukan rata-rata kelompok untuk
identifikasi lesio ringan, sedang, dan berat, serta dideskripsikan.
6
Peubah yang diamati pada pewarnaan IHK adalah reaksi positif terhadap
antibodi primer TNF-α, yang ditunjukkan oleh warna cokelat tua pada sitoplasma
sel. Hasil positif pewarnaan IHK menunjukkan kecenderungan sediaan menjadi
nekrosa jaringan. Hasil dinyatakan negatif apabila sediaan tidak terwarnai cokelat.
Hasil positif TNF-α dibagi menjadi positif ringan, sedang, dan berat. Positif
ringan apabila warna cokelat berbentuk fokus, positif sedang apabila warna
cokelat multifokus, dan positif berat apabila warna cokelat difusa.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gejala Klinis
Pemberian capsaicin tidak menimbulkan kelainan klinis pada kelompok
kontrol maupun perlakuan. Kelainanan klinis berupa diare, penurunan bobot
badan, penurunan nafsu makan, penurunan aktivitas, serta kenaikan temperatur
tidak ditunjukkan oleh setiap kelompok. Hasil pengamatan gejala klinis disajikan
pada Tabel 1.
Tabel 1 Gambaran gejala klinis kelompok kontrol (K1), capsaicin 2 minggu (K2),
dan capsaicin 4 minggu (K3)
Kelompok
Rataan temperatur tubuh
(oC)
Pre
Post
treatment
treatment
Rataan bobot badan
pada akhir
perlakuan (g)
K1
36.46±0.48
36.98±0.30
21.09±0.47
K2
36.65±0.60
36.95±0.18
22.15±0.15
K3
36.59±0.48
36.87±0.43
23.64±0.48
Aktivitas
Diare
Nafsu
Makan
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Tidak ada
(0/4)
Tidak ada
(0/4)
Tidak ada
(0/4)
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Patologi Anatomi Organ Hati dan Ginjal
Lesio yang diamati pada organ hati dan ginjal adalah lesio akibat perlakuan
pemberian capsaicin diantaranya kongesti dan hemoragi. Hasil pengamatan
patologi anatomi (PA) hati dan ginjal disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Lesio patologi anatomi pada organ hati dan ginjal mencit C3H kelompok
kontrol (K1), capsaicin 2 minggu (K2), capsaicin 4 minggu (K3)
Organ
Hati
Ginjal
Lesio
Kongesti
Hemoragi
Kongesti
Hemoragi
K1
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Kelompok
K2
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
K3
Tidak ada (0/4)
Ada (2/4)
Ada (2/4)
Tidak ada (0/4)
7
Organ hati kelompok pemberian capsaicin 4 minggu (K3) menunjukkan
terjadinya hemoragi yang ditunjukkan dengan warna kehitaman dan belang. Pada
kelompok kontrol (K1) dan kelompok pemberian capsaicin 2 minggu (K2) tidak
teramati lesio kongesti maupun hemoragi. Hemoragi pada kelompok pemberian
capsaicin 4 minggu (K3) menunjukkan pemberian capsaicin selama empat minggu
kurang aman bagi organ hati.
Lesio kongesti maupun hemoragi tidak teramati pada ginjal kelompok
kontrol (K1) dan kelompok pemberian capsaicin 2 minggu (K2). Organ ginjal
kelompok pemberian capsaicin 4 minggu (K3) mengalami kongesti, ditandai
dengan warna kehitaman yang menyebar secara merata pada korteks dan medula.
Hal tersebut menunjukkan rendahnya tingkat keamanan capsaicin terhadap organ
ginjal pada pemberian empat minggu. Foto makrografi organ hati dan ginjal
disajikan pada Gambar 1 dan 2.
K1
K2
K3
Gambar 1 Gambaran patologi anatomi organ hati mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ hati pada
K3 mengalami hemoragi ditandai dengan permukaan berwarna hitam
dan belang (tanda panah)
K1
K2
K3
Gambar 2 Gambaran patologi anatomi organ ginjal mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ ginjal pada
K3 mengalami kongesti ditandai dengan warna kehitaman yang
menyebar merata pada korteks dan medula
Histopatologi Organ Hati dan Ginjal
Metode pewarnaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Hematoksilin-Eosin (HE) yang merupakan metode pewarnaan umum yang
digunakan dalam histologi. Pewarnaan HE memberikan gambaran struktur
jaringan, memungkinkan diferensiasi struktur sebagai normal, mengalami
peradangan, mengalami perubahan degeneratif, atau patologis (Merck® 2004).
8
Pada penelitian ini, lesio histopatologi yang diamati adalah kongesti, degenerasi,
keberadaan sel radang, dan nekrosa.
Pewarnaan penunjang yang dilakukan adalah pewarnaan immunohistokimia
(IHK) yang bertujuan mendeteksi keberadaan antigen sitokin TNF-α pada
sitoplasma sel hati maupun ginjal. Hasil rataan skoring dan pengamatan IHK
organ hati dan ginjal disajikan pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3 Hasil rataan skoring pengamatan organ hati dan ginjal mencit C3H pada
kelompok kontrol (K1), pemberian capsaicin 2 minggu (K2), pemberian
capsaicin 4 minggu (K3)
No
1
2
Organ
Hati
Ginjal
K1
2.0 ± 1.1
1.8 ± 1.0
Kelompok
K2
2.5 ± 0.6
2.3 ± 1.0
K3
2.8 ± 0.5
2.8 ± 0.5
*Rataan skor 0
MENCIT C3H PASCA PEMBERIAN CAPSAICIN
FITRIAH IDRIS
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Gambaran
Toksikopatologi Organ Hati dan Ginjal Mencit C3H Pasca Pemberian Capsaicin
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Fitriah Idris
NIM B04100201
ABSTRAK
FITRIAH IDRIS. Gambaran Toksikopatologi Organ Hati dan Ginjal Mencit C3H
Pasca Pemberian Capsaicin. Dibimbing oleh MAWAR SUBANGKIT dan
ANDRIYANTO.
Capsaicin adalah senyawa utama yang ditemukan dalam cabai genus
Capsicum. Capsaicin secara in vitro terbukti bersifat antiproliferatif terhadap sel
kanker pada lambung, usus besar, hati, prostat, dan leukosit. Organ hati dan ginjal
merupakan organ sasaran utama dari efek toksik. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui efek pemberian capsaicin terhadap gambaran toksikopatologi organ
hati dan ginjal mencit C3H. Sebanyak 12 ekor mencit galur C3H dibagi dalam 3
kelompok. Kelompok 1 sebagai kontrol negatif tidak diberi capsaicin. Kelompok
2 diberi capsaicin selama dua minggu. Kelompok 3 diberi capsaicin selama empat
minggu. Pemberian capsaicin dilakukan dengan rute peroral dengan dosis 10
mg/kgBB. Pengamatan gejala klinis dilakukan sepanjang periode perlakuan.
Setelah itu, mencit dieutanasi dan diambil organnya untuk diamati dan dibuat
sediaan histopatologi dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) dan
imunohistokimia (IHK) menggunakan antibodi TNF-α. Hasil pengamatan patologi
anatomi dan histopatologi menunjukkan bahwa mencit yang diberikan capsaicin
selama 2 minggu menunjukkan kerusakan sedang pada hati dan ginjal sedangkan
mencit yang diberikan capsaicin selama 4 minggu mengalami kerusakan berat
pada hati dan ginjal. Hal ini menunjukkan tingkat keamanan capsaicin yang
rendah terhadap organ hati dan ginjal.
Kata kunci: capsaicin, ginjal, hati, mencit C3H, toksikopatologi
ABSTRACT
FITRIAH IDRIS. Toxicopathology of liver and kidney of C3H Mice PostCapsaicin Administration. Supervised by MAWAR SUBANGKIT and
ANDRIYANTO.
Capsaicin is the mayor compound founds in chilli peppers of the Capsicum
genus. Capsaicin has been shown to have antiproliferative activity to intestine,
liver, prostate, and leucocytes cancer cells in vitro. The liver and kidney are the
main target of toxic effect. The research was conducted to know the effect of
capsaicin to liver and kidney toxicopathology of C3H mice. Twelve mice strain
C3H were divided into 3 groups. Groups 1 as a negative control were not
administered capsaicin. Groups 2 were administered capsaicin for 2 weeks.
Groups 3 were administered capsaicin for 4 weeks. The capsaicin was
administered perorally with 10 mg/kgBW dose. Clinical observations made
throughout the treatment period. Then, the mice euthanized and their organs were
observed and preparated for histopathology stained hematoxylin-eosin (HE) and
immunohistochemistry (CPI) using TNF-α antibody. The gross anatomy and
histopathology showed that the mice treated capsaicin for 2 weeks showed
average damage to the liver and kidney, while mice treated capsaicin for 4 weeks
suffered severe damage to the liver and kidney. This shows the lack of security
levels of capsaicin to the liver and kidneys.
Keywords: capsaicin, C3H mice, kidney, liver, toxicopathology
GAMBARAN TOKSIKOPATOLOGI ORGAN HATI DAN GINJAL
MENCIT C3H PASCA PEMBERIAN CAPSAICIN
FITRIAH IDRIS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2013 sampai Juli 2014 ini ialah
Gambaran Toksikopatologi Organ Hati dan Ginjal Mencit C3H Pasca Pemberian
Capsaicin.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Drh Mawar Subangkit, MSi
APVet dan Bapak Drh Andriyanto, MSi selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan banyak pengarahan kepada penulis. Terima kasih pula penulis
sampaikan kepada Ibu Dr Drh Anita Esfandiari, MSi selaku pembimbing
akademik yang telah memberi bimbingan kepada penulis. Ungkapan terima kasih
kepada Bapak Endang, Bapak Kasnadi dan Bapak Sholeh serta seluruh staf
Bagian Patologi yang telah memberikan banyak bantuan selama penulis
melakukan penelitian. Penulis juga berterima kasih kepada Metrizal Abdi Taufik
selaku teman seperjuangan penulis selama penelitian. Terima pula penulis
sampaikan kepada Bapak M Idris Nur, Ibu Nur Alam, Muhammad Juwaini,
Pahimah, dan Muhammad Fuad yang telah melimpahkan kasih sayang dan
bantuan materiil maupun moril kepada menulis. Terima kasih kepada Keluarga
Besar Maddeppungeng, Keluarga Cendana 53, Keluarga Ikami SulSelBar,
Acromion 47, Andalas 12, serta seluruh pihak yang telah memberikan banyak
bantuan dan dukungan kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2014
Fitriah Idris
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
Manfaat Penelitian
1
TINJAUAN PUSTAKA
2
Capsaicin
2
Organ Hati
2
Organ Ginjal
3
METODOLOGI
3
Waktu dan Tempat
3
Hewan Percobaan
3
Alat dan Bahan
3
Metode Penelitian
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Gejala Klinis
6
Patologi Anatomi Organ Hati dan Ginjal
6
Histopatologi Organ Hati dan Ginjal
7
Pengamatan Pewarnaan Imunohistokimia
11
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
12
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1 Gambaran gejala klinis kelompok kontrol (K1), capsaicin 2 minggu
(K2), dan capsaicin 4 minggu (K3)
2 Lesio patologi anatomi pada organ hati dan ginjal mencit C3H
kelompok kontrol (K1), capsaicin 2 minggu (K2), capsaicin 4 minggu
(K3)
3 Hasil rataan skoring pengamatan organ hati dan ginjal mencit C3H
pada kelompok kontrol (K1), pemberian capsaicin 2 minggu (K2),
pemberian capsaicin 4 minggu (K3)
4 Hasil pengamatan IHK organ hati dan ginjal mencit C3H pada
kelompok kontrol (K1), pemberian capsaicin 2 minggu (K2),
pemberian capsaicin 4 minggu (K3)
6
6
8
8
DAFTAR GAMBAR
1 Gambaran patologi anatomi organ hati mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ hati pada
K3 mengalami hemoragi ditandai dengan permukaan berwarna hitam
dan belang (tanda panah)
2 Gambaran patologi anatomi organ ginjal mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ ginjal pada
K3 mengalami kongesti ditandai dengan warna kehitaman yang
menyebar merata pada korteks dan medula
3 Lesio histopatologi (A) organ hati K3 (pemberian capsaicin 4
minggu). Adanya lesio kongesti (panah hitam), degenerasi lemak
(panah hijau), sel radang (kepala panah), nekrosa (asterik), dan
anisositosis (panah merah) (B) organ ginjal K3 (pemberian capsaicin
4 minggu). Terlihat lesio kongesti (panah) dan nekrosa (asterik).
Pewarnaan HE perbesaran 400x
4 Hasil pewarnaan IHK yang bersifat imunoreaktif positif (panah)
terhadap antibodi anti TNF-α pada (A) hepatosit dan (B) sel tubulus
proksimal ginjal. Pewarnaan IHK metode LSAB perbesaran 400x
7
7
10
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Capsaicin adalah senyawa utama yang ditemukan dalam tanaman cabai
(Bode dan Dong 2011). Capsaicin dikonsumsi oleh hampir seluruh masyarakat di
dunia. Rasa pedas yang ditimbulkan oleh capsaicin pada cabai dimanfaatkan
sebagai penyedap makanan karena dapat menimbulkan nafsu makan.
Capsaicin berperan membantu pasien dengan beberapa kondisi seperti tukak
lambung. Zat ini juga berperan sebagai obat gangguan pencernaan. Selain itu,
capsaicin dapat meningkatkan sekresi saliva dan asam lambung serta
meningkatkan aktivitas saluran pencernaan. Studi terakhir menemukan bahwa
capsaicin berpotensi sebagai antikanker (Kautsar 2009). Capsaicin secara in vitro
terbukti memiliki efek antiproliferatif terhadap kanker prostat (Mori et al. 2006;
Sa'nchez et al. 2006), kanker usus besar (Kim et al. 2004), kanker lambung (Lo et
al. 2005), kanker hati (Jung et al. 2001) dan kanker leukemia (Ito et al. 2004)
tanpa menimbulkan efek samping signifikan pada sel-sel normal. Anandakumar et
al. (2009) telah membuktikan capsaicin yang diberikan peroral dengan dosis 10
mg/kgBB bersifat kemporeventif terhadap tumor paru-paru.
Hati dan ginjal merupakan organ penting dalam tubuh yang berfungsi
sebagai organ detoksifikasi. Ginjal merupakan organ ekskresi utama yang
berperan untuk mengeluarkan toksikan. Oleh karena itu, hati dan ginjal menjadi
organ sasaran utama dari efek toksik. Berdasarkan hal tersebut, penelitian
mengenai efek samping capsaicin terhadap organ hati dan ginjal menjadi penting
untuk dilakukan.
Penelitian ini menggunakan mencit C3H sebagai hewan coba. Menurut
Jaxmice (2014), mencit C3H digunakan sebagai strain dengan tujuan umum dalam
berbagai bidang penelitian termasuk penelitian kanker, penyakit menular,
sensorineural, dan biologi kardiovaskular. Sebuah mutasi spontan terjadi pada
mencit C3H membuat mencit ini lebih tahan terhadap endotoksin.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran toksikopatologi organ
hati dan ginjal mencit C3H pasca pemberian capsaicin dengan pewarnaan
Hematoksilin-Eosin (HE) dan imunohistokimia (IHK).
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat dibidang farmakologi,
toksikologi, dan patologi, khususnya mengetahui toksisitas capsaicin terhadap
organ hati dan ginjal sehingga dapat dijadikan bahan pertimbangan dalam
penggunaannya sebagai obat antikanker.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Capsaicin
Capsaicin (8-methyl-N-vanillyl1trans-6-nonenamide) termasuk dalam
capsaicinoid (Sanatombik 2008). Capsaicinoid berasal dari tanaman famili
Solanaceae dan diproduksi sebagai metabolit sekunder oleh cabai. Capsaicin
merupakan komponen aktif cabai yang menghasilkan panas yang bersifat iritan
terhadap mamalia termasuk manusia dan menimbulkan rasa terbakar dan panas
pada jaringan manapun yang tersentuh.
Capsaicin murni bersifat hidrofobik, tidak berwarna, tidak berbau, dan
bentuk kristal bahan digunakan sebagai bahan campuran lilin. Capsaicin disintesis
pada septa interlokular buah cabai dengan penambahan cabang rantai asam lemak
ke vanillyalamine. Biosintesis capsaicin tergantung pada gen AT3 (Stewart et al.
2005). Capsaicin termasuk senyawa Fenilpropanoid dengan rumus molekul
C18H27NO3 yang memiliki berat molekul 305.41 g/mol dengan titik lebur 62-65°C
dan titik didih 210-220°C (Chhabra et al. 2012).
Capsaicin memiliki aktifitas biologis yang tinggi diantaranya sebagai
antioksidan, iron-binding, dan efek hypolipidemic (Dairam et al. 2008;
Manjunatha dan Srinivasan 2007; Srinivasan et al. 2004). Capsaicin dapat
meredakan rasa nyeri dan peradangan (Sancho et al. 2002).
Kemampuan capsaicin menghambat pertumbuhan sel-sel kanker terletak
pada kemampuannya menginduksi terjadinya apoptosis, penangkapan
pertumbuhan siklus sel, regulasi faktor ekspresi transkripsi, dan penghambatan
terhadap growth signal transduction pathways (Lin et al. 2013).
Organ Hati
Hati adalah organ terbesar kedua dalam tubuh manusia setelah kulit. Hati
berbentuk segitiga yang memanjang melintasi rongga perut di kaudal diafragma.
Sebagian besar massa hati terletak di sisi kanan tubuh. Hati terdiri dari jaringan
merah muda kecokelatan yang sangat lunak yang dibalut oleh kapsul jaringan ikat
yang diperkuat oleh peritoneum yang melindungi dan memfiksasi hati di dalam
rongga perut. Organ hati berperan dalam banyak proses tubuh, diantaranya proses
digesti, metabolisme, detoksifikasi, imunitas, dan penyimpanan nutrisi (Taylor
2014).
Struktur mikroskopis dari hati dibagi menjadi sinusoid, lobulus, hepatosit,
dan triad portal. Sinusoid memiliki empati jenis sel yaitu sel Kupffer, sel endotel,
sel Ito, dan sel pit. Lobulus yaitu unit kecil berbentuk heksagonal dengan venule
terminal hepatik pada bagian tengah dan triad portal pada bagian ujung
heksagonal. Hepatosit merupakan parenkim organ hati yang tersusun radial dalam
lobulus hati yang tergabung satu sama lain dalam anastomosis plate yang dibatasi
oleh sinusoid. Triad portal terdiri dari cabang terminal vena porta, arteriol yang
merupakan cabang dari arteri hepatika, dan bile ductules (Lumongga 2008).
3
Organ Ginjal
Ginjal adalah suatu organ yang secara struktural kompleks dan berkembang
untuk beberapa fungsi, diantaranya ekskresi produk sisa metabolisme,
pengendalian air dan garam, pemeliharaan keseimbangan asam dan basa, serta
sekresi berbagai hormon dan autokoid (Cotran et al. 2007). Ginjal menjadi salah
satu organ sasaran utama dari efek toksik karena merupakan organ ekskresi utama
yang berperan untuk mengeluarkan toksikan.
Ginjal terdiri dari struktur internal berupa hilus, sinus, pelvis, parenkim, dan
lobus. Unit fungsional ginjal yaitu nefron yang terdiri dari glomerulus, tubulus
kontortus proksimal, ansa henle, tubulus kontortus distal, tubulus kolektivus, dan
duktus kolektivus (Slonane 2004).
METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada Maret 2013 sampai Juli 2014 di Bagian
Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran
Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Hewan Percobaan
Mencit dengan galur C3H berjenis kelamin betina, sebanyak 12 ekor
dengan berat badan rata-rata 20 g dipelihara dalam kotak plastik berukuran 20 x
30 cm, dalam ruangan dengan suhu berkisar antara 25-27°C, kelembapan relatif
antara 58-63%, dan pengondisian cahaya 12 jam terang dan 12 jam gelap. Mencit
diberi pakan pelet dan minum ad libitum. Mencit dibagi dalam 3 kelompok sama
rata sebagai berikut:
1. Kelompok 1 (K1), variabel kontrol negatif, tidak diberi capsaicin.
2. Kelompok 2 (K2), variabel kelompok perlakuan, diberi capsaicin selama dua
minggu dengan dosis 10 mg/kgBB.
3. Kelompok 3 (K3), variabel kelompok perlakuan, diberi capsaicin selama
empat minggu dengan dosis 10 mg/kgBB.
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan adalah kandang, syringe, timbangan, sonde
lambung, peralatan bedah minor, peralatan pembuatan sediaan histopatologi, dan
mikroskop cahaya. Bahan yang digunakan adalah pakan mencit crude protein
(CP) 14%, albendazole, amoxicillin, metronidazole, fraksi aktif capcaisin (Sigma
Life Science®), NaCl fisiologis, Tween 80, Lithium Karbonat, buffered neutral
formalin (BNF) 10%, etanol dengan konsentrasi 70%, 80%, 90%, 96%, etanol
4
absolut (Merck®), xylene, parafin, akuades, pewarna Mayer’s hematoksilin dan
eosin, Permount®, poly-L-lysine, phosphate buffered saline (PBS), asam sitrat,
antibodi primer anti TNF-α (Santa Cruz Biotechnology®), dan fetal bovine serum
1% (FBS 1%). Pewarnaan IHK menggunakan kit produksi Dako LSAB HRP
K0679® yang berisi H2O2 0.3%, biotin, streptavidin, dan diaminobenzidin
(DAB).
Metode Penelitian
Aklimatisasi Mencit
Mencit diaklimatisasi selama 7 hari untuk menyamakan status kesehatan,
adaptasi kandang, dan pemberian pakan. Selama masa aklimatisasi, tiap mencit
diberi anthelmentik (albendazole 25 mg/kgBB), antibiotik (amoxicillin 25
mg/kgBB), dan antiprotozoa (metronidazole 25 mg/kgBB), yang dilarutkan
dalam air minum mencit.
Persiapan dan Pemberian Capsaicin
Sebanyak 250 mg serbuk capsaicin murni dicampur dengan 1.25 mL etanol
100%. Setelah campuran homogen, ditambahkan 1.25 mL Tween 80 dan 22.5 mL
saline 0.9% (Ohara Lab® 2013). Larutan stok kemudian diencerkan dengan
aquades hingga mencapai 0.1%. Pemberian capsaicin dilakukan dengan
pencekokan dengan dosis 10 mg/kgBB selama dua minggu (K2) dan empat
minggu (K3) dengan interval pemberian dua hari sekali.
Pengamatan Gejala Klinis
Selama perlakuan, diamati gejala klinis dengan parameter berupa temperatur
tubuh, nafsu makan, diare, tampilan klinis, dan bobot badan.
Pengambilan Organ Hati dan Ginjal
Pada akhir perlakuan, semua kelompok mencit dieuthanasia menggunakan
ketamin HCl dengan dosis 15 mg/kgBB dengan rute intraperitoneal. Setelah
tertidur, dilakukan laparotomi medianus untuk mengambil organ hati dan ginjal.
Organ tersebut diamati keadaan patologi dan anatominya, kemudian difiksasi
dalam larutan BNF 10% selama ± 48 jam.
Pembuatan Sediaan Histopatologi
Organ hati dan ginjal dipotong dengan ketebalan kurang lebih 3 mm,
dimasukkan ke dalam tissue casette, kemudian dimasukkan ke dalam automatic
tissue processor untuk proses dehidrasi, clearing, dan infiltrasi. Proses dehidrasi
dimulai dengan merendam organ secara berturut-turut ke dalam etanol 70%, 80%,
90%, 96%, etanol absolut I, etanol absolut II, dan etanol absolut III. Proses
clearing dilakukan dengan merendam organ pada larutan xylene I dan xylene II,
dan proses infiltrasi dilakukan dengan merendam organ pada parafin I dan parafin
II yang bersuhu 58°C, dengan waktu masing-masing selama 2 jam.
Selanjutnya organ dimasukkan ke dalam cetakan berisi parafin cair
menggunakan paraffin embedding console dan dibiarkan mengeras hingga
terbentuk blok parafin. Organ dalam parafin kemudian dipotong menggunakan
mikrotom dengan ketebalan 3 µm. Hasil potongan berbentuk pita tipis diletakkan
5
di atas air pada waterbath bersuhu 45°C untuk menghilangkan lipatan-lipatan.
Sediaan kemudian diangkat dari permukaan air dengan gelas objek yang telah
diulas larutan albumin kemudian dikeringkan semalam dalam inkubator bersuhu
60°C.
Proses Deparafinisasi dan Rehidrasi
Sediaan direndam dalam xylene dua kali selama 2 menit, kemudian
direhidrasi menggunakan etanol bertingkat (absolut III, absolut II, absolut I, 96%,
80%) masing-masing 2 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1
menit dan dikeringkan.
Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)
Sediaan direndam dalam pewarna Mayer’s hematoksilin 8 menit, kemudian
dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan Lithium Karbonat 15 sampai 30 detik,
dan dibilas dengan air mengalir kembali. Selanjutnya sediaan dicelup ke dalam
pewarna eosin 2 menit, dibilas dengan air selama 30 sampai 60 detik, dicelup ke
dalam etanol 90% sebanyak 10 kali, etanol absolut I 10 kali, etanol absolut II
selama 2 menit, xylene I selama 1 menit, dan xylene II selama 2 menit. Kemudian
dikeringkan, diteteskan Permount® dan ditutup dengan gelas penutup.
Pembuatan Sediaan Imunohistokimia (IHK)
Sebelum digunakan, dilakukan proses coating slide menggunakan poly-Llysine. Sediaan kemudian direndam dalam larutan PBS sitrat dan dimasukkan ke
dalam microwave selama 5 menit. Selanjutnya sediaan didinginkan mencapai
25°C. Kemudian dilakukan proses rinsing (pencucian sediaan dengan larutan PBS
I, II, dan III masing-masing selama 5 menit). Proses selanjutnya adalah blocking
endogenous peroxidase dengan meneteskan H2O2 0.3% pada sediaan dan
dibiarkan selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan rinsing, blocking normal serum
menggunakan FBS 1% selama 30 menit, rinsing, penetesan antibodi primer pada
sediaan dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 4°C.
Keesokan harinya, dilakukan rinsing, kemudian diinkubasi dengan antibodi
sekunder yang telah dilabel dengan biotin selama 30 menit, dan dilakukan rinsing.
Selanjutnya inkubasi streptavidin selama 30 menit yang diikuti dengan rinsing,
kemudian sediaan diberi DAB selama 15 detik. Selanjutnya dilakukan
counterstain dengan pewarnaan Mayer’s hematoksilin sebanyak 5 kali celupan,
dehidrasi (etanol 70%, 80%, 90%, 96%, absolut I, absolut II, dan absolut III),
clearing (xylene I, II, dan III) masing-masing selama 2 menit. Selanjutnya sediaan
ditetesi Permount® dan diamati dengan mikroskop cahaya. Hasil dinyatakan
positif jika ditemukan warna cokelat tua pada jaringan.
Pengamatan dan Analisis Data
Data pengamatan gambaran histopatologi hati dan ginjal dijelaskan
menggunakan skoring dengan skala 0 sampai 3. Skor 0 menyatakan tidak ada
lesio pada organ. Skor 1 menyatakan terjadi kongesti dan degenerasi (khusus
organ hati). Skor 2 menyatakan terjadi kongesti, degenerasi, dan peradangan. Skor
3 menyatakan terjadi kongesti, degenerasi, peradangan, dan nekrosa. Skor tiap
individu kemudian dijumlahkan dan ditentukan rata-rata kelompok untuk
identifikasi lesio ringan, sedang, dan berat, serta dideskripsikan.
6
Peubah yang diamati pada pewarnaan IHK adalah reaksi positif terhadap
antibodi primer TNF-α, yang ditunjukkan oleh warna cokelat tua pada sitoplasma
sel. Hasil positif pewarnaan IHK menunjukkan kecenderungan sediaan menjadi
nekrosa jaringan. Hasil dinyatakan negatif apabila sediaan tidak terwarnai cokelat.
Hasil positif TNF-α dibagi menjadi positif ringan, sedang, dan berat. Positif
ringan apabila warna cokelat berbentuk fokus, positif sedang apabila warna
cokelat multifokus, dan positif berat apabila warna cokelat difusa.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gejala Klinis
Pemberian capsaicin tidak menimbulkan kelainan klinis pada kelompok
kontrol maupun perlakuan. Kelainanan klinis berupa diare, penurunan bobot
badan, penurunan nafsu makan, penurunan aktivitas, serta kenaikan temperatur
tidak ditunjukkan oleh setiap kelompok. Hasil pengamatan gejala klinis disajikan
pada Tabel 1.
Tabel 1 Gambaran gejala klinis kelompok kontrol (K1), capsaicin 2 minggu (K2),
dan capsaicin 4 minggu (K3)
Kelompok
Rataan temperatur tubuh
(oC)
Pre
Post
treatment
treatment
Rataan bobot badan
pada akhir
perlakuan (g)
K1
36.46±0.48
36.98±0.30
21.09±0.47
K2
36.65±0.60
36.95±0.18
22.15±0.15
K3
36.59±0.48
36.87±0.43
23.64±0.48
Aktivitas
Diare
Nafsu
Makan
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Tidak ada
(0/4)
Tidak ada
(0/4)
Tidak ada
(0/4)
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Baik
(4/4)
Patologi Anatomi Organ Hati dan Ginjal
Lesio yang diamati pada organ hati dan ginjal adalah lesio akibat perlakuan
pemberian capsaicin diantaranya kongesti dan hemoragi. Hasil pengamatan
patologi anatomi (PA) hati dan ginjal disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Lesio patologi anatomi pada organ hati dan ginjal mencit C3H kelompok
kontrol (K1), capsaicin 2 minggu (K2), capsaicin 4 minggu (K3)
Organ
Hati
Ginjal
Lesio
Kongesti
Hemoragi
Kongesti
Hemoragi
K1
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Kelompok
K2
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
Tidak ada (0/4)
K3
Tidak ada (0/4)
Ada (2/4)
Ada (2/4)
Tidak ada (0/4)
7
Organ hati kelompok pemberian capsaicin 4 minggu (K3) menunjukkan
terjadinya hemoragi yang ditunjukkan dengan warna kehitaman dan belang. Pada
kelompok kontrol (K1) dan kelompok pemberian capsaicin 2 minggu (K2) tidak
teramati lesio kongesti maupun hemoragi. Hemoragi pada kelompok pemberian
capsaicin 4 minggu (K3) menunjukkan pemberian capsaicin selama empat minggu
kurang aman bagi organ hati.
Lesio kongesti maupun hemoragi tidak teramati pada ginjal kelompok
kontrol (K1) dan kelompok pemberian capsaicin 2 minggu (K2). Organ ginjal
kelompok pemberian capsaicin 4 minggu (K3) mengalami kongesti, ditandai
dengan warna kehitaman yang menyebar secara merata pada korteks dan medula.
Hal tersebut menunjukkan rendahnya tingkat keamanan capsaicin terhadap organ
ginjal pada pemberian empat minggu. Foto makrografi organ hati dan ginjal
disajikan pada Gambar 1 dan 2.
K1
K2
K3
Gambar 1 Gambaran patologi anatomi organ hati mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ hati pada
K3 mengalami hemoragi ditandai dengan permukaan berwarna hitam
dan belang (tanda panah)
K1
K2
K3
Gambar 2 Gambaran patologi anatomi organ ginjal mencit (K1) tanpa capsaicin,
(K2) capsaicin 2 minggu, (K3) capsaicin 4 minggu. Organ ginjal pada
K3 mengalami kongesti ditandai dengan warna kehitaman yang
menyebar merata pada korteks dan medula
Histopatologi Organ Hati dan Ginjal
Metode pewarnaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Hematoksilin-Eosin (HE) yang merupakan metode pewarnaan umum yang
digunakan dalam histologi. Pewarnaan HE memberikan gambaran struktur
jaringan, memungkinkan diferensiasi struktur sebagai normal, mengalami
peradangan, mengalami perubahan degeneratif, atau patologis (Merck® 2004).
8
Pada penelitian ini, lesio histopatologi yang diamati adalah kongesti, degenerasi,
keberadaan sel radang, dan nekrosa.
Pewarnaan penunjang yang dilakukan adalah pewarnaan immunohistokimia
(IHK) yang bertujuan mendeteksi keberadaan antigen sitokin TNF-α pada
sitoplasma sel hati maupun ginjal. Hasil rataan skoring dan pengamatan IHK
organ hati dan ginjal disajikan pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3 Hasil rataan skoring pengamatan organ hati dan ginjal mencit C3H pada
kelompok kontrol (K1), pemberian capsaicin 2 minggu (K2), pemberian
capsaicin 4 minggu (K3)
No
1
2
Organ
Hati
Ginjal
K1
2.0 ± 1.1
1.8 ± 1.0
Kelompok
K2
2.5 ± 0.6
2.3 ± 1.0
K3
2.8 ± 0.5
2.8 ± 0.5
*Rataan skor 0