Pengaruh Etil Metan Sulfonat (Ems) Terhadap Mikroalga Spesies Dunaliella Sp
PENGARUH ETIL METAN SULFONAT (EMS) TERHADAP
MIKROALGA SPESIES Dunaliella sp.
AMELIA SALINA GUSTINI
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*1
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pengaruh Etil Metan
Sulfonat (EMS) Terhadap Mikroalga Spesies Dunaliella sp. adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Amelia Salina Gustini
NIM C54100052
*
Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB
harus didasarkan pada kerja sama yang terkait
ABSTRAK
AMELIA SALINA GUSTINI. Pengaruh Etil Metan Sulfonat (EMS) Terhadap
Mikroalga Spesies Dunaliella sp. Dibimbing oleh MUJIZAT KAWAROE dan
ADRIANI SUNUDDIN.
Mikroalga spesies Dunaliella sp. memiliki potensi yang besar untuk
dimanfaatkan sebagai bahan pakan maupun pangan sehingga dapat dijadikan
sebagai komoditi hasil perairan alternatif. Etil metan sulfonat (EMS) merupakan
suatu teknik mutagenesis yang banyak digunakan untuk meningkatkan produksi
mikroalga. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis pengaruh pemberian EMS
terhadap mikroalga spesies Dunaliella sp. Metode yang digunakan yaitu dengan
cara menambahkan EMS konsentrasi 0.1 M dan 0.5 M pada tahap awal kultivasi
mikroalga. Analisis yang dilakukan untuk mengetahui pengaruh dari penambahan
EMS yaitu dengan pengamatan ukuran sel, kepadatan sel, karakteristik proksimat,
karakteristik asam lemak dan aktivitas antioksidan mikroalga spesies Dunaliella
sp. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi 0.1 M memiliki ukuran sel tiga kali
lebih besar dari ukuran sel kontrol dan memiliki persentase asam lemak yang
lebih tinggi. Sedangkan perlakuan yang ditambahkan EMS memiliki laju
pertumbuhan dan aktivitas antioksidan yang rendah dibandingkan dengan
perlakuan kontrol.
Kata kunci: Dunaliella sp., Etil Metan Sulfonat, Mikroalga
ABSTRACT
AMELIA SALINA GUSTINI. Effect of Ethyl Methane Sulfonate (EMS) on
Microalgae Species Dunaliella sp. Supervised by MUJIZAT KAWAROE and
ADRIANI SUNUDDIN.
Microalgae species Dunaliella sp. has great potential to be used as feed or
food ingredients that can be used as an alternative commodities waters. Ethyl
methane sulfonate (EMS) mutagenesis is a technique that is widely used to
increase the production of microalgae. The purpose of this study was to analyze
the effect of EMS on the species microalgae Dunaliella sp. The method used is by
adding EMS concentration of 0.1 M and 0.5 M in the early stages of cultivation of
microalgae. The analysis conducted to determine the effect of the addition of EMS
is the observation cell size, cell density, proximate characteristics, characteristics
of fatty acid and antioxidant activity of species microalgae Dunaliella sp. EMS
concentration of 0.1 M has a cell size three times larger than the cell size control
and have a percentage of higher fatty acids. Meanwhile the EMS treatment had
low in growth rate and antioxidant activity compared to the control treatment.
Keywords: Dunaliella sp., Etil Metan Sulfonat, Microalgae
PENGARUH ETIL METAN SULFONAT (EMS) TERHADAP
MIKROALGA SPESIES Dunaliella sp.
AMELIA SALINA GUSTINI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Ilmu Kelautan
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul Skripsi: Pengamh Etil Metan Sulfonat (EMS) Terhadap Mikroalga Spesies
Dunaliella sp.
Nama
: Amelia Salina Gustini
NIM
: C54100052
Disetujui oleh
\
Adriani Sunuddin, SPi, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
1 5 APR 2015
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
rahmat dan karunia-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan pada bulan September hingga bulan
Desember 2014 ini ialah hidrobiologi, dengan judul “Pengaruh Etil Metan
Sulfonat (EMS) Terhadap Mikroalga Spesies Dunaliella sp.”
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Mujizat Kawaroe, MSi dan
Adriani Sunuddin, SPi, MSi selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Bapak Dr Ir I Wayan Nurjaya, MSc selaku ketua
Departemen, Bapak Dr Ir Henry M Manik, ST selaku Ketua Komisi Pendidikan
S1 ITK, Bapak Beginer Subhan, SPi, MSi selaku dosen penguji dan seluruh staf
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan untuk angkatan Ilmu dan Teknologi Kelautan tahun 2010, Safirah
Tassa, Wida Novasari, Marina Novasari, Abu Rizhal, Nandike Ayudiah Poetri,
Fitrianti Sofyan, Deni Yan Koesyana, Nurlita Putri, atas dukungan dan
bantuannya serta ayah, ibu, seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2015
Amelia Salina Gustini
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE
2
Lokasi dan Waktu Penelitian
2
Prosedur Penelitian
2
Analisis Data
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Morfologi Sel Mutagenesis Dunaliella sp.
5
Kepadatan Sel Dunaliella sp.
6
Karakteristik Mikroalga Spesies Dunaliella sp.
8
Karakteristik Senyawa Asam Lemak Mikroalga Dunaliella sp.
10
Aktivitas Antioksidan Kultur Dunaliella sp.
11
KESIMPULAN DAN SARAN
12
Kesimpulan
12
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
27
DAFTAR TABEL
1 Fisikokimiawi (%) mikroalga spesies Dunaliella sp.
2 Senyawa asam lemak Dunaliella sp.
3 Aktivitas antioksidan (%) mikroalga Dunaliella sp.
9
10
12
DAFTAR GAMBAR
1 Ukuran sel Dunaliella sp. perbesaran 1000x (a) Kontrol, (b) EMS 0.1
M, dan (c) EMS 0.5 M
2 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 10 ml
3 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 400 ml
4 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 20 liter
5 Pengujian aktivitas antioksidan Dunaliella sp. metode DPPH
5
6
7
8
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Metode analisis proksimat
2 Dokumentasi kegiatan
3 Uji statistik kepadatan sel pada media kultur 400 ml
4 Uji statistik kepadatan sel pada media kultur 20 liter
5 Uji statistik kadar air
6 Uji statistik kadar abu
7 Uji statistik kadar lemak
8 Uji statistik kadar protein
9 Identifikasi asam lemak Dunaliella sp.
10 Nilai absorbansi Dunaliella sp. metode DPPH
11 Uji statistik aktivitas antioksidan
16
18
20
20
20
21
22
22
24
26
26
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikroalga merupakan mahluk hidup berukuran mikroskopis yang dapat
hidup baik di air tawar maupun air laut. Organisme ini merupakan tumbuhan
paling primitif yang lebih dikenal dengan sebutan fitoplankton. Zat pigmen
klorofil yang dimiliki oleh mikroalga mampu melakukan fotosintesis seperti
tumbuhan tingkat tinggi lainnya sehingga menyebabkan mikroalga berperan
sebagai produsen di wilayah perairan. Selain itu mikroalga laut merupakan materi
organik dalam laut sehingga dapat dijadikan salah satu komponen pembentukan
minyak bumi di dasar laut (Kawaroe et al. 2010).
Dunaliella sp. merupakan salah satu jenis mikroalga yang termasuk dalam
kelas alga hijau, pergerakannya motil dengan dua flagella sama panjang.
Umumnya bentuk sel dari Dunaliella sp. adalah bulat dengan ukuran lebar 4-15
µm dan panjang 6-25 µm, tetapi tergantung fase pertumbuhan atau kondisi
lingkungan. Pada umumnya bentuk sel Dunaliella sp. simetris radial dan sebagian
berbentuk simetris bilateral, pipih, bagian atas melengkung atau sedikit asimetris.
(Gonzalez et al. 2009). Dunaliella sp. dapat ditemukan di air tawar maupun air
laut dan sebagian danau bersalinitas tinggi di seluruh dunia. Suhu, salinitas dan
nutrisi merupakan faktor pembatas bagi pertumbuhan dan perkembangan
Dunaliella sp.
Mikroalga jenis Dunaliella sp. memiliki potensi yang besar untuk
dimanfaatkan sebagai bahan pakan maupun pangan sehingga dapat dijadikan
sebagai komoditi hasil perairan alternatif. Kebanyakan spesies mikroalga
menghasilkan produk yang khas seperti asam lemak, antioksidan dan karotenoid
(Hossain et al. 2008). Dunaliella sp. merupakan salah satu mikroalga yang cukup
banyak diteliti karena kandungan karotenoid dan gliserol nya yang tinggi.
Kandungan kimiawi seperti protein, asam amino, vitamin, polisakarida dan
karbohidrat yang diekstrak dari mikroalga telah digunakan untuk bahan makanan.
Selain untuk pakan maupun pangan, mikroalga dapat dimanfaatkan sebagai
penghasil bahan bakar alternatif atau biofuel.
Sampai saat ini masih dilakukan penelitian untuk mendapatkan jenis
mikroalga yang mampu menghasilkan biomassa yang tinggi untuk menunjang
proses tahap selanjutnya. Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk
meningkatkan biomassa mikroalga adalah dengan teknik mutagenesis. Teknik
mutagenesis terbagi menjadi dua, yaitu mutagen fisik maupun senyawa kimia.
Mutagen fisik yang biasa digunakan adalah sinar-x dan sinar gamma, sedangkan
senyawa kimia adalah Kolkisin, Etil Metan Sulfonat (EMS), dan Etilen Oksida.
EMS merupakan senyawa mutagen yang paling sering digunakan dalam
mutagenesis kimia karena memiliki efektivitas mutasi dan sifat mutageniknya bisa
hilang setelah mengalami reaksi hidrolisis dengan air (Harten 1998). Oleh karena
itu, penelitian ini dilakukan dengan tujuan menganalisis pengaruh dari pemberian
EMS terhadap mikroalga spesies Dunaliella sp.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh pemberian Etil Metan
Sulfonat (EMS) terhadap mikroalga spesies Dunaliella sp.
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama bulan September hingga Desember 2014, di
Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC), Pusat Studi Biofarmaka,
LPPM, Laboratorium Bioprospecting, Ilmu dan Teknologi Kelautan, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Pangan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.
Prosedur Penelitian
Kultivasi Mikroalga
Kultivasi dilakukan pada skala laboratorium dengan perbandingan 1:3 yaitu
sebanyak 100 ml inokulan Dunaliella sp. ditambahkan air laut steril 300 ml, dan
tambahkan pupuk walne sebagai media. Sel Dunaliella sp. dikultivasi di dalam
erlenmeyer 500 ml dan diletakkan dalam rak kultur dengan pemberian areasi dan
penerangan cahaya lampu 1000 lux selama 24 jam.
EMS Mutagenesis
Setelah umur kultivasi mencapai fase logaritmik, sampel mikroalga diambil
untuk dimutasi menggunakan Etil Metan Sulfonat (Sigma USA) dan dikocok
dengan stabil menggunakan stirer magnetik selama 60 menit. EMS yang
digunakan yaitu konsentrasi 0.1 M dan 0.5 M untuk dilihat perbandingannya.
Setelah itu sampel mikroalga yang telah diberikan EMS dibilas sebanyak 3 kali
ulangan dengan air laut steril untuk menghilangkan EMS yang tersisa pada
mikroalga. Selanjutnya sampel tersebut ditambahkan kembali dengan pupuk
walne dan di separasi untuk masing-masing perlakuan (EMS 0.1 M, EMS 0.5 M
dan kontrol) ke dalam tabung reaksi 10 ml. Mikroalga dipelihara selama 7 hari
dan dihitung kepadatan selnya sebelum diseleksi. Tabung yang terseleksi
kemudian dikultivasi kembali pada skala yang lebih besar (scaling up).
Pemanenan Mikroalga
Pemanenan mikroalga dilakukan saat umur mikroalga mencapai fase
stasioner dan kematian dengan cara filtrasi menggunakan vacuum pump dan
kertas whatman berdiameter 90 mm. Biomassa mikroalga yang tersaring
dikeringkan menggunakan oven di bawah suhu 105 °C selama ± 1 jam.
Ekstraksi Lemak
Sampel kering ditimbang sebanyak 1-2 gram, dibungkus dalam selongsong
yang sebelumnya telah dimasukkan kapas bebas lemak. Kemudian sampel
3
tersebut dimasukkan ke dalam tabung soxhlet dan tambahkan zat kimia Heksan
sebagai pelarut ekstraksi selama 6 jam (Bligh dan Dyer 1959). Ekstrak lemak
didestilasi menggunakan soxhlet, kemudian oven lemak yang terekstrak dengan
suhu 105 °C selama kurang lebih 1 jam dan selanjutnya ditimbang untuk
mendapatkan kadar lemak.
Perhitungan Kepadatan Sel
Perhitungan kepadatan sel Dunaliella sp. pada setiap perlakuan dilakukan
setiap hari dengan menggunakan mikroskop elektron dengan perbesaran 10x dan
haemocytometer. Setiap perhitungan dilakukan dengan mencacah 5 lapang
pandang masing- masing 4 kali pengulangan. Sel yang telah tercacah selanjutnya
dihitung dengan menggunakan formula sebagai berikut :
Kepadatan sel (sel/ml) =
(1)
Keterangan:
n
= Jumlah sel yang teramati
Penentuan Kadar Air (AOAC 1995)
Keringkan cawan porselen yang digunakan selama 1 jam dalam oven pada
suhu 105 °C, lalu didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Sebanyak 23 gram sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan untuk dikeringkan
dalam oven selama 4-6 jam pada suhu 105 °C. Selanjutnya cawan tersebut
didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Persamaan kadar air terdapat
pada Lampiran 1.
Penentuan Kadar Abu (AOAC 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 2-3 gram dan dimasukkan ke dalam cawan
porselen yang telah diketahui beratnya. Setelah itu cawan dimasukkan ke dalam
tanur listrik tipe 1400 fumace dengan suhu 600 °C selama 4-6 jam sampai terjadi
pengabuan sempurna. Kemudian diangkat dan didinginkan dalam desikator lalu
ditimbang sampai konstan. Persamaan kadar abu terdapat pada Lampiran 1.
Penentuan Kadar Protein Kasar
Timbang sampel sebanyak 0.51 gram dan masukkan ke dalam labu kjeldahl
100 ml. Tambahkan 2 gram campuran selen dan 25 ml H2SO4 pekat kemudian
panaskan di atas pemanas listrik atau api pembakar sekitar 2 jam sampai mendidih
dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan. Dinginkan, kemudian encerkan dan
masukkan ke dalam labu ukur 100 ml, tepatkan sampai tanda garis. Pipet 5 ml
larutan dan dimasukkan ke dalam alat penyuling dan tambahkan 5 ml NaOH 30%
dan beberapa indikator PP. Sulingkan selama 10 menit, sebagai penampung
gunakan 10 ml larutan asam borat 2% yang telah dicampur indikator. Kemudian
titrasi dengan larutan HCl 0.001 N. Persamaan kadar protein kasar terdapat pada
Lampiran 1.
Esterifikasi
Sebanyak 2 gram lemak diekstraksi dengan heksana yang disaponifikasi
oleh 25 ml 0.5 M NaOH Metanol. Kemudian, 300 mg sampel lemak yang
disaponifikasi direaksikan dengan 8 ml BF3-metanol dan dipanaskan selama 3-4
menit. Setelah itu, ditambahkan Petroleum Ether (60 °C) sebanyak 2-3 ml untuk
4
memisahkan ester. Sampel ditambahkan NaCl untuk mengapungkan senyawa
asam lemak ke atas labu kemudian analisis dengan alat GC-MS (Prommuak et al.
2012)
Metode Kromatografi Gas–Spektrometri Massa (GC-MS)
Analisis kromatografi gas–spektrometri massa (Gas Chromatography –
Mass Spectrometry/ GC-MS) menggunakan kromatografi gas Shimadzu QP2010
yang dilengkapi dengan kolom silika DB-5 ms (panjang 30 m; 0.25 mm diameter
dalam; dan 0.25 µm ketebalan lapis film) serta helium sebagai gas pendorong.
Kromatografi gas memiliki batas deteksi 0.001 ppb. Kromatografi gas
menggunakan mode injeksi split dengan rasio 1 : 200. Suhu oven kromatografi
gas di program dari 80 °C dibiarkan konstan selama 2 menit, kemudian dinaikkan
210 °C dengan kecepatan 10°/menit dibiarkan konstan selama 1 menit, kemudian
dinaikkan lagi 280 °C dengan kecepatan 6 °C/menit dibiarkan konstan selama 5
menit. Kondisi GC-MS adalah ionisasi potensial/ electron energy 70eV, ion
source temperature 250 °C dan interface temperature 280 °C. Full mass data
dicatat antara 50 – 400 Dalton setiap detik. Waktu retensi dari 0 sampai 32.67
menit. Kemudian data dicatat dan dianalisis dengan peragkat lunak GC-MS Real
Time Analysis dan GCMS Postrun Analysis.
Uji Aktivitas Antioksidan
Larutan 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate (DPPH) disiapkan dengan
melarutkan 0.004 gram DPPH dalam 100 ml metanol (Romeilad et al. 2010; Das
et al. 2011). 1 ml mikroalga disentrifuse dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu
4 °C selama 15 menit, kemudian endapan diekstraksi dengan 1 ml etanol
kemudian vortex dengan kecepatan stabil. Ekstrak didiamkan pada suhu 4 °C
selama 4 jam dan tambahkan 2 ml larutan DPPH. Kemudian campuran diinkubasi
selama 30 menit di dalam ruang gelap suhu kamar. Sampel blanko (larutan etanol)
merupakan kontrol. Hitung absorbansi pada panjang gelombang 517 nm dengan
menggunakan spektrofotometer. Persamaan uji aktivitas antioksidan terdapat pada
Lampiran 1.
Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
rancangan acak lengkap (RAL) untuk kepadatan sel dan rancangan acak lengkap
faktorial (RALF) untuk uji proksimat dan aktivitas antioksidan (Walpole 1993).
Rancangan acak lengkap dilakukan terhadap kultur mikroalga dengan perbedaan
perlakuan kontrol, EMS 0.1 M dan EMS 0.5 M. Model rancangannya :
Yij = µ + i + εij
(2)
Keterangan :
Yij
= nilai pengamatan perlakuan ke-i, kelompok ke-j
µ
= rata-rata umum
= (µ i-µ) = pengaruh aditif perlakuan ke-i
i
εij
= galat percobaan dari perlakuan ke-i ulangan ke-j dengan εij ~ σ (0, 2)
5
Rancangan acak lengkap faktorial (RALF) dengan tiga kali ulangan
dilakukan pada uji proksimat dan aktivitas antioksidan. Faktor pertama adalah
perlakuan kontrol, EMS 0.1 M, dan EMS 0.5 M. Faktor kedua adalah hari panen
yaitu pada saat fase stasioner dan fase kematian. Model rancangannya adalah
sebagai berikut :
Yijk = µ + αi + βj + αβij + ε1(ij
(3)
Keterangan :
Yijk
= nilai proksimat dan antioksidan ke-k yang memperoleh kombinasi
perlakuan penambahan EMS ke-i dan hari panen ke-j
µ
= rata-rata nilai proksimat dan antioksidan sesungguhnya
αi
= pengaruh perlakuan penambahan EMS ke-i
βj
= pengaruh waktu panen ke-j
(αβ)ij = pengaruh perlakuan ke-i dan ke-j
εijk
= pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j pada satuan percobaan ke-k
Kedua rancangan ini diolah dengan menggunakan software SAS. Data yang
diperoleh dianalisis menggunakan Analisis of Variance (ANOVA) two way
dengan tingkat kepercayaan 95% dan taraf α 0.05 serta dilakukan uji lanjut
dengan uji Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi Sel Mutagenesis Dunaliella sp.
Pada penelitian ini kultivasi mikroalga yang dikombinasikan dengan
penambahan EMS berhasil dilakukan. Konsentrasi EMS yang diberikan pada
setiap perlakuan berpengaruh terhadap ukuran sel hasil kultur dan kandungan
kimia mikroalga. Pengaruh senyawa kimia Etil Metan Sulfonat (EMS) terhadap
mikroalga Dunaliella sp. secara kualitatif dapat dilihat dari ukuran sel yang
berbeda.
2 µm
2 µm
(a)
2 µm
(b)
(c)
Gambar 1 Ukuran sel Dunaliella sp. perbesaran 1000x pada kultivasi (a) EMS
0.1 M, (b) EMS 0.5 M, dan (c) Kontrol
6
Gambar 1 merupakan pengamatan sel mikroalga menggunakan mikroskop
elektron dengan perbesaran 1000x. Sel Dunaliella sp. perlakuan EMS 0.1 M
berukuran 11.09 µm, EMS 0.5 M berukuran 3.89 µm, dan kontrol berukuran 4.09
µm. Penambahan EMS 0.1 M terhadap kultivasi Dunaliella sp. dapat
menghasilkan ukuran sel mikroalga yang lebih besar dibandingkan dengan dua
perlakuan lainnya. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Aranez
(1981) yaitu, mikroalga spesies Scenedesmus yang diberikan perlakuan EMS
memiliki ukuran sel dua kali dan tiga kali dari sel normal. Namun pemberian
EMS 0.5 M tidak berpengaruh terhadap ukuran sel mikroalga Dunaliella sp. Hal
ini disebabkan karena Dunaliella sp. rentan terhadap konsentrasi 0.5 M.
Perlakuan penambahan EMS 0.5 M memiliki pigmen sel berwarna hijau
terang. Pigmen yang berwarna hijau terang ini menunjukkan bahwa kandungan
klorofil pada sel tersebut rendah, sehingga menyebabkan kepadatan sel perlakuan
EMS 0.5 M juga rendah. Dalam kondisi kultur yang normal mikroalga spesies
Dunaliella sp. memiliki warna yang hijau terang. Sedangkan mikroalga yang telah
mengalami mutasi memiliki pigmen warna yang lebih gelap. Hal ini sesuai
dengan penelitian Solomon dan Crane (1968) yaitu, Chlorella yang bermutasi
memiliki warna sel yang lebih gelap dibandingkan spesies asli. Selain itu kondisi
kultur pada perlakuan penambahan EMS mengalami stress sehingga dapat
meningkatkan produksi pigmen pada mikroalga (Pisal dan Lele 2005).
Kepadatan Sel Dunaliella sp.
Kultivasi skala 10 ml merupakan tahap awal dari proses kultur mikroalga
Dunaliella sp. Grafik kultivasi skala 10 ml memperlihatkan kepadatan sel
tertinggi terdapat pada perlakuan EMS 0.1 M dengan nilai rata-rata kepadatan sel
sebesar 4.85x106 sel/ml, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan kontrol dengan
nilai rata-rata 4.48x106 sel/ml dan EMS 0.5 M dengan nilai rata-rata kepadatan sel
sebesar 2.66x106 sel/ml. Grafik kepadatan sel mikroalga spesies Dunaliella sp.
pada skala 10 ml disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 10 ml
7
Gambar 2 menjelaskkan bahwa kepadatan sel terendah dimiliki oleh
perlakuan EMS 0.5 M, hal ini diduga karena saat induksi EMS 0.5 M dilakukan
jumlah kematian sel mikroalga mengalami peningkatkan hingga 60%. Hal ini
diduga karena sifat senyawa EMS sangat asam sehingga dapat menurunkan pH
dan ditandai dengan perubahan warna media kultur menjadi putih. Pada proses
inkubasi, jumlah sel cenderung tidak bertambah atau berkurang sehingga dapat
disimpulkan bahwa keadaan mikroalga tersebut berada pada fase dorman.
Penambahan EMS dapat mempengaruhi kondisi derajat keasaman (pH) awal
kultur. Laju fotosintesis akan terbatas oleh penurunan karbon dan tingginya nilai
pH Dengan demikian perlakuan pada EMS 0.5 M mengalami fase dormansi,
sehingga dapat menghambat pertumbuhan sel.
Scale up dilakukan setiap umur kultur mikroalga mencapai hari ke-8. Scale
up bertujuan untuk mendapatkan hasil panen yang lebih besar. Grafik kepadatan
sel mikroalga spesies Dunaliella sp. skala 400 ml dan 20 liter disajikan pada
Gambar 3 dan Gambar 4.
Gambar 3 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 400 ml
Gambar 3 menunjukkan bahwa pada saat penambahan skala kultivasi 400
ml, perlakuan kontrol memiliki kepadatan sel yang lebih tinggi jika dibandingkan
dengan perlakuan penambahan EMS. Kepadatan sel terendah dimiliki oleh
perlakuan EMS 0.5 M. Kepadatan sel perlakuan kontrol memiliki puncak
kepadatan sel pada hari ke-4 sebesar 22.6x106 sel/ml, sedangkan kepadatan sel
perlakuan EMS 0.1 M terus mengalami peningkatan dengan puncak tertinggi
kepadatan pada hari ke-5 sebesar 10.68 x 106 sel/ml. Chaturvedi dan Fujita (2006)
menyatakan bahwa mikroalga spesies mutan memiliki laju pertumbuhan dan
kepadatan yang rendah dibandingkan dengan spesies asli (wild type). Pada
penelitian ini sebelum dilakukannya scale up, pH awal perlakuan kontrol dan
EMS 0.1 M adalah 7, sedangkan EMS 0.5 M adalah 2.
8
Gambar 4 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 20 liter
Gambar 4 menunjukkan bahwa dengan penambahan volume skala kultivasi
20 liter dapat menurunkan jumlah kepadatan sel mikroalga spesies Dunaliella sp.
Hal ini diduga karena pada saat kultivasi skala 20 L, bibit mikroalga Dunaliella
sp. yang digunakan sedang berada pada fase kematian. Salah satu faktor yang
menentukan lamanya fase adaptasi adalah umur kultur yang digunakan sebagai
inokulum (Prihantini et al. 2005). Gambar kultivasi skala 20 L dapat dilihat pada
Lampiran 2.
Hasil uji statistika menunjukkan bahwa pemberian EMS dengan konsentrasi
0.1 M dan 0.5 M dapat mempengaruhi kepadatan sel mikroalga spesies Dunaliella
sp. pada tingkat signifikasi 5%. Hasil uji analysis of variance (ANOVA) RAL
memperlihatkan bahwa nilai-P
MIKROALGA SPESIES Dunaliella sp.
AMELIA SALINA GUSTINI
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*1
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pengaruh Etil Metan
Sulfonat (EMS) Terhadap Mikroalga Spesies Dunaliella sp. adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Amelia Salina Gustini
NIM C54100052
*
Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB
harus didasarkan pada kerja sama yang terkait
ABSTRAK
AMELIA SALINA GUSTINI. Pengaruh Etil Metan Sulfonat (EMS) Terhadap
Mikroalga Spesies Dunaliella sp. Dibimbing oleh MUJIZAT KAWAROE dan
ADRIANI SUNUDDIN.
Mikroalga spesies Dunaliella sp. memiliki potensi yang besar untuk
dimanfaatkan sebagai bahan pakan maupun pangan sehingga dapat dijadikan
sebagai komoditi hasil perairan alternatif. Etil metan sulfonat (EMS) merupakan
suatu teknik mutagenesis yang banyak digunakan untuk meningkatkan produksi
mikroalga. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis pengaruh pemberian EMS
terhadap mikroalga spesies Dunaliella sp. Metode yang digunakan yaitu dengan
cara menambahkan EMS konsentrasi 0.1 M dan 0.5 M pada tahap awal kultivasi
mikroalga. Analisis yang dilakukan untuk mengetahui pengaruh dari penambahan
EMS yaitu dengan pengamatan ukuran sel, kepadatan sel, karakteristik proksimat,
karakteristik asam lemak dan aktivitas antioksidan mikroalga spesies Dunaliella
sp. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi 0.1 M memiliki ukuran sel tiga kali
lebih besar dari ukuran sel kontrol dan memiliki persentase asam lemak yang
lebih tinggi. Sedangkan perlakuan yang ditambahkan EMS memiliki laju
pertumbuhan dan aktivitas antioksidan yang rendah dibandingkan dengan
perlakuan kontrol.
Kata kunci: Dunaliella sp., Etil Metan Sulfonat, Mikroalga
ABSTRACT
AMELIA SALINA GUSTINI. Effect of Ethyl Methane Sulfonate (EMS) on
Microalgae Species Dunaliella sp. Supervised by MUJIZAT KAWAROE and
ADRIANI SUNUDDIN.
Microalgae species Dunaliella sp. has great potential to be used as feed or
food ingredients that can be used as an alternative commodities waters. Ethyl
methane sulfonate (EMS) mutagenesis is a technique that is widely used to
increase the production of microalgae. The purpose of this study was to analyze
the effect of EMS on the species microalgae Dunaliella sp. The method used is by
adding EMS concentration of 0.1 M and 0.5 M in the early stages of cultivation of
microalgae. The analysis conducted to determine the effect of the addition of EMS
is the observation cell size, cell density, proximate characteristics, characteristics
of fatty acid and antioxidant activity of species microalgae Dunaliella sp. EMS
concentration of 0.1 M has a cell size three times larger than the cell size control
and have a percentage of higher fatty acids. Meanwhile the EMS treatment had
low in growth rate and antioxidant activity compared to the control treatment.
Keywords: Dunaliella sp., Etil Metan Sulfonat, Microalgae
PENGARUH ETIL METAN SULFONAT (EMS) TERHADAP
MIKROALGA SPESIES Dunaliella sp.
AMELIA SALINA GUSTINI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Ilmu Kelautan
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul Skripsi: Pengamh Etil Metan Sulfonat (EMS) Terhadap Mikroalga Spesies
Dunaliella sp.
Nama
: Amelia Salina Gustini
NIM
: C54100052
Disetujui oleh
\
Adriani Sunuddin, SPi, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
1 5 APR 2015
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
rahmat dan karunia-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan pada bulan September hingga bulan
Desember 2014 ini ialah hidrobiologi, dengan judul “Pengaruh Etil Metan
Sulfonat (EMS) Terhadap Mikroalga Spesies Dunaliella sp.”
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Mujizat Kawaroe, MSi dan
Adriani Sunuddin, SPi, MSi selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Bapak Dr Ir I Wayan Nurjaya, MSc selaku ketua
Departemen, Bapak Dr Ir Henry M Manik, ST selaku Ketua Komisi Pendidikan
S1 ITK, Bapak Beginer Subhan, SPi, MSi selaku dosen penguji dan seluruh staf
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan untuk angkatan Ilmu dan Teknologi Kelautan tahun 2010, Safirah
Tassa, Wida Novasari, Marina Novasari, Abu Rizhal, Nandike Ayudiah Poetri,
Fitrianti Sofyan, Deni Yan Koesyana, Nurlita Putri, atas dukungan dan
bantuannya serta ayah, ibu, seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2015
Amelia Salina Gustini
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE
2
Lokasi dan Waktu Penelitian
2
Prosedur Penelitian
2
Analisis Data
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Morfologi Sel Mutagenesis Dunaliella sp.
5
Kepadatan Sel Dunaliella sp.
6
Karakteristik Mikroalga Spesies Dunaliella sp.
8
Karakteristik Senyawa Asam Lemak Mikroalga Dunaliella sp.
10
Aktivitas Antioksidan Kultur Dunaliella sp.
11
KESIMPULAN DAN SARAN
12
Kesimpulan
12
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
27
DAFTAR TABEL
1 Fisikokimiawi (%) mikroalga spesies Dunaliella sp.
2 Senyawa asam lemak Dunaliella sp.
3 Aktivitas antioksidan (%) mikroalga Dunaliella sp.
9
10
12
DAFTAR GAMBAR
1 Ukuran sel Dunaliella sp. perbesaran 1000x (a) Kontrol, (b) EMS 0.1
M, dan (c) EMS 0.5 M
2 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 10 ml
3 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 400 ml
4 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 20 liter
5 Pengujian aktivitas antioksidan Dunaliella sp. metode DPPH
5
6
7
8
11
DAFTAR LAMPIRAN
1 Metode analisis proksimat
2 Dokumentasi kegiatan
3 Uji statistik kepadatan sel pada media kultur 400 ml
4 Uji statistik kepadatan sel pada media kultur 20 liter
5 Uji statistik kadar air
6 Uji statistik kadar abu
7 Uji statistik kadar lemak
8 Uji statistik kadar protein
9 Identifikasi asam lemak Dunaliella sp.
10 Nilai absorbansi Dunaliella sp. metode DPPH
11 Uji statistik aktivitas antioksidan
16
18
20
20
20
21
22
22
24
26
26
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikroalga merupakan mahluk hidup berukuran mikroskopis yang dapat
hidup baik di air tawar maupun air laut. Organisme ini merupakan tumbuhan
paling primitif yang lebih dikenal dengan sebutan fitoplankton. Zat pigmen
klorofil yang dimiliki oleh mikroalga mampu melakukan fotosintesis seperti
tumbuhan tingkat tinggi lainnya sehingga menyebabkan mikroalga berperan
sebagai produsen di wilayah perairan. Selain itu mikroalga laut merupakan materi
organik dalam laut sehingga dapat dijadikan salah satu komponen pembentukan
minyak bumi di dasar laut (Kawaroe et al. 2010).
Dunaliella sp. merupakan salah satu jenis mikroalga yang termasuk dalam
kelas alga hijau, pergerakannya motil dengan dua flagella sama panjang.
Umumnya bentuk sel dari Dunaliella sp. adalah bulat dengan ukuran lebar 4-15
µm dan panjang 6-25 µm, tetapi tergantung fase pertumbuhan atau kondisi
lingkungan. Pada umumnya bentuk sel Dunaliella sp. simetris radial dan sebagian
berbentuk simetris bilateral, pipih, bagian atas melengkung atau sedikit asimetris.
(Gonzalez et al. 2009). Dunaliella sp. dapat ditemukan di air tawar maupun air
laut dan sebagian danau bersalinitas tinggi di seluruh dunia. Suhu, salinitas dan
nutrisi merupakan faktor pembatas bagi pertumbuhan dan perkembangan
Dunaliella sp.
Mikroalga jenis Dunaliella sp. memiliki potensi yang besar untuk
dimanfaatkan sebagai bahan pakan maupun pangan sehingga dapat dijadikan
sebagai komoditi hasil perairan alternatif. Kebanyakan spesies mikroalga
menghasilkan produk yang khas seperti asam lemak, antioksidan dan karotenoid
(Hossain et al. 2008). Dunaliella sp. merupakan salah satu mikroalga yang cukup
banyak diteliti karena kandungan karotenoid dan gliserol nya yang tinggi.
Kandungan kimiawi seperti protein, asam amino, vitamin, polisakarida dan
karbohidrat yang diekstrak dari mikroalga telah digunakan untuk bahan makanan.
Selain untuk pakan maupun pangan, mikroalga dapat dimanfaatkan sebagai
penghasil bahan bakar alternatif atau biofuel.
Sampai saat ini masih dilakukan penelitian untuk mendapatkan jenis
mikroalga yang mampu menghasilkan biomassa yang tinggi untuk menunjang
proses tahap selanjutnya. Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk
meningkatkan biomassa mikroalga adalah dengan teknik mutagenesis. Teknik
mutagenesis terbagi menjadi dua, yaitu mutagen fisik maupun senyawa kimia.
Mutagen fisik yang biasa digunakan adalah sinar-x dan sinar gamma, sedangkan
senyawa kimia adalah Kolkisin, Etil Metan Sulfonat (EMS), dan Etilen Oksida.
EMS merupakan senyawa mutagen yang paling sering digunakan dalam
mutagenesis kimia karena memiliki efektivitas mutasi dan sifat mutageniknya bisa
hilang setelah mengalami reaksi hidrolisis dengan air (Harten 1998). Oleh karena
itu, penelitian ini dilakukan dengan tujuan menganalisis pengaruh dari pemberian
EMS terhadap mikroalga spesies Dunaliella sp.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh pemberian Etil Metan
Sulfonat (EMS) terhadap mikroalga spesies Dunaliella sp.
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama bulan September hingga Desember 2014, di
Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC), Pusat Studi Biofarmaka,
LPPM, Laboratorium Bioprospecting, Ilmu dan Teknologi Kelautan, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Pangan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.
Prosedur Penelitian
Kultivasi Mikroalga
Kultivasi dilakukan pada skala laboratorium dengan perbandingan 1:3 yaitu
sebanyak 100 ml inokulan Dunaliella sp. ditambahkan air laut steril 300 ml, dan
tambahkan pupuk walne sebagai media. Sel Dunaliella sp. dikultivasi di dalam
erlenmeyer 500 ml dan diletakkan dalam rak kultur dengan pemberian areasi dan
penerangan cahaya lampu 1000 lux selama 24 jam.
EMS Mutagenesis
Setelah umur kultivasi mencapai fase logaritmik, sampel mikroalga diambil
untuk dimutasi menggunakan Etil Metan Sulfonat (Sigma USA) dan dikocok
dengan stabil menggunakan stirer magnetik selama 60 menit. EMS yang
digunakan yaitu konsentrasi 0.1 M dan 0.5 M untuk dilihat perbandingannya.
Setelah itu sampel mikroalga yang telah diberikan EMS dibilas sebanyak 3 kali
ulangan dengan air laut steril untuk menghilangkan EMS yang tersisa pada
mikroalga. Selanjutnya sampel tersebut ditambahkan kembali dengan pupuk
walne dan di separasi untuk masing-masing perlakuan (EMS 0.1 M, EMS 0.5 M
dan kontrol) ke dalam tabung reaksi 10 ml. Mikroalga dipelihara selama 7 hari
dan dihitung kepadatan selnya sebelum diseleksi. Tabung yang terseleksi
kemudian dikultivasi kembali pada skala yang lebih besar (scaling up).
Pemanenan Mikroalga
Pemanenan mikroalga dilakukan saat umur mikroalga mencapai fase
stasioner dan kematian dengan cara filtrasi menggunakan vacuum pump dan
kertas whatman berdiameter 90 mm. Biomassa mikroalga yang tersaring
dikeringkan menggunakan oven di bawah suhu 105 °C selama ± 1 jam.
Ekstraksi Lemak
Sampel kering ditimbang sebanyak 1-2 gram, dibungkus dalam selongsong
yang sebelumnya telah dimasukkan kapas bebas lemak. Kemudian sampel
3
tersebut dimasukkan ke dalam tabung soxhlet dan tambahkan zat kimia Heksan
sebagai pelarut ekstraksi selama 6 jam (Bligh dan Dyer 1959). Ekstrak lemak
didestilasi menggunakan soxhlet, kemudian oven lemak yang terekstrak dengan
suhu 105 °C selama kurang lebih 1 jam dan selanjutnya ditimbang untuk
mendapatkan kadar lemak.
Perhitungan Kepadatan Sel
Perhitungan kepadatan sel Dunaliella sp. pada setiap perlakuan dilakukan
setiap hari dengan menggunakan mikroskop elektron dengan perbesaran 10x dan
haemocytometer. Setiap perhitungan dilakukan dengan mencacah 5 lapang
pandang masing- masing 4 kali pengulangan. Sel yang telah tercacah selanjutnya
dihitung dengan menggunakan formula sebagai berikut :
Kepadatan sel (sel/ml) =
(1)
Keterangan:
n
= Jumlah sel yang teramati
Penentuan Kadar Air (AOAC 1995)
Keringkan cawan porselen yang digunakan selama 1 jam dalam oven pada
suhu 105 °C, lalu didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Sebanyak 23 gram sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan untuk dikeringkan
dalam oven selama 4-6 jam pada suhu 105 °C. Selanjutnya cawan tersebut
didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Persamaan kadar air terdapat
pada Lampiran 1.
Penentuan Kadar Abu (AOAC 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 2-3 gram dan dimasukkan ke dalam cawan
porselen yang telah diketahui beratnya. Setelah itu cawan dimasukkan ke dalam
tanur listrik tipe 1400 fumace dengan suhu 600 °C selama 4-6 jam sampai terjadi
pengabuan sempurna. Kemudian diangkat dan didinginkan dalam desikator lalu
ditimbang sampai konstan. Persamaan kadar abu terdapat pada Lampiran 1.
Penentuan Kadar Protein Kasar
Timbang sampel sebanyak 0.51 gram dan masukkan ke dalam labu kjeldahl
100 ml. Tambahkan 2 gram campuran selen dan 25 ml H2SO4 pekat kemudian
panaskan di atas pemanas listrik atau api pembakar sekitar 2 jam sampai mendidih
dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan. Dinginkan, kemudian encerkan dan
masukkan ke dalam labu ukur 100 ml, tepatkan sampai tanda garis. Pipet 5 ml
larutan dan dimasukkan ke dalam alat penyuling dan tambahkan 5 ml NaOH 30%
dan beberapa indikator PP. Sulingkan selama 10 menit, sebagai penampung
gunakan 10 ml larutan asam borat 2% yang telah dicampur indikator. Kemudian
titrasi dengan larutan HCl 0.001 N. Persamaan kadar protein kasar terdapat pada
Lampiran 1.
Esterifikasi
Sebanyak 2 gram lemak diekstraksi dengan heksana yang disaponifikasi
oleh 25 ml 0.5 M NaOH Metanol. Kemudian, 300 mg sampel lemak yang
disaponifikasi direaksikan dengan 8 ml BF3-metanol dan dipanaskan selama 3-4
menit. Setelah itu, ditambahkan Petroleum Ether (60 °C) sebanyak 2-3 ml untuk
4
memisahkan ester. Sampel ditambahkan NaCl untuk mengapungkan senyawa
asam lemak ke atas labu kemudian analisis dengan alat GC-MS (Prommuak et al.
2012)
Metode Kromatografi Gas–Spektrometri Massa (GC-MS)
Analisis kromatografi gas–spektrometri massa (Gas Chromatography –
Mass Spectrometry/ GC-MS) menggunakan kromatografi gas Shimadzu QP2010
yang dilengkapi dengan kolom silika DB-5 ms (panjang 30 m; 0.25 mm diameter
dalam; dan 0.25 µm ketebalan lapis film) serta helium sebagai gas pendorong.
Kromatografi gas memiliki batas deteksi 0.001 ppb. Kromatografi gas
menggunakan mode injeksi split dengan rasio 1 : 200. Suhu oven kromatografi
gas di program dari 80 °C dibiarkan konstan selama 2 menit, kemudian dinaikkan
210 °C dengan kecepatan 10°/menit dibiarkan konstan selama 1 menit, kemudian
dinaikkan lagi 280 °C dengan kecepatan 6 °C/menit dibiarkan konstan selama 5
menit. Kondisi GC-MS adalah ionisasi potensial/ electron energy 70eV, ion
source temperature 250 °C dan interface temperature 280 °C. Full mass data
dicatat antara 50 – 400 Dalton setiap detik. Waktu retensi dari 0 sampai 32.67
menit. Kemudian data dicatat dan dianalisis dengan peragkat lunak GC-MS Real
Time Analysis dan GCMS Postrun Analysis.
Uji Aktivitas Antioksidan
Larutan 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate (DPPH) disiapkan dengan
melarutkan 0.004 gram DPPH dalam 100 ml metanol (Romeilad et al. 2010; Das
et al. 2011). 1 ml mikroalga disentrifuse dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu
4 °C selama 15 menit, kemudian endapan diekstraksi dengan 1 ml etanol
kemudian vortex dengan kecepatan stabil. Ekstrak didiamkan pada suhu 4 °C
selama 4 jam dan tambahkan 2 ml larutan DPPH. Kemudian campuran diinkubasi
selama 30 menit di dalam ruang gelap suhu kamar. Sampel blanko (larutan etanol)
merupakan kontrol. Hitung absorbansi pada panjang gelombang 517 nm dengan
menggunakan spektrofotometer. Persamaan uji aktivitas antioksidan terdapat pada
Lampiran 1.
Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
rancangan acak lengkap (RAL) untuk kepadatan sel dan rancangan acak lengkap
faktorial (RALF) untuk uji proksimat dan aktivitas antioksidan (Walpole 1993).
Rancangan acak lengkap dilakukan terhadap kultur mikroalga dengan perbedaan
perlakuan kontrol, EMS 0.1 M dan EMS 0.5 M. Model rancangannya :
Yij = µ + i + εij
(2)
Keterangan :
Yij
= nilai pengamatan perlakuan ke-i, kelompok ke-j
µ
= rata-rata umum
= (µ i-µ) = pengaruh aditif perlakuan ke-i
i
εij
= galat percobaan dari perlakuan ke-i ulangan ke-j dengan εij ~ σ (0, 2)
5
Rancangan acak lengkap faktorial (RALF) dengan tiga kali ulangan
dilakukan pada uji proksimat dan aktivitas antioksidan. Faktor pertama adalah
perlakuan kontrol, EMS 0.1 M, dan EMS 0.5 M. Faktor kedua adalah hari panen
yaitu pada saat fase stasioner dan fase kematian. Model rancangannya adalah
sebagai berikut :
Yijk = µ + αi + βj + αβij + ε1(ij
(3)
Keterangan :
Yijk
= nilai proksimat dan antioksidan ke-k yang memperoleh kombinasi
perlakuan penambahan EMS ke-i dan hari panen ke-j
µ
= rata-rata nilai proksimat dan antioksidan sesungguhnya
αi
= pengaruh perlakuan penambahan EMS ke-i
βj
= pengaruh waktu panen ke-j
(αβ)ij = pengaruh perlakuan ke-i dan ke-j
εijk
= pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j pada satuan percobaan ke-k
Kedua rancangan ini diolah dengan menggunakan software SAS. Data yang
diperoleh dianalisis menggunakan Analisis of Variance (ANOVA) two way
dengan tingkat kepercayaan 95% dan taraf α 0.05 serta dilakukan uji lanjut
dengan uji Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi Sel Mutagenesis Dunaliella sp.
Pada penelitian ini kultivasi mikroalga yang dikombinasikan dengan
penambahan EMS berhasil dilakukan. Konsentrasi EMS yang diberikan pada
setiap perlakuan berpengaruh terhadap ukuran sel hasil kultur dan kandungan
kimia mikroalga. Pengaruh senyawa kimia Etil Metan Sulfonat (EMS) terhadap
mikroalga Dunaliella sp. secara kualitatif dapat dilihat dari ukuran sel yang
berbeda.
2 µm
2 µm
(a)
2 µm
(b)
(c)
Gambar 1 Ukuran sel Dunaliella sp. perbesaran 1000x pada kultivasi (a) EMS
0.1 M, (b) EMS 0.5 M, dan (c) Kontrol
6
Gambar 1 merupakan pengamatan sel mikroalga menggunakan mikroskop
elektron dengan perbesaran 1000x. Sel Dunaliella sp. perlakuan EMS 0.1 M
berukuran 11.09 µm, EMS 0.5 M berukuran 3.89 µm, dan kontrol berukuran 4.09
µm. Penambahan EMS 0.1 M terhadap kultivasi Dunaliella sp. dapat
menghasilkan ukuran sel mikroalga yang lebih besar dibandingkan dengan dua
perlakuan lainnya. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Aranez
(1981) yaitu, mikroalga spesies Scenedesmus yang diberikan perlakuan EMS
memiliki ukuran sel dua kali dan tiga kali dari sel normal. Namun pemberian
EMS 0.5 M tidak berpengaruh terhadap ukuran sel mikroalga Dunaliella sp. Hal
ini disebabkan karena Dunaliella sp. rentan terhadap konsentrasi 0.5 M.
Perlakuan penambahan EMS 0.5 M memiliki pigmen sel berwarna hijau
terang. Pigmen yang berwarna hijau terang ini menunjukkan bahwa kandungan
klorofil pada sel tersebut rendah, sehingga menyebabkan kepadatan sel perlakuan
EMS 0.5 M juga rendah. Dalam kondisi kultur yang normal mikroalga spesies
Dunaliella sp. memiliki warna yang hijau terang. Sedangkan mikroalga yang telah
mengalami mutasi memiliki pigmen warna yang lebih gelap. Hal ini sesuai
dengan penelitian Solomon dan Crane (1968) yaitu, Chlorella yang bermutasi
memiliki warna sel yang lebih gelap dibandingkan spesies asli. Selain itu kondisi
kultur pada perlakuan penambahan EMS mengalami stress sehingga dapat
meningkatkan produksi pigmen pada mikroalga (Pisal dan Lele 2005).
Kepadatan Sel Dunaliella sp.
Kultivasi skala 10 ml merupakan tahap awal dari proses kultur mikroalga
Dunaliella sp. Grafik kultivasi skala 10 ml memperlihatkan kepadatan sel
tertinggi terdapat pada perlakuan EMS 0.1 M dengan nilai rata-rata kepadatan sel
sebesar 4.85x106 sel/ml, kemudian dilanjutkan dengan perlakuan kontrol dengan
nilai rata-rata 4.48x106 sel/ml dan EMS 0.5 M dengan nilai rata-rata kepadatan sel
sebesar 2.66x106 sel/ml. Grafik kepadatan sel mikroalga spesies Dunaliella sp.
pada skala 10 ml disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 10 ml
7
Gambar 2 menjelaskkan bahwa kepadatan sel terendah dimiliki oleh
perlakuan EMS 0.5 M, hal ini diduga karena saat induksi EMS 0.5 M dilakukan
jumlah kematian sel mikroalga mengalami peningkatkan hingga 60%. Hal ini
diduga karena sifat senyawa EMS sangat asam sehingga dapat menurunkan pH
dan ditandai dengan perubahan warna media kultur menjadi putih. Pada proses
inkubasi, jumlah sel cenderung tidak bertambah atau berkurang sehingga dapat
disimpulkan bahwa keadaan mikroalga tersebut berada pada fase dorman.
Penambahan EMS dapat mempengaruhi kondisi derajat keasaman (pH) awal
kultur. Laju fotosintesis akan terbatas oleh penurunan karbon dan tingginya nilai
pH Dengan demikian perlakuan pada EMS 0.5 M mengalami fase dormansi,
sehingga dapat menghambat pertumbuhan sel.
Scale up dilakukan setiap umur kultur mikroalga mencapai hari ke-8. Scale
up bertujuan untuk mendapatkan hasil panen yang lebih besar. Grafik kepadatan
sel mikroalga spesies Dunaliella sp. skala 400 ml dan 20 liter disajikan pada
Gambar 3 dan Gambar 4.
Gambar 3 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 400 ml
Gambar 3 menunjukkan bahwa pada saat penambahan skala kultivasi 400
ml, perlakuan kontrol memiliki kepadatan sel yang lebih tinggi jika dibandingkan
dengan perlakuan penambahan EMS. Kepadatan sel terendah dimiliki oleh
perlakuan EMS 0.5 M. Kepadatan sel perlakuan kontrol memiliki puncak
kepadatan sel pada hari ke-4 sebesar 22.6x106 sel/ml, sedangkan kepadatan sel
perlakuan EMS 0.1 M terus mengalami peningkatan dengan puncak tertinggi
kepadatan pada hari ke-5 sebesar 10.68 x 106 sel/ml. Chaturvedi dan Fujita (2006)
menyatakan bahwa mikroalga spesies mutan memiliki laju pertumbuhan dan
kepadatan yang rendah dibandingkan dengan spesies asli (wild type). Pada
penelitian ini sebelum dilakukannya scale up, pH awal perlakuan kontrol dan
EMS 0.1 M adalah 7, sedangkan EMS 0.5 M adalah 2.
8
Gambar 4 Grafik kepadatan sel Dunaliella sp. pada media kultur 20 liter
Gambar 4 menunjukkan bahwa dengan penambahan volume skala kultivasi
20 liter dapat menurunkan jumlah kepadatan sel mikroalga spesies Dunaliella sp.
Hal ini diduga karena pada saat kultivasi skala 20 L, bibit mikroalga Dunaliella
sp. yang digunakan sedang berada pada fase kematian. Salah satu faktor yang
menentukan lamanya fase adaptasi adalah umur kultur yang digunakan sebagai
inokulum (Prihantini et al. 2005). Gambar kultivasi skala 20 L dapat dilihat pada
Lampiran 2.
Hasil uji statistika menunjukkan bahwa pemberian EMS dengan konsentrasi
0.1 M dan 0.5 M dapat mempengaruhi kepadatan sel mikroalga spesies Dunaliella
sp. pada tingkat signifikasi 5%. Hasil uji analysis of variance (ANOVA) RAL
memperlihatkan bahwa nilai-P