14
III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai September 2009. Penelitian meliputi penanganan dan preservasi sampel dilakukan di Laboratorium
Budidaya Jurusan Perikanan dan Kelautan Fakultas Sains dan Teknik Universitas Jenderal Soedirman UNSOED Purwokerto Jawa Tengah. Histologi dilakukan di
Laboratorium Struktur Pengembangan Hewan Fakultas Biologi UNSOED. Sedangkan penentuan kadar steroid dilakukan di Laboratorium Hormon Unit
Reproduksi dan Kebidanan FKH IPB Bogor.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan singgaringan betina dengan kisaran bobot 32,50 – 69,50 g dan jantan dengan
kisaran 27,17 – 49,67 g, berasal dari sungai Clawing Kab. Purbalingga yang merupakan hasil tangkapan dari alam, minyak cengkeh untuk anestesi ikan
sehingga memudahkan dalam pengambilan darahmengurangi stres, ethylene diamine tetra acetic acid EDTA sebagai antikoagulan, larutan bouin-hollande
untuk preparasi histologi, larutan hematosiklin eosin menjadi preparat, pakan berupa cacing darah beku, H
2
SO
4
pekat, akuades, MnSO
4
, Na
2
S
2
O
3
, indikator phenolphtalein, koh KI untuk titrasi O
2
CO
2
dan kit EIA Estradiol E2. Sedangkan peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 9 bak
kayu dengan ukuran 150x80x60 cm yang dilapisi terpal biru, heater T ±
1
o
C, lampu PE 20 Watt intensitas cahaya 12 lux Lampiran 27, lux meter untuk
mengukur intensitas cahaya lampu, serok, aerasi, pompa air, timer sebagai pengatur pencahayaan, plastik penutup bak perlakuan kedap cahaya, disetting set,
cawan petri, timbangan analitik ketelitian ± 0,001 g, baki, gelas ukur, serta mikrotom. Mikroscop kamera untuk mengamati preparat, pengukuran bobot
menggunakan timbangan elektrik dan timbangan Ohaus ketelit ian 0,1 g, milimeter blok untuk pengukuran panjang tubuh, tabung eppendorf tempat plasma
darah, freezer -20
o
C sebagai tempat penyimpanan sampel segar, sentrifuge, dan enzym linked immunoasorbent assays ELISA.
15
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimen dengan menggunakan rancangan acak lengkap faktorial 2 kombinasi perlakuan yaitu foto dan thermal = fotothermal,
yang terdiri atas 9 perlakuan, sebagai ulangan 3 individu ikan diambil setiap sampling. Untuk jelasnya dapat dilihat pada Tabel 1 dibawah ini.
Tabel 1. Perlakuan fotothermal yang dicobakan Kode Perlakuan
Keterangan T
L Temperatur dan durasi pencahayaan alami
T L
1
Temperatur alami dan durasi pencahayaan 10T :14G T
L
2
Temperatur alami dan durasi pencahayaan 14T :10G T
1
L Temperatur 25
o
C dan durasi pencahayaan alami T
1
L
1
Temperatur 25
o
C dan durasi pencahayaan 10T:14G T
1
L
2
Temperatur 25
o
C dan durasi pencahayaan 14T:10G T
2
L Temperatur 30
o
C dan durasi pencahayaan alami T
2
L
1
Temperatur 30
o
C dan durasi pencahayaan 10T:14G T
2
L
2
Temperatur 30
o
C dan durasi pencahayaan 14T:10G
3.3.1. Ikan Uji
Ikan uji diperoleh dengan bantuan nelayan setempat menggunakan perahu kondisi hidup, dikumpulkan dalam keramba kecil, jika jumlah sampel telah
mencukupi kemudian dibawa ke laboratorium, untuk selanjutnya diaklimatisasi dan diadaptasikan kedalam bak penampung sebelum dimasukkan kedalam bak
penelitian.
3.3.2. Wadah Penelitian
Wadah penelitian yang digunakan adalah bak kayu yang telah dilapisi terpal plastik, masing-masing ditutupi dengan plastik polybag, satu perlakuan
memerlukan satu wadah, dan temperatur air distabilkan dengan menggunakan heater kecuali untuk T0
,
wadah dipasang sebuah lampu sumber cahaya kecuali L0, lampu digantungkan dengan ketinggian 1,5 m dari permukaan air. Bak
percobaan diisi air hingga kedalaman 40 cm kapasitas 500 L, dengan sistem resirkulasi tertutup agar tidak perlu dilakukan pergantian air.
3.3.3. Padat Tebar
Padat tebar ikan 12 ekorwadah rasio betina : jantan = 1:1, dengan asumsi tidak turut memberi pengaruh positif terhadap perkembangan gonad ikan,
16 ikan diberi pakan blood worm dengan jumlah yang sama, frekuensi pemberian 3
kali sehari pagi, siang dan sore secara adlibitum.
3.3.4. Pengaturan Temperatur
Sebelum ikan dimasukkan kedalam wadah perlakuan, terlebih dahulu dilakukan aklimatisasi. Temperatur air media dipertahankan sesuai perlakuan
yang diinginkkan dengan heather dan semua perlakuan fotoperiode yang berbeda diatur dengan timer mulai jam 08.00 pagi. Selanjutnya sebagai pendukung
dilakukan pengukuran fisika dan kimia air seperti temperatur, oksigen terlarut dan karbondioksida bebas Lampiran 1.
3.4. Parameter yang dievaluasi 1 Ukuran Morfologis
Sebelumnya ikan sebagai sampel diambil secara acak masing-masing 3 ekor, kemudian dipingsankan, dan diukur bobot tubuh g dan panjang total cm.
2 Koleksi Plasma Darah
Darah diambil dari bagian bawah sirip punggungdiatas sirip dada menggunakan spuit injeksi 1 mL yang sudah diisi antikoagulan. Darah yang
diperoleh ditampung di dalam tabung reaksi, dimasukkan kedalam icebox, disentrifugasi dengan kecepatan rendah 3000 rpm selama 15 menit, kemudian
plasmanya ditampung dalam tabung ependorf dan diberi label sesuai dengan nomor sampel dan jenis perlakuan, disimpan dalam freezer -20
o
C hingga waktunya dianalisis. Langkah selanjutnya ikan sampel dibedah untuk melihat
indeks morfoanatomi seperti ;
3 Indeks Gonadosomatik IGS
Gonad yang didapat ditimbang, dan selanjutnya dikalkulasikan untuk mendapatkan persentase. IGS individu ikan dihitung dengan persamaan Effendie,
1997 ; Bobot Gonad g
IGS = x 100 Bobot Tubuh g
17 Indeks ini mencerminkan perkembangan gamet ovariumtestis, di mana
jika nilainya semakin tinggi maka perkembangan gonadnya juga semakin maju De Vlaming et al. 1982 dalam Sulistyo et al. 2008.
4 Indeks Hepatosomatik IHS
Hati yang didapat ditimbang, kemudian dikalkulasikan untuk mendapatkan persentase. IHS individu ikan dihitung dengan persmaan Sulistyo et al. 2000 ;
Bobot Hati g IHS = x 100
Bobot Tubuh g Evaluasi ini dilakukan karena diduga ada keterkaitan organ hati
khususnya pada ikan betina sebagai sumber materi pada proses vitellogenesis. Sheikh-Eldin et al. 1995 menjelaskan bahwa organ hati merupakan organ
penimbun cadangan energi dan akan dibongkar untuk mendukung perkembangan oosit. Cadangan energi dalam hati ini selanjutnya baru akan dipergunakan untuk
mendukung kegiatan pemijahan jika deposit energi pada organ lain tidak mencukupi. Selain itu, tingginya nilai IHS ini juga dikarenakan adanya akumulasi
steroid Estradiol-17ß pada organ hati yang berfungsi untuk mensintesis vitellogenin selama masa vitellogenesis.
5 Indeks Viscerasomatik IVS
Organ visceral selain hati dan gonad yang didapat ditimbang, selanjutnya dikalkulasikan. IVS individu ikan dihitung dengan persamaan Sulistyo et al.
1998 ; Bobot Visceral g
IVS = x 100 Bobot Tubuh g
Menurut Sulistyo 1998 bahwa visceral adalah organ dalam ikan selain gonad dan hati. Evaluasi ini dilakukan karena diduga ada kaitan organ visceral
jaringan lemak sebagai sumber utama energi untuk mendukung perkembangan gonad.
18
6 Histologi
Pembuatan preparat histologi dilakukan dengan metode parafin Kiernan, 1990. Proses pemotongan dilakukan dengan menggunakan mikrotom, dimana
untuk preparat jaringan testis dipotong dengan ketebalan 6 mikron Lampiran 2.
-Penghitungan proporsi setiap tahapan perkembangan oosit
Tahapan perkembangan oosit pada ovarium senggaringan ditentukan menurut Wijayanti et al. 2004. Secara garis besar oosit dik lasifikasikan ; tahap
previtellogenesis, vitellogenesis awal, vitellogenesis pertengahan, vitellogenesis akhir dan maturasi. Jumlah oosit pada masing-masing tahap perkembangan
dihitung dengan mengevaluasi histologi ovarium bagian anterior, median dan posterior, untuk setiap preparat diamati dalam 3 lapang pandang, setiap lapang
pandang dihitung jumlah setiap tahapan sel pada oogenesis. Oosit pada masing- masing tahapan kemudian dipresentasekan terhadap jumlah total oosit yang
diamati. Proporsi oosit pada masing-masing tahapan perkembangan X dihitung dengan rumus :
oosit pada tahap tertentu X = x 100
oosit yang diamati ∑
∑
7 Analisa Kadar Hormon
Analisis kadar hormon dalam plasma darah dilakukan dengan metode ELISA sesuai protokol yang terdapat dalam kit estradiol produk GB Lampiran 3.
8 Fekunditas
Gonad yang telah didapat, fekunditasnya dihitung dengan cara mengambil sebagian gonad yang telah disimpan dalam larutan gilson, kemudian ditimbang
dan dicatat, selanjutnya dihitung jumlah telur didalamnya. F dihitung dengan pendekatan Cerda et al. 1994 ;
Wg x S
F = Ws
∑ dimana ; F : fekunditas mutlak, Wg : berat gonad g,
∑ S : jumlah telur sebagian,
Ws : berat gonad sebagian g. Merupakan satu mata rantai penghubung satu generasi dengan generasi berikutnya
dan terkait persoalan stock rekrutmen serta produksi.
19
3.5. Analisis Data
Kategori