Genetic variation and pathological changes of Koi Herpesvirus (KHV) Infection of Cyprinus carpio

VARIASI GENETIK DAN PERUBAHAN PATOLOGIS

INFEKSI

KOI HERPESVIRUS (KHV) PADA

Cyprinus carpio

BUDI SUGIANTI

SEKOLAH PASCA SARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

YATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Variasi Genetik

dan

Perubahan

Patologik Infeksi Koi Herpesvirus (KHV) pada

Cyprinus carpio

adalah karya saya dengan

arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan

tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan

dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, Januari 2012

Budi Sugianti

NRP B161020071

bstract

UDI SUGIANTI. Genetic Variation and Pathological Changes of Koi Herpesvirus (KHV)

Infection of Cyprinus carpio. Under supervision of MARTHEN B.M. MALOLE,

BAMBANG PONTJO P., S. BUDI PRAYITNO, ETTY RIANI.

KHV has made mass mortality in koi and common carp, and spread out to many

countries. In Indonesia, KHV has caused outbreaks of mass mortality in many provinces, and

cause economic losses and significant social matter. The aim of this research are to recognize

and to analyze genetic variation of KHV that infects

y

-carpio

and to recognize its

biogeographic distribution in Indonesia as well as to recognize and to analyze tissues

pathological changes which infected by KHV. In this research, the fish that have been used

are koi and common carp which suspected infected by KHV according to the clinical

symptoms derived from 20 provinces in Indonesia. In every fish sample was taken its gill to

PCR examination and then was done sequencing DNA (for KHV positive samples), for

histopathology and immunohistochemistry examination, the organs that were taken: gill,

kidney, spleen, intestine or digestive tract, liver, heart, and brain. Based on the results of

sequencing DNA KHV and phylogenetic tree construction that has been made, there are 17

variants from 18 samples KHV positive was found. Those variants can be grouped into two

clusters the main branch which consisted of group 1 includes variants KHV from South

Kalimantan, Lampung, West Papua, West Kalimantan, West Java, Bali, East Nusa Tenggara.

Then group II consists of KHV variants from North Sumatra, West Kalimantan, West Nusa

Tenggara, Riau, East Kalimantan, and DKI Jakarta.

Related to the infections of KHV

variants on koi and common carp, pathological changes were found in such organs (gill,

spleen, kidney, intestine and digestive tract, liver, heart, and brain). Pathological changes in

gill organ was found proliferation of epithelial cells and fusion of secondary lamella,

hypertrophy epithelial cells of gill lamella, telangiectasis, the inclusion body, edema,

proliferation of hyaline layer and fibrosis at the base of the gills. Spleen pathological change

was found infiltration of inflammatory cells or lymphocytes, appeared MMC, hemorrhage,

congestion, and edema. Kidney pathological change was found hemorrhage, proliferation of

cells in the interstitial, MMC, thickening of the tubule, inflammation of the glomerulus, the

inclusion body, congestion, edema, fibrosis, necrosis of the glomerular. Intestine and

digestive tract was found hemorrhage, enteritis, proliferation, goblet cells, fusion of the villi,

deposit enterolit on gastric, congestion, edema, and necrosis in krypta. Liver pathological

change was found hydropic degeneration, perivascular cuffing, congestion, and fibrosis.

Heart pathological change was found infiltration of inflammatory cells or lymphocytes in the

endocardium, hemorrhage, epicarditis, pericarditis, myocarditis, vacuolization, congestion,

edema, fibrosis, and necrosis.

! " ! #$# %! & '$ (# )* + $ ( %,- ,.!" $ /# &"! 0,!

1# 2#" 3! )"

(

0 1

)

2 '

Cyprinus carpio.

!*! 4*! $. ,-#+ 5 6 17 5

58987:5 (9 ;9(: (6 < 9

,

'$7 <6

01 '!&#% +)! % #- + 4# $

y

#** &$ &# 4 %!$ 4"- 2 ' .,- ,$.$ !&$ 4" '$&,! ! )" ! $! % # - + %# "#* '!*# *.! $# . '! ') $! ! $' ,$#"!

,

01 '! - 2 , &$ %# -+ 4# $! 4*) -&$

w

* + &#4 %!$ 4 " - '! * $

y

& 2 ,3!$" !

,

'$4# $#* * & $

y

&# ) .!$# &,$,4!'$" ," !-

y

$.=) &)2* #"

# &!%$ '# $. $ + - %# "#*) %

,

2#$# -! %! $ ! $! *# %)>) $ ) $%) & 4#$.# %+)! '$ 4# $. $-! "! " 3 ! " ! .# $# %!& 0 1

y

$. 4#$.!$/# &" !

Cyprinus carpio

'$ 4# $.# % +)! " #* $ *! ,.# ,. /!"$

y

'! $',$#"!

,

4# $.# %+)! ' $ 4# $. $-! " !" 2# )* + $ 2% ,-,.! "

j

rin

.

n

y

n

.

t

#

ri

$/#

k

si

01

,

"#

rt

m

#

n

.#

t

+)! '

n

m

# $. $

lisis

2## *

n

y

r

n

01 2 '

j

ri

$.

n

o

r

.

n

-organ target yang terinfeksi

KHV.

Dalam penelitian ini, ikan uji yang digunakan adalah ikan mas dan koi yang

diduga positif terinfeksi KHV berdasarkan pada gejala klinis yang berasal dari 20

provinsi di Indonesia.

Pada setiap ikan sampel diambil organ insang untuk

pemeriksaan PCR, dan selanjutnya dilakukan sekuensing DNA (untuk

sampel-sampel positif KHV). Untuk pemeriksaan histopatologi dan uji imunohistokimia,

organ yang diambil terdiri dari insang, ginjal, limpa, usus/saluran pencernaan,

hati, jantung, dan otak. Pemeriksaan sampel dengan metoda PCR dimulai dengan

melakukan ekstraksi DNA KHV dari insang, selanjutnya dilakukan amplifikasi

produk DNA, elektroforesis, serta pengamatan dan dokumentasi.

Hasil

menunjukkan positif KHV jika terlihat ada pita DNA pada ukuran fragmen 290

bp. Uji PCR dilakukan untuk meneguhkan diagnosa KHVD terhadap ikan mas

dan koi sampel yang menunjukkan gejala klinis melalui pengamatan secara

makroskopik.

Selain menggunakan metoda PCR dan DNA

Sequencing,

pemeriksaan KHV juga dilakukan dengan pemeriksaan histopatologik dan uji

imunohistokimia.

Pemeriksaan histopatologik dilakukan untuk mengetahui

perubahan patologik pada organ-organ yang terinfeksi varian-varian KHV, dan

dilakukan dengan menggunakan pewarna rutin hematoksilin eosin (HE).

Selanjutnya, pada uji imunohistokimia dilakukan aplikasi dengan kromogen DAB.

Perubahan warna menjadi cokelat/kecokelatan menunjukkan jaringan positif

terinfeksi KHV.

Analisis data dilakukan menggunakan metode deskriptif kualitatif.

Analisis dilakukan terhadap hasil uji PCR dan imunohistokimia pada ikan-ikan

yang positif KHV. Selanjutnya, hasil sekuensing DNA KHV digunakan sebagai

dasar pembuatan pohon filogenetik. Konstruksi pohon filogenetik dibuat

menggunakan metoda Neighbor Joining dengan 100 x replikasi menggunakan

software

ClustalX. Hasil yang diperoleh dianalisis untuk memberikan gambaran

tentang jarak genetik/kemiripan varian-varian KHV yang ditemukan. Untuk

mengetahui perubahan patologik jaringan yang terinfeksi varian-varian KHV dan

penyebarannya pada organ-organ target, dilakukan pendekatan dengan

pemeriksaan histopatologik dan imunohistokimia.

Dari sejumlah sampel bergejala klinis KHV, sebanyak 18 sampel

ditemukan positif KHV melalui PCR dan juga positif dengan metoda

imunohistokimia. Sedangkan 4 sampel lainnya menunjukkan hasil negatif dengan

metoda PCR, namun memberikan hasil positif dengan metoda imunohistokimia.

Hal tersebut menunjukkan 4 sampel genom tidak dapat diamplifikasi melalui

PCR. Sampel-sampel genom yang tidak berhasil diamplifikasi adalah genom asal

Jawa Timur, Sumatera Selatan, Gorontalo, dan Sulawesi Utara. Hal yang dapat

menyebabkan kegagalan amplifikasi adalah penggunaan primer kurang spesifik

untuk sampel-sampel genom dari 4 provinsi tersebut. Adanya variasi genetik

KHV yang relatif tinggi atau jarak genetik yang relatif jauh pada sampel-sampel

genom dari 4 lokasi dibandingkan dengan sampel-sampel genom yang berhasil

diamplifikasi, dapat merupakan penyebab kegagalan proses amplifikasi.

Berdasarkan hasil sekuensing DNA KHV dan konstruksi

pohon

filogenetik yang dibuat, ada 17 varian dari 18 sampel positif KHV yang

ditemukan. Varian-varian tersebut dapat dikelompokkan dalam 2

clusters

cabang

utama yang terdiri dari kelompok I meliputi varian-varian KHV yang berasal dari

Kalimantan Selatan, Lampung, Papua Barat, Kalimantan Barat, Jawa Barat, Bali,

Nusa Tenggara Timur, D.I. Yogyakarta, Sumatera Barat, Bengkulu, D.I. Aceh,

dan Kalimantan Timur. Selanjutnya kelompok II terdiri dari varian-varian KHV

yang berasal dari Sumatera Utara, Kalimantan Barat, Nusa Tengara Barat, Riau,

Kalimantan Timur dan DKI Jakarta.

Berkaitan dengan infeksi varian-varian KHV pada ikan mas dan koi,

perubahan patologis yang ditemukan diantaranya terjadi pada organ-organ insang,

limpa, ginjal, usus dan saluran pencernaan, hati, jantung, dan otak. Perubahan

patologis organ insang yang ditemukan antara lain adalah proliferasi sel-sel epitel

lamela sekunder dan fusi lamela, hipertrofi sel-sel epitel lamela insang,

telangiectasis, adanya

inclusion body, edema, proliferasi lapisan hyaline, dan

fibrosis pada pangkal insang. Perubahan patologis organ limpa yang ditemukan

antara lain infiltrasi sel-sel radang/limfosit, tampak MMC, hemoragi, kongesti dan

edema. Perubahan patologis organ ginjal yang ditemukan antara lain hemoragi,

proliferasi sel-sel di interstisial, tampak MMC, penebalan pada tubulus, radang

pada glomerulus, adanya

inclusion body,

kongesti, edema, fibrosis, dan nekrosis

pada glomerulus. Perubahan patologis pada usus/saluran pencernaan yang

ditemukan antara lain adalah hemoragi, enteritis, proliferasi sel-sel goblet, fusi

vili, deposit enterolit pada lambung, kongesti, edema, dan nekrosis pada krypta.

Perubahan patologis organ hati yang ditemukan antara lain adalah degenerasi

hidropik,

perivascular cuffing, kongesti, dan fibrosis. Perubahan patologis pada

organ jantung yang ditemukan antara lain adalah infiltrasi sel-sel radang/limfosit

pada endokardium, hemoragi, epikarditis, perikarditis, myokarditis, vakuolisasi,

kongesti, edema, fibrosis, dan nekrosis. Perubahan patologis organ otak yang

ditemukan antara lain adalah hemoragi, vakuolisasi,

perivascular cuffing,

satelitosis, gliosis, kongesti, edema, fibrosis, dan nekrosis.

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012

Hak Cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau

menyebutkan sumbernya.

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya

ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah.

b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis

dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

VARIASI GENETIK DAN PERUBAHAN PATOLOGIS INFEKSI

KOI HERPESVIRUS (KHV) PADA

Cyprinus carpio

BUDI SUGIANTI

Disertasi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktor pada

Program Studi Sains Veteriner

SEKOLAH PASCA SARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

? @ABCDEFGHGI DE GAJ@KL CLCF MNKOHKPOQRGS GKTEAGUV WE OUX ?Y @L O

NKOZKOWKE[CK\G LE UV W

? @ABCDEFGHGI DE GAJ@K]C^G

M?K_`ONKOW\GabCTVGcGKE` NKOZKOQHEWCFKE\_A_UVWdO

e fgfhi jk lmn okj

pq omj okjrls lnjtg osulmfv owosu onxhxyj tzs{ltkj|x j}lm~lk j mfk

(

|} q€~og o ‚ƒ„… †‡ˆ‰Š„ ƒ… ‹ Œoo

pŽfg jf yjosn j

Œu pŽ ‘’‘ “”““•‘

i jk ln f–f j

|xjkjulv jv jsy

i m—˜omn wl sŽ—˜—˜oh xh l

|ln fo

u mx{—im—g mw—Žov osyuxsn–xu—™˜  —™š uqln— u mx{—i m—zm— —Žfg ju mo›jnsx ™˜œ—

šsyyxn o šsyyxn o

i m—zm—n n›j osj

,

˜  — šsyyxn o

˜lsylnowf j

|ln fou mxymon fg j il tosltxhowu okœokom–oso

ojskqlnl mjsl m

u mx{—im—g mw—Žosvos yux sn–xu—™˜ —™šuqln— i m—zm—iowmfh›o w™˜ œ—šym—

¡ ¢

A

£¤¥ ¤

¦ § ¨©ª© «¬­® ¯©°±© ² §«©³ © ´ªª©¯ ¦µ ¶· ±©° ¨ ¸§ª©¯ ¹ §ª ® ¹«©¯² © ° º©¯¹© ¸ ³©° ¯®³©±©¯ »±©

¼ §¯®°¨¨© « §°¬ª ® ¼³©«© ¸¹§° ±§ª§¼©® ²©°«§°§ª ® ¸® © °³© °« §°¬ª®¼©°¯©¼® ª« §°§ª®¸® ©°® °®

.

½® ¼ §º¸© ¼®® °® ¾§º®¼®®°¿Àº¹© ¼® ¸ §°¸ ©°¨ Á©º®© ¼® ¨§° §¸®² ³© ° «§º¬ ¾©¯© ° « © ¸ÀªÀ¨® ² ® °¿ §² ¼® ² À®¯ §º« §¼Á®º¬¼

(

Â Ã Ä Å «©³© Æ ÇÈÉÊ ËÌÍ ÎÏ ÉÈÊ ÐÑ Ò°¿Àº¹© ¼® ¸ §º¼ §¾¬¸ ³® ¯ ©º© «²©° ³©«© ¸ ¾ §º¹©°¿©© ¸ ¬ °¸¬² ¹ §°¨§¹¾© ° ¨²©°

ª© °¨² ©¯

-

ª© ° ¨²©¯«§°Ó§ ¨© ¯© °³©°« §° ¨§°³©ª® ©°®°¿§² ¼®Â Ãij®Ò°³ À°§¼® ©

.

¶ §º®¹©²©¼® ¯³© °«§°¨¯©º ¨© ©°±©° ¨¸©²¸ §º°®ª ©®³® ¸ ¬­ ¬²©°² §«©³©Ô © «©²½º

.

Õ© º¸¯ §°Ô

.

Õ

.

Õ ©ªÀª § ¼ §ª©² ¬ ² §¸ ¬© ² À ¹® ¼®« §¹¾® ¹ ¾® °¨

,

Ô©«©² ÖºÀ¿

.

½ º

.

³ º¯ ×Ô ©¹ ¾©° ¨ ÖÀ°¸ ­À· Õ ¦

.,

´Ö ħ¸

.,

Ô©«©²ÖºÀ¿

.

½º

.

Òº

.

¦

.

Ô ¬³®Öº©±® ¸°À

,

Õ¦Ó

.,

³© °Ò¾ ¬½ º

.

Òº

.

ظ ¸±Ù® © °®Õ¦

.,

¼§ª©² ¬© ° ¨¨À¸©² À¹®¼® « §¹¾® ¹ ¾® °¨

,

© ¸© ¼ ² §®²¯ ª ©¼© ° ³© ° ² §¼© ¾© º© °°±© ±© ° ¨ ¸§ª©¯ ¹§¹ ¾§º®² ©° ¾®¹¾®°¨© °· °© ¼ §¯ © ¸

,

© º©¯© °· ³©° ³ ÀºÀ° ¨© ° ¼§ª© ¹© «§º§°Ó© °©© °· «§ª©² ¼© °©©° ³© ° « §°¬ª® ¼© ° ¯©¼® ª « §° §ª ® ¸®© ° ® °®

.

ÚÓ©«©° ¸§º® ¹© ²©¼®¯ ­¬¨© ³® ¸ ¬­ ¬²©° ² §«©³©  §«©ª© Ö¬¼© ¸ © º© °¸®°© Ò² © ° ¾§¼ §º¸© ¼ ¸© ¿

,

§«©ª © Ô©ª©® Ú­® ¦ ¸©°³© º  © º© ° ¸® °© Ò²© ° ¾ §¼§º¸© ¼ §ª ¬º¬¯ ¼¸©¿

,

¼ §º¸ © º§²© °

-

º§²© ° ±© °¨ ¸§ª©¯ ¹§¹¾© °¸¬· ¼ §ª © ¹©«§°¬ª®¼¹ §°§¹«¬ ¯« §°³®³®²© °¼ §º¸©¹§°±§ª §¼©® ²©°« §° §ª® ¸®© °® °®

.

´²¯®º ²© ¸© «§°¬ª®¼ ¾§º¯© º©« ¼§¹ À¨© « §° §ª®¸®© ° ®°® ³©«© ¸ ¾§º¹©°¿© ©¸ ¾© ¨® «§° ¨§¹ ¾©° ¨© °

®ª¹¬ « §°¨§¸©¯¬© ° ³®¹© ¼© ±©° ¨ ©²© ° ³© ¸© ° ¨ ¸§º¬ ¸© ¹© ³©ª© ¹ « §°¨§¹¾© ° ¨© ° ¬«©±© « §°Ó § ¨©¯ © °

³© °« §° ¨§°³©ª ®© °«§°±©² ® ¸®²© °³®Ò°³ À°§¼®©

.

Ô À ¨Àº

,

Û © °¬© º®ÜÝÞÜ

ßà

WAYAT HIDUP

á âãäåæ ç èæå éêæ ëìéã èæ

J

éìéëíé îéèé íéã ïïéå ðñ

J

éãäéëæ ñ òóôõ çâöéïéæ éãé ì ìâåæ÷é èéëæ âã é÷ öâë çé äèéëé è éëæ îé çéã ïéã

(A

å÷

.)

ø

.

øéùæúâèæã ûæ íæ ìúâçúâ÷é

(A

üé êýèéãø

.

þéëæùéê

(I

öäý

.

á âãèæèæìéãçéëÿéãé

(

ñýèæíâ÷îäêèæ

J

äëä çéã

B

äèæèéüé á âëéæ ëéãõ é ìäåí éç á âëæìéãéã

I

ã çí æí äí á âëíéãæéã

B

úïúë

(

åäå äç í é êäã ñ ò

),

èéã î âãèæ èæ ìéã îé çéç éëÿ éãé

(

ý èæ áëúïëé÷ íäèæ þéãéÿâ÷âã

K

âä éã ïéã ãæ âë çæ íé ç

K

éíúå æ ì

A

í÷é

J

éüé

J

éìéëíé

(

å äåä çí éêäãñ òòôý

.

âåéãÿäí ãüé

îéèéíé êäãõ î âãäåæ ç ÷âå éã ÿäíìéã ìâ îëúïë é÷ èúìíúë

(

ðý îéèé áëúïëé÷ íäèæ éæã ç âíâëæã âë

,

âìúåé ê áé çé çéëÿéã é

I

ã çíæ íäíáâëíéãæéã úïúë

.

ééí æãæ î âãäåæç öâìâëÿé èæ á äçéí

K

éë éãíæãé

I

ìéã

(

áä çìéëæ

), B

éèéã

K

éë éãíæ ãé

I

ì éã á âãï âãèéå æéã þäíä èéã

K

âé÷éãéã

H

é çæå áâëæìéãéã

(BKI

á þ

),

çâöé ïéæ

K

âî éå é

B

æ èéã ï æçíâ÷ á âëìéëéã í æãééã

I

ìéã

D

äé öäéê éëíæ ìâå æå÷æé ê öâëÿ äèäå á âëä öé êéã

H

æçíúîéíúåúïæ

B

âöâëéîé ë ïéã

I

ìéã þéç áúçæíæù

K

úæ

H

âëî âç æ ëäç

(KH

ý üé ã ï

D

æ åéåäå æãíé ç ìéãèæ

I

ãèúãâ çæ ééìéãèæíâë öæíìéãîéèé

J

äëãéå âí âëæã âë

I

ãèúãâç æ é

H

â÷âëé úéî éèéí é êäãñ

. A

ëíæìâåå éæã öâëÿäèäå

D

âíâìçæ éëæé çæ

G

âã âíæ ì

K

úæ

H

âëî âç æëä ç îéèé èâãïéã þ âíúèé á

C

ø

,

âìä âã çæãï

D

û õ è éã

I

÷äãúêæ çíúìæ÷æé îéèé æíæì þé çä ì ëéã çîúëíé çæ

I

ìéã èæ

I

ãèúã â çæ é

,

éìéã èæ í âëöæ í ìéã îé èé

J

äëãéå âíâëæã âë ã æ âë çæ íé ç èéüéãé îéèé íéêäã ñ

K

éëüé

-

ìé ëüé æå÷æ éê íâëç âöäí ÷âëäîéìéãöé ïæ éãèé ëæîëúïëé÷ ðî âãäå æ ç

.

!"!

#$%$ &$'

()*

T

)

R ISI

+++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ()*

T

)

R T

),-

L

+++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ()*

T

)

R G

)

M

,)

R

++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ . !/

012 #3 432

////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// 5

6+ 6+

L

7879,:; 7< 7= >+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ 6 6+?+

T

@A @7=B:=:;87=+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ? 6+ C+

K

:97= ><7

P

:D<97=B:=:;87=++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ C 6+E+

M

7=F778

P

:= :;87=

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ G

6+G+

K

:H79@7=I

Novelty

)

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ J 6+ J+

,78 7K7=B:=:;87=

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ J

6+ L+

H

MN8 :K K+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

J

! !/ !2 O3 203" P/////////////////////////////////////////////////////////////////////////

8

?+ 6+

K

797<8 : 9 K8<

Q

HV

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

8

?+?+

V

797K

G

:=:8<+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ 66 ?+ C+

I

= 7= >+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ 6G ?+E+

M

:<7=KD :R7=B: 9@H7S7=B78 N;N><

I

=F:<K

KHV

++++++++++++++++++++++++ 6J ?+G+

P

:=>7 9@S

L

= ><@= >7=++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ?? ?+ J+

S

:H797=T:N>97FK++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ?E

III.

BAHAN DAN METODA PENELITIAN ... 29

C+ 6+U7<8@( 7=V:DM 78

P

:=:;87=+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ?W C+?+,7S7=B:=:;87=+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ?W

C+?+ 6+

I

< 7=

U

A+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ?W C+?+?+(

N

)

V

9@K++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ?W C+?+ C+,7S7=++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ?W

C+?+E+B:97;78 7=++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ CX

C+ C+

P

9NK:R @9

P

:=:;87=+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ C6 C+ C+ 6+B:=>7D H;7=Y7DM :; +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ C6

\]^]

U

_ [

P

`

R

abcd efgech[cij

N

k]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \l \]^]m]nfho pb fh [j

N

k ]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \l \]^]q]k rst [u[ fbh [j

N

k ]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \v \]^]\]ntefopwuw peh [h ]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \x

\]^]^]

P

ecibr bob cab cjwfgrecobh[ ]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \x \]^]l]ygp[u [fbh[j

N

k ]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \x \]^]v]k rst [u[ fbh [

Cycling Sequencing

]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \z \]^]x]ygp[u [fbh[

Cycling Sequencing

]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \{ \]^]z]

Sequencing

j

N

k ]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] \{ \]l]

P

erep[fh bb c|[ho wsbo wtwi[ f]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] ^} \]v]

P

erep[fh bb c~ bp[cib caecibcefc[ f

I

r rgcw€[howf[ r[b]]]]]]]]]]]]]] ^m \]x]k cbt[h[hjbob]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] ^q

‚ ƒ „… † ‡ˆ… ‰Š‹

MBAHASAN... 43

^]m]

G

e_bt b

K

t[c[h]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] ^\ ^]q]

U

_ [

Polymerase Chain Reaction

(P

`

R)

]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] ^{ ^]\]

U

_ [

I

rr gcw€[howf[ r[b]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] lm ^]^]

V

bp[bh[

G

eceo[fabcd eŒbpb cewipb u[h]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] l\ ^]l]

P

epgŒb €b cybowtwi[f

I

cu efh[

KHV

]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] lx ^]l]m]

P

epgŒb €b c

P

bo wtwi[ fybab

I

chb c i]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] v\ ^]l]q]

P

epgŒb€b cybowtwi[ fybab

G

[c_bt ]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]

8

m ^]l]\]

P

epgŒb€b cybowtwi[ fybab

L

[ rsb]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]

87

^]l]^]

P

epgŒb€b cybowtwi[ fybab

H

bo[]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]

9

^ ^]l]l]

P

epgŒb€b cybowtwi[ fybab

U

h gh]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] m}q ^]l]v]

P

epgŒb €b cybowtwi[f

P

bab

J

bcogci]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] m}z ^]l]x]

P

epgŒb €b cybowtwi[fybab

O

ob f]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]] mm\

V.

KESIMPULAN DAN SARAN ... 120

5.1. Kesimpulan ... 120

5.2. Saran... 121

DAF



A



ABE

‘

’“ ” •–—˜–™š ›œ —–•–œžŸ —Ž –™“““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““ ¡¢

£“

G

Ÿš– —–

k

—Ž™Ž•¤–¥Ž–™

-v

–¥Ž–™¦

HV

ž–

d

–

C

§¨© ª«¬­®¯© ¨ ª°““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““

4

± ¡“

J

›œ—–

h

—² –•Ž•– œžŸ—Ž

k

–™ž² •Ž

t

Ž

f

¦

HV d

Ÿ™

g

–™œŸ

t

²˜Ÿ

PCR d

–™

Žœ ›™²Ž•³² ŽœŽ–““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““ ±¢

4

“

H

– •Ž—•Ÿ

k

›Ÿ™ •Ž™

g DNA

¦

HV d

–¥ŽŽ

k

–™•– œž Ÿ —ž² •Ž

t

Ž

f

¦

HV

“““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““ ±´ ±“

J

–¥–

k g

Ÿ™ Ÿ

t

Ž

k d

–™•ŽœŽ—–¥Ž

t

–•¤–¥Ž–™

-v

–¥Ž–™¦

HV

µ–™¶

d

Ž

t

Ÿœ ›  –™

d

–—– œžŸ™Ÿ —Ž

t

Ž–™“““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““ ·£ ·“

P

Ÿ¥›¸–

h

–™ž–

t

² —²

g

Ž

k

š–¥Ž™¶–™ ¹§ ¨©ª«¬­®¯© ¨ ª°ž² •Ž

t

Ž

f

¦

HV d

Ÿ™

g

–™

›šŽ

PCR

d

–™œŸ

t

²˜ŸŽœœ ›™²Ž•³² ŽœŽ–““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““ ·´

7

“

P

Ÿ¥›¸–

h

–™ž–

t

² —²

g

Ž

k

š–¥Ž™¶–™¹§¨©ª«¬­® ¯© ¨ ª°ž² •Ž

t

Ž

f

¦

HV d

Ÿ™

g

–™ œŸ

t

²˜Ÿ

Žœœ ›™²Ž•³² ŽœŽ–“““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““““

7

£

½¾ ¿À ¾Á ¾ÃÄ ¾Á

ÅÆÇÆ ÈÆÉ

ÊË ÌÍÎÏ ÐÑÒ ÓÔ»Õ»

Herpesviridae

...

Ö ×Ë Ø» Ù» ÚÎ

-

¼»Ù»ÚÎÛÜ ØÝÓÎÞÏ ÍÙßÓàÓÏàÓßÓáÍÕ

-

áÍÕÛâÊËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ã äË åàÍá»Ò»ÑÓá»æ çèàÙ»Ô ÍÙáÍÏ

y

ÓÎÞß»ßÍáÓ»ÎéÙÍ

y

et al.

ê×ëë×ìËËËËËËËËËËËËË ÊÊ íË åÏÙÓÏ ÍÞ»ßÓáÓÙÙÍàÕ»ÑÓỼ» ÙÐáßÍÎÞÓÎÞÍÎÚÔß áî ïðËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË Êñ

òË éÍó ÓÕÓÑջλ á»ÑÓÎ

y

ÓÎÞÏ ÍÙ áÍÙÓÎÞÛÜ ØËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ×ë ôË õÓÙ»ÎÞÓλÎáÓÎÞ

y

ÓÎÞÏ ÍٻΠÒÍÑá»ÛÜØËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ×Ê ñË ïÍÑÙÚ àá»»ÑÓÎ öàÍÎÞÞÐÎÏ»ÎÞÓÎÑÐÕ»Ï

b

ÓÞ»ÓμÍÎÏÙÓÕ»ÑÓÎßÓÙ»ÓÎ Ðá

ÑÍóÓÙ»ÎÞÓλ áÏ÷ÔÐáËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË äò

ÖË

B

Í

b

ÍÙÓàÓ

b

ÍÎÏ ÐÑßÓÎàÚ á»á»ÚÙ ÞÓλÎÏ ÍÙÎÓÕ»ÑÓÎËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË äò ãË éÍó ÓÕÓÑջλ á»ÑÓÎÔÓááÓÔàÍÕ

y

ÓÎÞÏÍÙßÐÞÓÏÍÙ»Î Ò ÍÑá»ÛÜ ØîËËËËËËËËËË íí ÊëËÜÓá»ÕàÍÔ ÍÙ»ÑáÓÓÎ»Ñ ÓÎáÓÔàÍÕßÍÎÞÓÎÔ ÍÏÚßÓæ çèËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË òÊ

ÊÊË

ÜÓá»ÕàÍÔ ÍÙ»ÑáÓÓÎßÍÎÞÓÎÔ ÍÏÚßÍ»ÔÔÐÎÚ ÷» áÏÚѻԻÓ

Ë ËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ò×

Ê×ËæÚ ÷ÚÎÒ»ÕÚ ÞÍÎ ÍÏ»ÑÛÜØ

ËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ôë

ÊäË

æÚ ÷ÚÎÒ»ÕÚ ÞÍÎ ÍÏ»ÑÛÜØ

ËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ôÊ

ÊíËæ ÍÏ ÓáÍ

b

ÓÙÓÎø»Ú ÞÍÚÞÙÓ Ò»áÔÚÕ ÍÑÐÕÍÙÛÜ Øß»ùÎßÚÎ Íá»ÓËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ôä ÊòËæÙÚÕ»ÒÍÙÓá»áÍÕúáÍÕÍà»ÏÍÕ

lamella

áÍÑÐÎßÍÙêÓ

)

ßÓÎÍßÍÔÓê

b)

àÓßÓ»ÎáÓÎÞËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ôô

ÊôËùÎÒ»ÕÏÙÓá»áÍÕúáÍÕÙÓßÓÎÞàÓßÓ»ÎáÓÎÞ ËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ôô

ÊñËæÙÚÕ»ÒÍÙÓá»áÍÕúáÍÕÍà»ÏÍÕ

lamella

áÍÑÐÎßÍÙàÓßÓ»ÎáÓÎÞË ËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ôñ ÊÖË

Telangiectasis

àÓßÓ»ÎáÓÎÞËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ôñ ÊãËæ ÍÙáÍÎÒÙÍÑÐÍÎá»ÑÍóÓß»ÓÎàÍÙÐø Ó÷ÓÎàÓÏÚÕÚ Þ»áóÓÙ »ÎÞÓλÎáÓÎÞËËËËËËËËË Öë

×ëËæ ÍÎ Í

b

ÓÕÓÎÕ ÐÔÍÎÏ Ðø ÐÕ ÐáßÓÎÎ ÍÑÙÚ á»áÏÐø ÐÕ ÐáËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË Öä ×ÊËÜÓÍÔÚÙÓÞ÷»àÓßÓ޻Πó ÓÕËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË Öí

××ËùÎÒ»ÕÏÙÓá»ûûçàÓßÓ޻ΠóÓÕ ËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË Öí

×äË

Inclusion body

ê Ó

)

ßÓÎÎ Í ÑÙÚ á»áê

b)

àÓßÓ޻ΠóÓÕËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË Öò ×íËÛÚÎÞÍáÏ»àÓßÓ޻Πó ÓÕËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË Öò

×òËæ ÍÙáÍÎÒÙÍÑÐÍÎá»ÑÍóÓß»ÓÎàÍÙÐø Ó÷ÓÎàÓÏÚÕÚ Þ»áó ÓÙ»ÎÞÓÎ޻ΠóÓÕËËËËËËËËËËË Öô

×ôËùÎÒ»ÕÏÙÓá»

MMC

àÓßÓÕ»ÔàÓËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ãÊ ×ñËÛÚÎÞÍáÏ»

ßÓÎ»Î Ò»Õ ÏÙÓá»ûûçàÓßÓÕ»ÔàÓËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËËË ã×

ýþÿ

.. ...

þ ÿ

v

u

l

u

ffing

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ

ÿ

)

b)

!! "#

)

ÿ

ýÿ ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ

ÿ $

goblet

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ % &ÿ' # ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ %

%ÿ

Fusi vili

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ ( (ÿ

Haemoraghi

# ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ (

)ÿ ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ )

*ÿ

Epikarditis

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ þÿ+ ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ

&ÿ

Vakuolisasi

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ &ÿ

Miokarditis

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ

&ýÿ ÿÿÿÿÿÿÿÿ ý

&ÿ

Kongesti

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ % &&ÿ

Gliosis

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ % &%ÿ,

mononuclear perivascular cuffing

)

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ ( &(ÿ

Nekrosis

ÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿÿ (

-

.

./012345 420

1

.

67 89:9;

<=> 9? 9@ A

Salah satu spesies ikan yang cukup luas dibudidayakan dan dipelihara di

Indonesia adalah ikan mas dan koi (

B

y

CDE FGH IJ DCE K

) karena mempunyai nilai

ekonomi yang tinggi. Ikan mas dibudidayakan untuk tujuan konsumsi, sedangkan

ikan koi dipelihara karena keindahannya. Tingginya permintaan dunia maupun

domestik terhadap ikan-ikan tersebut, membawa konsekuensi meningkatnya

lalulintas ikan mas dan koi, baik antar negara maupun antar area di dalam wilayah

negara Indonesia.

Salah satu resiko meningkatnya perdagangan ikan adalah terbawanya

hama dan penyakit ikan berbahaya yang apabila tidak dilakukan

tindakan-tindakan pencegahan penyebarannya, maka dapat menyebabkan kerugian

ekonomi yang tidak kecil. Pada bulan Maret tahun 2002, dilaporkan telah terjadi

wabah kematian masal pada ikan mas dan koi yang menyebabkan kerugian

ekonomi dan sosial yang cukup besar. Serangan pertama kali terjadi di Blitar

Jawa Timur. Wabah terjadi pada ikan koi yang baru datang dari Surabaya. Ikan

koi ini diimpor dari Cina ke Surabaya melalui Hong Kong kurang lebih pada

bulan Desember 2001-Januari 2002 (Sunarto

LMJ NO

, 2004). Pada waktu yang tidak

terlalu lama sejak kejadian pertama kalinya di Blitar, wabah penyakit ini

dilaporkan telah menyebar di beberapa lokasi pembudidayaan maupun

penampungan ikan mas dan koi di beberapa provinsi. Umumnya, wabah terjadi

setelah hujan deras dengan total kematian mencapai 80-95%. Ikan yang sakit

memperlihatkan gejala klinis antara lain kerusakan insang, pendarahan pada

pangkal dan ujung sirip serta permukaan tubuh,

P QRST R T

y

T

s

, sering juga

ditemukan adanya kulit yang melepuh. Agen penyakit ini diketahui sangat ganas

dan cepat menular, baik melalui ikan-ikan yang terinfeksi maupun media air

pemeliharaan ikan yang terkontaminasi (Sunarto

T

t

UVW

, 2005, Taukhid

T X UVW

,

2004).

Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Tim Badan Riset Kelautan dan

Perikanan (BRKP) dengan Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific

(NACA) menemukan beberapa bukti ilmiah yang mendukung bahwa wabah ini

disebabkan oleh koi herpesvirus (KHV) (Sunarto

T X UV W

, 2004). KHV merupakan

salah satu anggota Herpesviridae yang menyerang ikan mas dan koi di banyak

negara dan telah menimbulkan kerugian ekonomi yang cukup besar (Perelberg

T X

UV

., 2003). Selain Indonesia, beberapa negara yang dilaporkan telah terserang

wabah penyakit KHV yaitu Israel, Amerika Serikat, beberapa negara Eropa,

Afrika Selatan, Cina, Taiwan, dan Jepang (Hedrick

T XUV

., 2005).

Koi herpes virus disease (KHVD) telah menjadi wabah pada ikan mas dan

koi hampir di seluruh Indonesia. Namun demikian, hingga saat ini data dan

informasi tentang variasi genetik KHV dan wilayah persebarannya di Indonesia

masih terbatas. Demikian pula halnya dengan informasi tentang perubahan

patologis infeksinya pada ikan mas dan koi, padahal data dan informasi tersebut

sangat diperlukan untuk mengembangkan langkah-langkah pencegahan dan

pengendalian infeksi KHV di Indonesia. Oleh karena itu, diperlukan penelitian

untuk menggali informasi tentang hal tersebut di atas.

YZ[Z \] ^

u

_`ab` bc d

t

d_`

1. Menganalisis variasi genetik KHV yang menginfeksi

e

y

fg hijklmg f hno

2. Memetakan sebaran biogeografis variasi genetik KHV di Indonesia.

3. Menganalisis perubahan patologis jaringan

epfg hijk l mgf hn

yang terinfeksi

KHV.

4.

Menganalisis penyebaran KHV pada jaringan organ-organ pada

epfg hijk

l mgf hn

yang terinfeksi KHV.

qrsr tu vwx yz w{u |} z}vwx{ux u~} }wx

KHV diketahui telah menyebabkan kematian masal pada golongan ikan

mas (

epfg hijk l mgf hn lmgf hn

) dan koi (

epfg pi jk l mg f hn €n h

). Virus ini telah

tersebar terutama di Amerika Utara , Eropa, Israel, dan Asia. Di Indonesia, wabah

kematian masal pada ikan mas dan koi akibat KHV pertama kali dilaporkan

terjadi pada tahun 2002, yang menyebabkan kerugian ekonomi dan sosial yang

cukup besar. Serangan pertama kali terjadi di Blitar Jawa Timur, kemudian

dengan cepat menyebar ke tempat-tempat pembudidayaan maupun penampungan

ikan mas dan koi di banyak provinsi. Berdasarkan hasil pemantauan hama dan

penyakit ikan karantina (HPIK) yang dilakukan unit-unit pelaksana teknis (UPT)

karantina ikan di Indonesia, pada tahun 2010 KHV ditemukan pada 17 provinsi di

Indonesia (Pusat Karantina Ikan, 2010).

Sesuai dengan Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan Republik

Indonesia No. Kep.03/MEN/2010 tentang Penetapan Jenis-jenis Hama dan

Penyakit Ikan Karantina, Golongan, Media Pembawa, dan Sebarannya, KHV

merupakan salah satu jenis HPIK dari golongan virus yang dicegah masuk dan

tersebarnya ke/di dalam wilayah Republik Indonesia. Selain itu,

penyakit akibat

infeksi

KHV juga termasuk kategori

‚ ƒ „… ƒ„ ƒ †‚ƒ‡„ˆ‰Š ‹ Œ„ Ž

yang termasuk

jenis penyakit berbahaya yang perlu diwaspadai di dunia (OIE, 2010).

Dalam rangka pencegahan dan pengendalian penyakit KHV di Indonesia,

berbagai upaya telah dilakukan antara lain melalui deteksi dini KHV dengan

metoda

‘’“Š”„• … ƒ„ – Œ… ‚ — •„…– ‡‚ ’—

(PCR). Sampai saat ini, penerapan metoda

PCR untuk deteksi KHV sudah meluas dan berbagai disain

‘•‚ ”„•

digunakan

untuk pengujian KHV. Banyak lembaga-lembaga pemerintah maupun swasta

yang menerapkan metoda ini sebagai satu-satunya metoda yang dianggap paling

sensitif dan spesifik untuk mendeteksi KHV. Namun demikian, dalam

perkembangannya, seringkali ditemukan hasil uji yang variatif. Diduga telah

terjadi mutasi atau ada variasi genetik KHV di Indonesia. Menurut Walker

(2000), variasi genetik karena mutasi sekuen nukleotida dapat mencegah

mengikatnya

‘• ‚” „•

PCR pada sekuen target.

Berkaitan dengan variasi genetik, Aoki

„ ‡… “

. (2007) telah meneliti secara

molekuler 3 isolat KHV yang berasal dari Jepang, Amerika Serikat, dan Israel,

dan menemukan bahwa ketiganya merupakan strain baru KHV. Selanjutnya

berdasarkan hasil penelitian Sano

„ ‡ … “˜

(2007) ditemukan adanya perbedaan

isolat-isolat KHV dari berbagai negara seperti Israel, Indonesia, Malaysia,

Thailand, dan negara-negara Eropa. Di Indonesia, data dan informasi yang

berkaitan dengan varian-varian KHV dan wilayah persebarannya secara geografis

masih terbatas. Sejauh ini laporan KHV di seluruh Indonesia masih berupa

laporan kejadian, dan belum diteliti perbandingan genetika molekulernya.

Indonesia memegang peranan penting untuk mengidentifikasi varian-varian virus

yang berkembang di Indonesia dan patogenesanya. Hal tersebut akan memberikan

petunjuk berharga berkaitan dengan pola transmisi virus, sehingga memberikan

informasi bagi tindakan pencegahan maupun pengendaliannya.

Perubahan

patologis varian KHV yang diperiksa melalui penelitian ini, juga akan menyajikan

gambaran gejala klinis dan kerusakan yang ditimbulkan oleh virus dalam tubuh

hospes. Melalui hal tersebut, pengenalan infeksi oleh KHV dapat bersifat variatif

dalam memberikan informasi terhadap deteksi dini infeksi KHV di Indonesia.

™š›š

Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Informasi

ilmiah tentang variasi genetik KHV yang menginfeksi

œ

y

ž Ÿ ¡¢

£¤ž  Ÿ¥

.

2. Informasi

ilmiah tentang sebaran geografis variasi genetik KHV di Indonesia.

3. Informasi ilmiah tentang perubahan patologis infeksi varian KHV di Indonesia.

4. Informasi ilmiah

sebagai dasar

untuk merumuskan

kebijakan, strategi,

program dan kegiatan

pencegahan dan pengendalian penyakit KHV di

Indonesia yaitu antara lain:

a)

Pengembangan vaksin sesuai dengan varian KHV yang ada di Indonesia.

b)

Pengembangan metode deteksi dan diagnosa penyakit berdasarkan variasi

genetik KHV.

c)

Pengembangan kegiatan pemantauan dan surveilen berdasarkan variasi

genetik KHV yang ada di Indonesia.

d) Pengembangan teknik pencegahan dan pengendalian penyakit KHV

lainnya.

5.

Informasi

ilmiah sebagai bahan evaluasi keberhasilan program dan kegiatan

intervensi yang sudah dilakukan dalam pencegahan dan pengendalian

penyakit KHV di Indonesia.

¦§¨§ ©ª« ¬­® ¬¯

(

Novelty

)

Hal-hal baru yang membedakan penelitian ini dengan penelitian yang telah

dilakukan sebelumnya adalah sebagai berikut :

1. Variasi genetik KHV pada

°

y

±² ³´µ¶·¸² ±³ ¹

di Indonesia.

2. Sebaran biogeografis variasi genetik KHV di Indonesia.

3. Perubahan patologis infeksi varian KHV di Indonesia.

1

.

6.

Batasan Penelitian

Batasan penelitian ini meliputi pengamatan gejala klinis dan deteksi KHV

dengan uji PCR pada ikan-ikan yang diduga terinfeksi KHV. Selanjutnya

dilakukan DNA

¶ º»µ º´ ·³´¼

untuk mengetahui profil DNA KHV dari ikan-ikan

yang positif KHV yang berasal dari berbagai lokasi yang diteliti, dan dianalisis

variasi genetiknya. Pengamatan dan analisis selanjutnya dilakukan terhadap

histopatologi ikan-ikan yang diketahui terinfeksi KHV. Konfirmasi hasil uji

PCR dan mengetahui penyebaran KHV pada jaringan atau organ-target, dilakukan

pengujian dengan teknik imunohistokimia.

1.7.

Hipotesis

Hipotesis penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Ada variasi genetik KHV yang ditemukan pada

°½±²³´µ¶ ·¸² ±³ ¹

di berbagai

2. Varian KHV sudah menyebar secara geografis di berbagai lokasi budidaya di

Indonesia.

3.

Ada hubungan antar kelompok (

¾¿

u

st

À

r

) variasi genetik KHV dengan

perubahan patologis yang ditimbulkan pada jaringan

Á

y

Âà ÄÅÆǾÈà  ÄÉ

.

II

Ê Ë Ì ÍÎÏÐÏ Í

ÑÐ ÒËÏ ÓÏ

ÔÊÕÊ Ö×Ø×Ù ÚÛØÜ Ý ÚÜÙ

ÖÞß

Herpesvirus adalah virus yang berukuran besar. Herpetos berasal dari

bahasa Yunani yang artinya mengerikan.

àá

r

âáãä ãåæá

sv

berbiak dalam inti,

membentuk badan inklusi yang disebut

ç

o

w

åä è

ty

âá é

. Virus-virus ini

memperoleh amplopnya sewaktu

êëåå ãìí

melalui membran inti sel (Malole,

1988)

Herpesvirus memiliki sejumlah besar gen, yang telah dibuktikan bersifat

peka terhadap kemoterapi anti virus (Brooks,

á

t

æî

, 1995). Menurut Malole (1988),

semua anggota Herpesviridae sensitif terhadap

á

t

ïá

r

dan asam. DNA-nya

berserabut ganda dengan berat molekul 50 100 x 10

6

Dalton. Kapsidnya

bersimetri kubus memiliki 162 kapsomer (150 heksagonal dan 12 pentagonal).

Virion yang beramplop berukuran antara 150 200 nm, tetapi virion yang tanpa

amplop juga sering ditemukan dengan ukuran 100 110 nm. Bentuk famili

àáä âá

sv

ãäãåæá

dapat dilihat pada Gambar 1.

KHV yang termasuk salah satu anggota famili Herpesviridae, dilaporkan

menyerang ikan mas dan koi (

ð

y

ñòó ôõö ÷ø òñó

o

) di banyak negara dan telah

menimbulkan kerugian ekonomi yang cukup besar (Perelberg

ù

t

ø úû

, 2003).

Pengamatan dengan menggunakan mikroskop elektron pada sel-sel yang

terinfeksi KHV menemukan virion-virion beramplop yang membungkus

nukleokapsid ikosahedral berukuran diameter sekitar 100

110 nm yang terdapat

di bagian dalamnya. Virion-virion KHV memiliki suatu lapisan

t

ùüõý ùôþ

diantara amplop dan nukleokapsidnya.

Ukuran diameter total virion matang

dengan amplopnya sekitar 170 230 nm (Hedrick

ù

t

ø úûÿ

2005). Bentuk KHV yang

dilihat melalui mikroskop elektron dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Virion-virion KHV yang terdapat pada sel-sel KF-1. Figur

ó ôö ù

t

adalah virion KHV lengkap dengan amplop viral,

t

ùüõýùôþ

, dan

nukleokapsid hexagonal. Bar = 100 nm (Hedrick

ù

t

ø úûÿ

2005)

Genom KHV merupakan suatu molekul

õú ù

st

òø ô ù

(ds) DNA dan

diperkirakan berukuran 277 kbp, melebihi rata-rata ukuran virus yang termasuk

famili Herpesviridae yang berkisar 250 kbp (Ronnen

ù

t

ø úû

, 2003

ø úø ý

Hedrick

ù

t

yang dipertimbangkan dalam mengelompokkan virus ini dalam famili

Herpesviridae.

KHV berbeda dari herpesvirus-herpesvirus lainnya yang menyerang

ikan-ikan cyprinid seperti

y

sv

ru

s

1 yang merupakan agen penyebab

p

o

x

. Hal ini ditunjukkan melalui uji-uji

yang

menemukan antibodi anti-CyHV-1 gagal bereaksi dengan KHV (Hedrick

t

,

2000). Selanjutnya, perbedaan-perbedaan dalam susunan protein dan

genomik virion memberikan bukti tambahan bahwa kedua jenis virus tersebut

merupakan agen-agen yang berbeda (Gilad

t

2002). CyHV-1 dapat

menyebabkan mortalitas pada ikan mas dan koi tetapi hanya terjadi pada ikan-ikan

yang usianya kurang dari 2 bulan (Sano

t

, 1985

Hedrick

t

2005).

Selain itu juga, ikan-ikan yang dapat bertahan hidup dari infeksi CyHV-1

menunjukkan karakteristik pertumbuhan

o

u

s

yang umum

diketahui sebagai

p

o

x

(Schubert, 1966

Hedrick

t

, 2005). Satu

jenis herpesvirus lainnya adalah

y

sv

ru

s

2 yang awalnya dinamakan

t

s v

ru

s

(GFHNV), telah diobservasi melalui

mikroskop elektron dan telah berhasil diisolasi dari ikan koki (

u

s

u

s

)

yang menunjukkan nekrosis yang parah pada sel-sel hematopoietic. Tidak seperti

CyHV-1, KHV sangat virulen dan dapat

menyebabkan

mortalitas pada seluruh

ukuran ikan mas dan koi (Hedrick

t

, 2000 dan Perelberg

t

, 2003).

CyHV-1 hanya dapat menyebabkan kematian pada Ikan Mas dan Koi yang berumur

kurang dari 2 bulan (Sano

t

, 1985

Hedrick

t

, 2005). Selain itu,

bukti lainnya adalah tidak terjadi pembentukan papilloma pada ikan-ikan yang

dapat bertahan hidup dari infeksi KHV.

Perbandingan-perbandingan DNA genomik dan polipeptida virion dari

KHV terhadap CyHV-1 menunjukkan bahwa virus-virus tersebut memiliki

kemiripan tetapi merupakan agen-agen yang berbeda nyata. Perbedaan ini dapat

ditunjukkan melalui deteksi terhadap masing-masing virus dengan menggunakan

uji-uji PCR yang dikembangkan oleh beberapa peneliti (Gray

et

2002;

Bercovier

t

, 2005). Gray

t

(2002), telah mengembangkan uji PCR melalui

pembuatan disain primer untuk mendeteksi KHV.

!" #

r

$

t

SphI-5,

%

o

rw

!&

(5 -GACACCACATCTGCAAGGAG-3 )

dan

r

v

!$

(5

-GACACATGTTACAATGGTGGC-3 ), untuk mengamplifikasi produk dengan

ukuran fragmen DNA 290 bp, terbukti dapat mendeteksi KHV. Hal ini

ditunjukkan dengan munculnya pita DNA yang tampak jelas pada ukuran fragmen

290 bp. Sedangkan pada isolat-isolat virus lainnya seperti

'()) '* %"$ (+"

ru

s

(CCV) dan

'

y

,!")"& - !,

sv

"

ru

s

(CHV), pita-pita DNA tersebut tidak tampak

(Gambar 3). Uji PCR ini cukup sensitif untuk mendeteksi 100 femtograms atau

sekitar 600 kopi DNA dari DNA genomik KHV (Gray

t

2002).

Gambar 3 PCR

,!" #

r

$

t

yang didisain Gray

t

(2002) spesifik untuk

mendeteksi KHV, hal ini tampak dari pita DNA pada ukuran fragmen

290bp.

././ 0123 14 3567 6 839

Variasi genetik merupakan ciri-ciri yang paling esensial pada seluruh

organisme hidup, yang merupakan salah satu cara untuk beradaptasi secara

progresif terhadap perubahan lingkungan alamiah (Walker, 2000). Mutasi dan

rekombinasi menyebabkan adanya variasi genetika (Trun dan Trempy, 2004).

Menurut Trun dan Trempy (2004), mutasi adalah suatu perubahan fisikal

pada satu atau lebih dari satu pasang nukleotida dalam DNA, dan dapat hanya

mempengaruhi satu pasang nukleotida atau dapat mempengaruhi ratusan kilo basa

nukleotida. Pengaruh mutasi tergantung pada tempat dimana mutasi tersebut

terjadi dalam DNA. Mutasi dapat diklasifikasikan dalam dua kelompok, yaitu

yang terjadi pada nukleotida tunggal dan banyak nukleotida. Mutasi yang

mempengaruhi nukleotida tunggal disebut

m

icro

lesio

n

s

, sedangkan yang

mempengaruhi banyak nukleotida disebut sebagai

:;

m

ro

lesi

<=> ?

Beberapa tipe

@ A; B<C D>A <=>

adalah mutasi titik dan mutasi

E B:@D> FA E

t

.

Mutasi titik adalah perubahan yang terjadi pada satu pasang basa nukleotida.

Perubahan tersebut dapat berupa substitusi basa dari satu purin dengan satu purin

(A menjadi G atau G menjadi A), atau satu pirimidin dengan satu pirimidin (T

menjadi C atau C menjadi T). Mutasi titik ini disebut juga transisi. Jika

mutasi

titik tersebut berupa substitusi basa dari satu purin dengan satu pirimidin atau

satu pirimidin dengan satu purin, mutasi ini disebut juga suatu

t

B:=>GD

rs

D?

Tipe

@ A; B<CD> A<=>

lainnya adalah mutasi

E B:@D> FA E

t

, yang berupa insersi/penyisipan

atau delesi/penghapusan satu pasang basa tunggal dalam suatu gen. Beberapa

mutasi

EB:@ D>FAE

t

juga dapat diklasifikasikan sebagai

@ : ; B<CD> A<=>H

jika mutasi

tersebut berupa insersi/penyisipan atau delesi/penghapusan yang terjadi pada basa

dalam jumlah banyak. Tipe mutasi

@ :; B<CD> A<=>

termasuk didalamnya meliputi

seperti

in

verse

/pembalikan dan translokasi. Seluruh mutasi tersebut melibatkan

perubahan-perubahan besar dalam urutan nukleotida (Trun dan Trempy, 2004)..

Variasi genetik juga dapat terjadi pada virus. Variasi viral tersebut dapat

terjadi melalui sejumlah mekanisme yang meliputi penyusunan/pengaturan

kembali yang utama pada struktur genom, dan pengorganisasiannya dapat terjadi

melalui rekombinasi genetik. Selain itu, dapat juga melalui duplikasi gen,

pertukaran gen, penghapusan gen, dan penyisipan gen. Namun demikian, bentuk

variasi yang paling umum adalah mutasi melalui substitusi nukleotida (Walker,

2000).

Variasi

genetika yang terjadi dapat disebabkan virus-virus tersebut harus

menghadapi perubahan lingkungan yang terjadi secara terus menerus. Seperti

halnya virus-virus melintas dari satu inang ke inang lainnya, mereka harus

berhadapan dengan respon pertahanan dan sistem imunologis inang.

Penghindaran dari pertahanan inang merupakan suatu ciri pokok strategi bertahan

pada seluruh virus (Walker, 2000).

Terkait dengan KHV, sejak pertama kali terjadinya wabah, perkembangan

KHV telah dilaporkan melalui berbagai penelitian maupun forum ilmiah.

Berdasarkan pada penelitian

penelitian tersebut diketahui bahwa isolat isolat

KHV dari berbagai Negara seperti USA, Israel, Indonesia, Malaysia, Thailand,

dan Negara Negara Eropa memiliki perbedaan (Sano

et

IJKL MNNO

). Penelitian

Stone

P

t

IJ

. (2007) melaporkan berbagai varian KHV yang terdeteksi di Eropa.

Selanjutnya, penelitian Aoki

P

t

IJK

(2007) menemukan adanya variasi genetik 3

isolat KHV yang berasal dari Jepang, Amerika Serikat, dan Israel. Ukuran genom

KHV yang teridentifikasi untuk masing-masing varian adalah 295,271 bp (varian

1 ), 295,146 bp (varian 2) dan 295,138 (varian 3). Berdasarkan pada preparasi

DNA melalui

QR

strictio

n

STUVTWXYRZ[R

D

\]R

st

\VT

dengan

^

o

t

Y

atau

XbaI

menghasilkan profil yang identik dari ketiga

strain

tersebut. Genom strain KHV

memiliki pengulangan langsung (

direct repeat

) sebesar 22 kbp pada tiap tiap

terminal (22,437 bp untuk varian 1, 22,469 bp untuk varian 2 dan 22,485 bp untuk

varian 3). Genom-genom varian tersebut memiliki tingkat kesamaan yang cukup

tinggi pada level sekuen. Sebagai contoh, substitusi

nukleotida

tunggal (tidak

termasuk duplikat terminal pengulangan/terminal

repeat

) varian 1 berbeda dengan

varian 2 dan 3 pada loki 181 dari 217 loki. Hal tersebut berarti terdapat perbedaan

pada setiap rata rata 1,5 kbp. Disisi lain, dari sebanyak 36

nonconserved

loki,

varian 3 berbeda dengan varian 1 dan 2 pada 32 loki dan varian 2 berbeda dengan

varian 1 dan 3 pada 4 loki. Selain tinjauan pada genom dan loki tersebut, ketiga

strain KHV menunjukkan perbedaan pada

open reading frame

atau dikenal

sebagai ORF. Kejadian tersebut diduga karena adanya insersi dan delesi yang

terjadi pada satu atau dua strain menyebabkan kerusakan pada titik pengkodean

(

coding region

).

Variasi genetik KHV dari beberapa isolat di Eropa, Israel dan Amerika

jauh sebelumnya pada tahun 2003 telah diteliti oleh Gilad

et al.

(2003). Pada

penelitian tersebut diketahui bahwa sebanyak 6 dari 7 isolat yang diteliti tidak

memiliki perbedaan yang signifikan berkaitan dengan polipeptida virionnya. Pada

isolat KHV D-081 dari Israel diketahui memiliki polipeptida tambahan dengan

ukuran 162 dan 41 kDa. Penelitian tersebut juga menemukan adanya perbedaan

antara isolat KHV yang berasal dari Israel dengan isolat Amerika. Isolat-isolat

selanjutnya yang ditemukan di Israel maupun Amerika dengan lokasi geografis

yang berbeda-beda memiliki polipeptida virion dan RFLP yang identik atau mirip

dengan isolat KHV yang terlebih dulu diisolasi (

Gilad et al.,

2002). Sejalan

dengan hasil penemuan tersebut, Banks (1993) mengemukakan bahwa meskipun

terdapat variasi minor yang terlihat pada isolat virus dalam satu spesies, namun

isolat yang berasal dari lokasi geografis yang sejenis akan membentuk kelompok

yang bersifat

relative homogeny

. Penelitian yang mendalam berkaitan dengan

sequencing

amplikon KHV dan jumlah variasi lokasi geografis asal genom di

masa mendatang akan sangat berguna dalam membedakan beberapa isolat KHV

berdasarkan lokasi geografis.

_`a`

I

b cb d

Ikan

mas

dan

koki

(

Cyprinus carpio

)

merupakan

inang KHV

(Perelberg

et al.,

2003; Hedrick

et al.,

2005; Ishioka

et al

., 2005; Shapira

et al.,

2005; Waltzek

et al.

, 2005).

KHV

ini diketahui dapat menyerang seluruh ukuran

ikan. Meskipun demikian, ikan-ikan berukuran kecil lebih sensitif terhadap KHV

daripada yang berukuran lebih besar ( Perelberg

et al

., 2003).

Kerentanan ikan terhadap infeksi KHV dan cara transmisinya dapat

berpatokan pada hasil penelitian Perelberg

et al.

(2003) dengan menggunakan

berbagai jenis ikan cyprinids yaitu

Cyprinus carpio

,

Oreochromis niloticus,

Bidyanus

bidyanus,

Hypophthalmichthys

molitrix,

Carassius

auratus,

Ctenopharyngodon idella.

Hasil penelitiannya menunjukkan hanya

Cyprinus

carpio

saja yang rentan terhadap infeksi KHV, dengan tingkat kematian

mencapai 72 % setelah terpapar virus, sedangkan jenis-jenis ikan lainnya tidak

terpengaruh dan tetap bertahan hidup. Melalui uji kohabitasi yang dilakukan

Perelberg

et al.

(2003) menunjukkan hanya ikan mas saja yang dapat

mentransmisikan KHV ke ikan mas lainnya yang sehat. Sedangkan ikan-ikan

dari strain-strain yang resisten tetap bertahan hidup dan tidak menularkan KHV

pada ikan mas yang sehat.

efgf hi

k

jk

i

lminjkoipq

b

j rjkoj stut vw l

I

kxi

k

lw

K

yz

Proses infeksi herpesvirus pada sel inang dimulai dengan terjadinya

perlekatan atau adsorpsi partikel virus pada reseptor yang ada di permukaan sel

inang. Adsorpsi virus pada permukaan sel segera diikuti oleh masuknya

virus-virus yang mengandung genom ds DNA ke dalam sitoplasma melalui proses

endocytosis. Selanjutnya nucleocapsid ditransportasikan sepanjang

matriks

cytoskeletal menuju membran

inti

kemudian masuk ke

dalam inti/nukleus.

Setelah memasuki

inti, terjadi proses replikasi virus dengan langkah-langkah

biosintesisnya menurut urutan sebagai berikut: 1) Transkripsi untuk pembuatan

m

essen

g

er

RNA (mRNA) dari DNA virus asal (

parent

) yang menginfeksi sel

(sesudah

uncoating

). 2) mRNA tersebut berpindah ke ribosom dalam sitoplasma

sel dan diterjemahkan (

translated

) menjadi enzim dan protein-protein lainnya

(

early

protein = protein awal) yang melakukan sintesis asam nukleat untuk virus

baru. 3) Replikasi DNA virus

dalam inti.

4) Transkripsi lanjutan untuk pembuatan

mRNA lagi dari DNA-

parent

dan virus baru (

progeny

). 5) Penerjemahan

(

translation

) mRNA yang dibentuk kemudian (

late

mRNA) menjadi protein (

late

protein) sebagai bagian dari komponen virus dan sebagai enzim yang sama

dengan

early enzyme

. 6) Perakitan (

assembly

) virus baru (

progeny

virus) di dalam

inti

sel. 7) Pelepasan virus yang matang (

mature

virus) dari sel. Herpesvirus

selain keluar secara biasa melalui sitoplasma dimana virus-virus ini memperoleh

amplop, dapat juga berpindah langsung ke sel terdekat tanpa harus terlebih dahulu

keluar sel yang terinfeksi.

Metode transfer antar sel tersebut memungkinkan virus menyebar dalam

tubuh inang walaupun terdapat banyak antibodi di dalam cairan tubuh di luar sel.

Hal inilah yang menyebabkan terjadinya infeksi virus secara laten atau kronis

selama berbulan-bulan sampai bertahun-tahun pada inang yang terlihat sehat

(Malole, 1988; Walker, 2000). Strategi dasar replikasi virus dengan genome ds

DNA dapat dilihat pada Gambar 4. Terkait dengan KHV, Hedrick

et

{|

.

(2000)

dan Perelberg

et al.

(2003) berdasarkan hasil penelitiannya menyimpulkan bahwa

KHV pertama kali masuk dan menginfeksi ikan melalui insang dan atau usus.

Mekanisme infeksi KHV menurut laporan Pikarsky

et al.

(2004) menyebutkan

bahwa virus pertama kali masuk ke dalam tubuh ikan melalui insang, selanjutnya

bereplikasi di dalam insang. Aktivitas replikasi tersebut mempengaruhi struktur

insang sehingga terlihat mengalami nekrosis dan kelukaan pada lapisan

mukosanya. Kerusakan insang yang parah merupakan salah satu faktor

munculnya gejala klinis pada ikan.

!"# !"$ %#&& "$ ' !(

))) *$ "# $+ ,# -

u

s

rin

p

y

./0 12

o

$# $3 4 ++ $3 , 3 $ 567

l

89608:;; <. 8= 2

sh

>/?

h

o

l

8@AB@CD E@CF8

##, G H !+ $3 IJ # ))K LMN2./7 L

i

.0 <O 2

o

l

< PQ R !S+ 3S (TT+ # $ 3I$ U# "T $( V + $3 WKT

!33 # X X # 3$+ $3 * $,, *,+ +T ))

#& $ Y# # ! & Z ! ! $3 &!# $ 3 +$ # 4 3

:.

t

/8>[ Q

sio

l

8\./ ]N8\6

p

p

l

8 ^_`CB_a Cb8

U $S$$V *))) U + + !+$3 $ # $3& + $# c $(R $#+# (

U#+ + # & c $( $3 * 3 U $+ I! # $

' Y (

U+$!3$ G dde J$4 Y# $ ,# T 3$ U T %T Y !

f-

y

%c g SX$ T& f -

s

u

rin

yp

./012

o

gh $+ $, !+$

3 I!34 *$i" + $ 'Y $*!

U# c $j * + G # ! * # I G++ H *$

I && * "# c $3 T+$ dd) "$j# T# $+ #&

( ,# T Y! -

yp

rin

u

s

./012

o

, k8 l2

ro

l

8 N< 2B @@DCmkln8b D`b FEb C

h $ # o $*h &+# # HIR$3U $$ p! $3

G h * # dd) G+(# # "$+ !3( #& # $3& q/7

o

O/?0 /.

h

u

s

N2N/.

tylu

s

f 3edg # " $ \.

i

M

n

ti

/L/0 2]/a `B

5

@FE

5

DF

#44 $ )KK !V#+ & "$++ r s T# &

U $ = 0<tu[MvM 1/0 ? M

m

M

n

t

<w-[M./

i

m

l

>/?

h

o

l

< PQx

n

iv

M

rsity

<w yMM N;8

G + $3 z! X 3 * 3, # o+# , % # Y

V+3$ R % 3 , dd r $+ $$ #& ,# T Y! $3

3 Y+#T " #& $ T#+(" $ $ $ # $ $ ( # 3 Y!

,# -

yp

rin

u

s

./0 12

o

ko

i

v

i

; M/;M

s

<w :{ 6/?

i

. |0 P/ ]2

sm

; ^ l<78

4

C B @b @ E @b C^Dbb D8

G + $3 z! * 3,# X s$( J % s+ + % #Y R

% 3 , dd *#+ !+ $ # "T $ # #& #+ $ #& $ " &

T $# ,# T Y ! $3&&#&4 $"T $ !# "# $+ (

#& iT " $+ +( & 3 ,# k<60]/7 <w }M ]M0 /7 l2

ro

l

< PQ ~Dbb `^ C€^ D__@ D__C8

G + $3 z! H oc $ $U *I! % # Y R% 3,

…† ‡ …ˆ‰Š …‹ŒŽ Ž  ‰ ‹ …‘Œ…’ “

y

p

rin

u

s

”•–—˜

o

ko

i

™ ™™ …™™ …’ š  ˆ …Ž›Œ‰Š … œŠ ‹ž Ÿ ¡ ¢

i

£¤ •£¤

s

¥¦§¨© •ª ”

i

« –¬ •­˜

sm

s

®¥¯°±²³´µ¶ ´·µ¸¹²² º° »ˆ¼½ ¡ ¾¡¼¾¡¿À ŽŽ ‰™ ¼Á ¡Â¡¾ ž Œˆ ¼Ã¡¿¡» ˆÄ¼Å¡» ÄÄ’Æ ‰‹¡ ƒÇǃ¡ È …Œ…‘Œ‰ ċĐ

É Ä‰Ê…ˆ‡ …™ ˉˆÀ™ È Ìʼn‹Œ ‰™ ™ À …™ Љ ‹ …‘Œ …’ ‰™Ê¡ Í¥© –­ •¯ ¥¦Î˜

sh

¢

i

£¤ •£¤

s

¹²² ¹¸¹Ï ¸´µ´ ´µ·°

» ……ˆ¼Ð¡Ã ¡¼Ã¡ СÁƍ ‹…‡ ąŽ¼¿¡ Ì¡Ì …Ž¡ ‚ÑÑÒ¡ Ð ‰™ŒÄŽ Äӏ ‹’À Ž Œˆ™ ŒˆÀ ‘ŒÀˆ…ĐŒÊ…

ʅ‡ ŒÄ‡ ‹‘ˆ…™ Đ Œ ʅ Œ ‰Ó…ˆ ‰™ ʼ Ô

y

Ֆ ¥ ”

s

u

yn

¦

o

rsk

•Ö ¯

ii

¡ Í¥© –­ •¯ ¥¦ ×

o

rp

h

o

l

¥¬Ø¹¹µ³¶Ù ´²² °

» ÄÄ’Æ ‰‹¼ Å ¡¼ ƒÇÇÚ¡ È ‰ …ˆ…‹Œ ‰ Ž ȉ Ӌꉙ Û ÁÜ Ÿ ˙¡ Ý ÐÜ ‰ ‹ Ýĉ¡ Î ˜

sh

Ô¤ •¯

th

Þ¤

w

sl

¤

tt

¤ –¸§Î ßàÎ Ôß°Ù´³´¸¶³ ´Ù°

Ѕ’ˆ ‰‘ɼ  ¡ ž¡¼ á¡ » ‰ Ž ’¼ Á ¡ âÀ ‹¼ á Ü¡ Á ‡ ‹Ó…‹š…ˆ Ó¼ »¡È ¡ ¿ˆ Œ¼  ¡½¡

ÌĈ ’ʍÀ™ …‹¼ ¿¡Ã¡ Ý …šÀ™ ¼ С ㅈ ‘Äˉ …ˆ¼ Å¡  Ž’ ˆ ¡ ƒÇÇÇ¡ Šʅˆ‡ …™ ˉˆÀ™

™™Ä‘‰ Œ … ƉŒ Ê Š™ ™ ŠÄˆ Œ Ž‰ Œ  Đ äÀ ˅‹‰Ž …  ‹’  ’À Ž Œ É Ä‰¼  ™ Œˆ ‰‹ Đ 

‘ÄŠŠÄ‹‘ˆ‡¡ Í¥© –­ •¯§¨© •ª

i

”§­˜•¯

m

Ô¤ •¯

t

Ö ¸´¹ ¸ºº

5

µ°

Ѕ’ˆ ‰‘ɼ   ¡ ž¡¼ á¡ » ‰Ž ’¼ Á ¡ Ÿ¡ âÀ ‹¼ œ¡Á ¡ ¿‘’ÄƅŽ¼ œ¡ã¡ ½  Ž Œå …ɼ »¡ ᡠ݅Ž Ž…¼

¿¡Å¡ Å ’É ‰™Ä‹¡ ƒÇÇæ¡ ç‹‰Œ ‰ Ž ‰™ÄŽ Œ ‰Ä‹  ‹’ ‘ʍˆ ‘Œ…ˆ ‰å Œ‰ ċ Đ  Ê …ˆ‡…™›

Ž‰É … ˉˆÀ™ èÝÐ Ü鐈 Ċ Ýĉ ‹’ Ÿ ĊŠ ċ Ÿˆ‡¡ ȅ‡ˆ ŒŠ…‹Œ Đ ¿…’‰ ‘‰ ‹ …

 ‹’ ‡ ‰ ’…Š ‰ ĎÄӏ¼ Á‘ ÊÄĎ Đ ܅Œ …ˆ ‰ ‹ˆ ¿ …’‰‘‰ ‹…¼ ê ‹‰ ˅ˆ™ ‰Œ Đ

Ÿ Ž‰ Ĉ‹‰¼È  ˉ™ ¼Ÿ Ž‰Äˆ‹‰¡ 뇡

Љ ‹ŒÄ‹¼ È¡Â ¡  ‹’ ȡá ¾Àˆ…‹¼ ‚ÑÑÇ¡ 狌…Óˆ Œ‰ ˅ ʉ™ Œ ć ŒÊĎÄӉ ‘Ž ‡‡ ˆ č ‘Ê…™ Œ Ä

’…Œ…‘Œ‰ ‹Ó… … ‘Œ™Ä…‹Ë‰ˆÄ‹Š …‹Œ Ž™ Œˆ …™ ™Äˆ™Ä‹ ‰™Ê…™ ¡§ì°Î˜£Ö°ß ¥”°ß

ym

p

·³

5

´ ±±°

ÐÄĎ …¼È¡¼ È ¡ãÀ ‘É …¼ ž¡ãÀˆÓ…™ ™¼ç¡½…Ž Žš¡ ƒÇǂ¡ ¢

i

£¤ •£¤

s

¥¦“ •–— •­Õ «

t

Ö¤

r

“

yp

rin

i

ÕΘ£Ö¤

s

¡ 퉙ʉ‹Ó̅ƙãÄÄə ¼ãŽ ‘É Æ …Ž ŽÁ‘‰ …‹‘…¾Œ ’¡ ¾Ä‹’Ä‹¡ çŽ ÄÀ å …¼ ¿¡¼ Å¡ È ‰™Êċ¼ œ¡ ÝÊ ‹¼ ¿¡ ÝČ Ž…ˆ¡ ƒÇÇÒ¡ Ÿ‡ˆ‰ ‹‰’ ʅˆ‡ …™ ˉˆÀ™›Ú

èŸ ÐܛÚé š …ˆ™ Ó …‹…™ Đ Ó …‹…Œ ‰‘ ŽŽ ’‰™Œ  ‹Œ Ž ˆ Ó … ÈÌŠˉˆÀ™…™¡ Îî ïß

ð¤

tt

°

5

·²³

44

µÙñ·°

ç™Ê‰ Äɍ¼ œ¡¼¿¡â ę ʉ åÀŠ ‰¼Á ¡çåÀŠ ‰¼Ý¡Á À åÀÉ ‰¼Ð¡ Á À åÀÉ ‰¼Ý¡Ý ÄåÆ¼¿¡Å ˆ ‰¼

Ý¡ Ì ÄšÀ™ Æ ¼ â¡ ¿ Ĉ‰ Œ ¼ ¿¡ ݍŒ ļ œ¡ Ðęʉ‹Ä¼ œ¡ ç‰ ’¼ Ý¡ Ýę À Ӆ¼ С

݉ŠÀˆ¡ ƒÇÇæ¡ È…Œ …‘Œ‰ ċ ‹’ ™…À …‹‘…‹ Ž™ ‰™ÄÈ ÌÅ ‡ ϏŠ… ˆ ™ … ‹’

Š ä Ĉ …‹Ë…Ž 慇ˆÄŒ…‰‹Ó…‹ …™ ‰ ‹ É Ä‰ Ê …ˆ‡…™Ë‰ˆÀ™…™ ’…ˆ ‰ Ë …’ ˆ Ċ “

rin

u

s

yp

”•–—˜

o

‰‹ » À ‹Š ‡ˆ… …‘Œ Àˆ…¼ ͇‹¡ ®¤

t

¤

ri

­ •–Ø ×

i

”– ¥ò˜

o

l

¥¬Ø ´´² ó¹²²Ïô ¹µ ÙÙ°

ÝÊĎ ‰’‰ ‹¼Â¡ã¡ƒÇÇë¡ÁŒÀ ’‰ …™ ċ Ýĉ Ѕˆ‡ …™ ˉˆÀ™ ȉ™…™… ᑑÀ ˆˆ…’ ‰‹ 狒 ċ…™ ‰¡

¾ šÄˆ Œ Ĉ Đ í‰™Ê ž ŒÊĎÄӏ »ˆ ’À  Œ… Á‘ÊÄÄ Ž Đ ã‰Äˆ …™ ÄÀˆ‘…™ ¿ ‰…

ùúû üýþ ÿ úþ þ ý ùûþý û üü ýþ ÿ ýü ú ýÿ þ ÿ þ úûþÿ

þ ü ú ú þ þ ýüÿ þ üýü ýú ü ÿü þ

S

ilu

ru

s g

la

n

is

m

i

o

isto

l

!"# $% &' (

o

l

!"# )!*' + !, -..

ri

' (/ .0#1

i

.2345667 859:9 9:;4

jo

u

'+'

i

1

l

.8<

ù ý ü = ü > > ù ûþü ö??@ ýü ýÿ ý ú þ þ ü

þ þþþ Aþ þ ý Bú þ ) <C #

sh

D #

o

l

<

44

E97 9 F 9G2<

H ú I J Hú K K üü ýú ö?Lø M .

xt

& !!N !,

h

isto

l

!"( O

ü ýI úüB þü þü

ü ú ö?LL - #

ro

l

!"# < ü K üý P þ ýþ ü = þ ý üþü ú úý ú úý öö÷

þÿ Q ö?øR M .

xt

& !!N!,S .. '+T U(

sio

l

!"( ÿýüAQ þ úúIú = VAWúý

þ ý =Q üK I üü÷XööHþ ýú úA ýú Y1U!' Z

h

t

izo

1

u

rvi

,

ro

n

s

Q ÿ [Kþ úÿ þ ÿ ü B\

n

t

<) <D #

o

l

<] U.

m

<^E3^ 7^

þBüû üþ W ù ûBü W ü úú Wüü ùú_üBüþ ÷XXL

Qþ úü ú úþ ÿü ü ýü ýÿýü üý ú ù úþ ý þ ý ùQ>`

þ ÿ ÿüý ]

yp

rin

u

s

1 ' a# ! ü úý úú B ü úý ú þú ùQ > b

i

c.c.

s

!,d*1

i

e' "#

sm

s

-!+<76 E9 F 995667 <

üú ÷XX÷ M .

kn

o

l

!"# f.( c

k

S.

n

.

tik

ü ü Oþ ýüü ü ü gü üýü

h g g g gI úþ J ùþ ù > Jüýü W gùþ K üýü

ù I ÷XXö K þýü þ ü úÿÿ ýýþ þ ÿ ý ÿüý IBýþ

1' a#

o

þùúýüC#

sh

T

t

U<2;9:3 F9^ 9< h= ÷XöX d*

i

1 #

m

+ .+

th

]!0. <h= üýþ

ý _ ý K þ ý ú Q úýü K iþü ü W ýüú ù ú ý

÷XXj þ þ ú ú þ ÿü ÿýþþú ú ü A þýü þ ü ü þÿ þ

ÿý ]

yp

rin

u

s

1'a#

o

þ = ý ü \c '.

li

) <d*

t

<D%

i

0".U< ^^^ 95 < þ üý B KJ ú gK_ýüúAþ H üþ` þü Q úýü W üþýü

÷XX@ ü ú þ ú üÿ þýü þ ü þÿ þ þ _ B ÿü ý

þ ý þþü ýþ þüþ ÿýú þþ ý) <-#

ro

l

<37 EG^ ::F

5

9<

ýþ ÿ K H Oþ ú ö??÷ ]

lin

i

1+ ]!1.

p

ts

!, b

i

c.c .

s

T'!1.c c .

s

ú _ BWüýúú = ÿ

üù üýüþü=ü ÷XXk ýú ýhý ü þ úü üüýù üýüþü= ü

ü ùüýüþü= ü gü üý ü

o pqrstrur vs w vrxyr vz m{l{z o |s r }r |ur ~ q|ru ~r €r}r v|v‚rywswyr vyrurvs w vr

ƒ„ o xt …z o pqrs t rur vswvr xyr v† t|€|vs|uwr v t|‡r psr v }rv o |uwyr vr v†

ˆ r yrus rz

‰|w Š|‡† ‹z Œz r v} zz Ž urw ‡‡ z l‘z ’ s up “s pu | rv} “r u ” ~‚}urs | ~w qs ” “~ |€w qsu‚

” Šs ~|w vs|qs w v|wvs |vs |‡|” qs|r vq |“w |qz •–—

h

o

rp

o

l

–˜™š›œž  šŸ– ‰w ‡ | ‚†Œz ‰z†m{{  z —

o

l

¡¢

u

l

£¤¥¦§ ¨¡©ª«

l

io

m

©¬ ­®¬ ¡¢

tio

u

s

¯

i

° ¡£°¡

s

z ’ ± ou|q qz

Œr q~wv²s” v†³ ‹z

‰” |us q†‰z ˆ z†m{{lz ´§

sh

µ£ ¶

h

o

l

©ª« z Ž ~w u}· }ws w” vz Œz ¸z’ rpv}|u qz ¹” v}” vz ‰” wvq† ’ z¹z† ‰z’ z ‹”sur v† ºz tp€ruz l»z µ ©¢

k

¡

t

¼

o

m

¦£®§

o

n

to

µ£ ¶

h

o

l

©ª§¢

½£° §

s

©¬¯

i

°¡£°¡ z Œz ¸z’ r pv}|u q‹” €r v‚†o ~w‡ r }|‡~wrz

‰” q |vyur v¾† ³z† ¸z¿z t‡p† ˆ z oz Ž|wŠy|† „ z ¿ur v¾”À† ³z Áw“~s v|u† Žz ‹z

±|s s |v‡|ws |u†Œz Áp“~qz

m{{Âz x} |vswŠw“rsw” v” Š| v|‡ ” |u”s|wvÃ ‰ÁÂl ” Šy”w~|u|q wu pqz • ©Ä¤ ®£Å©¬Æ ¡® ¡¤ £Åǧ

ro

l

©ª«È›ŸŸÉʘÉË ˜ÉË š Ë ŸŸ– ’ r v”†±z†Žz xs ”†ˆ ztpuw sr†’z±w Àr†Ž zxw}rz m{{ ‘z ³w r²v” qw q” Št ”w„|u |q wu pq

ƒt„ º …³wq|rq |w vˆ rr vz ½ÄÅ

l

–´§° Ì –Í ¡° – Ϊ¡® –Ï Ħ¦Å ¡

m

¡

n

t

Ð ©–›˜

5

Ë Ñšž ˜ ›ŸŸÒ–

’ r vs |u† ‰z ±z† lÂ»z ±”u ~”‡ ”²‚ r v} wvv|u rsw ” v ” Š s~| Šw q ~ ~|r us– Ψ–

v

ή£ ¶ – ¥ÓÔ¤ «

o

l

–¼¡

ll

½§

o

l

– ™Ë ÉÕ ˜ÉË œ™Ÿ›–

’~r wur† Öz† Öz ±r² |v† Žz ×ry† ±z t”s ‡ |u† ¿z „p‡rsr† ¸z ¹z ’ wr vz m{{»z

³wŠŠ|u|vs wr‡ u |qw qsr v“| s ” y”w ~|u |q w upq ƒt „ º …Ø“ru w vs|uqs wsw r‡ v|~uwsw q

r v}²w ‡‡v|“u” qw qwu pqƒ‹Ù¿º …r €” v²“” € €” v “ru ƒ¼

yp

rin

u

s

¢£¤ ¦§

o

¹z … qsurw vqr v}“u” q qu|}qz ÎÚÄ£ ¢

u

lt

Ĥ¡›žÕțŸŸÕʙ ™™–

’ÛrŠ|w†³z’ z† ’p‡ w qs w” v”z l{z —©¤ ¬

o

l

©ª§¨£®Î ®£ ¶

o

m

i

­

k

£® z Ár yp‡s r qo |uwyrvr v xvqs wspso |us r vwr v¸” ²”uz ¸” ²”uz

’ ‡ ”rv|† ·z l  z ή£ ¶

o

m

y

£® ¨ µÌ «©ª«

l

sio

ή ¥£°« Ü¡£¤ ® ¡

r

z ˆ ” v|q rv } ¸r us‡|ss o p‡ w q ~|uq†xv“z’p}pu‚z

’p}w ” v”† ˆ z† ¸z t pu vwr }~w †z „|v}urÀ r v†¸z ³Ûw€r vs ”u”z m{{Ýz ­

lm

u

µ £ ¶

o

l

©ª§ z o |v|uw s¸pypt|}” ys |urv· ¿‹z ˆ r yrus rz

’pvrus ”† z m{{  z ·w}|€w”‡ ”²w |v‚r yws y”w ~|u |qw upq ƒt„º… }w xv }” v|qwrz

¹r ” urs ”uwp€‰wq |s t |q| ~rs r v xyr v†¸r }r v‰w q |s t|‡ r psrv}r v o |uw yr vr vz

ˆ r yrus rz ~‡€z

’pvrus ”†z† z ‰py ‚rvw †Žz xs r€wz m{{»z xv}” v|qw rv |ށ|uw |v“|” v s ~|” psu|r y

” Š y”w ~|u  |qw upq w v y”w r v} “ru  ƒ ¼

s

u

rin

yp

¢£¤¦§

o

…z ½ÄÅ

l

– ´§° Ì – Í ¡° – Ϊ¡® –Ï Ħ¦Å ¡

m

¡

n

t

Ð ©–›˜™Õ ›™˜›ŸŸÕ –

â ãäåæçèé êëé ì åãíîï ðéêë ñ ãí òåäï é óëôèõöî åæòå äï é÷ë â ãøæïòåðï é ùëúåæ ð õäïåé÷ë

÷ ãûï äçèéüëñëê ýãäýøæïòèäèéþë÷ëÿ åö åæï ãéï ðè ðèéüë÷õæðï íï å åäéüë

ñ ãí ûè äèéâë ëÿæ åòïçäèë

àë þïõ ðï äõöçïýåçïè äö è ä åö õæï è ãö ðï ö õåöõ è ãç æ õåí åûè ä ý ôèï åäð è ûûè ä åæø

y

p

rin

u

s

o

ï ä óäðè ä õöï åë

n

ÿë å í õæé ñë ùõö çõæ åäð ëúë è äðåðñ õå äçåöè õðöë

i

s in

u

lt

p

p

!" #

sh

$%

th

&

ti

'

si

# (

ri

s

&'

i

ty

)

l

â ûï çîé ë * ëé âë êë â ûïçîé ë ì õäý+ åæè õäí ã ë ß,,ßë ú æè ö ö ûèæøîèèý ò åäð

çèøèýæ åø îò è - çîõ åðãç ïäçõö çïäå çæ å.ç è - çî õ çï åøïåä -ï öîé / '

h

ro

m

is

n

ilo

ti

u

s

ë

ll

0

i

/1 223 45!"6"

ì åí åöîïûåé þëé ì ë ÷ï ïòåë ß,,ë 7

n

7

tl

8

s

9

ish

:

isto

lo

;

y

é <%

o

rm

= >?

h

o

l

' 1%#?

s

ë â õ.è äð@ðïçï è äë ôè ðåäöî åùç ðë ìèíòèë

ì åãíîï ðéì ëâãûï å çï éóëô è õöî åæòå äï ë àë ÿ õäýåæãî â ãî ãêï æ ðåäìè ç ååî åä

Aæ ýåäïíìõæåæãçì õæîåð åø ÿ åçèý õäï öï ç åö ôèï÷ õæ ø õö ï æãö ø åðå óíåäåöë

å åïñïöõçÿõæïí åä åäã ðïðåòåêïæìååæéèýèæ ë

ì åãíîï ðé êë â ãäåæ çèé óë ôè õöî åæòå äïé ÷ ë â ãøæïòå ðï é ùë úåæ ðõäïåë àBë â çæ åç õýï

ø õäý õäðå ï åä ø õä òåíï ç íèï î õæø õöï æãö ô÷C ø åðå ïí åä ûåö ðåä íèïë

ùå è æåçèæïãûñïö õç ô õöõî åç åäóí åäéåðåäñï ö õç ôõåãçåäð åäÿ õæï í åäåäé

* åí åæ ç åë )D% ( =

n

t

k

= E

p

rksh

o

o

1 =%

i

n

y

D

it

F

o

i

$

sviru

s

GF$H = I= =J

i

k

r t

K L' 1' M

&

p

t

m

I

r

66 5

ìæ ãäé Né *é ìæ õûøòé àBë # =O

n

t

% L

t

ri

% P

n

ti

s

ë å.íõ ÿ ã ï öîï äýë A Q-èæðéRôë àSáøë

Cõýýõçï éêëé êëñè õæ ö è äéúëñ åðå õï éâëêæ æï ýî ïéëüè ûõäõýîï äï ë ß,,,ë ÿè öç

î åç.îïäý ð õõèø û õäç è - çî õ ýãç åäðåçõæ å û ãö . õ ï ä çî õ öèõë T # (

L

o

l

55 !2

Cï . õäçï äï é ë êëé óë ë þæåä.î õö.îï äïCï. õäçïäïé ëì ë è û è äåçèé ë õæçè ã..ïé

âëúë ùïûåé êë âë â åäçè öë àë èæøîèèýï . å âçãðò è- çî õ ùïõæ ïä çî õ

ì õ õè ö ç/ '

h

ro

m

is n

ilo

ti

u

s

t

n

T)

o

rp

h

o

l

"G"H3!2 66 åðåéâëé ëâîïûåûèçèéAëôãæåç åéôë ÷ åç åï éôë Uãåöåë àVë ÷ï ö çèøåçîèèý ò

è - åæçï -ï.ïå ïä-õ. çï è ä è - íèï î õæø õö ïæ ãö ðï ö õåö õë î ã åè äýíèæ ä Räïë

þå.ëè-Cõçëâ.ëéåäýíè íéìî åïåäðë

åýäõæé@ëô ëéë * ë÷õ õç çë àBë L

si

ro

lo

1J ë â õ.è äð @ðïçï è äë

å.í õ ÿ ã ï öîï äýè ûø åä òë AQ-èæ ðë BBøë

åí õæé ÿë * ëé àë óäçæè ðã.çïè ä çè Cïæèè ý òë âóñA ì æèøï. å êýæï . ãçãæ õé

[\] ^_`a bcd caYeeec fg ] _hi]\`_jkl _m kg]g n ogpqk`\] krp_hs kgrc tuvwxy`g jkh\]

zn` khi] si` _avrl `gg`gg jk]]oa{i _ _r|] \rlazi| s` \] k\c

[\]s }_^a yc ~ca c xc € _] ] _ oa cfc u sgr _a €c [\oa ‚c ƒ\r| gra ƒc „i^il\a vc

ƒ k`grga yc zg ^ka zcbc \ qk| gra wcd c ƒ _l` kh ^c Yee …c €g k †_`j_| qk`i|

` _j` _|_rs | \ s†k`l hoj` kr kl †_` j_| qk`i| ‡toƒˆ‰Š‹ kr s†_ p\mk]o

Œ Ž ‘ 

sviri

c ’“”Ž•‘–“—˜ • Ž‘–™š“›œ

ro

l

žŸŸ

5

 ¡¢£¡¤£¥¦ ¤££§¨ [\| ksga X©©©c ª 

tu

n

ju

k

«

kn

is

¬

i

‘›• “­‘ ®

lin

is

‘• ª‘ ¯

o

l

“› š

s

‘‘°

k

‘• c d i| \s