4 Mengetahui pengaruh pupuk daun dan air kelapa untuk substitusi sumber hara dan ZPT pada medium MS pada multiplikasi transforman.
METODE PENELITIAN A. Regenerasi transforman kedelai subkultur dan multiplikasi
Kalus atau tunas kedelai hasil transformasi diperbanyak pada medium MS + 0,3 mgl NAA + 2 mgl BAP sesuai prosedur George dan Sherrington Pierik, 1987. Seluruh
tahapan multiplikasi dilakukan dalam kondisi aseptis dan diinkubasi pada pencahayaan sekitar 1000 lux dengan transmission light fase gelap 8 jam dan fase terang 16 jam serta
suhu 25-28 C.
B. Isolasi dan penentuan konsentrasi coat protein SMV
a. Isolasi dan penentuan konsentrasi crude protein kalus transforman kedelai Kalus seberat 2-5 gram dilumatkan dengan penambahan buffer 5mM
Sodiumphosphat 0,14 N NaCl pH 7 dingin. Selanjutnya siap disentrifugasi dengan microcentrifuge MSE pada kecepatan 10.000 g selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh disimpan dalam 4 C. Konsentrasi crude protein ditentukan berdasarkan serapan
sinar ultraviolet panjang gelombang 280 nm dan 260 nm Robyt White, 1987. C. Analisis coat protein SMV dengan metode Elektroforesis SDS-PAGE
Gel akrilamid terdiri atas resolving gel 15 10 ml larutan stok akrilamid : bisakrilamid 30 : 0,8 + 7,4 ml Tris-HCl 1 M pH 8,6 + 0,2 ml SDS 10 + 1 ml APS 1,5
+ 1,36 ml akuades + 10 µl TEMED, segera dimasukkan ke slab gel vertikal setinggi 5 cm dan stacking gel 3. Selanjutnya ditambahkan butanol untuk menutup permukaan
larutan agar permukaan rata dan menghilangkan gelembung udara. Gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30 - 60 menit. Setelah padat maka resolving gel
dibersihkan dengan menyemprot akuades ke permukaan gel. Stacking gel 2,8 ml larutan stok akrilamid : bisakrilamid 30 : 0,8 + 1,66 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8 + 0,14 ml SDS 10
+ 0,66 ml APS 1,5 + 8,2 ml akuades + 8 µl TEMED. Campuran dituang di atas resolving gel dengan cepat, kemudian sisir dipasang dan gel dibiarkan berpolimerisasi
selama 30-40 menit sehingga siap digunakan. Sampel protein yang akan dipisahkan ditambah dengan sampel bufer 2X, dipanaskan selama 2 menit, setelah itu larutan sampel
dimasukkan ke dalam sumuran pada gel yang telah terbentuk. Elektroforesis protein SDS- PAGE dijalankan pada voltase 80 V selama kurang lebih 1 jam hingga batas bawah gel.
Setelah selesai gel direndam dalam coomase blue untuk pewarnaan dan digoyang selama
semalam dan dilakukan desstaining hingga pita-pitanya dapat dilihat dengan jelas dan dapat diketahui berat molekulnya.
D. Analisis coat protein SMV dengan metode Immunoblotting- antibodi poliklonal Pengujian ini terdiri atas tahapan : transfer membran, blocking, pengujian antibodi,
pengujian anti-antibodi conjugate dan pewarnaan. Transfer gel ke membran dilakukan setelah protein dielektroforesis pada SDS-PAGE dan direndam transfer bufer selama 30
menit. Membran nitrosellulosa dipotong sesuai ukuran gel dan diberi tanda untuk menentukan posisi sumuran, lalu direndam transfer buffer bersama-sama dengan fiber
pads. Setelah 30 menit, gel disusun dalam Trans-blot SD Semi-dry Transfer Cell dengan urutan dari bawah sebagai berikut : fiber pad +, membran nitrosellulosa, gel, fiber pad -
, diratakan agar tidak ada gelembung. Trans-blot SD Semi-dry Transfer Cell ditutup. Blotting dijalankan pada voltase 20 V selama 45 menit. Blocking dilakukan supaya gel
tertutup larutan blocking sehingga pita protein yang sudah diberi antigen dapat terdeteksi. Sebelum dilakukan blocking dengan larutan BSA 1 dalam TTBS-tween 0,05 ,
membran yang telah diblot dengan protein dari gel direndam dengan transfer bufer salin TBS 1X selama 5 menit. Membran direndam pada larutan blocking selama 60 semalam
pada suhu 4 C tanpa penggoyangan. Selanjutnya larutan blocking dibuang dan membran
dicuci dengan larutan Tween transfer bufer salin TTBS selama 10 menit dengan penggoyangan pada suhu kamar lalu larutan TTBS dibuang. Pengujian antibodi dilakukan
dengan merendam membran pada larutan antibodi pertama dan selanjutnya membran diinkubasi selama 120 menit dengan penggoyangan pada suhu kamar. Membran dicuci
dengan TTBS dua kali, masing-masing 5 menit dan selanjutnya TTBS dibuang. Pengujian anti-antibodi conjugate dilakukan dengan merendam membran pada larutan antibodi ke
dua anti-Rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dengan penggoyangan. Setelah inkubasi, larutan antibodi ke dua dibuang dan
membran dicuci dengan TTBS dua kali, masing-masing 5 menit, kemudian dicuci dengan larutan TBS satu kali 5 menit. Deteksi hasil reaksi dilakukan dengan merendam membran
di dalam larutan colour developer BCIPNBT sampai terbentuk warna ungu pada membran. Reaksi pewarnaan kemudian dihentikan dengan merendam membran dalam
akuades selama 10 menit.
E. Optimasi medium regenerasi untuk induksi akartunas transforman
