Isolasi dan Kloning Fragmen DNA Mikrosatelit dari Tanaman Gaharu (Aquilaria malaccensis Lamk.)

ISOLASI DAN KLONING FRAGMEN DNA MIKROSATELIT
DARI TANAMAN GAHARU (Aquilaria malaccensis Lamk.)

ARIE AQMARINA

DEPARTEMEN SILVIKULTUR
FAKULTAS KEHUTANAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Kloning
Fragmen DNA Mikrosatelit dari Tanaman Gaharu (Aquilaria malaccensis Lamk.)
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014

Arie Aqmarina
NIM E44100015

ABSTRAK
ARIE AQMARINA. Isolasi dan Kloning Fragmen DNA Mikrosatelit dari
Tanaman Gaharu (Aquilaria malaccensis Lamk.). Dibimbing oleh ULFAH
JUNIARTI SIREGAR dan UTUT WIDYASTUTI.
Aquilaria malaccensis Lamk. merupakan salah satu jenis tanaman hutan
yang menghasilkan resin beraroma wangi terbaik di dunia dan masuk ke dalam
kategori Appendix II dalam CITES. Penanda mikrosatelit dapat dikembangkan
sebagai bahan pembeda antara tanaman A. malaccensis yang menghasilkan gaharu
dengan yang tidak menghasilkan gaharu. Tujuan dari penelitian ini ialah
mengisolasi dan mengklon fragmen DNA mikrosatelit tanaman A. malaccensis
hasil PCR. Metode yang dilakukan terdiri atas isolasi DNA genom A.
malaccensis, PCR dengan primer mikrosatelit 10pa17 dan 16pa17, elusi produk
PCR, dan kloning fragmen DNA mikrosatelit. Proses kloning meliputi persiapan
fragmen DNA mikrosatelit untuk sisipan, ligasi ke dalam vektor pGemT-Easy,

persiapan sel kompeten E.coli strain DH5α, transformasi sel kompeten dengan
vektor pembawa DNA sisipan, serta seleksi koloni bakteri biru-putih. Isolasi DNA
genom menghasilkan DNA dengan konsentrasi 20 ng/µl. Fragmen DNA
mikrosatelit hasil PCR berukuran 150 bp. Proses kloning telah menghasilkan
koloni yang berwarna putih yang mengindikasikan bahwa koloni bakteri tersebut
telah tersisipi DNA rekombinan.
Kata kunci: Aquilaria malaccensis, gaharu, kloning, mikrosatelit, Polymerase
Chain Reaction (PCR).

ABSTRACT
ARIE AQMARINA. Isolation and Cloning of Microsatellite DNA Fragments of
Agarwood Plant (Aquilaria malaccensis Lamk.). Supervised by ULFAH
JUNIARTI SIREGAR and UTUT WIDYASTUTI.
Aquilaria malaccensis Lamk. is one of forest tree species which produces
best aromatic resin in the world and is listed in the Appendix II of CITES. Its
microsatellite marker was developed in order to be able to differentiate plants of A.
malaccensis which actually could produce agarwood and those which could not.
The objective of this research was to isolate and clone microsatellite DNA
fragment of A. malaccensis resulted from PCR process. Methods included A.
malaccensis genomic DNA isolation, PCR using microsatellite primers, i.e.

10pa17 and 16pa17, PCR products elution, and cloning of microsatellite DNA
fragment. The cloning process was conducted as followed, preparation of
microsatellite DNA fragment as insert, ligation of insert to pGemT-Easy vector,
preparation of competent E.coli cells strain DH5α, transformation of competent
cell with vector carrying inserted DNA, and selection of blue-white colonies.
Isolation of genomic DNA could obtain DNA having concentration of 20 ng/µl.
The size of microsatellite DNA fragment as PCR product was 150 bp. The cloning
process has produced white becterial colonies indicating that the bacterial colonies
has contained the inserted recombinant DNA.
Keywords: Agarwood, Aquilaria malaccensis, cloning, microsatellite, Polymerase
Chain Reaction (PCR).

ISOLASI DAN KLONING FRAGMEN DNA MIKROSATELIT
DARI TANAMAN GAHARU (Aquilaria malaccensis Lamk.)

ARIE AQMARINA

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kehutanan

pada
Departemen Silvikultur

DEPARTEMEN SILVIKULTUR
FAKULTAS KEHUTANAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Judul Skripsi : Isolasi dan Kloning Fragmen DNA Mikrosatelit dari Tanaman
Gaharu (Aquilaria malaccensis Lamk.)
Nama
: Arie Aqmarina
NIM
: E44100015

Disetujui oleh

Dr Ulfah Juniarti Siregar
Pembimbing I

Dr Utut Widyastuti
Pembimbing II

Diketahui oleh

Prof Dr Ir Nurheni Wijayanto, MS
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2013 ini ialah
kloning fragmen DNA, dengan judul “Isolasi dan Kloning Fragmen DNA
Mikrosatelit dari Tanaman Gaharu (Aquilaria malaccensis Lamk.).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ulfah Juniarti Siregar dan Dr
Utut Widyastuti selaku pembimbing yang telah banyak memberikan arahan, saran,
dukungan dan bantuan lainnya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

Selan itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Mbak Laswi Irmayanti, S.Hut
selaku teknisi Laboratorium Genetika Hutan, Departemen Silvikultur dan Mbak
Anidah, S.Si selaku teknisi Laboratorium Bioteknologi SEAMEO-BIOTROP, dan
Mbak Peppy Elvafina selaku teknisi Laboratorium Biorin, PPSHB IPB yang telah
membimbing selama pelaksanaan penelitian ini. Ayahanda Alm. Rusli Nasution,
Ibu Emma Salamah, Bang Emir Idris Nasution, dan seluruh keluarga lainnya yang
telah memberikan do’a, kasih sayang dan dukungan dalam proses
penyelesaiannya. Di samping itu, pada saudara-saudara, akang-akang, dan tetehteteh Rimbawan Pecinta Alam (RIMPALA) khususnya R-XVI, teman-teman
Silvikultur 47, sahabat-sahabat penulis Hassyati Shabrina, Desi Nurafida, Intan
Nurhajah, Mirzha Hanifah, Kumala Fitriyanita, Mira Febianti, M. Nur Alifudin,
dan Bayu Winata yang juga memberikan bantuan, dukungan, saran dan semangat
yang melimpah dalam proses penyusunan hingga penulisan penelitian ini. Tak
lupa semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang turut membantu
dalam penyusunan skripsi ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2014
Arie Aqmarina

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Perumusan Masalah

2

Tujuan Penelitian

2

Manfaat Penelitian

2

Ruang Lingkup Penelitian

2

METODE

3

Waktu dan Tempat

3

Bahan dan Alat

3

Prosedur Penelitian

3

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA Genom Tanaman Gaharu

8
8

Perbanyakan Fragmen DNA Gaharu dengan PCR

12

Pembentukan DNA Rekombinan

13

SIMPULAN DAN SARAN

20

Simpulan

20

Saran

20

DAFTAR PUSTAKA

20

LAMPIRAN

24

RIWAYAT HIDUP

29

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5

Komposisi bahan PCR
Primer mikrosatelit 10pa17 dan 16pa17 (Eurlings et al. 2009)
Kondisi PCR
Reaksi ligasi
Ukuran konsentrasi DNA genom dari empat individu

5
6
6
7
11

DAFTAR GAMBAR
1 Bagan alur penelitian
2 Elektroforesis hasil isolasi DNA genom pada gel agarosa 1% (b/v). 1
dan 2 adalah DNA lambda dengan konsentrasi 5 ng/µl dan 10 ng/µl. 3,
4, 5, dan 6 adalah DNA genom dengan konsentrasi 10 ng/µl, 20 ng/µl,
10 ng/µl, 20 ng/µl.
3 Elektroforesis hasil PCR fragmen DNA menggunakan (A) Primer
10pa17 dengan 1 adalah ladder berukuran 100 bp, (B) Primer 16pa17
dengan 1 adalah ladder berukuran 1 kb. 2 dan 3 adalah contoh fragmen
DNA hasil amplifikasi.
4 Elektroforesis fragmen DNA untuk persiapan elusi dari fragmen DNA
dengan primer 10pa17 (pita DNA kiri) dan primer 16pa17 (pita DNA
kanan)
5 Elektroforesis hasil elusi fragmen DNA dengan primer 10pa17 (2) dan
primer 16pa17 (1)
6 Peta vektor pGemT-Easy (Promega 2010)
7 Koloni E.coli yang tumbuh dari fragmen DNA dengan (A) Primer
10pa17, (B) Primer 16pa17, (C) Kontrol positif

4

11

13

14
15
16
19

DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi pembuatan buffer TAE 50 kali (Tris-Acetate-EDTA)

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

(Setyari 2014)
Cara pembuatan loading dye 6 kali (Fermentas 2011)
Cara pembuatan media LB (Luria bertani) cair (Apriani 2008).
Cara pembuatan media LB (Luria bertani) agar (Apriani 2008).
Cara pembuatan TFB (Transformation Buffer) (Suharsono dan
Widyastuti 2010).
Cara pembuatan media 2xYT (Alimuddin dkk. 2008)
Cara pembuatan IPTG 0,1 M (Promega 2010)
Cara pembuatan X-Gal 50 mg/ml (Promega 2010)
Prosedur isolasi DNA genom menggunakan "DNeasy Plant Mini Kit"
dari Qiagen (2012)
Proses perbanyakan DNA dengan PCR (Vierstraete 1999)
Cara perhitungan perbandingan 3:1 antara DNA sisipan dengan DNA
vektor (Promega 2010).
Prosedur transformasi (Promega 2010)

24

24
24
24
25
25
25
25
26
27
27
28

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia sekarang ini telah dikenal sebagai negara penghasil gaharu di
dunia karena hutan tropis Indonesia dapat ditumbuhi secara luas oleh beberapa
jenis gaharu terbaik. Pohon gaharu terutama dikenal karena manfaatnya untuk
menghasilkan produk hutan berupa Hasil Hutan Bukan Kayu (HHBK) yang telah
memiliki nilai komersial tinggi disamping pemanfaatan kayunya. Salah satu
HHBK yang dihasilkan adalah gaharu atau resin yang berasal dari pohon
penghasil gaharu. Resin tersebut kemudian dapat dijadikan bahan baku terutama
untuk produk yang memerlukan zat wangi-wangian yang dihasilkan minyak
gaharu, serta dijadikan sebagai campuran dalam obat-obatan dan kosmetik.
Sejalan dengan semakin berkembangnya teknologi, maka semakin banyak pula
pemanfaatan untuk produk turunan gaharu, sehingga permintaan akan komoditi
gaharu juga semakin meningkat. Hal ini juga didukung pula dengan semakin
tingginya harga jual gaharu di pasaran dunia.
Perkembangan pesat gaharu yang dimulai sejak era tahun 1980an
membuat perdangangan ekspor gaharu terus mengalami peningkatan. Tercatat
pada tahun 1990-1998 ekspor gaharu mencapai 165 ton/tahun yang bernilai US$ 2
juta. Kemudian, tahun 2000 tercatat ekspor hingga 446 ton dengan nilai US$ 2,2
juta. Akan tetapi, memasuki tahun-tahun berikutnya ekspornya mulai menurun
seperti pada tahun 2002 dari kuota ekspor 300 ton/tahun tapi hanya terpenuhi
sekitar 10-15%. Selanjutnya, sejak tahun 2004 keadaan semakin buruk dengan
penurunan ekspor yakni dengan kuota 150 ton bahkan tidak tercatat adanya
transaksi ekspor dari hutan alam Indonesia (Sumarna 2009).
Kondisi penurunan jumlah produksi gaharu ini menunjukkan bahwa
keberadaan pohon penghasil gaharu di hutan alam semakin sedikit karena
perburuan gaharu dimana- mana yang disebabkan peningkatan jumlah permintaan
pasar internasional akan gaharu tersebut. Padahal awalnya produksi gaharu hanya
berasal dari pemungutan batang yang telah mati dan menangandung gaharu, tetapi
sekarang ini yang terjadi adalah perburuan hingga pada batang yang masih hidup.
Menurut Balitbanghut (2006) hal ini menyebabkan beberapa pohon penghasil
gaharu sejak tahun 2004 mengalami perubahan status menjadi Apendix II dalam
CITES (Convention on International in Trade Endangered of Wild Fauna and
Flora Species) untuk pohon dari genus Aquilaria spp. dan Gyrinops sp. Gaharu
jenis A. malaccensis sejak tahun 1995 sudah masuk dalam kategori Appendix II di
CITES (Ditjen PHKA 2005), sehingga perlu adanya pembatasan mengenai
kegiatan perdagangan internasional dari jenis gaharu tersebut agar tidak terancam
punah.
Hutan alam Indonesia yang tidak mampu memenuhi permintaan pasar
internasional yang terus meningkat harus diimbangi dengan cara pemenuhan lain
agar pendapatan untuk masyarakat ataupun untuk devisa negara yang berasal dari
ekspor juga tetap terpenuhi. Oleh karena itu, diperlukan upaya- upaya lain untuk
memenuhi kondisi tersebut, yakni dengan cara membudidayakan jenis-jenis
penghasil gaharu terbaik dan memiliki nilai komersial tinggi, yakni jenis A.
malaccensis.

2
Langkah awal untuk mengembangkan gaharu budidaya adalah dengan
seleksi pohon-pohon yang mempunyai gen untuk menghasilkan gaharu tersebut.
Oleh sebab itu, diperlukan teknik untuk membedakan antara tanaman penghasil
gaharu dengan yang tidak menghasilkan gaharu. Hal ini dapat dilakukan dengan
menggunakan mikrosatelit sebagai penanda untuk mengidentifikasi gen penghasil
gaharu.
Mikrosatelit atau Simple Sequence Repeats (SSRs) adalah salah satu
penanda DNA berdasarkan teknik PCR (Varshney et al. 2005). Penanda ini
menggunakan primer (potongan pendek DNA sintetik) yang mengandung motif
mikrosatelit pendek pada ujung 3’ atau 5’ atau mengapit daerah mikrosatelit. Saat
ini mikrosatelit dapat dipakai sebagai alat dalam program pemuliaan karena
kemampuan yang tinggi dalam mendeteksi perbedaan urutan basa, sampai satu
pasang basa. Penggunaan mikrosatelit relatif mudah karena menggunakan teknik
PCR. Hasil studi dengan menggunakan penanda mikrosatelit ini akan dijadikan
sebagai petunjuk untuk menentukan tanaman yang menghasilkan gaharu dengan
yang tidak menghasilkan gaharu. Oleh karena itu, perlu dikembangkan sebagai
bahan pembeda melalui analisis fragmen DN A melalui teknik pembentukan DNA
rekombinan atau kloning.
Perumusan Masalah
Fragmen DNA mikrosatelit yang diisolasi dari tanaman gaharu (A.
malaccensis Lamk.) digunakan untuk mengidentifikasi gen penginduksi gaharu
yang diperbanyak secara invitro. Hasil studi fragmen DNA mikrosatelit ini
kemudian perlu dikembangkan sebagai bahan pembeda antara tanaman penghasil
gaharu dengan tanaman yang tidak penghasil gaharu. Oleh karena itu, salah satu
teknik yang digunakan adalah dengan melakukan analisis fragmen DNA melalui
pembentukan DNA rekombinan atau kloning fragmen DNA mikrosatelit tersebut.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengisolasi dan mengklon fragmen
DNA mikrosatelit pada tanaman gaharu (A. malaccensis Lamk.) untuk
mengidentifikasi gen penginduksi gaharu sebagai salah satu cara untuk pemuliaan
tanaman dan konservasi sumberdaya genetik tanaman A. malaccensis.
Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah memberikan informasi
mengenai hasil isolasi dan kloning fragmen DNA mikrosatelit dari tanaman
gaharu (A. malaccensis Lamk.) yang akan dikembangkan sebagai bahan pembeda
antara tanaman yang menghasilkan gaharu dengan yang tidak menghasilkan
gaharu. Hal tersebut merupakan penunjang program pemuliaan dan konservasi
sumberdaya genetik tanaman gaharu guna pengembangan gaharu hasil budidaya.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah isolasi DNA genom, amplifikasi lokus
mikrosatelit gaharu dengan PCR, isolasi fragmen DNA mikrosatelit hasil PCR,

3
serta pembentukan DNA rekombinan atau kloning fragmen DNA mikrosatelit dari
tanaman gaharu (Aquilaria malaccensis Lamk).

METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada Januari 2014–Juli 2014. Penelitian ini
berlokasi di tiga laboratorium yakni Laboratorium Genetika Hutan, Departemen
Silvikultur, Fakultas Kehutanan, IPB, Laboratorium Bioteknologi, SEAMEOBIOTROP, serta Laboratorium BIORIN, PPSHB IPB.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan yakni sampel daun yang berasal dari bibit gaharu
jenis A. malaccensis usia 3 bulan yang didapatkan dari persemaian Pusat
Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Gunung Batu, Bogor, nitrogen cair,
DNeasy Plant Mini Kit dari Qiagen (2012), PVP 26% (b/v), agarosa, buffer TAE
50 kali (Tris-Acetate-EDTA) (Lampiran 1), gel red, EtBr (Ethidium Bromide),
blue juice 6 kali (Lampiran 2), DNA lambda 50 ng/µl, primer mikrosatelit
10pa17 dan 16pa17 dengan konsentrasi 10 µM untuk forward dan reverse, PCR
Nucleotide Mix 10 mM, DNA Taq polymerase 5U/µl, MgCl2 25 mM, 5X Go taq
flexi buffer, nuklease free water, Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit dari
Geneaid (2008), vektor pGEM-T Easy, T4 DNA ligase, buffer T4 DNA ligase 2X,
bakteri E. coli strain DH5α berbentuk gliserol, media LB (Luria bertani) cair
(Lampiran 3), LB agar (Lampiran 4), TFB (Tranformation buffer) (Lampiran 5),
DMSO (Dimethyl sulfoxide), media cair 2xYT atau recovery media (Lampiran 6),
alkohol, antibiotik ampicilin, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 0,1
M (Lampiran 7), X- gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside)
50 mg/ml (Lampiran 8).
Alat yang digunakan terdiri atas autoclave, gunting, mortar, pestle, spatula,
tube berukuran 2 ml, 1,5 ml, 0,5 ml, rak tube, pipet mikro, tips, vortex, spatula,
gabus, mesin sentrifuge, waterbath, freezer, timbangan analitik, tabung
erlenmeyer, gelas ukur, labu takar, gelas piala, sisir, cetakan agar, dan mesin
elektroforesis, Kodak Gel Logic 200, mesin PCR thermal cycler Applied
Biosystems, pestile, mesin UV, lemari es, tusuk gigi, shaker incubator, cawan
Petri, heat shock, inkubator, batang kaca, bunsen, laminar air flow, kertas sil,
plastik wrap, sprayer, oven, sarung tangan, masker, jas laboratorium, dan termos.
Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian yang akan dilakukan disajikan pada bagan alur
penelitian yang terdapat Gambar 1.

4
Pengadaan Bibit
Aqularia
malaccensis

Pengambilan
sampel daun

Isolasi DNA
Genom

Uji Kualitas
DNA

Kloning fragmen
DNA

Elusi DNA

PCR Amplifikasi
dengan Primer
Mikrosatelit

Gambar 1 Bagan alur penelitian
Pengambilan Sampel Daun
Daun gaharu (A. malaccensis) yang digunakan berasal dari persemaian
Pusat Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Gunung Batu, Bogor. Bibit
gaharu yang digunakan berusia tiga bulan dengan tinggi 30-40 cm. Daun gaharu
yang diutamakan sebagai sampel adalah daun muda seberat 100 g yang berada
pada bagian pucuk.
Isolasi DNA Genom
Protokol ekstraksi DNA yang digunakan adalah dengan DNeasy Plant
Mini Kit dari Qiagen (2012). Sampel daun basah seberat 100 g disiapkan sebagai
bahan untuk proses disrupsi jaringan tanaman. Sampel daun tersebut ditambahkan
nitrogen cair, lalu digerus pada mortar hingga sampel menjadi serbuk yang halus.
Proses selanjutnya adalah lisis organel tanaman. Serbuk halus tersebut
dimasukkan ke dalam mikrotube yang telah berisi campuran 400 µl buffer AP1,
40 µl PVP 26%, dan 4 µl RNase A stock (100 mg/ml) dan divortex selama 2
menit. Selanjutnya, campuran diinkubasi ke dalam waterbath pada suhu 65o C
selama 30 menit sambil membolak-balikkan tube sebanyak 2-3 kali.
Selanjutnya adalah pemisahan DNA dengan kotorannya, seperti protein,
polisakarida, dan polifenol. 150 µl buffer P3 ditambahkan pada lysate dan
diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu -20o C. Sentrifuge lysate dengan
kecepatan 14 000 rpm selama 5 menit dan tranfer lysate ke dalam QIAshredder
spin colomn. Setelah itu, sentrifuge kembali lysate dengan kecepatan 14 000 rpm
selama 2 menit hingga terbentuk pellet. Cairan yang lewat membran tersebut
ditransfer ke dalam mikrotube baru (ukuran 2 ml) tanpa mengganggu pellet yang
telah terbentuk. Setelah pellet terbentuk, maka buffer AW1 sebanyak 1,5 volume
ditambahkan, lalu dicampur dengan teknik pipetting.
650 µl dari campuran di atas dimasukkan ke dalam DNeasy mini spin
colomn dan sentrifuge dengan kecepatan 8 000 rpm selama 1 menit. Cairan yang
telah melewati membran mini spin colomn tersebut kemudian dibuang. Jika
campuran masih bersisa, maka lakukan kembali sentrifuge 8 000 rpm selama 1
menit. Cairan yang telah melewati membran mini spin colomn, lalu dibuang
kembali. Setelah itu, 500 µl buffer AW2 ditambahkan ke dalam mini spin colomn
dan sentrifuge dengan kecepatan 8 000 rpm selama 1 menit. Cairan yang melewati
membran mini spin colomn tersebut dibuang. Setelah itu, collection tube diganti
dengan mikrotube berukuran 1,5 ml. Kemudian, 100 µl buffer AE ditambahkan

5
dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Selanjutnya, sentrifuge dengan
kecepatan 8 000 rpm selama 1 menit. Ulangi langkah penambahan 100 µl buffer
AE, hingga didapatkan volume DNA sebanyak 200 µl. Prosedur isolasi DNA
genom dengan menggunakan DNeasy Plant Mini Kit dari Qiagen (2012)
(Lampiran 9).
Uji Kualitas DNA dengan Elektroforesis
Elektroforesis dilakukan berdasarkan metode Sambrook dan Russell
(2001). Gel agarosa 1% (b/v) disiapkan dari 0,3 g agarosa yang dilarutkan dalam
30 ml buffer TAE 1 kali pada tabung erlenmeyer. Larutan dipanaskan di dalam
microwave selama 1 menit hingga didapatkan larutan yang bening. Setelah itu, 1
µl gel red dimasukkan ke dalam larutan bening tersebut. Kemudian larutan
dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan bersama sisirnya. Biarkan
hingga agarosa telah menjadi gel yang sudah mengeras. Selanjutnya, gel tersebut
dimasukkan ke dalam mesin eletroforesis yang telah berisi buffer TAE 1 kali yang
dibuat dari komposisi bahan TAE 50 kali (Lampiran 1).
10 ml TAE 50 kali ditambahkan ke dalam 490 ml aquadest, sehingga TAE
50 kali akan menjadi TAE 1 kali. 5 µl DNA genom hasil ekstraksi dicampurkan
dengan 2 µl blue juice 6 kali dan dicampurkan dengan teknik pipetting. Campuran
tersebut dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat pada cetakan. Buat agar
seluruh gel agarosa telah terendam buffer TAE 1 kali pada mesin elektroforesis.
Setelah semua sampel dimasukkan nyalakan mesin elektroforesis dengan
tegangan 75 Volt selama 60 menit. Hasil proses running kemudian divisualisasi
dengan mesin Kodak Gel Logic 200.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
1 µl DNA cetakan diencerkan 10 kali yang akan digunakan sebagai salah
satu komponen bahan PCR. Komposisi reaksi PCR ini dibuat berdasarkan GoTaq
PCR Core Systems dari Promega (2009) dengan volume akhir 25 µl/reaksi, seperti
yang terdapat pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi bahan PCR (Promega 2009)
Bahan
DNA cetakan (20 ng/µl)
Primer forward 10 mM
Primer reverse 10 mM
PCR NucleotideMix (10 mM)
Go Taq DNA polymerase (5 U/µl)
MgCl2 (25 mM)
5X Green Go Taqflexi buffer
Nuklease Free Water
Volume akhir

1 kali reaksi
10 µl
2 µl
2 µl
0,5 µl
0,4 µl
2,5 µl
5 µl
2,6 µl
25 µl

Konsentrasi akhir
0,2 µg/25µl
0,8 mM
0,8 mM
200 µM
2 U/25µl
2,5 mM
1X

Primer mikrosatelit yang digunakan pada penelitian ini ada 2, yakni 10pa17
dan 16pa17. Urutan primer yang digunakan dalam penelitian ini terdapat pada
Tabel 2.

6
Tabel 2 Primer mikrosatelit 10pa17 dan 16pa17 (Eurlings et al. 2009)
Locus
10pa17
16pa17

Primer Sequence
F:3’ ACACACTGTTATGGTCTACAGCTT 5’
R:5’ CGCCATCTCATAATATTCTAATGTA 3’
F:3’ AGTGAACAACTTGACTAGGCTTG 5’
R:5’ GCTGAACACAACAAGATATCACC 3’

Repeat
(CA)12

Size Range
(bp)
152 - 156

Number of
alleles
3

TA
(°C)
50

(CA)19

143 - 155

6

59

Primer mikrosatelit 10pa17 memiliki suhu annealing 50 o C, sedangkan
primer mikrosatelit 16pa17 memiliki suhu annealing 59 o C, seperti yang terlihat
pada Tabel 2. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam mikrotube 0,5 ml. Setelah
itu, campuran divortex selama 3-5 detik dan dispin. Selanjutnya, dimasukkan ke
dalam mesin PCR thermal cycler Applied Biosystems. Proses di dalam mesin PCR
diatur sesuai dengan tiap tahapnya seperti yang ditampilkan pada Tabel 3.
Tabel 3 Kondisi PCR
Tahapan
Pradenaturasi
Denaturasi
Annealing
Elongasi
Postelongasi

Suhu (°C)
94
94
50-59
72
72

Waktu
5’
30”
1’
30”
7’

∑ Siklus
1
35
35
35
1

Proses perbanyakan DNA melalui mesin PCR (Lampiran 10). Setelah
dilakukan PCR, maka DNA tersebut akan dielektroforesis kembali pada gel
agarosa 2% (b/v). Kondisi PCR yang digunakan didapat dari proses optimasi
waktu dan suhu annealing PCR.
Purifikasi Hasil PCR
Purifikasi hasil PCR dilakukan dengan Gel/PCR DNA Fragments
Extraction Kit dari Geneaid (2008) pada bagian PCR Clean Up Protocol yang
dilakukan melalui empat proses. Proses pertama adalah p emisahan/penguraian gel.
Gel agarose yang mengandung pita-pita DNA produk PCR hasil elektroforesis
sebanyak 100 µl dipotong-potong pada mesin UV.
Gel tersebut dicacah di atas cawan petri dan dimasukkan ke dalam tube 1,5
ml dan ditambahkan dengan 500 µl DF buffer, lalu divortex. Selanjutnya,
diinkubasi pada suhu 55-60 o C selama 10-15 menit sambil dibolak-balikkan
selama 2-3 kali. Jika sudah selesai, dinginkan pada suhu ruang. Proses yang kedua
adalah DNA binding/pengikatan DNA. 800 µl campuran gel tersebut ditransfer ke
dalam DF colomn yang telah ditempatkan pada collection tube 2 ml. Sentrifuge
selama 2 menit pada kecepatan penuh dan cairan dibuang, lalu DF column
ditempatkan kembali pada collection tube (jika > 800 µl campuran gel, maka
ulangi tahap ini).
Proses yang ketiga adalah pencucian DNA. 400 µl buffer W1 ditambahkan
ke dalam DF colomn dan sentrifuge selama 2 menit pada kecepatan penuh. Cairan
dibuang dan DF column ditempatkan kembali pada collection tube. Kemudian,
600 µl wash buffer ditambahkan dan sentrifuge selama 2 menit pada kecepatan

7
penuh. Setelah itu, cairan dibuang dan DF colomn ditempatkan kembali pada
collection tube dan sentrifuge kembali selama 10 menit pada kecepatan penuh
untuk mengeringkan matriks. Proses yang keempat adalah elusi DNA. DF colomn
kering dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml baru, lalu 30 µl elution buffer
ditambahkan pada DF colomn kering. Biarkan selama beberapa saat hingga
elution buffer terserap seluruhnya ke dalam matriks dan sentrifuge kembali selama
10 menit pada kecepatan penuh untuk mendapatk an produk PCR yang telah murni.
Ligasi DNA Plasmid dengan Fragmen DNA Target.
Proses ligasi dilakukan dengan vektor pGemT-Easy (Promega 2010).
Reaksi yang dilakukan seperti pada Tabel 4.
Tabel 4 Reaksi ligasi
Bahan
DNA sisipan 2,5 ng
DNA vektor pGemT-Easy 50 ng
T4 DNA ligase
Buffer ligasi
Nuclease free water
Total

Volume untuk primer
10pa17 (µl)
1
1
0,2
1
6,8
10

Volume untuk primer
16pa17 (µl)
0,5
1
0,2
1
7,3
10

Komponen tersebut dicampurkan dan diinkubasi pada suhu 4°C selama 16 jam.
Konsentrasi DNA sisipan yang digunakan sebesar 2,5 ng yang didapat melalui
perbandingan ukuran dan konsentrasi antara stock DNA sisipan dengan DNA
vektor sebesar 3:1 (Lampiran 11).
Pembuatan Sel Kompeten
Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan metode Zhiming (2005).
Bakteri E.coli strain DH5α yang berbentuk gliserol disiapkan sebanyak 100 µl
untuk dikulturkan ke dalam media 2 ml LB cair. Campuran gliserol+LB cair
diinkubasikan pada shaker incubator pada suhu 37 o C dengan kecepatan 150 rpm
selama 16-20 jam. Setelah itu, hasil kultur tersebut digoreskan ke dalam media LB
agar dan diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 o C selama 16-20 jam untuk
peremajaan bakteri. Langkah selanjutnya, koloni tunggal bakteri yang terbentuk
pada media LB agar diambil dan dimasukkan ke dalam media 2 ml LB cair. Lalu,
diinkubasi di shaker incubator pada suhu 37 o C dengan kecepatan 150 rpm selama
16-20 jam.
1 ml kultur bakteri E.coli strain DH5α tersebut dimasukkan ke dalam 10 ml
LB cair untuk pembuatan subkultur. Kemudian, diinkubasi pada shaker incubator
pada suhu 37 o C dengan kecepatan 150 rpm selama 2,5 jam. Setelah itu, 1,5 ml
subkultur diambil dan dimasukkan pada masing- masing tube 1,5 ml sesuai dengan
kebutuhan sampel untuk transformasi. Tube-tube yang telah berisi hasil subkultur
tersebut disentrifuge pada suhu 4 o C selama 10 menit dengan kecepatan 5 000 rpm
hingga terbentuklah pellet bakteri. Cairan hasil sentrifuge dibuang pada wadah

8
yang berisi subkultur tanpa adanya kontak antara mulut tube dengan mulut wadah
subkultur untuk menghindari kontaminasi.
Selanjutnya, 495 µl transformation buffer ditambahkan sambil
disuspensikan, lalu diinkubasi di es selama 10 menit. Selanjutnya sentrifuge pada
suhu 4°C selama 10 menit dengan kecepatan 5 000 rpm. Cairan hasil sentrifuge
dibuang kembali pada wadah yang berisi subkultur dengan hati- hati. 125 µl
transformation buffer dan 8,8 µl DMSO ditambahkan, lalu disuspensikan dengan
endapan (sambil diaduk dengan mengetuk- ngetukkan dasar tube dengan jari
secara perlahan) dan diinkubasi dalam es selama 10 menit. Tiap 50 µl suspensi sel
kompeten disimpan ke dalam tiap tube 1,5 ml dan siap untuk digunakan.
Transformasi dan Seleksi DNA Rekombinan
Transformasi dilakukan dengan metode kejut panas (Suharsono dan
Widyastuti 2010). Prosedur transformasi (Lampiran 12). 10 µl reaksi ligase
dimasukkan ke dalam tube yang telah berisi 50 µl sel bakteri kompeten (sambil
diaduk dengan mengetuk- ngetukkan dasar tube dengan jari secara perlahan) dan
diinkubasi di es selama 20 menit. Kemudian, campuran sel kompeten dan ligasi
dipanaskan pada mesin heat shock pada suhu 42°C, selama 45 detik. Setelah itu,
langsung diangkat dan diinkubasikan kembali ke dalam es selama 5 menit. Setelah
melakukan langkah heatshock, tube dipindahkan ke suhu ruang dan 100 µl
recovery media yakni media cair 2xYT ditambahkan pada campuran reaksi
tersebut dan diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 250 rpm, suhu
37°C selama 1 jam.
Selanjutnya adalah tahap seleksi DNA rekombinan. 50 µl X- gal dan 10 µl
IPTG ditambahkan pada masing- masing campuran reaksi. Setelah tercampur,
maka bakteri ditebar di atas media LB agar dengan menggunakan batang kaca
steril hingga mengering (telah dicelupkan dalam alkohol dan dibakar oleh api
bunsen dan biarkan mendingin). Media LB agar tersebut ada yang mengandung
antibiotik ampisilin ataupun yang tidak mengandung ampicilin sebagai kontrol.
Apabila substrat sudah disiapkan, proses seleksi sisipan plasmid dapat
diduga melalui marka seleksi dari gen lacZ. Bakteri yang tersisipi fragmen DNA
MCS (Multiple Cloning Sites) pada daerah gen lacZ di dalam plasmidnya akan
berwarna putih, sedangkan yang tidak tersisipi akan berwarna biru dan mati.
Setelah itu, cawan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 16 jam dengan posisi
cawan terbalik. DNA rekombinan yang terbentuk akan berukuran putih,
sedangkan nonrekombinan berwarna biru (Suharsono dan Widyastuti 2010).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA Genom Tanaman Gaharu
Sampel gaharu diperoleh dari bibit gaharu yang berasal dari persemaian
Pusat Penelitian dan Pengembangan Kehutanan, Gunung Batu, Bogor. Isolasi
DNA genom tanaman gaharu dilakukan dengan mengekstrak daun bibit gaharu
menggunakan DNeasy Plant Mini Kit dari Qiagen (2012). Terdapat tiga jenis

9
DNA yakni DNA inti, DNA kloroplas, dan DNA mitokondira. DNeasy Plant Mini
Kit dari Qiagen (2012) ini memiliki cara kerja untuk mengektrak total DNA.
DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) merupakan susunan sistematis dari
polimer asam nukleat yang membawa informasi genetik kepada keturunannya
(Yuwono 2009). Watson dan Crick pada tahun 1953 menemukan bahwa struktur
asam nukleat DNA adalah double helix yang memutar ke arah kanan (Gaffar
2007). Struktur seperti ini dikarenakan DNA tersusun atas dua rantai nukleotida
yang dihubungkan oleh ikatan hidrogen, sedangkan antar nukleotida dalam satu
rantai linier tersebut dihubungkan oleh ikatan phospodiester (Sriati 2011). DNA
genom adalah satu set lengkap atau keseluruhan informasi genetik yang terdapat
pada suatu organisme (Weaver dan Hedrick 1997). Isolasi DNA genom ada lah
suatu cara untuk memisahkan molekul DNA yang mengandung keseluruhan
informasi genetik dari molekul lainnya pada suatu organisme. Isolasi DNA genom
merupakan langkah awal yang digunakan untuk menyalurkan informasi genetik.
Isolasi DNA genom diawali dengan disrupsi jaringan tanaman melalui
penghancuran dinding sel tanaman dengan cara menggerus daun hingga menjadi
seperti bubuk dengan bantuan nitrogen cair. Sampel daun basah yang digunakan
seberat 100 mg yang sebelumnya dipotong-potong terlebih dahulu karena sifat
daun gaharu yang berserat (Weising et al. 2005).
Disrupsi ini dilakukan secara fisik menggunakan metode freezing-thawing
yakni dengan penggerusan sampel yang telah ditambahkan nitogen cair dengan
menggunakan mortar dan pestle. Kehadiran nitrogen cair juga berfungsi untuk
mempermudah degradasi dinding sel tanaman yang akan diekstrak sehingga
mengeluarkan seluruh isi sel. Tahapan awal dilakukan dengan melisiskan dinding
sel yang bertujuan untuk mengeluarkan seluruh isi di dalam sel (Holme dan Hazel
1998).
Potongan-potongan daun yang telah menjadi bubuk dimasukkan ke dalam
campuran buffer AP1, PVP, dan RNase yang ada pada mikrotube. Buffer AP1
merupakan buffer lisis yang terdiri atas detergen seperti CTAB, buffer system
seperti Tris-HCl, garam seperti NaCl, serta agen pereduksi seperti βmerkaptoetanol. Detergent CTAB (cethyl trimethylammonium bromide) berfungsi
untuk melisiskan membran sel tanaman (Bettelheim dan Landesberg 2007) serta
mendenaturasikan dan memisahkan protein dari DNA (Weising et al. 2005).
Tris-HCl berguna untuk mengatur kondisi keasaman atau pH agar enzim
pendegradasi tidak dapat berkerja secara optimal (Weising et al. 2005). Garam
NaCl yang digunakan harus memiliki konsentrasi > 1 M karena fungsi utamanya
adalah untuk mendegradasi polisakarida dan memisahkan protein yang terdapat
pada inti sel dari DNA (Weising et al. 2005).
β-merkaptoetanol berfungsi untuk menghilangkan polifenol. Polifenol ini
perlu dihilangkan dari sel tanaman karena keberadaannya sebagai inhibitor enzim
Taq polymerase saat proses amplifikasi. Kemudian, senyawa ini perlu dihilangkan
karena dapat mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebski et al. 1997). Di
samping itu,juga mengandung agen pengkelat seperti EDTA (Etilen Diamin
Tetraasetik Acid) yang berfungsi untuk mengikat ion magnesium yang merupakan
kofaktor enzim DNase (Corkill dan Rapley 2008). Oleh karena itu, zat pengkelat
ini membantu menghancurkan sel dan menginaktifkan enzim DNase (nuklease)
yang dapat mendenaturasi DNA. Secara keseluruhan Buffer AP1 ini berfungsi

10
untuk melisiskan membran sel dan organel-organel yang telah keluar dari dalam
sel.
Dimodifikasi dengan penambahan PVP (polyvinyl pyrrolidon) 26% yang
berfungsi untuk mereduksi polisakarida dan penjerat polifenol yang banyak di sel
tanaman (Weising et al. 2005). RNase A adalah enzim yang berfungsi untuk
mendegradasi RNA agar tidak mengkontaminasi DNA. proses melisiskan
membran dan organel sel ini juga dibantu dengan menginkubasi sampel pada suhu
65o C.
Tahap selanjutnya adalah presipitasi dari agen-agen pengotor dengan
memberikan buffer P3 dan mengikubasinya ke dalam suhu -20o C. Buffer P3 ini
berisi asam asetat yang berfungsi sebagai neutralization buffer. Penambahan
buffer P3 ini dimaksudkan untuk menetralkan reaksi dalam tube dan menjaga agar
pH reaksi tersebut tidak basa. Hasilnya dapat dilihat melalui sentrifuge dengan
kecepatan 14 000 rpm sehingga terbentuklah dua lapisan padat dan cair. Pada
akhir tahap ini DNA akan terpisah dengan komponen lainnya setelah mengalami
sentrifuge sehingga terbentuk dua lapisan yakni fase organik pada lapisan bawah
yang berisi protein dan lipid, serta lapisan aquoeus (cairan) yang merupakan hasil
presipitasi yang berisi DNA (Weising et al. 2005).
Lapisan atas kemudian dimasukkan dalam QIAshredder tube untuk
disentrifuge sehingga dihasilkan pellet yang merupakan lanjutan proses presipitasi
protein dan polisakarida dari tahap sebelumnya. Cairan yang melewati membran
QIAshredder tersebut yang digunakan untuk tahap presipitas DNA. Presipitasi
DNA dari molekul- molekul lain seperti protein dengan cara menambahkan buffer
AW1 yang berisi guanidine hydrochloride yang telah dicampur ethanol.
Guanidine-HCl ini merupakan garam chaotropic yang sangat berguna untuk
mendegradasi protein-protein sel ataupun jaringan (Novel 2010), sedangkan
ethanol yang berfungsi untuk mengendapkan atau presipitasi DNA (Walker dan
Rapley 2002).
Molekul- molekul DNA akan tertahan pada membran mini spin colomn
setelah disentrifuge. Tahap selanjutnya adalah pemurnian DNA dengan cara
penambahan buffer AW2 yang merupakan wash buffer. Wash buffer ini digunakan
dengan tujuan untuk mencuci molekul DNA. Tahap akhir adalah elusi DNA
dengan menggunakan buffer AE yang merupakan campuran buffer TE dan ethanol
pada tube baru.
Fungsi buffer ini adalah untuk melarutkan DNA dengan mengurangi daya
ikat atau afinitas molekul DNA dari membran mini spin colomn sehingga molekul
DNA tercampur dengan larutan buffer AE pada tube baru (Novel 2010). Buffer
TE yang ditambahkan peda pellet DNA berfungsi untuk memisahkan RNA dari
DNA (Keller and Mark 1989) serta membuat DNA dapat disimpan dalam waktu
berminggu- minggu (Verkuil et al. 2008). Proses ini dilakukan dua kali dengan
masing- masing volume buffer AE adalah 100 µl, sehingga volume akhir template
DNA adalah 200 µl. Setelah itu, sampel DNA dapat disimpan pada freezer
bersuhu -20o C.
Template DNA tersebut kemudian dapat diperiksa keberadaannya dengan
cara dielektroforesis. Elektroforesis merupakan metode umum yang digunakan
untuk memisahkan molekul organik, seperti DNA, sehingga dapat berguna untuk
menentukan berat molekul DNA melalui aliran medan listrik (Ausubel et al.
1998). Clark (1997) menyatakan bahwa hal ini dikarenakan molekul DNA

11
bermuatan negatif, sehingga ketika dialiri oleh arus listrik, maka akan mengalami
migrasi dari kutub negatif (anoda) ke positif (katoda). Media yang digunakan
adalah gel agarosa. Pemilihan gel agarosa dikarenakan agarosa tidak bersifat
karsinogenik, seperti halnya acrylamide (Larasati 2001).
Sampel DNA yang digunakan kemudian dicampur terlebih dahulu dengan
loading dye atau blue juice yang berisi dua zat warna yaitu bromophenol biru dan
xilena cyanol FF yang berfungsi untuk melacak migrasi DNA secara visual. Selan
itu, loading dye juga mengandung gliserol yang berfungsi sebagai pemberat,
sehingga DNA akan membentuk suatu lapisan pada bagia n bawah cetakan gel
(Fermentas 2011). Gambar 2 merupakan hasil visualisasi DNA yang telah
diisolasi menggunakan DNeasy Plant Mini Kit dari Qiagen (2012).
1

2

3

4

5

6

Gambar 2 Elektroforesis hasil isolasi DNA genom pada gel agarosa 1% (b/v). 1
dan 2 adalah DNA lambda dengan konsentrasi 5 ng/µl dan 10 ng/µl. 3,
4, 5, dan 6 adalah DNA genom dengan konsentrasi 10 ng/µl, 20 ng/µl,
10 ng/µl, 20 ng/µl.
Empat pita DNA tanaman gaharu yang berasal dari individu- individu yang
berbeda-beda yang diperlihatkan pada Tabel 5 berikut ini.
Tabel 5 Ukuran konsentrasi DNA genom dari empat individu
No Sumur
3
4
5
6

Konsentrasi (ng/µl)
10
20
10
20

Pengukuran konsentrasi hasil isolasi DNA genom dari empat individu
tanaman gaharu didasarkan pada perbandingan dengan konsentrasi marker DNA
lambda yang digunakan. Marker DNA lambda merupakan DNA yang telah
diketahui konsentrasinya sehingga dapat digunakan sebagai acuan dalam
menentukan konsentrasi DNA dari sampel yang digunakan. Nomor 1 adalah
marker DNA lambda dengan konsentrasi 5 ng/µl, sedangkan nomor 2 berukuran
10 ng/µl. Sampel DNA nomor 3, 4, 5, dan 6 dapat diketahui konsentrasinya
dengan cara membandingkan ketebalan pita DNA dari keempat individu tersebut
dengan pita DNA lambda, sehingga mendapatkan hasil pengukuran konsentrasi
seperti yang terdapat pada Tabel 5. Selanjutnya untuk tahap perbanyakan fragmen
DNA gaharu dengan PCR hanya menggunakan satu sampel yakni dari individu
nomor 6 yang berkonsentrasi 20 ng/µl, sedangkan yang lainnya dijadikan sebagai
persediaan DNA.

12
Perbanyakan Fragmen DNA Gaharu dengan PCR
Amplifikasi fragmen DNA merupakan reaksi rantai polimerase yakni
metode melipatgandakan fragmen DNA berupa sekuen nukleotida atau
oligonukleotida secara eksponensial yang dilakukan dengan bantuan enzimatis
dan secara invitro (Yuwono 2006). Terdapat 5 komponen penting dalam
melakukan reaksi rantai polimerase (PCR) yakni : template DNA; oligonukleotida
primer; deoksinukleotide triphosphate (dNTP) yang terdiri atas dATP, dTTP,
dGTP, dCTP; enzim Taq polymerase, serta buffer PCR (Yuwono 2006). Kelima
komponen ini akan sangat mempengaruhi produk PCR.
Template DNA berfungsi menyediakan cetakan utas ganda DNA yang
mengandung DNA target yang akan diamplifikasi. DNA target ini dapat di PCR
langsung tanpa melalui proses pemurnian terlebih dahulu. Konsentrasi yang
digunakan untuk melakukan reaksi PCR harus diencerka terlebih dahulu 10X
untuk meningkatkan efisiensi proses amplifikasi. Template DNA yang digunakan
untuk proses PCR memiliki konsentrasi stock sebesar 20 ng/µl, sehingga setelah
diencerkan akan memiliki konsentrasi akhir 2 ng.
Primer merupakan sekuen basa-basa nukleotida atau oligonukleotida yang
berperan dalam memulai proses penggandaan DNA dengan cara menempel pada
bagian template DNA tertentu yang merupakan komplemen dari sekuen basa-basa
primer. Terdapat dua jenis primer yakni primer yang berada sebelum daerah target
disebut dengan primer forward dan primer yang berada setelah daerah target yang
disebut dengan primer reverse (Muladno 2010). Hal yang harus diperhatikan
dalam sebuah primer adalah panjang primer, komposisi primer, melting
temperature, dan interaksi antar primer-primer (Handoyo dan Rudiretna 2010).
Panjang primer secara umum adalah 18-30 nukleotida. Apabila sekuen
primer yang kurang atau lebih dari range tersebut dikhawatirkan dapat
menimbulkan ketidakspesifikan proses annealing. Komposisi primer yang dapat
mempengaruhi hasil PCR adalah G+C contens (%) yakni dikatakan cukup baik
apabila primer tersebut memiliki % G+C sebesar 50-60%. Hal ini berfungsi untuk
mencegah terjadinya mispriming (kesalahan penempelan) terutama pada daerahdaerah yang kaya akan G+C (Gelfand dan White 1990).
Temperature melting (Tm) adalah suhu ketika setengah dari rantai
template DNA sudah mengalami denaturasi. Tm ini sangat dipengaruhi oleh
panjang dan komposisi primer dan sangat mempengaruhi proses annealing DNAprimer. Secara umum suhu annealing berada 5o C dibawah Tm (Muladno 2010).
Interaksi primer-primer yang dimaksud adalah yang dapat menimbulkan
mispriming. Penelitian ini menggunakan penanda mikrosatelit sehingga memiliki
panjang fragmen 23-25 nukleotida dan persentase G+C sebesar 32-50%.
Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah primer dari penanda
mikrosatelit atau simple sequence repeats (SSRs) yang berisi motif urutan DNA
pendek yang tersusun secara tandem. Weising (2005) menyatakan bahwa urutan
DNA yang ada pada daerah apit dari primer mikrosatelit ini dapat digunakan untk
merancang suatu lokus spesifik dari pasangan primer PCR. Hal ini dapat dijadikan
informasi untuk merancang suatu primer spesifik yang bisa digunakan untuk
membedakan tanaman penghasil gaharu dengan yang tidak menghasilkan gaharu
apabila fragmen DNA mikrosatelit tersebut telah dikloning.

13
Komponen berikutnya adalah dNTP yang berfungsi sebagai bahan utama
amplifikasi DNA. Enzim Taq polymerase merupakan enzim yang digunakan
untuk mengkatalisis saat proses polimerisasi terjadi antara template DNA-primer.
Buffer PCR berisi Tris-HCl dan KCl yang berfungsi untuk menjaga pH dalam
membantu kerja enzim Taq polymerase.
Tahapan PCR yakni denaturasi, annealing (penempelan), dan ekstensi
(pemanjangan) juga sangat mempengaruhi keberhasilan proses PCR dari aspek
suhu dan waktu amplifikasi. Perbedaan suhu pada tahap annealing akan sangat
memengaruhi produk PCR karena sangat disesuaikan dengan tiap primer yang
digunakan. Gambar 3 berikut adalah hasil amplifikasi untuk primer mikrosatelit
gaharu.
1 2 3
200 bp

1

2

3

250 bp

A

B

Gambar 3 Elektroforesis hasil PCR fragmen DNA menggunakan (A) Primer
10pa17 dengan 1 adalah ladder berukuran 100 bp, (B) Primer
16pa17 dengan 1 adalah ladder berukuran 1 kb. 2 dan 3 adalah
contoh fragmen DNA hasil amplifikasi.
Dua primer yakni 10pa17 dan 16pa17 merupakan suatu pita DNA tunggal
yang merupakan persyaratan untuk proses kloning dari produk PCR. Nomor 1
adalah ladder berukuran 100 bp untuk Gambar 3(A) dan ladder berukuran 1 kb
untuk Gambar 3(B). Hasil Gambar 3 tersebut menunjukkan panjang rantai DNA
yang telah terbentuk sebesar 150 bp. Hal ini dikarenakan pita DNA hasil
amplifikasi primer 10pa17 (sampel nomor 3) berada pada ladder yang berukuran
100 bp dan 200 bp (Gambar 3A). Begitu pula dengan pita DNA hasil amplifikasi
primer 16pa17 (sampel nomor 3) yang berada di bawah ladder yang berukuran
250 bp (Gambar 3B).
Pita tunggal hasil PCR ini didapatkan melalui hasil optimasi suhu PCR.
Suhu annealing yang digunakan untuk amplifikasi primer 10pa17 adalah 50 o C,
sedangkan untuk primer 16pa17 adalah 59 o C. Selain optimasi suhu juga
dilakukan optimasi pada waktu tahap annealing. Primer dengan panjang 18-22
nukleotida cukup dengan waktu 30 detik, sedangkan primer dengan panjang lebih
dari 22 nukleotida membutuhkan waktu 60 detik (Handoyo dan Rudiretna 2010).
Hal ini dikarenakan primer yang memiliki basa-basa nukleotida lebih banyak akan
mengalami proses polimerisasi yang lebih panjang sehingga akan membutuhkan
waktu yang lebih lama saat tahap penempelan “annealing”.
Pembentukan DNA Rekombinan
Kloning adalah suatu proses pembentukan salinan suatu gen dengan
menggunakan prinsip DNA rekombinan (Brooker 2005). DNA rekombinan dibuat
dengan cara menyisipkan DNA target ke dalam suatu vektor. Wong (1997)

14
menyatakan bahwa vektor rekombinan yang merupakan agen yang tersisipi oleh
DNA target akan ikut terbawa ketika sel inang yang telah mengalami proses
transformasi melakukan pembelahan, sehingga koloni sel inang akan
menghasilkan salinan identik dari DNA target.
Penyiapan DNA Sisipan
DNA sisipan disiapkan dengan melakukan elusi yakni suatu proses
pemurnian atau isolasi produk PCR yang dilakukan melalui kegiatan preparasi gel
agarose. Penelitian kloning fragmen DNA membutuhkan fragmen DNA dengan
kualitas yang baik, sehingga tahap pemurnian melalui teknik elusi ini sangat
dibutuhkan. Hasil proses running untuk persiapan pemurnian DNA diperlihatkan
pada Gambar 4 berikut ini.
10pa17

16pa17
250 bp

Gambar 4 Elektroforesis fragmen DNA untuk persiapan elusi dengan primer
10pa17 (pita DNA kiri) dan primer 16pa17 (pita DNA kanan)
Hasil proses running dari dua primer yang berukuran 150 bp, seperti yang
terlihat pada Gambar 4 merupakan pita DNA produk PCR. Pita DNA produk PCR
tersebut terlihat tunggal dan tebal sehingga dapat dilakukan proses elusi. Tahap
elusi dilakukan dengan menggunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction
Kitdari Geneaid (2008) pada bagian PCR Clean Up Protocol.
Terdapat empat kegiatan pada proses ini yang meliputi penguraian gel,
pengikatan DNA, pencucian DNA, serta elusi DNA. Penguraian gel dilakukan
dengan menambahkan DF buffer ke dalam tube yang telah berisi cacahan gel.
Lalu, diinkubasi pada suhu 55-60 o C hingga gel meluruh seluruhnya. Setelah itu,
binding DNA atau pengikatan DNA dilakukan dengan melakukan sentrifuge
selama 2 menit pada kecepatan penuh sehingga molekul- molekul DNA akan
tersaring pada DF column.
Molekul- molekul DNA yang telah tersaring dimurnikan dengan W1 buffer
yang berisi campuran NaOH dan ethanol yang berfungsi untuk memekatkan DNA
setelah sentrifuge selama 2 menit pada kecepatan penuh dan dilanjutkan dengan
penambahan Wash buffer yang berisi ethanol untuk mencuci molekul- molekul
DNA melalui sentrifuge selama 2 menit pada kecepatan penuh dan dikeringkan.
Kegiatan terakhir adalah elusi DNA yang dilakukan dengan menambahkan
elution buffer yang berisi 10 mM Tris-HCl pH 8,5 pada DF column yang berisi
molekul DNA kering. Elution buffer ini berfungsi untuk menjaga keseimbangan
reaksi agar enzim dapat bekerja lebih optimal dan mencegah terjadinya proses
lisis sel (Lodish et al. 1995). Kemudian, lakukan sentrifuge kembali selama 2
menit pada kecepatan penuh untuk mendapatkan produk PCR ya ng telah murni.
Hasil elusi tersebut kemudian dapat divisualisasi dengan melakukkan
elektoforesis pada gel agarose seperti yang terdapat pada Gambar 5.

15
1

2

3

250 bp
Gambar 5 Elektroforesis hasil elusi fragmen DNA dengan primer 10pa17 (2) dan
primer 16pa17 (1)
Proses running hasil elusi untuk persiapan DNA sisipan dari kedua primer
digunakan dalam memastikan keberhasilan proses pemurnian produk PCR dari
kedua primer tersebut. Hal ini terlihat pada ukuran DNA yang sama ketika proses
running persiapan elusi (Gambar 4) dengan proses running hasil elusi yakni 150
bp (Gambar 5) karena berada pada posisi yang sama yakni di bawah ladder 250
bp. Hasil pemurnian pada Gambar 5 siap digunakan sebagai sisipan pada tahap
kloning produk PCR. Selain itu, fragmen DNA hasil PCR menggunakan primer
10pa17 dan 16pa17 menunjukkan ukuran yang sama antara Gambar 4 dan
Gambar 5.
Ligasi
Ligasi merupakan proses pertama pada tahap kloning DNA rekombinan.
Secara umum ligasi adalah suatu proses penggabungan fragmen suatu DNA
dengan fragmen DNA lainnya yang menghasilkan suatu DNA rekombinan (Anam
2009). Hal- hal yang dibutuhkan pada proses ligasi meliputi DNA target sebagai
sisipan, DNA vektor, enzim ligase, dan buffer ligasi. DNA sisipan dalam
penelitian ini adalah produk PCR dari primer 10pa17 dan 16pa17 berukuran 150
bp yang telah dimurnikan melalui tahap elusi.
Vektor adalah biotransport yakni sebagai pembawa fragmen DNA target
yang kemudian akan disisipkan dan digandakan pada sel inang. Pemilihan vektor
didasarkan pada ukuran fragmen DNA target, dan yang paling sering digunakan
sebagai vektor adalah plasmid (Brown 1991). Plasmid merupakan DNA untai
ganda yang berasal dari sel bakteri, berbentuk sirkuler, yang berukuran lebih dari
500 kb, terdapat pada sitoplasma dan dapat bereplikasi secara autonom
(Suharsono dan Widyastuti 2006). Kemampuan yang dimiliki plasmid seperti
inilah merupakan keuntungan untuk menggunakannya sebagai vektor kloning.
Vektor yang digunakan adalah plasmid pGemT- Easy yang berukuran 3015
bp. Kriteria terpenting yang harus dimiliki plasmid adalah harus mengandung
situs ORI (Origin of Replication), marker seleksi (selectable marker), dan situs
kloning (multiple cloning site). Promega (2010) menjelaskan beberapa kelebihan
pGemT-Easy yakni ukuran relatif kecil sehingga dapat membawa fragmen DNA
target yang berukuran besar, mengandung situs ORI (Origin of Replication) untuk
direplikasi pada bakteri E.coli, membawa gen ketahanan ampisilin sebagai marka
seleksi, dan mempunyai multiple cloning site (MCS) dengan 19 sisi unik, seperti
yang terdapat pada Gambar 6.

16

Gambar 6 Peta vektor pGemT-Easy (Promega 2010)
MCS merupakan suatu partisi dari DNA vektor yang merupakan tempat
dimasukkannya fragmen DNA asing. Selain itu, plasmid ini juga memiliki gen
lacZ yang dapat digunakan untuk seleksi koloni biru putih. Gen lacZ ini
mengkode enzim β-galaktosidase yang mengubah isopropil- β galaktopiranosida
(IPTG) dan substrat 5-bromo-4-kloro-3-indol-β-galaktosidase (X-gal) menjadi
biru apabila plasmid tidak tersisipi atau termasuki DNA target, sebaliknya jika
tersisipi maka gen lacZ tidak akan terekspresi sehingga koloni tetap berwarna
putih (Promega 2010).
Plasmid ini juga dapat langsung diligasikan ke DNA target tanpa melalui
proses restriksi sehingga kriteria terpenting sudah terpenuhi sebagai vektor
plasmid. Plasmid pGemT-Easy merupakan teknologi baru dari plasmid yang
didesain khusus untuk mengkloning gen dar