Potensi Ekstrak Daun Kayu Manis Cinnamomum burmanni Untuk Meningkatkan Respons Imun Ikan Patin Pangasianodon hypopthalmus Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila
POTENSI EKSTRAK DAUN KAYU MANIS Cinnamomum
burmanni UNTUK MENINGKATKAN RESPONS IMUN IKAN
PATIN Pangasianodon hypopthalmus YANG DIINFEKSI
Aeromonas hydrophila
SAFRATILOFA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Potensi ekstrak daun
kayu manis Cinnamomum burmanni untuk meningkatkan respons imun ikan patin
Pangasianodon hypopthalmus yang diinfeksi Aeromonas hydrophila” adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis
lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, April 2015
Safratilofa
NIM C15112021
RINGKASAN
SAFRATILOFA. Potensi Ekstrak Daun Kayu Manis Cinnamomum burmanni
Untuk Meningkatkan Respons Imun Ikan Patin Pangasianodon hypopthalmus
Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh DINAMELLA
WAHJUNINGRUM, DEDI JUSADI dan MIA SETIAWATI.
Salah satu patogen penyebab timbulnya penyakit pada usaha budidaya
ikan patin adalah bakteri Aeromonas hydrophila yang dapat menyebabkan
penyakit Motile Aeromonads Septicaemia (MAS). Peningkatan daya imunitas
benih yang digunakan merupakan salah satu pendekatan untuk mendukung
keberhasilan budidaya ikan patin. Imunitas yang baik akan dapat mengurangi
kematian pada masa awal penebaran benih pada tahap pembesaran. Salah satu
alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan memberikan suatu bahan alami
yang dapat meningkatkan respons imun ikan terhadap infeksi patogen yang
menyerang serta ramah lingkungan. Tanaman yang diketahui berpotensi sebagai
antibakteri berbasis bahan nabati adalah tumbuhan kayu manis Cinnamomum
burmanni. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari daya antibakteri ekstrak
daun kayu manis C. burmanni terhadap A. hydrophila dan menguji potensi
ekstrak daun kayu manis untuk meningkatkan respons imun ikan patin dalam
pencegahan dan pengendalian MAS
Penelitian terdiri atas dua tahap, yaitu uji antibakteri ekstrak daun kayu
manis secara in vitro dan uji ekstrak daun kayu manis dalam meningkatkan
respons imun ikan patin yang diinfeksi A. hydrophila. Pada uji daya antibakteri
ekstrak daun kayu manis dosis yang diujikan yaitu 0%, 0,25%, 0,5% dan 1%
dengan modifikasi metode macrodilution. Pada pengujian ekstrak daun kayu
manis untuk meningkatkan respons imun ikan patin dibagi menjadi dua tahap
yaitu tahap sebelum uji tantang dan tahap uji tantang. Pada tahap sebelum uji
tantang ikan patin diberi pakan dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 0%,
0,5% dan 1%. Parameter yang diamati pada tahap sebelum uji tantang meliputi
jumlah konsumsi pakan, bobot awal, bobot akhir, laju pertumbuhan harian,
kelangsungan hidup dan gambaran darah (total eritrosit, kadar hemoglobin, kadar
hematokrit, total leukosit, aktivitas fagositik dan aktivitas respiratory burst)
yang diamati pada hari ke-0 dan hari ke-14. Pada tahap uji tantang perlakuan
yang diberikan ada enam perlakuan dengan tiga ulangan. Perlakuan pencegahan
0,5% dan 1%, perlakuan pengendalian 0,5% dan 1% serta kontrol negatif dan
positif. Uji tantang dilakukan pada hari ke-16. Parameter yang diamati yaitu
gambaran darah yang diamati pada hari ke-0, 1, 3, 6 dan 10 dan parameter
kelangsungan hidup yang diamati setiap hari setelah uji tantang.
Hasil yang diperoleh pada uji antibakteri ekstrak daun kayu manis secara
in vitro yaitu pada dosis 0,5% dan 1% tidak ada pertumbuhan bakteri A.
hydrophila. Hasil penelitian pada tahap sebelum uji tantang menunjukkan bahwa
penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5% dalam pakan memberikan hasil yang
lebih baik dibandingkan dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 1% dan
berbeda nyata (p0,05) dengan kontrol. Pada tahap uji tantang perlakuan pengendalian
dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5% merupakan hasil terbaik.
Pada perlakuan pengendalian 0,5% kelangsungan hidup ikan patin mencapai
100%, sedangkan pada kontrol positif hanya 63,33% dan memberikan hasil
terbaik pada semua parameter gambaran darah. Pengamatan histopatologi
menunjukkan bahwa pada perlakuan penambahan ekstrak daun kayu manis,
terjadi kerusakan organ ginjal dan hati yang lebih ringan dibandingkan perlakuan
kontrol positif. Kesimpulannya adalah ekstrak daun kayu manis lebih dari 0,5%
dapat menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila dan penambahan ekstrak
daun kayu manis 0,5% dalam pakan dapat meningkatkan respons imun ikan patin
dan dapat digunakan sebagai pencegahan dan pengendalian penyakit MAS.
Kata kunci: Aeromonas hydrophila, Cinnamomum burmanni, Pangasianodon
hypopthalmus, respons imun
SUMMARY
SAFRATILOFA. The Potency of Cinnamon Cinnamomum burmanni Leaves
Extract to Enhance Immune Response of Striped Catfish Pangasianodon
hypopthalmus Infected by Aeromonas hydrophila. Supervised by DINAMELLA
WAHJUNINGRUM, DEDI JUSADI and MIA SETIAWATI.
One of pathogens causing the emergence of the diseases in catfish
cultivation is Aeromonas hydrophila which can cause Motile Aeromonads
Septicaemia (MAS) disease. The immunity improvement of fingerlings is one of
the approach to support the success of catfish culture. A better immunity will be
able to reduce the mortality in initial stocking in grow out stage. One of
alternatives that can be done is by giving a natural material which can enhance
fish immune responses to pathogen and also environmental friendly. In the
previous studies about the addition of cinnamon leaves into fish feed in the form
of cinnamon leaves simplisia have been done. There is no study that using
cinnamon leaves in extract form. The benefits of the extract form have higher
active material compound and more stable than the raw material. The aimed of
this study was to examine antibacterial activity of cinnamon leaves extract of C.
burmanni to A. hydrophila and to examine the potency of cinnamon leaves extract
to enhance immune response of catfish in preventing and controlling MAS
This study include two steps, the first was antibacterial test of cinnamon
leaves extract in vitro and the second step was test of cinnamon leaves extract in
enhancing immune response of catfish infected by A. hydrophila. In antibacterial
activity test of cinnamon leaves extract, the doses were 0%, 0,25%, 0,5% and 1%
with modification of macrodilution method. In the cinnamon leaves extract test to
enhance immune responses of catfish divided into two periods rearing period and
challenge test period. In the rearing period, catfish were fed by feed which was
added with cinnamon leaves extract 0%, 0,5% and 1%. The parameters observed
in the rearing period were feed intake, weight gain, daily growth rate, survival rate
and hematology (total erythrocyte, hemoglobin content, hematocrit, total
leukocyte, phagocytic activity and respiratory burst that observed on day 0 and
day 14). In the challenge test period, the experimental design used was
completely randomized design (CRD) with six treatments and three replication.
The preventing treatments were 0,5% (A) and 1% (B), the controlling treatments
0,5% (C) and 1% (D), negative control and positive control. The challenge test
was done in day 16. The parameters observed were hematology that observed on
day 0, 1, 3, 6 and 10 and survival rate observed every day post-challenge test.
The results in the antibacterial activity test of cinnamon leaves extract in
vitro was no any growth of A. hydrophila on the dose of 0.5 and 1%. On the other
hand, in the rearing period showed that the addition of 0,5% cinnamon leaves
extract in the feed gave the better results than the addition of 1% cinnamon leaves
extract and significantly different (p0.05) with controls. In the challenge test period of controlling
treatment by the addition of 0.5% cinnamon leaves extract was the best results. In
the controlling treatment of 0.5%, the survival rate of catfish was 100% while in
the positive control was only 63.33% and gave the best results on all of
hematological parameters. Histopathology examination showed that on the
addition cinnamon leaver extract treatment, there were organ damage in kidney
and liver was lower than positive control. In conclusion, cinnamon leaves extract
more than 0.5% could suppress the growth of A. hydrophila and the addition of
0.5% cinnamon leaves extract in the feed could increase catfish immune response
and able to be used for preventing and controlling of MAS disease.
Keywords: Aeromonas hydrophila, Cinnamomum burmanni, immune response,
Pangasianodon hypopthalmus.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
POTENSI EKSTRAK DAUN KAYU MANIS Cinnamomum
burmanni UNTUK MENINGKATKAN RESPONS IMUN IKAN
PATIN Pangasianodon hypopthalmus YANG DIINFEKSI
Aeromonas hydrophila
SAFRATILOFA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:Dr Sri Nuryati, SPi, MSi
Judul Tesis : Potensi Ekstrak Daun Kayu Manis Cinnamomum burmanni Untuk
Meningkatkan Respons Imun Ikan Patin Pangasianodon
hypopthalmus Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila
Nama
: Safratilofa
NIM
: C151120221
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi
Ketua
Dr Ir Dedi Jusadi, MSc
Anggota
Dr Ir Mia Setiawati, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Widanarni, MSi
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga tesis yang berjudul “Potensi Ekstrak Daun Kayu
Manis Cinnamomum burmanni Untuk Meningkatkan Respons Imun Ikan Patin
Pangasianodon hypopthalmus Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila” berhasil
diselesaikan. Tesis ini bersumber dari hasil penelitian yang dilaksanakan pada
bulan Desember 2013-Juli 2014 bertempat di Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan secara khusus
kepada Ibu Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi, Bapak Dr Ir Dedi jusadi, MSc
dan Ibu Dr Ir Mia Setiawati, MSi selaku dosen pembimbing atas waktu,
kebijaksanaan, tuntunan, kesabaran, memberikan semangat dan keteladanan untuk
bekerja keras serta masukan hingga tesis ini dapat diselesaikan. Ibu Dr Sri
Nuryati, SPi, MSi sebagai dosen penguji luar komisi dan Bapak Dr Alimuddin,
SPi MSc selaku ketua program studi atas segala saran yang diberikan sehingga
tesis ini lebih berkualitas.
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi atas bantuan
dana Beasiswa Pendidikan Pascasarjana dan biaya penelitian yang diperoleh dari
dana penelitian BOPTN DIKTI. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian
dasar untuk bagian Desentralisasi Unggulan Perguruan Tinggi Institut Pertanian
Bogor dengan judul penelitian “Evaluasi Daun Kayu Manis Cinnamomum
burmanni didalam Pakan Terhadap Kinerja Pertumbuhan, Status Kesehatan dan
Kualitas Daging Ikan” dengan ketua pelaksana Dr Ir Mia Setiawati.
Terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu serta memberikan
masukan dan ide yang membangun, teman-teman mahasiswa Program Studi Ilmu
Akuakultur angkatan 2012 atas kekompakan serta motivasinya, teman-teman
Laboratorium Kesehatan Ikan, teman-teman Ilmu Akuakultur angkatan 2013,
adik-adik S1 angkatan 47 dan angkatan 48, Pak Ranta, Dendi Hidayatullah, Pak
Henda, Pak Manawan dan semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
Penulis juga mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada
orang tua penulis Ayahanda Sabri dan Razali, Ibunda Rosmaeti dan Amak
Dasnawati atas keteladanan, semangat untuk selalu pantang menyerah,
kelembutan hati, kesederhanaan hidup yang diajarkannya, serta dorongannya
untuk terus mencari ilmu dan menyampaikan pada sesama. Suamiku Mardianto,
ananda Zahroni Hanifa dan ananda Ajit Afif Aito atas semangat dan cintanya.
Ibuk Dusmaeli, Mama Darningsih, Ibu mertua, Adik-adikku, serta seluruh
keluarga, atas segala do’a, dukungan, pengertian dan kasih sayang yang tulus
selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2015
Safratilofa
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
1
2
2
2
3
2 METODE PENELITIAN
Materi Uji
Prosedur Penelitian
Parameter Penelitian
Analisis Data
3
3
6
9
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
10
19
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
23
23
DAFTAR PUSTAKA
23
LAMPIRAN
27
RIWAYAT HIDUP
30
DAFTAR TABEL
1 Hasil uji in vitro ekstrak daun kayu manis
2 Hasil uji fitokimia ekstrak daun kayu manis
3 Jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot akhir (Wt), laju
pertumbuhan harian (LPH) dan kelangsungan hidup (KH) ikan uji pada
tahap sebelum uji tantang
10
11
12
DAFTAR GAMBAR
1 Jadwal pemberian pakan ikan patin dan uji tantang menggunakan A.
hydrophila
2 Daya hambat ekstrak daun kayu manis terhadap pertumbuhan bakteri A.
hydrophila pada berbagai konsentrasi. Kontrol (A); dosis ekstrak daun
kayu manis 0,25% (B); 0,5% (C); 1% (D).
3 Gambaran darah ikan patin pada tahap sebelum uji tantang. Total
eritrosit (a); kadar hemoglobin (b); kadar hematokrit (c); total leukosit
(d), aktivitas fagositosis (e) dan aktivitas respiratory burst (f)
4 Total eritrosit ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
5 Kadar hemoglobin ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
6 Kadar hematokrit ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
7 Total leukosit ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
8 Aktivitas fagositik ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
9 Aktivitas respiratory burst ikan patin selama uji tantang dengan A.
hydrophila. Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan
ekstrak daun kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan
dosis 0,5% (A); 1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C);
1% (D).
10 Kelangsungan hidup ikan patin uji setelah uji tantang dengan A.
hydrophila. Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan
6
10
12
13
14
14
15
16
16
ekstrak daun kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan
dosis 0,5% (A); 1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C);
1% (D).
11 Histopatologi ginjal dan hati ikan patin setelah uji tantang dengan A.
hydrophila. Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan
ekstrak daun kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan
dosis 0,5% (A); 1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C);
1% (D).
17
18
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji karakterisasi bakteri A. hydrophila dengan metode kit API 20 E
2 Hasil uji LD50 A. hydrophila terhadap ikan patin
3 Pembuatan preparat histopatologi
27
28
29
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu penyakit yang sering menyerang usaha budidaya ikan patin
Pangasianodon hypopthalmus adalah Motile Aeromonads Septicaemia (MAS)
yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. Penyakit MAS ini
dikenal sebagai penyakit bercak merah (Angka et al. 2004) dan menyerang ikan
budidaya yang dapat mengakibatkan kematian benih ikan patin hingga 80%
(Wartono et al. 2010). Gejala infeksi A. hydrophila meliputi pembengkakan
jaringan, perdarahan yang meluas pada permukaan kulit (haemorrhagic
septicemia), nekrosis, luka pada kulit hingga luka terbuka (ulcer) pada permukaan
tubuh atau hingga ke dalam jaringan (Mu et al. 2011; Pridgeon dan Klesius 2011)
Pada beberapa jenis ikan sering ditemukan gejala klinis seperti sirip punggung
dan sirip ekor rontok, serta pembengkakan pada perut dan berisi cairan (dropsy),
yang diikuti dengan kematian (Popma dan Masser 1999; Yuasa et al. 2003).
Peningkatan daya imunitas benih yang digunakan merupakan salah satu
pendekatan untuk mendukung keberhasilan budidaya ikan. Imunitas benih ikan
yang baik akan dapat mengurangi kematian pada masa awal penebaran benih pada
tahap pembesaran, karena pada tahap ini merupakan tahap yang rawan dengan
kematian ikan. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan
memberikan suatu bahan alami yang berasal dari tumbuhan (bahan nabati) dan
dapat meningkatkan respons imun ikan terhadap infeksi patogen yang menyerang
serta ramah lingkungan (Chakraborty dan Hancz, 2011). Tanaman yang diketahui
berpotensi sebagai antibakteri berbasis bahan nabati adalah tumbuhan kayu manis
Cinnamomum burmanni.
Kayu manis C. burmanni termasuk ke dalam vamili Lauraceae. Bagian dari
pohon kayu manis yang telah dimanfaatkan yaitu kulit batang dan daun. Kulit
dan batang kayu manis juga dapat diolah menjadi minyak atsiri. Kulit kayu manis
memiliki zat aktif seperti flavanoid, saponin, tanin dan alkanoid (Azima et al.
2004). Menurut Kumar et al. (2005), senyawa-senyawa kimia dari tumbuhan
dapat meningkatkan aktivitas sistem imun seperti senyawa flavonoid, fenolik,
alkaloid dan terpenoid. Hasil penelitian Rattanachaikunsopon dan Phumkhachorn
(2010), menyatakan bahwa minyak atsiri dari kulit kayu manis jenis
Cinnamomum verum mengandung sinamaldehid, limonene, cinamal asetat,
linalool dan α-terpineol; pada konsentrasi 20 µg/ml dapat menghambat
pertumbuhan Streptococcus iniae. Pemberian pakan yang mengandung minyak
atsiri kayu manis sebanyak 0,4% (w/w) ke ikan nila Oreochromis niloticus selama
lima hari menunjukkan adanya peningkatan respons imun ikan. Hal ini
ditunjukkan dengan tidak adanya kematian ikan yang terjadi setelah diuji tantang
dengan S. iniae. Chang et al. (2001) menyatakan bahwa minyak atsiri dari daun
kayu manis dengan dosis 250 µg/ml efektif menghambat pertumbuhan 9 jenis
bakteri yaitu Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA), Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp. dan
2
Vibrio parahemolyticus. Hasil penelitian Sufriadi (2006) menyatakan bahwa daun
kayu manis mengandung alkanoid, flavonoid, fenolik hidrokuinon, saponin dan
tanin.
Pada penelitian sebelumnya oleh Marlinda (2014), telah diteliti bahwa
penambahan daun kayu manis ke dalam pakan ikan dalam bentuk simplisia
sebanyak 1% dapat meningkatkan kinerja pertumbuhan ikan patin. Tepung daun
kayu manis yang ditambahkan melalui pakan ikan patin dengan dosis 0,5% dapat
memperbaiki tekstur daging dengan kandungan protein daging tinggi (Sakinah
2014). Namun belum ada penelitian yang meneliti pengaruh ekstrak daun kayu
manis terhadap respons imun ikan. Penggunaan ekstrak diduga lebih baik karena
kandungan bahan aktif lebih stabil dibanding pengunaan daun. Berdasarkan hal
tersebut perlu dilakukan penelitian mengenai potensi ekstrak daun kayu manis
sebagai bahan nabati yang dapat meningkatkan respons imun ikan patin,
mengingat daun kayu manis tersedia dalam jumlah yang melimpah dan belum
banyak dimanfaatkan.
Perumusan Masalah
Salah satu bakteri penyebab penyakit pada ikan adalah bakteri A.
hydrophila. Peningkatan daya imunitas benih yang akan digunakan dalam
budidaya ikan merupakan salah satu pendekatan dalam mendukung keberhasilan
budidaya ikan. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan
pemberian bahan alami yang dapat meningkatkan respons imun ikan patin.
Pemanfaatan bahan-bahan dari alam, yang salah satunya diketahui mengandung
senyawa antibakterial adalah daun kayu manis. Sudah dilakukan penelitian
mengenai potensi daun kayu manis dalam bentuk tepung terhadap kinerja
pertumbuhan dan kualitas daging ikan. Namun belum ada kajian tentang manfaat
daun kayu manis dalam bentuk ekstrak dan potensinya untuk meningkatkan
respons imun ikan patin. Dalam bentuk ekstrak diharapkan dapat memperoleh
bahan aktif yang lebih stabil dibandingkan dengan penggunaan daun. Selain itu
senyawa-senyawa dari tumbuhan diketahui juga dapat meningkatkan aktivitas
sistem imun. Untuk itu perlu diteliti lebih lanjut pemanfaatan ekstrak daun kayu
manis untuk meningkatkan respons imun ikan dan sebagai agen pengendali
bakteri pathogen, terutama pada ikan patin P. hypopthalmus.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi daya antibakteri ekstrak daun
kayu manis terhadap A. hydrophila. Penelitian ini juga menguji potensi ekstrak
daun kayu manis untuk meningkatkan respons imun ikan patin dalam pencegahan
dan pengendalian motile aeromonads septicaemia.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi bagi pembudidaya
ikan patin khususnya tentang ekstrak aditif berupa daun kayu manis yang dapat
3
digunakan untuk mencegah dan mengendalikan penyakit motile aeromonads
septicaemia sehingga dapat membantu pembudidaya untuk meningkatkan
produksinya.
Hipotesis
Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah penambahan ekstrak
daun kayu manis dalam pakan dapat meningkatkan respons imun serta dapat
mencegah dan mengendalikan infeksi bakteri A. hydrophila pada ikan patin P.
hypopthalmus .
2 METODE PENELITIAN
Materi Uji
Ikan uji yang digunakan adalah ikan patin yang berasal dari pembudidaya di
daerah Parung, Bogor dengan bobot rata-rata 6±0,26 g. Bakteri uji yang
digunakan adalah A. hydrophila yang berasal dari koleksi Laboratorium
Kesehatan Ikan(LKI), Departemen Budidaya Perairan (BDP), Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan (FPIK), Institut Pertanian Bogor (IPB). Sebelum digunakan,
dilakukan uji konfirmasi bakteri terlebih dahulu dengan media API 20 E yang
menunjukkan bahwa spesies bakteri yang digunakan adalah A. hydrophila
(Lampiran 1). Daun kayu manis yang digunakan adalah dari jenis Cinamomum
burmanni, yang diperoleh dari petani di kota Jambi. Daun kayu manis yang akan
digunakan dipilih daun yang tidak terlalu muda yaitu dimulai dari daun yang
kelima dari pucuk daun, kemudian daun dicuci bersih.
Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri atas dua prosedur utama, yaitu uji antibakteri ekstrak
daun kayu manis secara in vitro dan uji in vivo.
Uji antibakteri Ekstrak Daun Kayu Manis secara In Vitro
Uji in vitro dilakukan untuk menentukan dosis terbaik ekstrak daun kayu
manis dalam menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Dosis terbaik
digunakan dalam uji in vivo. Uji in vitro dilakukan di LKI, BDP, FPIK, IPB pada
bulan April 2014.
Daun kayu manis dikeringkan pada udara terbuka (kering udara) tanpa
terkena cahaya matahari langsung untuk menghindari kerusakan bahan aktif yang
terdapat pada daun kayu manis.
Pengeringan dilakukan sampai daun dapat
dihaluskan dan diayak untuk mendapatkan serbuk daun kayu manis. Metode
ekstraksi daun kayu manis yang digunakan pada penelitian ini merupakan
modifikasi metode yang dikembangkan oleh Prasad et al. (2009). Serbuk daun
4
kayu manis direndam dalam pelarut etanol 96% dengan perbandingan 1:10 (w/v)
kemudian dilakukan proses maserasi dengan pengadukan selama 24 jam. Hasil
maserasi didiamkan hingga terbentuk dua lapisan suspensi bahan. Lapisan atas
merupakan filtrat hasil maserasi dan disaring menggunakan kertas saring mesh
size sebesar ±0,6 mm sebagai filter pertama, sedangkan filter kedua menggunakan
kertas saring Whatman no 125. Lapisan kedua merupakan endapan simplisia
daun kayu manis yang kemudian ditambahkan kembali etanol 96% sebanyak 1000
ml dan dimaserasi selama 24 jam sambil diaduk. Setelah didiamkan dan
mengendap, filtrat kembali disaring dengan filter pertama dan filter kedua. Hal
ini dilakukan berulang sampai filtrat hasil maserasi menjadi bening. Filtrat hasil
maserasi kemudian diuapkan dengan menggunakan evaporator sampai didapat
ekstrak kental dan kemudian dikeringkan dengan metode freeze drying. Hasil
ekstraksi diperoleh dalam bentuk pasta kering sebanyak 12% kemudian disimpan
dalam lemari pendingin sampai waktu akan digunakan. Hasil ekstraksi metode
Freeze drying diambil sebanyak 5 g untuk diuji fitokimia guna melihat kandungan
zat aktif dari ekstrak daun kayu manis. Uji fitokimia dilakukan di Balai Penelitian
Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO) Bogor.
Uji antibakteri ekstrak daun kayu manis dilakukan dengan modifikasi
metode Macrodilution (NCLLS 2005). Tabung mikro diisi dengan akuades steril
dan ditambahkan ekstrak daun kayu manis hingga diperoleh konsentrasi sesuai
dengan dosis yang akan diuji yaitu 0,25%, 0,5% dan 1%. Tabung mikro untuk
kontrol diisi akuades sebanyak 0,9 ml tanpa ekstrak daun kayu manis. Masingmasing tabung mikro ditambahkan 0,1 ml suspensi bakteri, kemudian
dihomogenkan dan diinkubasi selama 24 jam. Pada hari kedua dari masingmasing campuran bakteri dengan ekstrak daun kayu manis diencerkan sampai 106
CFU/ml dan disebarkan pada media TSA sebanyak 50 µl selanjutnya diinkubasi
kembali selama 24 jam. Pada hari ketiga dihitung masing-masing jumlah koloni
yang tumbuh. Pada media TSA yang tidak menampakkan pertumbuhan bakteri,
menunjukkan bahwa dosis ekstrak daun kayu manis tersebut mampu menghambat
pertumbuhan A. hydrophila sehingga dapat digunakan untuk uji in vivo.
Uji In Vivo
Uji in vivo dilakukan untuk melihat potensi ekstrak daun kayu manis yang
diberikan melalui pakan sebagai pencegahan dan pengendalian terhadap infeksi A.
hydrophila.
Persiapan Ikan Patin
Ikan dipelihara dalam akuarium berukuran 60x30x40 cm3. Ikan ditebar
sebanyak 10 ekor/akuarium. Ikan diadaptasikan dan dipelihara selama 2 minggu
sebelum diberi perlakuan. Selama proses adaptasi, ikan diberi pakan komersial
sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore hari secara at satiation.
Persiapan Pakan
Pakan yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan penambahan
ekstrak daun kayu manis sebanyak 0%, 0,5%, dan 1%. Penambahan ekstrak daun
kayu manis ke dalam pakan dilakukan dengan metode repelleting. Untuk 1 kg
5
pakan, ekstrak daun kayu manis 0,5%, dan 1% masing-masing dilarutkan dengan
akuades sebanyak 200 ml, kemudian dicampurkan dengan putih telur sebanyak 20
ml sebagai perekat dan diaduk menggunakan mixer hingga homogen. Campuran
yang telah homogen ditambahkan pakan komersial protein 30% yang sudah
dihaluskan terlebih dahulu. Setelah campuran rata, bahan dicetak kembali
kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 35 °C selama 24 jam. Pelet yang
sudah kering kemudian disimpan dalam tempat yang kedap udara.
Uji LD50 A. hydrophila
Uji LD50 dilakukan untuk mengetahui tingkat kepadatan bakteri yang dapat
menyebabkan kematian ikan sebanyak 50% dari populasi. Hasil uji LD50
digunakan sebagai patokan kepadatan bakteri dalam uji in vivo. Ikan uji yang
digunakan sebanyak 8 ekor per akuarium, ikan uji diinjeksi dengan bakteri A.
hydrophila sebanyak 0,1 ml/ekor secara intramuskuler dengan kepadatan bakteri
106, 107, 108 dan 109 CFU/ml dan sebagai kontrol ikan diinjeksi dengan PBS
(phosphate buffer saline), masing-masing dilakukan sebanyak dua ulangan.
Selama uji LD50 ikan diberi pakan komersial. Diamati ikan yang mati pada
masing-masing akuarium selama 7 hari dan dilakukan penghitungan dengan
menggunakan rumus Reed dan Muench (1938). Berdasarkan hasil perhitungan
diperoleh nilai LD50 sebesar 108 CFU/ml (lampiran 2).
Uji Ekstrak Daun Kayu Manis secara In Vivo
Pada uji in vivo terbagi atas dua tahap yaitu tahap sebelum uji tantang dan
tahap uji tantang. Tahap sebelum uji tantang dimulai dari hari ke-0 sampai hari
ke-14, sedangkan tahap uji tantang dimulai dari hari ke-0 sampai hari ke-10
setelah uji tantang atau sama dengan hari ke-16 sampai hari ke-26. Selama uji in
vivo ikan diberi pakan uji sebanyak dua kali sehari yaitu pagi dan sore (07.00 dan
16.00 WIB) secara at satiation. Pakan uji diberikan selama 14 hari kemudian
dilakukan uji tantang dengan A. hydrophila pada hari ke-16. Pada perlakuan
pencegahan ikan di beri pakan uji selama 14 hari setelah uji tantang ikan diberi
pakan komersial. Sementara pada perlakuan pengendalian ikan diberi pakan uji
sebelum dan sesudah uji tantang. Pada kontrol negatif, pakan yang diberikan
adalah pakan komersial dan saat uji tantang diinjeksi dengan PBS, sedangkan
pada kontrol positif ikan diberi pakan komersial dan diinjeksi dengan bakteri A.
hydrophila. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak lima ulangan, tiga
ulangan untuk melihat pertambahan bobot dan kelangsungan hidup sedangkan dua
ulangan lainnya untuk parameter gambaran darah. Perlakuan selengkapnya dapat
dilihat pada Gambar 1. Kualitas air dijaga agar berada dalam kisaran optimal
untuk kehidupan ikan budidaya. Kualitas air selama penelitian yaitu suhu 2728 °C, pH 6,5 – 8,5, DO 4,5 – 6,6 mg/L dan TAN 0,4 – 0,93. Menurut Boyd
(1990) kualitas air untuk budidaya ikan aiir tawar yaitu oksigen terlarut > 5 mg/L,
suhu 24 – 30 °C, pH 6,5 – 9,5 dan total amonia nitrogen (TAN) < 0,52 ppm.
Kualitas air dijaga dengan memberi heater pada masing-masing akuarium, aerasi
sebagai penyuplai oksigen dan dilakukan pergantian air setiap tiga hari. Setiap
sisi akuarium ditutup dengan plastik berwarna hitam untuk menghindari stres pada
ikan.
6
1. Kontrol (-)
Pakan komersial
Pakan komersial
Hari ke0
14
26
16
(*)
2. Kontrol (+)
Pakan komersial
Pakan komersial
Hari ke0
14
26
16
(**)
3. Perlakuan A (pencegahan)
Pakan uji 0,5%
Pakan komersial
Hari ke0
14
26
16
(**)
4. Perlakuan B (pencegahan)
Pakan komersial
Pakan uji 1%
Hari ke0
14
26
16
(**)
5. Perlakuan C (pengendalian)
Pakan uji 0,5%
Pakan uji 0,5%
Hari ke0
14
26
16
(**)
6. Perlakuan D (pengendalian)
Pakan uji 1%
Pakan uji 1%
Hari ke0
14
16
(**)
26
Keterangan : *: Injeksi phosphate buffer saline; **: Injeksi bakteri Aeromonas hydrophila
Gambar 1 Jadwal pemberian pakan ikan patin dan uji tantang menggunakan A.
hydrophila
Parameter Penelitian
Parameter yang diukur dilakukan dalam dua tahap yaitu tahap sebelum uji
tantang dan tahap uji tantang. Pada tahap sebelum uji tantang parameter yang
diukur terdiri dari jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot akhir
(Wt), laju pertumbuhan harian (LPH), kelangsungan hidup (KH) dan parameter
gambaran darah yang meliputi jumlah eritrosit, kadar hemoglobin, kadar
hematokrit, total leukosit, aktivitas fagositosis dan aktivitas Respiratory burst.
7
Pengukuran parameter dilakukan pada saat awal (hari ke-0) dan setelah akhir
pemeliharaan (hari ke-15). Sedangkan pada tahap uji tantang, parameter yang
diukur meliputi kelangsungan hidup, gambaran darah dan histopatologi.
Kelangsungan hidup ikan uji diamati setiap hari setelah uji tantang (hari ke-17)
sampai akhir penelitian (hari ke-26). Pengamatan parameter darah dilakukan pada
hari ke-0, 1, 3, 6, dan 10 setelah uji tantang. Pada pengamatan gambaran darah, 3
ekor ikan diambil dari setiap perlakuan. Ikan terlebih dahulu dibius menggunakan
stabilizer, dengan cara mencampurkan 1 ml stabilizer ke dalam 1 liter air. Darah
diambil melalui vena caudal. Ikan yang telah diambil darahnya dipisahkan pada
akuarium yang berbeda untuk mencegah kemungkinan terambil kembali saat
pengamatan pada hari berikutnya.
Jumlah Konsumsi Pakan
Pakan yang akan diberikan ditimbang terlebih dahulu, setelah diberikan
pakan yang tersisa kembali dilakukan penimbangan. Jumlah konsumsi pakan
dihitung berdasarkan perhitungan Watanabe (1988) yaitu: Jumlah konsumsi pakan
(g) = Jumlah pakan awal (g) - Jumlah pakan akhir (g)
Laju Pertumbuhan Harian
Laju pertumbuhan harian dihitung dengan menggunakan rumus Huisman
(1987) :
Keterangan:
LPH
t
Wt
W0
LPH = [√
]
= Laju pertumbuhan harian (%)
= Waktu pemeliharaan (hari)
= Rerata bobot individu pada akhir pemeliharaan (g)
= Rerata bobot individu pada awal pemeliharaan (g)
Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup (KH), dihitung dengan rumus :
KH
Keterangan : KH
Nt
No
Nt
100
No
= Kelangsungan hidup (%)
= Jumlah ikan pada akhir penelitian
= Jumlah udang ikan pada awal penelitian
Gambaran Darah
Total Eritrosit
Darah sampel dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah
sampai skala 0,5, selanjutnya ditambah larutan Hayem sampai skala 101. Darah
dalam pipet diaduk dengan cara menggoyangkan pipet selama 3-5 menit sehingga
darah dan larutan Hayem tercampur rata. Dua tetes pertama larutan darah dalam
8
pipet tersebut dibuang, selanjutnya larutan darah tersebut diteteskan di atas
haemocytometer yang telah diletakkan gelas penutup di atasnya. Jumlah sel darah
merah dapat dihitung dengan bantuan mikroskop dengan pembesaran 400x.
Perhitungan dilakukan pada lima kotak kecil dalam haemocytometer. Total
eritrosit dihitung menggunakan metode Blaxhall dan Daisley (1973) dengan
rumus :
Kadar Hemoglobin
Kadar hemoglobin diukur menurut metode Sahli (Wedemeyer dan Yasutake,
1977) yaitu dengan mengisi tabung Sahlinometer dengan larutan HCl 0,1 N
sampai garis skala paling bawah, kemudian ditempatkan diantara dua tabung
dengan warna standar. Darah ikan dari tabung Eppendorf diambil dengan pipet
Sahli sebanyak 0,02 ml dan dimasukkan ke tabung sahli dan didiamkan selama
tiga menit, sebelumnya ujung pipet dibersihkan terlebih dahulu. Kemudian
ditambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit dan diaduk sampai
berubah warna tepat sama dengan warna standar. Kadar hemoglobin dinyatakan
dalam %.
Total Leukosit
Darah dihisap menggunakan pipet bulir putih sampai skala 0,5 lalu
diencerkan dengan larutan Turk’s sampai skala maksimum 11. Kedua ujung
ditutup sejajar kemudian digoyangkan selama 3-5 menit hingga darah dan larutan
Turk’s tercampur. Tetesan darah yang pertama dibuang dann tetesan berikutnya
diteteskan ke hemasitometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian
yang berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran
400x dan jumlah eritrosit dihitung pada empat kotak besar pada hemasitometer.
Perhitungan total leukosit meggunakan metode Blaxhall dan Daisley (1973),
dengan rumus :
Kadar Hematokrit
Darah dihisap dengan tabung kapiler (mikrohematokrit) hingga tiga per
empat bagian tabung lalu ujung tabung ditutup dengan ditancapkan pada
crytoceal. Setelah itu, tabung mikrohematokrit yang berisi darah disentrifuse pada
kecepatan 3000 rpm selama 5 menit lalu dilihat endapan darahnya. Perhitungan
kadar hematokrit dengan cara membandingkan panjang endapan darah (a)
terhadap panjang total seluruh darah (b). Menghitung kadar hematokrit
menggunakan metode Anderson dan Siwicki (1993). Berikut ini adalah rumus
perhitungan kadar hematokrit:
Kadar Hematokrit(%)
a
x 100
b
9
Aktivitas Fagositik
Aktivitas fagositik dihitung berdasarkan persamaan Anderson dan Siwicki
(1993).
Darah sebanyak 50µ dimasukkan ke dalam tabung eppendorf,
ditambahkan 50µ suspensi bakteri Staphylococcus aureus dalam PBS dengan
kepadatan 107 CFU/ml, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20
menit. Selanjutnya dari campuran tersebut diambil sebanyak 5 µl untuk dibuat
preparat ulas. Preparat ini difiksasi dengan methanol selama 5 menit dan
dikeringkan, kemudian direndam dalam larutan Giemsa selama 15 menit, lalu
dicuci dalam air mengalir dan dikeringkan. Pengamatan dilakukan menggunakan
mikroskop. Berikut adalah rumus untuk menghitung aktivitas fagositik :
sel yang melakukan fagositosis x100
Aktifitas fagositik (%)
sel yang diamati
Aktivitas Respiratory Burst
Aktivitas respiratory burst dapat diukur dengan pewarnaan nitroblue
tetrazolium (NBT-Assay) mengacu pada metode Secomb (1990), yang telah
dimodifikasi oleh Stasiack dan Bauman (1996) dalam Singh (2012). Pengambilan
sampel darah ikan melalui vena caudal. Sampel darah diambil 50 µL diletakkan
kedalam sumuran mikrotiter berbentuk “U”. Darah diinkubasi selama 1 jam pada
suhu 37 oC agar terjadi “adhesi” sel. Kemudian supernatan dibuang dan sumuran
dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali. Selanjutnya ditambahkan 50 µL suspensi
NBT dengan konsentrasi 0,2% dan diinkubasi selama 1 jam. Pelekatan sel darah
kemudian dikuatkan dengan 50 µL methanol 100% selama 2-3 menit kemudian
supernatan dibuang dan dilakukan pencucian sebanyak 3 kali dengan methanol
30%. Sumuran dikeringanginkan, kemudian ditambahkan 60 µL 2N pottasium
hydroxide dan 70 µL dimethyl sulphoside. Kemudian dilakukan pembacaan
Optical Density (OD) di microplate reader pada panjang gelombang 540 nm.
Histopatologi
Perubahan histopatologi organ internal yang diamati yaitu pada ginjal dan
hati. Pengamatan histopatologi dilakukan dengan mengambil satu ekor ikan dari
masing-masing perlakuan untuk dibuat preparat histopatologi. Organ ginjal dan
hati dimasukkan kedalam larutan Neutral Buffer Formalin (BNF) 10%. Setelah
difiksasi kemudian dibuat preparat histopatologi dan dilakukan pewarnaan dengan
Hematoksilin-Eosin, kemudian dilakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan
perbesaran 200-400 kali. Metode histopatologi selengkapnya diuraikan pada
Lampiran 3. Hasil histopatologi dianalisis secara deskriptif mengacu pada metode
Adinata et al. (2012) yaitu berdasarkan jumlah kerusakan pada organ ikan pada
beberapa bagian organ. Jika jumlah kerusakan organ hanya di satu bagian (fokal),
di beberapa tempat (multifokal), dan di semua tempat (difus), maka diberi tanda
berturut-turut +, ++, +++.
Analisis Data
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan satu faktor.
Data dianalisis menggunakan uji ANOVA pada selang kepercayaan 95 %, jika
terdapat perbedaan dilakukan uji lanjut Duncan dengan menggunakan program
SPSS.16.
10
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Antibakteri Ekstrak Daun Kayu Manis
Dari hasil uji in vitro ekstrak daun kayu manis yang dicobakan terhadap
bakteri A. hydrophila diketahui bahwa dosis ekstrak kayu manis yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila mulai dari dosis 0,5%, hal ini
ditandai dengan tidak adanya bakteri A. hydrophila yang tumbuh pada media agar
TSA (trypticase soy agar) seperti yang dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 2,
sedangkan untuk hasil uji fitokimia ekstrak daun kayu manis disajikan pada Tabel
3.
Tabel 1 Hasil uji in vitro ekstrak daun kayu manis
Dosis ekstrak daun kayu
Rata-rata kepadatan bakteri A.
manis
hydrophila (CFU/ml)
Kontrol
1,13x105
0,25%
8,00x103
0,5%
Tidak ada pertumbuhan
1%
Tidak ada pertumbuhan
A
B
C
D
Gambar 2 Daya hambat ekstrak daun kayu manis terhadap pertumbuhan bakteri
A. hydrophila pada berbagai konsentrasi. Kontrol (A), Dosis ekstrak
kayu manis 0, 25% (B); 0,5% (C); 1% (D).
11
Tabel 2 Hasil uji fitokimia ekstrak daun kayu manis
No
1
2
3
4
5
6
7
8
Jenis
Pengujian
Saponin
Tanin
Flavonoid
Fenolik
Alkanoid
Triterpenoid
Steroid
Glikosida
Sumber data :
Keterangan:
Metode Pengujian
(Kuantitatif)
TLC Scanner
Spektrophotometri
Spektrophotometri
Hasil Uji
Kualitatif
+
+
+
+
+
+
+
Hasil Uji
Kuantitatif (%)
2,19
4,69
8,64
TD
TD
TD
TD
TD
Hasil Analiasis di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO) Bogor
+ = Terkandung dalam ekstrak daun kayu manis
- = Tidak terkandung dalam ekstrak daun kayu manis
TD = Tidak diukur
Uji In Vivo
Tahap Sebelum Uji Tantang
Hasil penghitungan jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot
akhir (Wt), laju pertumbuhan harian (LPH) dan kelangsungan hidup (KH)
ditampilkan pada Tabel 4. JKP, Wt dan LPH terendah terdapat pada perlakuan
penambahan ekstrak daun kayu manis 1% yaitu masing-masing sebesar
46,05±4,02 g, 8,68±0,188 g dan 1,85±0,16% dan berbeda nyata dengan kontrol
dan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5%. KH terendah juga terjadi pada
perlakuan penambahan ekstrak daun kayu manis 1% yaitu 95±5,48% dibanding
perlakuan kontrol dan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5% yang mencapai
100%.
Tabel 3 Jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot akhir (Wt), laju
pertumbuhan harian (LPH) dan kelangsungan hidup (KH) ikan uji pada
tahap sebelum uji tantang
Perlakuan
Parameter
Kontrol
0,5%
1%
JKP (g)
58,49±2,84a
58,80±3,58a
46,05±4,02b
Wo (g)
6,72±0,016a
6,73±0,022a
6,71±0,028a
Wt (g)
9,95±0,336 a
9,80±0,176 a
8,68±0,188 b
a
a
LPH (%)
2,85±0,23
2,72±0,14
1,85±0,16b
KH (%)
100±0,00a
100±0,00a
95±5,48b
Keterangan : huruf superscript yang berbeda pada tiap baris menunjukkan hasil yang berbeda
nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan). Nilai yang tertera merupakan
nilai rata-rata dan simpangan baku.
Gambaran darah ikan selama pemeliharaan pada tahap sebelum uji tantang
ditampilkan pada Gambar 3. Setelah 14 hari pemeliharaan tidak ada perbedaan
pada parameter gambaran darah untuk kadar hemoglobin, total leukosit dan
aktivitas fagositik (Gambar 3b, c, d dan e). Parameter total eritrosit tertinggi
terdapat pada perlakuan kontrol yaitu sebesar 2,26±0,08% dan berbeda nyata
terhadap perlakuan penambahan ekstrak daun kayu manis dengan dosis 0,5% dan
12
Kontrol
a a
2,5
0,50%
a
a
Kontrol
1%
b
c
2,0
1,5
1,0
0,5
Hemoglobin (g%)
Eritrosit (X106 sel/ml)
1%. (Gambar 3a). Kadar hematokrit tertinggi terdapat pada perlakuan kontrol
yaitu 26,90±0,28 dan berbeda nyata terhadap perlakuan 1% (Gambar 3c).
0,0
0,5%
a
a
a
6
4
2
Setelah
Perlakuan
Sebelum
perlakuan
Setelah
Perlakuan
(a)
(b)
0,5%
1%
a a b
a a a
20
10
0
Sebelum
perlakuan
Setelah
Perlakuan
Kontrol
Leukosit (X105 sel/ml)
Hematokrit (%)
Kontrol
1,5
a
a
a
a
a
a a
Sebelum
perlakuan
(e)
a
a
1,0
0,5
0,0
Sebelum
Perlakuan
Setelah
Perlakuan
(d)
0,5%
a
1%
a
a
Setelah
Perlakuan
Kontrol
OD NBT-Assay (540 nm)
Aktivitas Fagositik (%)
Kontrol
1%
0,5%
(c)
70
60
50
40
30
20
10
0
a
0
Sebelum
Perlakuan
30
1%
a a
8
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
a
0,5%
aa
Sebelum
perlakuan
1%
a
b b
Setelah
perlakuan
(f)
Keterangan : a huruf yang berbeda pada periode waktu yang sama menunjukkan hasil yang berbeda
nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan)
Gambar 3 Gambaran darah ikan patin pada tahap sebelum uji tantang. Total
eritrosit (a); kadar hemoglobin (b); kadar hematokrit (c); total
leukosit (d); aktivitas fagositosis (e); aktivitas respiratory burst (f)
13
Tahap Uji Tantang
Gambaran Darah
Total eritrosit
Hasil penghitungan total eritrosit ditampilkan pada Gambar 4. Setelah uji
tantang total eritrosit menurun pada setiap perlakuan dan meningkat setelah hari
ke-3 dan kembali menurun pada hari ke-6 hingga hari ke-10. Total eritrosit
tertinggi terjadi pada hari ke-3 diperoleh pada perlakuan C yakni perlakuan
pengendalian dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5%, yaitu sebesar
2,39±0,16 dan berbeda nyata (p
burmanni UNTUK MENINGKATKAN RESPONS IMUN IKAN
PATIN Pangasianodon hypopthalmus YANG DIINFEKSI
Aeromonas hydrophila
SAFRATILOFA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Potensi ekstrak daun
kayu manis Cinnamomum burmanni untuk meningkatkan respons imun ikan patin
Pangasianodon hypopthalmus yang diinfeksi Aeromonas hydrophila” adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis
lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, April 2015
Safratilofa
NIM C15112021
RINGKASAN
SAFRATILOFA. Potensi Ekstrak Daun Kayu Manis Cinnamomum burmanni
Untuk Meningkatkan Respons Imun Ikan Patin Pangasianodon hypopthalmus
Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh DINAMELLA
WAHJUNINGRUM, DEDI JUSADI dan MIA SETIAWATI.
Salah satu patogen penyebab timbulnya penyakit pada usaha budidaya
ikan patin adalah bakteri Aeromonas hydrophila yang dapat menyebabkan
penyakit Motile Aeromonads Septicaemia (MAS). Peningkatan daya imunitas
benih yang digunakan merupakan salah satu pendekatan untuk mendukung
keberhasilan budidaya ikan patin. Imunitas yang baik akan dapat mengurangi
kematian pada masa awal penebaran benih pada tahap pembesaran. Salah satu
alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan memberikan suatu bahan alami
yang dapat meningkatkan respons imun ikan terhadap infeksi patogen yang
menyerang serta ramah lingkungan. Tanaman yang diketahui berpotensi sebagai
antibakteri berbasis bahan nabati adalah tumbuhan kayu manis Cinnamomum
burmanni. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari daya antibakteri ekstrak
daun kayu manis C. burmanni terhadap A. hydrophila dan menguji potensi
ekstrak daun kayu manis untuk meningkatkan respons imun ikan patin dalam
pencegahan dan pengendalian MAS
Penelitian terdiri atas dua tahap, yaitu uji antibakteri ekstrak daun kayu
manis secara in vitro dan uji ekstrak daun kayu manis dalam meningkatkan
respons imun ikan patin yang diinfeksi A. hydrophila. Pada uji daya antibakteri
ekstrak daun kayu manis dosis yang diujikan yaitu 0%, 0,25%, 0,5% dan 1%
dengan modifikasi metode macrodilution. Pada pengujian ekstrak daun kayu
manis untuk meningkatkan respons imun ikan patin dibagi menjadi dua tahap
yaitu tahap sebelum uji tantang dan tahap uji tantang. Pada tahap sebelum uji
tantang ikan patin diberi pakan dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 0%,
0,5% dan 1%. Parameter yang diamati pada tahap sebelum uji tantang meliputi
jumlah konsumsi pakan, bobot awal, bobot akhir, laju pertumbuhan harian,
kelangsungan hidup dan gambaran darah (total eritrosit, kadar hemoglobin, kadar
hematokrit, total leukosit, aktivitas fagositik dan aktivitas respiratory burst)
yang diamati pada hari ke-0 dan hari ke-14. Pada tahap uji tantang perlakuan
yang diberikan ada enam perlakuan dengan tiga ulangan. Perlakuan pencegahan
0,5% dan 1%, perlakuan pengendalian 0,5% dan 1% serta kontrol negatif dan
positif. Uji tantang dilakukan pada hari ke-16. Parameter yang diamati yaitu
gambaran darah yang diamati pada hari ke-0, 1, 3, 6 dan 10 dan parameter
kelangsungan hidup yang diamati setiap hari setelah uji tantang.
Hasil yang diperoleh pada uji antibakteri ekstrak daun kayu manis secara
in vitro yaitu pada dosis 0,5% dan 1% tidak ada pertumbuhan bakteri A.
hydrophila. Hasil penelitian pada tahap sebelum uji tantang menunjukkan bahwa
penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5% dalam pakan memberikan hasil yang
lebih baik dibandingkan dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 1% dan
berbeda nyata (p0,05) dengan kontrol. Pada tahap uji tantang perlakuan pengendalian
dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5% merupakan hasil terbaik.
Pada perlakuan pengendalian 0,5% kelangsungan hidup ikan patin mencapai
100%, sedangkan pada kontrol positif hanya 63,33% dan memberikan hasil
terbaik pada semua parameter gambaran darah. Pengamatan histopatologi
menunjukkan bahwa pada perlakuan penambahan ekstrak daun kayu manis,
terjadi kerusakan organ ginjal dan hati yang lebih ringan dibandingkan perlakuan
kontrol positif. Kesimpulannya adalah ekstrak daun kayu manis lebih dari 0,5%
dapat menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila dan penambahan ekstrak
daun kayu manis 0,5% dalam pakan dapat meningkatkan respons imun ikan patin
dan dapat digunakan sebagai pencegahan dan pengendalian penyakit MAS.
Kata kunci: Aeromonas hydrophila, Cinnamomum burmanni, Pangasianodon
hypopthalmus, respons imun
SUMMARY
SAFRATILOFA. The Potency of Cinnamon Cinnamomum burmanni Leaves
Extract to Enhance Immune Response of Striped Catfish Pangasianodon
hypopthalmus Infected by Aeromonas hydrophila. Supervised by DINAMELLA
WAHJUNINGRUM, DEDI JUSADI and MIA SETIAWATI.
One of pathogens causing the emergence of the diseases in catfish
cultivation is Aeromonas hydrophila which can cause Motile Aeromonads
Septicaemia (MAS) disease. The immunity improvement of fingerlings is one of
the approach to support the success of catfish culture. A better immunity will be
able to reduce the mortality in initial stocking in grow out stage. One of
alternatives that can be done is by giving a natural material which can enhance
fish immune responses to pathogen and also environmental friendly. In the
previous studies about the addition of cinnamon leaves into fish feed in the form
of cinnamon leaves simplisia have been done. There is no study that using
cinnamon leaves in extract form. The benefits of the extract form have higher
active material compound and more stable than the raw material. The aimed of
this study was to examine antibacterial activity of cinnamon leaves extract of C.
burmanni to A. hydrophila and to examine the potency of cinnamon leaves extract
to enhance immune response of catfish in preventing and controlling MAS
This study include two steps, the first was antibacterial test of cinnamon
leaves extract in vitro and the second step was test of cinnamon leaves extract in
enhancing immune response of catfish infected by A. hydrophila. In antibacterial
activity test of cinnamon leaves extract, the doses were 0%, 0,25%, 0,5% and 1%
with modification of macrodilution method. In the cinnamon leaves extract test to
enhance immune responses of catfish divided into two periods rearing period and
challenge test period. In the rearing period, catfish were fed by feed which was
added with cinnamon leaves extract 0%, 0,5% and 1%. The parameters observed
in the rearing period were feed intake, weight gain, daily growth rate, survival rate
and hematology (total erythrocyte, hemoglobin content, hematocrit, total
leukocyte, phagocytic activity and respiratory burst that observed on day 0 and
day 14). In the challenge test period, the experimental design used was
completely randomized design (CRD) with six treatments and three replication.
The preventing treatments were 0,5% (A) and 1% (B), the controlling treatments
0,5% (C) and 1% (D), negative control and positive control. The challenge test
was done in day 16. The parameters observed were hematology that observed on
day 0, 1, 3, 6 and 10 and survival rate observed every day post-challenge test.
The results in the antibacterial activity test of cinnamon leaves extract in
vitro was no any growth of A. hydrophila on the dose of 0.5 and 1%. On the other
hand, in the rearing period showed that the addition of 0,5% cinnamon leaves
extract in the feed gave the better results than the addition of 1% cinnamon leaves
extract and significantly different (p0.05) with controls. In the challenge test period of controlling
treatment by the addition of 0.5% cinnamon leaves extract was the best results. In
the controlling treatment of 0.5%, the survival rate of catfish was 100% while in
the positive control was only 63.33% and gave the best results on all of
hematological parameters. Histopathology examination showed that on the
addition cinnamon leaver extract treatment, there were organ damage in kidney
and liver was lower than positive control. In conclusion, cinnamon leaves extract
more than 0.5% could suppress the growth of A. hydrophila and the addition of
0.5% cinnamon leaves extract in the feed could increase catfish immune response
and able to be used for preventing and controlling of MAS disease.
Keywords: Aeromonas hydrophila, Cinnamomum burmanni, immune response,
Pangasianodon hypopthalmus.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
POTENSI EKSTRAK DAUN KAYU MANIS Cinnamomum
burmanni UNTUK MENINGKATKAN RESPONS IMUN IKAN
PATIN Pangasianodon hypopthalmus YANG DIINFEKSI
Aeromonas hydrophila
SAFRATILOFA
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:Dr Sri Nuryati, SPi, MSi
Judul Tesis : Potensi Ekstrak Daun Kayu Manis Cinnamomum burmanni Untuk
Meningkatkan Respons Imun Ikan Patin Pangasianodon
hypopthalmus Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila
Nama
: Safratilofa
NIM
: C151120221
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi
Ketua
Dr Ir Dedi Jusadi, MSc
Anggota
Dr Ir Mia Setiawati, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Widanarni, MSi
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga tesis yang berjudul “Potensi Ekstrak Daun Kayu
Manis Cinnamomum burmanni Untuk Meningkatkan Respons Imun Ikan Patin
Pangasianodon hypopthalmus Yang Diinfeksi Aeromonas hydrophila” berhasil
diselesaikan. Tesis ini bersumber dari hasil penelitian yang dilaksanakan pada
bulan Desember 2013-Juli 2014 bertempat di Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan secara khusus
kepada Ibu Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi, Bapak Dr Ir Dedi jusadi, MSc
dan Ibu Dr Ir Mia Setiawati, MSi selaku dosen pembimbing atas waktu,
kebijaksanaan, tuntunan, kesabaran, memberikan semangat dan keteladanan untuk
bekerja keras serta masukan hingga tesis ini dapat diselesaikan. Ibu Dr Sri
Nuryati, SPi, MSi sebagai dosen penguji luar komisi dan Bapak Dr Alimuddin,
SPi MSc selaku ketua program studi atas segala saran yang diberikan sehingga
tesis ini lebih berkualitas.
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi atas bantuan
dana Beasiswa Pendidikan Pascasarjana dan biaya penelitian yang diperoleh dari
dana penelitian BOPTN DIKTI. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian
dasar untuk bagian Desentralisasi Unggulan Perguruan Tinggi Institut Pertanian
Bogor dengan judul penelitian “Evaluasi Daun Kayu Manis Cinnamomum
burmanni didalam Pakan Terhadap Kinerja Pertumbuhan, Status Kesehatan dan
Kualitas Daging Ikan” dengan ketua pelaksana Dr Ir Mia Setiawati.
Terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu serta memberikan
masukan dan ide yang membangun, teman-teman mahasiswa Program Studi Ilmu
Akuakultur angkatan 2012 atas kekompakan serta motivasinya, teman-teman
Laboratorium Kesehatan Ikan, teman-teman Ilmu Akuakultur angkatan 2013,
adik-adik S1 angkatan 47 dan angkatan 48, Pak Ranta, Dendi Hidayatullah, Pak
Henda, Pak Manawan dan semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
Penulis juga mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada
orang tua penulis Ayahanda Sabri dan Razali, Ibunda Rosmaeti dan Amak
Dasnawati atas keteladanan, semangat untuk selalu pantang menyerah,
kelembutan hati, kesederhanaan hidup yang diajarkannya, serta dorongannya
untuk terus mencari ilmu dan menyampaikan pada sesama. Suamiku Mardianto,
ananda Zahroni Hanifa dan ananda Ajit Afif Aito atas semangat dan cintanya.
Ibuk Dusmaeli, Mama Darningsih, Ibu mertua, Adik-adikku, serta seluruh
keluarga, atas segala do’a, dukungan, pengertian dan kasih sayang yang tulus
selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2015
Safratilofa
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
1
2
2
2
3
2 METODE PENELITIAN
Materi Uji
Prosedur Penelitian
Parameter Penelitian
Analisis Data
3
3
6
9
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
10
19
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
23
23
DAFTAR PUSTAKA
23
LAMPIRAN
27
RIWAYAT HIDUP
30
DAFTAR TABEL
1 Hasil uji in vitro ekstrak daun kayu manis
2 Hasil uji fitokimia ekstrak daun kayu manis
3 Jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot akhir (Wt), laju
pertumbuhan harian (LPH) dan kelangsungan hidup (KH) ikan uji pada
tahap sebelum uji tantang
10
11
12
DAFTAR GAMBAR
1 Jadwal pemberian pakan ikan patin dan uji tantang menggunakan A.
hydrophila
2 Daya hambat ekstrak daun kayu manis terhadap pertumbuhan bakteri A.
hydrophila pada berbagai konsentrasi. Kontrol (A); dosis ekstrak daun
kayu manis 0,25% (B); 0,5% (C); 1% (D).
3 Gambaran darah ikan patin pada tahap sebelum uji tantang. Total
eritrosit (a); kadar hemoglobin (b); kadar hematokrit (c); total leukosit
(d), aktivitas fagositosis (e) dan aktivitas respiratory burst (f)
4 Total eritrosit ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
5 Kadar hemoglobin ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
6 Kadar hematokrit ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
7 Total leukosit ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
8 Aktivitas fagositik ikan patin selama uji tantang dengan A. hydrophila.
Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan ekstrak daun
kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan dosis 0,5% (A);
1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C); 1% (D).
9 Aktivitas respiratory burst ikan patin selama uji tantang dengan A.
hydrophila. Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan
ekstrak daun kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan
dosis 0,5% (A); 1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C);
1% (D).
10 Kelangsungan hidup ikan patin uji setelah uji tantang dengan A.
hydrophila. Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan
6
10
12
13
14
14
15
16
16
ekstrak daun kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan
dosis 0,5% (A); 1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C);
1% (D).
11 Histopatologi ginjal dan hati ikan patin setelah uji tantang dengan A.
hydrophila. Kontrol negatif (K-); kontrol positif (K+); penambahan
ekstrak daun kayu manis melalui pakan perlakuan pencegahan dengan
dosis 0,5% (A); 1% (B); perlakuan pengendalian dengan dosis 0,5% (C);
1% (D).
17
18
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji karakterisasi bakteri A. hydrophila dengan metode kit API 20 E
2 Hasil uji LD50 A. hydrophila terhadap ikan patin
3 Pembuatan preparat histopatologi
27
28
29
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu penyakit yang sering menyerang usaha budidaya ikan patin
Pangasianodon hypopthalmus adalah Motile Aeromonads Septicaemia (MAS)
yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. Penyakit MAS ini
dikenal sebagai penyakit bercak merah (Angka et al. 2004) dan menyerang ikan
budidaya yang dapat mengakibatkan kematian benih ikan patin hingga 80%
(Wartono et al. 2010). Gejala infeksi A. hydrophila meliputi pembengkakan
jaringan, perdarahan yang meluas pada permukaan kulit (haemorrhagic
septicemia), nekrosis, luka pada kulit hingga luka terbuka (ulcer) pada permukaan
tubuh atau hingga ke dalam jaringan (Mu et al. 2011; Pridgeon dan Klesius 2011)
Pada beberapa jenis ikan sering ditemukan gejala klinis seperti sirip punggung
dan sirip ekor rontok, serta pembengkakan pada perut dan berisi cairan (dropsy),
yang diikuti dengan kematian (Popma dan Masser 1999; Yuasa et al. 2003).
Peningkatan daya imunitas benih yang digunakan merupakan salah satu
pendekatan untuk mendukung keberhasilan budidaya ikan. Imunitas benih ikan
yang baik akan dapat mengurangi kematian pada masa awal penebaran benih pada
tahap pembesaran, karena pada tahap ini merupakan tahap yang rawan dengan
kematian ikan. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan
memberikan suatu bahan alami yang berasal dari tumbuhan (bahan nabati) dan
dapat meningkatkan respons imun ikan terhadap infeksi patogen yang menyerang
serta ramah lingkungan (Chakraborty dan Hancz, 2011). Tanaman yang diketahui
berpotensi sebagai antibakteri berbasis bahan nabati adalah tumbuhan kayu manis
Cinnamomum burmanni.
Kayu manis C. burmanni termasuk ke dalam vamili Lauraceae. Bagian dari
pohon kayu manis yang telah dimanfaatkan yaitu kulit batang dan daun. Kulit
dan batang kayu manis juga dapat diolah menjadi minyak atsiri. Kulit kayu manis
memiliki zat aktif seperti flavanoid, saponin, tanin dan alkanoid (Azima et al.
2004). Menurut Kumar et al. (2005), senyawa-senyawa kimia dari tumbuhan
dapat meningkatkan aktivitas sistem imun seperti senyawa flavonoid, fenolik,
alkaloid dan terpenoid. Hasil penelitian Rattanachaikunsopon dan Phumkhachorn
(2010), menyatakan bahwa minyak atsiri dari kulit kayu manis jenis
Cinnamomum verum mengandung sinamaldehid, limonene, cinamal asetat,
linalool dan α-terpineol; pada konsentrasi 20 µg/ml dapat menghambat
pertumbuhan Streptococcus iniae. Pemberian pakan yang mengandung minyak
atsiri kayu manis sebanyak 0,4% (w/w) ke ikan nila Oreochromis niloticus selama
lima hari menunjukkan adanya peningkatan respons imun ikan. Hal ini
ditunjukkan dengan tidak adanya kematian ikan yang terjadi setelah diuji tantang
dengan S. iniae. Chang et al. (2001) menyatakan bahwa minyak atsiri dari daun
kayu manis dengan dosis 250 µg/ml efektif menghambat pertumbuhan 9 jenis
bakteri yaitu Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA), Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp. dan
2
Vibrio parahemolyticus. Hasil penelitian Sufriadi (2006) menyatakan bahwa daun
kayu manis mengandung alkanoid, flavonoid, fenolik hidrokuinon, saponin dan
tanin.
Pada penelitian sebelumnya oleh Marlinda (2014), telah diteliti bahwa
penambahan daun kayu manis ke dalam pakan ikan dalam bentuk simplisia
sebanyak 1% dapat meningkatkan kinerja pertumbuhan ikan patin. Tepung daun
kayu manis yang ditambahkan melalui pakan ikan patin dengan dosis 0,5% dapat
memperbaiki tekstur daging dengan kandungan protein daging tinggi (Sakinah
2014). Namun belum ada penelitian yang meneliti pengaruh ekstrak daun kayu
manis terhadap respons imun ikan. Penggunaan ekstrak diduga lebih baik karena
kandungan bahan aktif lebih stabil dibanding pengunaan daun. Berdasarkan hal
tersebut perlu dilakukan penelitian mengenai potensi ekstrak daun kayu manis
sebagai bahan nabati yang dapat meningkatkan respons imun ikan patin,
mengingat daun kayu manis tersedia dalam jumlah yang melimpah dan belum
banyak dimanfaatkan.
Perumusan Masalah
Salah satu bakteri penyebab penyakit pada ikan adalah bakteri A.
hydrophila. Peningkatan daya imunitas benih yang akan digunakan dalam
budidaya ikan merupakan salah satu pendekatan dalam mendukung keberhasilan
budidaya ikan. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan
pemberian bahan alami yang dapat meningkatkan respons imun ikan patin.
Pemanfaatan bahan-bahan dari alam, yang salah satunya diketahui mengandung
senyawa antibakterial adalah daun kayu manis. Sudah dilakukan penelitian
mengenai potensi daun kayu manis dalam bentuk tepung terhadap kinerja
pertumbuhan dan kualitas daging ikan. Namun belum ada kajian tentang manfaat
daun kayu manis dalam bentuk ekstrak dan potensinya untuk meningkatkan
respons imun ikan patin. Dalam bentuk ekstrak diharapkan dapat memperoleh
bahan aktif yang lebih stabil dibandingkan dengan penggunaan daun. Selain itu
senyawa-senyawa dari tumbuhan diketahui juga dapat meningkatkan aktivitas
sistem imun. Untuk itu perlu diteliti lebih lanjut pemanfaatan ekstrak daun kayu
manis untuk meningkatkan respons imun ikan dan sebagai agen pengendali
bakteri pathogen, terutama pada ikan patin P. hypopthalmus.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi daya antibakteri ekstrak daun
kayu manis terhadap A. hydrophila. Penelitian ini juga menguji potensi ekstrak
daun kayu manis untuk meningkatkan respons imun ikan patin dalam pencegahan
dan pengendalian motile aeromonads septicaemia.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi bagi pembudidaya
ikan patin khususnya tentang ekstrak aditif berupa daun kayu manis yang dapat
3
digunakan untuk mencegah dan mengendalikan penyakit motile aeromonads
septicaemia sehingga dapat membantu pembudidaya untuk meningkatkan
produksinya.
Hipotesis
Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah penambahan ekstrak
daun kayu manis dalam pakan dapat meningkatkan respons imun serta dapat
mencegah dan mengendalikan infeksi bakteri A. hydrophila pada ikan patin P.
hypopthalmus .
2 METODE PENELITIAN
Materi Uji
Ikan uji yang digunakan adalah ikan patin yang berasal dari pembudidaya di
daerah Parung, Bogor dengan bobot rata-rata 6±0,26 g. Bakteri uji yang
digunakan adalah A. hydrophila yang berasal dari koleksi Laboratorium
Kesehatan Ikan(LKI), Departemen Budidaya Perairan (BDP), Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan (FPIK), Institut Pertanian Bogor (IPB). Sebelum digunakan,
dilakukan uji konfirmasi bakteri terlebih dahulu dengan media API 20 E yang
menunjukkan bahwa spesies bakteri yang digunakan adalah A. hydrophila
(Lampiran 1). Daun kayu manis yang digunakan adalah dari jenis Cinamomum
burmanni, yang diperoleh dari petani di kota Jambi. Daun kayu manis yang akan
digunakan dipilih daun yang tidak terlalu muda yaitu dimulai dari daun yang
kelima dari pucuk daun, kemudian daun dicuci bersih.
Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri atas dua prosedur utama, yaitu uji antibakteri ekstrak
daun kayu manis secara in vitro dan uji in vivo.
Uji antibakteri Ekstrak Daun Kayu Manis secara In Vitro
Uji in vitro dilakukan untuk menentukan dosis terbaik ekstrak daun kayu
manis dalam menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Dosis terbaik
digunakan dalam uji in vivo. Uji in vitro dilakukan di LKI, BDP, FPIK, IPB pada
bulan April 2014.
Daun kayu manis dikeringkan pada udara terbuka (kering udara) tanpa
terkena cahaya matahari langsung untuk menghindari kerusakan bahan aktif yang
terdapat pada daun kayu manis.
Pengeringan dilakukan sampai daun dapat
dihaluskan dan diayak untuk mendapatkan serbuk daun kayu manis. Metode
ekstraksi daun kayu manis yang digunakan pada penelitian ini merupakan
modifikasi metode yang dikembangkan oleh Prasad et al. (2009). Serbuk daun
4
kayu manis direndam dalam pelarut etanol 96% dengan perbandingan 1:10 (w/v)
kemudian dilakukan proses maserasi dengan pengadukan selama 24 jam. Hasil
maserasi didiamkan hingga terbentuk dua lapisan suspensi bahan. Lapisan atas
merupakan filtrat hasil maserasi dan disaring menggunakan kertas saring mesh
size sebesar ±0,6 mm sebagai filter pertama, sedangkan filter kedua menggunakan
kertas saring Whatman no 125. Lapisan kedua merupakan endapan simplisia
daun kayu manis yang kemudian ditambahkan kembali etanol 96% sebanyak 1000
ml dan dimaserasi selama 24 jam sambil diaduk. Setelah didiamkan dan
mengendap, filtrat kembali disaring dengan filter pertama dan filter kedua. Hal
ini dilakukan berulang sampai filtrat hasil maserasi menjadi bening. Filtrat hasil
maserasi kemudian diuapkan dengan menggunakan evaporator sampai didapat
ekstrak kental dan kemudian dikeringkan dengan metode freeze drying. Hasil
ekstraksi diperoleh dalam bentuk pasta kering sebanyak 12% kemudian disimpan
dalam lemari pendingin sampai waktu akan digunakan. Hasil ekstraksi metode
Freeze drying diambil sebanyak 5 g untuk diuji fitokimia guna melihat kandungan
zat aktif dari ekstrak daun kayu manis. Uji fitokimia dilakukan di Balai Penelitian
Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO) Bogor.
Uji antibakteri ekstrak daun kayu manis dilakukan dengan modifikasi
metode Macrodilution (NCLLS 2005). Tabung mikro diisi dengan akuades steril
dan ditambahkan ekstrak daun kayu manis hingga diperoleh konsentrasi sesuai
dengan dosis yang akan diuji yaitu 0,25%, 0,5% dan 1%. Tabung mikro untuk
kontrol diisi akuades sebanyak 0,9 ml tanpa ekstrak daun kayu manis. Masingmasing tabung mikro ditambahkan 0,1 ml suspensi bakteri, kemudian
dihomogenkan dan diinkubasi selama 24 jam. Pada hari kedua dari masingmasing campuran bakteri dengan ekstrak daun kayu manis diencerkan sampai 106
CFU/ml dan disebarkan pada media TSA sebanyak 50 µl selanjutnya diinkubasi
kembali selama 24 jam. Pada hari ketiga dihitung masing-masing jumlah koloni
yang tumbuh. Pada media TSA yang tidak menampakkan pertumbuhan bakteri,
menunjukkan bahwa dosis ekstrak daun kayu manis tersebut mampu menghambat
pertumbuhan A. hydrophila sehingga dapat digunakan untuk uji in vivo.
Uji In Vivo
Uji in vivo dilakukan untuk melihat potensi ekstrak daun kayu manis yang
diberikan melalui pakan sebagai pencegahan dan pengendalian terhadap infeksi A.
hydrophila.
Persiapan Ikan Patin
Ikan dipelihara dalam akuarium berukuran 60x30x40 cm3. Ikan ditebar
sebanyak 10 ekor/akuarium. Ikan diadaptasikan dan dipelihara selama 2 minggu
sebelum diberi perlakuan. Selama proses adaptasi, ikan diberi pakan komersial
sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore hari secara at satiation.
Persiapan Pakan
Pakan yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan penambahan
ekstrak daun kayu manis sebanyak 0%, 0,5%, dan 1%. Penambahan ekstrak daun
kayu manis ke dalam pakan dilakukan dengan metode repelleting. Untuk 1 kg
5
pakan, ekstrak daun kayu manis 0,5%, dan 1% masing-masing dilarutkan dengan
akuades sebanyak 200 ml, kemudian dicampurkan dengan putih telur sebanyak 20
ml sebagai perekat dan diaduk menggunakan mixer hingga homogen. Campuran
yang telah homogen ditambahkan pakan komersial protein 30% yang sudah
dihaluskan terlebih dahulu. Setelah campuran rata, bahan dicetak kembali
kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 35 °C selama 24 jam. Pelet yang
sudah kering kemudian disimpan dalam tempat yang kedap udara.
Uji LD50 A. hydrophila
Uji LD50 dilakukan untuk mengetahui tingkat kepadatan bakteri yang dapat
menyebabkan kematian ikan sebanyak 50% dari populasi. Hasil uji LD50
digunakan sebagai patokan kepadatan bakteri dalam uji in vivo. Ikan uji yang
digunakan sebanyak 8 ekor per akuarium, ikan uji diinjeksi dengan bakteri A.
hydrophila sebanyak 0,1 ml/ekor secara intramuskuler dengan kepadatan bakteri
106, 107, 108 dan 109 CFU/ml dan sebagai kontrol ikan diinjeksi dengan PBS
(phosphate buffer saline), masing-masing dilakukan sebanyak dua ulangan.
Selama uji LD50 ikan diberi pakan komersial. Diamati ikan yang mati pada
masing-masing akuarium selama 7 hari dan dilakukan penghitungan dengan
menggunakan rumus Reed dan Muench (1938). Berdasarkan hasil perhitungan
diperoleh nilai LD50 sebesar 108 CFU/ml (lampiran 2).
Uji Ekstrak Daun Kayu Manis secara In Vivo
Pada uji in vivo terbagi atas dua tahap yaitu tahap sebelum uji tantang dan
tahap uji tantang. Tahap sebelum uji tantang dimulai dari hari ke-0 sampai hari
ke-14, sedangkan tahap uji tantang dimulai dari hari ke-0 sampai hari ke-10
setelah uji tantang atau sama dengan hari ke-16 sampai hari ke-26. Selama uji in
vivo ikan diberi pakan uji sebanyak dua kali sehari yaitu pagi dan sore (07.00 dan
16.00 WIB) secara at satiation. Pakan uji diberikan selama 14 hari kemudian
dilakukan uji tantang dengan A. hydrophila pada hari ke-16. Pada perlakuan
pencegahan ikan di beri pakan uji selama 14 hari setelah uji tantang ikan diberi
pakan komersial. Sementara pada perlakuan pengendalian ikan diberi pakan uji
sebelum dan sesudah uji tantang. Pada kontrol negatif, pakan yang diberikan
adalah pakan komersial dan saat uji tantang diinjeksi dengan PBS, sedangkan
pada kontrol positif ikan diberi pakan komersial dan diinjeksi dengan bakteri A.
hydrophila. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak lima ulangan, tiga
ulangan untuk melihat pertambahan bobot dan kelangsungan hidup sedangkan dua
ulangan lainnya untuk parameter gambaran darah. Perlakuan selengkapnya dapat
dilihat pada Gambar 1. Kualitas air dijaga agar berada dalam kisaran optimal
untuk kehidupan ikan budidaya. Kualitas air selama penelitian yaitu suhu 2728 °C, pH 6,5 – 8,5, DO 4,5 – 6,6 mg/L dan TAN 0,4 – 0,93. Menurut Boyd
(1990) kualitas air untuk budidaya ikan aiir tawar yaitu oksigen terlarut > 5 mg/L,
suhu 24 – 30 °C, pH 6,5 – 9,5 dan total amonia nitrogen (TAN) < 0,52 ppm.
Kualitas air dijaga dengan memberi heater pada masing-masing akuarium, aerasi
sebagai penyuplai oksigen dan dilakukan pergantian air setiap tiga hari. Setiap
sisi akuarium ditutup dengan plastik berwarna hitam untuk menghindari stres pada
ikan.
6
1. Kontrol (-)
Pakan komersial
Pakan komersial
Hari ke0
14
26
16
(*)
2. Kontrol (+)
Pakan komersial
Pakan komersial
Hari ke0
14
26
16
(**)
3. Perlakuan A (pencegahan)
Pakan uji 0,5%
Pakan komersial
Hari ke0
14
26
16
(**)
4. Perlakuan B (pencegahan)
Pakan komersial
Pakan uji 1%
Hari ke0
14
26
16
(**)
5. Perlakuan C (pengendalian)
Pakan uji 0,5%
Pakan uji 0,5%
Hari ke0
14
26
16
(**)
6. Perlakuan D (pengendalian)
Pakan uji 1%
Pakan uji 1%
Hari ke0
14
16
(**)
26
Keterangan : *: Injeksi phosphate buffer saline; **: Injeksi bakteri Aeromonas hydrophila
Gambar 1 Jadwal pemberian pakan ikan patin dan uji tantang menggunakan A.
hydrophila
Parameter Penelitian
Parameter yang diukur dilakukan dalam dua tahap yaitu tahap sebelum uji
tantang dan tahap uji tantang. Pada tahap sebelum uji tantang parameter yang
diukur terdiri dari jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot akhir
(Wt), laju pertumbuhan harian (LPH), kelangsungan hidup (KH) dan parameter
gambaran darah yang meliputi jumlah eritrosit, kadar hemoglobin, kadar
hematokrit, total leukosit, aktivitas fagositosis dan aktivitas Respiratory burst.
7
Pengukuran parameter dilakukan pada saat awal (hari ke-0) dan setelah akhir
pemeliharaan (hari ke-15). Sedangkan pada tahap uji tantang, parameter yang
diukur meliputi kelangsungan hidup, gambaran darah dan histopatologi.
Kelangsungan hidup ikan uji diamati setiap hari setelah uji tantang (hari ke-17)
sampai akhir penelitian (hari ke-26). Pengamatan parameter darah dilakukan pada
hari ke-0, 1, 3, 6, dan 10 setelah uji tantang. Pada pengamatan gambaran darah, 3
ekor ikan diambil dari setiap perlakuan. Ikan terlebih dahulu dibius menggunakan
stabilizer, dengan cara mencampurkan 1 ml stabilizer ke dalam 1 liter air. Darah
diambil melalui vena caudal. Ikan yang telah diambil darahnya dipisahkan pada
akuarium yang berbeda untuk mencegah kemungkinan terambil kembali saat
pengamatan pada hari berikutnya.
Jumlah Konsumsi Pakan
Pakan yang akan diberikan ditimbang terlebih dahulu, setelah diberikan
pakan yang tersisa kembali dilakukan penimbangan. Jumlah konsumsi pakan
dihitung berdasarkan perhitungan Watanabe (1988) yaitu: Jumlah konsumsi pakan
(g) = Jumlah pakan awal (g) - Jumlah pakan akhir (g)
Laju Pertumbuhan Harian
Laju pertumbuhan harian dihitung dengan menggunakan rumus Huisman
(1987) :
Keterangan:
LPH
t
Wt
W0
LPH = [√
]
= Laju pertumbuhan harian (%)
= Waktu pemeliharaan (hari)
= Rerata bobot individu pada akhir pemeliharaan (g)
= Rerata bobot individu pada awal pemeliharaan (g)
Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup (KH), dihitung dengan rumus :
KH
Keterangan : KH
Nt
No
Nt
100
No
= Kelangsungan hidup (%)
= Jumlah ikan pada akhir penelitian
= Jumlah udang ikan pada awal penelitian
Gambaran Darah
Total Eritrosit
Darah sampel dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah
sampai skala 0,5, selanjutnya ditambah larutan Hayem sampai skala 101. Darah
dalam pipet diaduk dengan cara menggoyangkan pipet selama 3-5 menit sehingga
darah dan larutan Hayem tercampur rata. Dua tetes pertama larutan darah dalam
8
pipet tersebut dibuang, selanjutnya larutan darah tersebut diteteskan di atas
haemocytometer yang telah diletakkan gelas penutup di atasnya. Jumlah sel darah
merah dapat dihitung dengan bantuan mikroskop dengan pembesaran 400x.
Perhitungan dilakukan pada lima kotak kecil dalam haemocytometer. Total
eritrosit dihitung menggunakan metode Blaxhall dan Daisley (1973) dengan
rumus :
Kadar Hemoglobin
Kadar hemoglobin diukur menurut metode Sahli (Wedemeyer dan Yasutake,
1977) yaitu dengan mengisi tabung Sahlinometer dengan larutan HCl 0,1 N
sampai garis skala paling bawah, kemudian ditempatkan diantara dua tabung
dengan warna standar. Darah ikan dari tabung Eppendorf diambil dengan pipet
Sahli sebanyak 0,02 ml dan dimasukkan ke tabung sahli dan didiamkan selama
tiga menit, sebelumnya ujung pipet dibersihkan terlebih dahulu. Kemudian
ditambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit dan diaduk sampai
berubah warna tepat sama dengan warna standar. Kadar hemoglobin dinyatakan
dalam %.
Total Leukosit
Darah dihisap menggunakan pipet bulir putih sampai skala 0,5 lalu
diencerkan dengan larutan Turk’s sampai skala maksimum 11. Kedua ujung
ditutup sejajar kemudian digoyangkan selama 3-5 menit hingga darah dan larutan
Turk’s tercampur. Tetesan darah yang pertama dibuang dann tetesan berikutnya
diteteskan ke hemasitometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian
yang berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran
400x dan jumlah eritrosit dihitung pada empat kotak besar pada hemasitometer.
Perhitungan total leukosit meggunakan metode Blaxhall dan Daisley (1973),
dengan rumus :
Kadar Hematokrit
Darah dihisap dengan tabung kapiler (mikrohematokrit) hingga tiga per
empat bagian tabung lalu ujung tabung ditutup dengan ditancapkan pada
crytoceal. Setelah itu, tabung mikrohematokrit yang berisi darah disentrifuse pada
kecepatan 3000 rpm selama 5 menit lalu dilihat endapan darahnya. Perhitungan
kadar hematokrit dengan cara membandingkan panjang endapan darah (a)
terhadap panjang total seluruh darah (b). Menghitung kadar hematokrit
menggunakan metode Anderson dan Siwicki (1993). Berikut ini adalah rumus
perhitungan kadar hematokrit:
Kadar Hematokrit(%)
a
x 100
b
9
Aktivitas Fagositik
Aktivitas fagositik dihitung berdasarkan persamaan Anderson dan Siwicki
(1993).
Darah sebanyak 50µ dimasukkan ke dalam tabung eppendorf,
ditambahkan 50µ suspensi bakteri Staphylococcus aureus dalam PBS dengan
kepadatan 107 CFU/ml, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20
menit. Selanjutnya dari campuran tersebut diambil sebanyak 5 µl untuk dibuat
preparat ulas. Preparat ini difiksasi dengan methanol selama 5 menit dan
dikeringkan, kemudian direndam dalam larutan Giemsa selama 15 menit, lalu
dicuci dalam air mengalir dan dikeringkan. Pengamatan dilakukan menggunakan
mikroskop. Berikut adalah rumus untuk menghitung aktivitas fagositik :
sel yang melakukan fagositosis x100
Aktifitas fagositik (%)
sel yang diamati
Aktivitas Respiratory Burst
Aktivitas respiratory burst dapat diukur dengan pewarnaan nitroblue
tetrazolium (NBT-Assay) mengacu pada metode Secomb (1990), yang telah
dimodifikasi oleh Stasiack dan Bauman (1996) dalam Singh (2012). Pengambilan
sampel darah ikan melalui vena caudal. Sampel darah diambil 50 µL diletakkan
kedalam sumuran mikrotiter berbentuk “U”. Darah diinkubasi selama 1 jam pada
suhu 37 oC agar terjadi “adhesi” sel. Kemudian supernatan dibuang dan sumuran
dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali. Selanjutnya ditambahkan 50 µL suspensi
NBT dengan konsentrasi 0,2% dan diinkubasi selama 1 jam. Pelekatan sel darah
kemudian dikuatkan dengan 50 µL methanol 100% selama 2-3 menit kemudian
supernatan dibuang dan dilakukan pencucian sebanyak 3 kali dengan methanol
30%. Sumuran dikeringanginkan, kemudian ditambahkan 60 µL 2N pottasium
hydroxide dan 70 µL dimethyl sulphoside. Kemudian dilakukan pembacaan
Optical Density (OD) di microplate reader pada panjang gelombang 540 nm.
Histopatologi
Perubahan histopatologi organ internal yang diamati yaitu pada ginjal dan
hati. Pengamatan histopatologi dilakukan dengan mengambil satu ekor ikan dari
masing-masing perlakuan untuk dibuat preparat histopatologi. Organ ginjal dan
hati dimasukkan kedalam larutan Neutral Buffer Formalin (BNF) 10%. Setelah
difiksasi kemudian dibuat preparat histopatologi dan dilakukan pewarnaan dengan
Hematoksilin-Eosin, kemudian dilakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan
perbesaran 200-400 kali. Metode histopatologi selengkapnya diuraikan pada
Lampiran 3. Hasil histopatologi dianalisis secara deskriptif mengacu pada metode
Adinata et al. (2012) yaitu berdasarkan jumlah kerusakan pada organ ikan pada
beberapa bagian organ. Jika jumlah kerusakan organ hanya di satu bagian (fokal),
di beberapa tempat (multifokal), dan di semua tempat (difus), maka diberi tanda
berturut-turut +, ++, +++.
Analisis Data
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan satu faktor.
Data dianalisis menggunakan uji ANOVA pada selang kepercayaan 95 %, jika
terdapat perbedaan dilakukan uji lanjut Duncan dengan menggunakan program
SPSS.16.
10
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Antibakteri Ekstrak Daun Kayu Manis
Dari hasil uji in vitro ekstrak daun kayu manis yang dicobakan terhadap
bakteri A. hydrophila diketahui bahwa dosis ekstrak kayu manis yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila mulai dari dosis 0,5%, hal ini
ditandai dengan tidak adanya bakteri A. hydrophila yang tumbuh pada media agar
TSA (trypticase soy agar) seperti yang dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 2,
sedangkan untuk hasil uji fitokimia ekstrak daun kayu manis disajikan pada Tabel
3.
Tabel 1 Hasil uji in vitro ekstrak daun kayu manis
Dosis ekstrak daun kayu
Rata-rata kepadatan bakteri A.
manis
hydrophila (CFU/ml)
Kontrol
1,13x105
0,25%
8,00x103
0,5%
Tidak ada pertumbuhan
1%
Tidak ada pertumbuhan
A
B
C
D
Gambar 2 Daya hambat ekstrak daun kayu manis terhadap pertumbuhan bakteri
A. hydrophila pada berbagai konsentrasi. Kontrol (A), Dosis ekstrak
kayu manis 0, 25% (B); 0,5% (C); 1% (D).
11
Tabel 2 Hasil uji fitokimia ekstrak daun kayu manis
No
1
2
3
4
5
6
7
8
Jenis
Pengujian
Saponin
Tanin
Flavonoid
Fenolik
Alkanoid
Triterpenoid
Steroid
Glikosida
Sumber data :
Keterangan:
Metode Pengujian
(Kuantitatif)
TLC Scanner
Spektrophotometri
Spektrophotometri
Hasil Uji
Kualitatif
+
+
+
+
+
+
+
Hasil Uji
Kuantitatif (%)
2,19
4,69
8,64
TD
TD
TD
TD
TD
Hasil Analiasis di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO) Bogor
+ = Terkandung dalam ekstrak daun kayu manis
- = Tidak terkandung dalam ekstrak daun kayu manis
TD = Tidak diukur
Uji In Vivo
Tahap Sebelum Uji Tantang
Hasil penghitungan jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot
akhir (Wt), laju pertumbuhan harian (LPH) dan kelangsungan hidup (KH)
ditampilkan pada Tabel 4. JKP, Wt dan LPH terendah terdapat pada perlakuan
penambahan ekstrak daun kayu manis 1% yaitu masing-masing sebesar
46,05±4,02 g, 8,68±0,188 g dan 1,85±0,16% dan berbeda nyata dengan kontrol
dan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5%. KH terendah juga terjadi pada
perlakuan penambahan ekstrak daun kayu manis 1% yaitu 95±5,48% dibanding
perlakuan kontrol dan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5% yang mencapai
100%.
Tabel 3 Jumlah konsumsi pakan (JKP), bobot awal (Wo), bobot akhir (Wt), laju
pertumbuhan harian (LPH) dan kelangsungan hidup (KH) ikan uji pada
tahap sebelum uji tantang
Perlakuan
Parameter
Kontrol
0,5%
1%
JKP (g)
58,49±2,84a
58,80±3,58a
46,05±4,02b
Wo (g)
6,72±0,016a
6,73±0,022a
6,71±0,028a
Wt (g)
9,95±0,336 a
9,80±0,176 a
8,68±0,188 b
a
a
LPH (%)
2,85±0,23
2,72±0,14
1,85±0,16b
KH (%)
100±0,00a
100±0,00a
95±5,48b
Keterangan : huruf superscript yang berbeda pada tiap baris menunjukkan hasil yang berbeda
nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan). Nilai yang tertera merupakan
nilai rata-rata dan simpangan baku.
Gambaran darah ikan selama pemeliharaan pada tahap sebelum uji tantang
ditampilkan pada Gambar 3. Setelah 14 hari pemeliharaan tidak ada perbedaan
pada parameter gambaran darah untuk kadar hemoglobin, total leukosit dan
aktivitas fagositik (Gambar 3b, c, d dan e). Parameter total eritrosit tertinggi
terdapat pada perlakuan kontrol yaitu sebesar 2,26±0,08% dan berbeda nyata
terhadap perlakuan penambahan ekstrak daun kayu manis dengan dosis 0,5% dan
12
Kontrol
a a
2,5
0,50%
a
a
Kontrol
1%
b
c
2,0
1,5
1,0
0,5
Hemoglobin (g%)
Eritrosit (X106 sel/ml)
1%. (Gambar 3a). Kadar hematokrit tertinggi terdapat pada perlakuan kontrol
yaitu 26,90±0,28 dan berbeda nyata terhadap perlakuan 1% (Gambar 3c).
0,0
0,5%
a
a
a
6
4
2
Setelah
Perlakuan
Sebelum
perlakuan
Setelah
Perlakuan
(a)
(b)
0,5%
1%
a a b
a a a
20
10
0
Sebelum
perlakuan
Setelah
Perlakuan
Kontrol
Leukosit (X105 sel/ml)
Hematokrit (%)
Kontrol
1,5
a
a
a
a
a
a a
Sebelum
perlakuan
(e)
a
a
1,0
0,5
0,0
Sebelum
Perlakuan
Setelah
Perlakuan
(d)
0,5%
a
1%
a
a
Setelah
Perlakuan
Kontrol
OD NBT-Assay (540 nm)
Aktivitas Fagositik (%)
Kontrol
1%
0,5%
(c)
70
60
50
40
30
20
10
0
a
0
Sebelum
Perlakuan
30
1%
a a
8
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
a
0,5%
aa
Sebelum
perlakuan
1%
a
b b
Setelah
perlakuan
(f)
Keterangan : a huruf yang berbeda pada periode waktu yang sama menunjukkan hasil yang berbeda
nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan)
Gambar 3 Gambaran darah ikan patin pada tahap sebelum uji tantang. Total
eritrosit (a); kadar hemoglobin (b); kadar hematokrit (c); total
leukosit (d); aktivitas fagositosis (e); aktivitas respiratory burst (f)
13
Tahap Uji Tantang
Gambaran Darah
Total eritrosit
Hasil penghitungan total eritrosit ditampilkan pada Gambar 4. Setelah uji
tantang total eritrosit menurun pada setiap perlakuan dan meningkat setelah hari
ke-3 dan kembali menurun pada hari ke-6 hingga hari ke-10. Total eritrosit
tertinggi terjadi pada hari ke-3 diperoleh pada perlakuan C yakni perlakuan
pengendalian dengan penambahan ekstrak daun kayu manis 0,5%, yaitu sebesar
2,39±0,16 dan berbeda nyata (p