semalam dan dilakukan desstaining hingga pita-pitanya dapat dilihat dengan jelas dan dapat diketahui berat molekulnya.
D. Analisis coat protein SMV dengan metode Immunoblotting- antibodi poliklonal Pengujian ini terdiri atas tahapan : transfer membran, blocking, pengujian antibodi,
pengujian anti-antibodi conjugate dan pewarnaan. Transfer gel ke membran dilakukan setelah protein dielektroforesis pada SDS-PAGE dan direndam transfer bufer selama 30
menit. Membran nitrosellulosa dipotong sesuai ukuran gel dan diberi tanda untuk menentukan posisi sumuran, lalu direndam transfer buffer bersama-sama dengan fiber
pads. Setelah 30 menit, gel disusun dalam Trans-blot SD Semi-dry Transfer Cell dengan urutan dari bawah sebagai berikut : fiber pad +, membran nitrosellulosa, gel, fiber pad -
, diratakan agar tidak ada gelembung. Trans-blot SD Semi-dry Transfer Cell ditutup. Blotting dijalankan pada voltase 20 V selama 45 menit. Blocking dilakukan supaya gel
tertutup larutan blocking sehingga pita protein yang sudah diberi antigen dapat terdeteksi. Sebelum dilakukan blocking dengan larutan BSA 1 dalam TTBS-tween 0,05 ,
membran yang telah diblot dengan protein dari gel direndam dengan transfer bufer salin TBS 1X selama 5 menit. Membran direndam pada larutan blocking selama 60 semalam
pada suhu 4 C tanpa penggoyangan. Selanjutnya larutan blocking dibuang dan membran
dicuci dengan larutan Tween transfer bufer salin TTBS selama 10 menit dengan penggoyangan pada suhu kamar lalu larutan TTBS dibuang. Pengujian antibodi dilakukan
dengan merendam membran pada larutan antibodi pertama dan selanjutnya membran diinkubasi selama 120 menit dengan penggoyangan pada suhu kamar. Membran dicuci
dengan TTBS dua kali, masing-masing 5 menit dan selanjutnya TTBS dibuang. Pengujian anti-antibodi conjugate dilakukan dengan merendam membran pada larutan antibodi ke
dua anti-Rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dengan penggoyangan. Setelah inkubasi, larutan antibodi ke dua dibuang dan
membran dicuci dengan TTBS dua kali, masing-masing 5 menit, kemudian dicuci dengan larutan TBS satu kali 5 menit. Deteksi hasil reaksi dilakukan dengan merendam membran
di dalam larutan colour developer BCIPNBT sampai terbentuk warna ungu pada membran. Reaksi pewarnaan kemudian dihentikan dengan merendam membran dalam
akuades selama 10 menit.
E. Optimasi medium regenerasi untuk induksi akartunas transforman
Kalus yang telah disubkultur dan dimultiplikasi kemudian diinduksi untuk beregenerasi membentuk tunas atau akar. Untuk itu dilakukan optimasi medium terbaik yang dapat
menginduksi tunas atau akar dengan Kanamycin 50 mgl sebagai marker seleksi. Optimasi medium regenerasi dilakukan dalam kondisi aseptis dan diinkubasi pada pencahayaan
sekitar 1000 lux dengan transmision light fase gelap 8 jam dan fase terang 16 jam serta suhu 25-28
C. Perlakuan medium yang dicobakan adalah :
C. MS + 0,3 mgl NAA + 2 mgl BAP E. MS + 0,5 mgl NAA + 3 mgl BAP
F. MS + 0,1 mgl NAA + 1 mgl BAP G. MS0
H. MS + 0,5 mgl NAA + 3 mgl Kinetin I. MS + 0,5 mgl NAA + 5 mgl BAP
J. MS + 3 mgl BAP
F. Substitusi medium pemeliharaan dengan pupuk daun dan air kelapa
Kalus kedelai hasil transformasi yang diperoleh dari multiplikasi, selanjutnya diperbanyak pada medium MS sesuai prosedur George dan Sherrington Pierik, 1987 yang
disubstitusi dengan pupuk daun Hyponek ditambah NAA dan BAP dan air kelapa dengan Kanamycin sebagai penanda seleksi. Perlakuan medium :
K. MS + 0,5 mgl NAA + 3 mgl BAP + 20 air kelapa L. MS + 0,5 mgl NAA + 2 mgl BAP + 20 air kelapa
M. MS + 0,5 mgl NAA + 1 mgl BAP + 20 air kelapa N. MS + 0,5 mgl NAA + 20 air kelapa
O. Hyponek + 0,5 mgl NAA + 3 mgl BAP + 20 air kelapa P. Hyponek + 0,5 mgl NAA + 2 mgl BAP + 20 air kelapa
Q. Hyponek + 0,5 mgl NAA + 1 mgl BAP + 20 air kelapa R. Hyponek + 0,5 mgl NAA + 20 air kelapa
Seluruh tahapan substitusi medium multiplikasi dilakukan dalam kondisi aseptis dan diinkubasi pada pencahayaan sekitar 1000 lux dengan transmision light fase gelap 8 jam
dan fase terang 16 jam serta suhu 25-28 C.
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Regenerasi Transforman Kedelai cp-SMV
Transformasi dilakukan menggunakan 200 eksplan dan diseleksi dalam medium medium MS + 2 mgl BAP + 0,3 mgl NAA yang ditambah Kanamycin. Hasil seleksi
dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Jumlah dan persentase transforman kedelai cp-SMV berkalus
selama regenerasi dari 200 eksplan
Tahap Kegiatan Jumlah isolat
Isolat berkalus
Kultur Skrining Kanamycin 151
75,50 Subkultur I
60 39,70
Subkultur II 20
10,00 Subkultur III
8 4,00
Subkultur IV 6
3,00 Subkultur V
6 3,00
Subkultur VI 6
3,00 Subkultur VII
6 3,00
Dari 200 eksplan yang diseleksi, 151 isolat berhasil membentuk kalus dalam medium berisi Kanamycin 75,5. Kalus yang telah tersisipi gen cp- SMV kemudian
diisolasi DNAnya untuk mendeteksi keberhasilan transformasi. Dari 151 isolat, yang diisolasi DNAnya sebanyak 21 isolat 13,9 . Dari 21 DNA yang dideteksi PCR dan
menunjukkan kalus tersisipi gen cp-SMV sebanyak 11 isolat 5,5 . Sementara kalus juga disubkultur untuk menyuplai hara dan dimultiplikasi untuk memperbanyak kalus.
Kalus yang sudah ditransformasi tidak mudah mempertahankan pertumbuhannya, kalus mengalami browning yang kemudian berlanjut pada kematian kalus. Kalus bisa
dipertahankan kesegarannya antara 3 – 6 minggu dari inokulasi, sehingga kalus harus disubkultur dan dilakukan sampai 7 kali selama sekitar 7 bulan untuk memperoleh kalus
yang akan diisolasi protein dan diregenerasi lebih lanjut. Keberhasilan kalus beregenerasi dan membelah cukup rendah, karena dari 21 transforman, hanya 6 isolat 3 yang dapat
bertahan hidup dan diperbanyak yaitu transforman S11, S17, 24, 33, 35 dan 40. Sementara itu menurut Wattimena 1992 keberhasilan transformasi genetik kedelai menggunakan
metode mikroproyektil sebesar 2 persen . Isolat yang membentuk kalus dan bertahan hidup sampai subkultur VII kemudian
dikembangkan untuk mendapatkan kalus dalam jumlah banyak. Hasil multiplikasi dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Multiplikasi kalus transforman kedelai cp-SMV
Kemampuan multiplikasi kalus cenderung rendah, karena dari 1 botol koleksi isolat transforman rata-rata hanya dapat diperbanyak menjadi 2 botol koleksi, kecuali pada
transforman nomor S11 yang dapat diperbanyak sampai 64 botol koleksi pada subkultur III, meskipun kemampuan multiplikasinya menurun pada subkultur IV menjadi 16 botol
koleksi dan meningkat lagi pada subkultur V. Keberhasilan subkultur dan multiplikasi menurun karena komposisi medium dan ZPT yang digunakan sama dengan medium untuk
induksi kalus awal, sehingga kalus mengalami stagnasi pertumbuhan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Gunawan 1987 bahwa subkultur beruntun pada medium yang sama
menyebabkan pertumbuhan eksplan mengalami stagnasi.
B. Isolasi dan Penentuan Konsentrasi coat protein SMV
