Isolasi dan Kloning Gen Sitokinin Oksidase (OsCKX) Pengendali Sifat Produktivitas dari Padi Varietas Ciherang

i

ISOLASI DAN KLONING GEN SITOKININ OKSIDASE (OsCKX)
PENGENDALI SIFAT PRODUKTIVITAS DARI PADI
VARIETAS CIHERANG

SISCA RESHA SAPUTRI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Kloning
Gen Sitokinin Oksidase (OsCKX) Pengendali Sifat Produktivitas dari Padi
Varietas Ciherang adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juli 2013

Sisca Resha Saputri
NIM G84090041

ABSTRAK
SISCA RESHA SAPUTRI. Isolasi dan Kloning Gen Sitokinin Oksidase (OsCKX)
Pengendali Sifat Produktivitas dari Padi Varietas Ciherang. Dibimbing oleh
SURYANI dan TRI JOKO SANTOSO.
Gen Gn1a/OsCKX (Grain nomor 1a/Sitokinin oksidase) dari tanaman padi
(Oryza sativa L.) yang mengkode sitokinin oksidase, telah diidentifikasi sebagai
lokus sifat kuantitatif yang berkontribusi terhadap peningkatan jumlah biji padi.
Studi ini bertujuan mengisolasi gen OsCKX dari padi varietas Ciherang.

Amplifikasi gen OsCKX dilakukan dengan teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction) menggunakan pasangan primer spesifik dan cetakan cDNA padi cv.
Ciherang. Fragmen gen OsCKX produk PCR selanjutnya diklon pada vektor
kloning pGEM-T Easy dengan bantuan enzim T4-ligase dan ditransformasikan ke
sel kompeten bakteri Escherichia coli Dh5α melalui metode kejut panas, serta
ditumbuhkan pada media LB agar yang mengandung antibiotik ampisilin. Hasil
studi menunjukkan bahwa amplifikasi gen OsCKX dengan primer spesifik
menghasikan amplikon berukuran ± 2000 pb. Fragmen gen tersebut berhasil
diklon ke vektor pGEM-T dan ditransformasikan ke sel E. coli Dh5α. Verifikasi
klon rekombinan dengan pemotongan menggunakan dua enzim restriksi SmaI
dan KpnI diperoleh 2 pita yang berukuran 3015 pb (vektor pGEM-T Easy) dan
2000 pb (fragmen gen OsCKX).
Kata kunci : Enzim restriksi, gen OsCKX, isolasi gen, kloning, padi (Oryza sativa
L.), vektor pGEM-T Easy

ABSTRACT
SISCA RESHA SAPUTRI. Isolation and Cloned Cytokinin Oxidase gene
(OsCKX) as a Gene Controlling Productivity Character from Rice cv. Ciherang.
Supervised by SURYANI and TRI JOKO SANTOSO.
Gn1a/OsCKX gene (grain number 1a/Cytokinin Oxidase) of rice (Oryza

sativa L.) that encodes cytokinin oxidase has been identified as a quantitative trait
loci that contribute to an increase in the number of grains of rice. This study
aimed to isolate an OsCKX gene from rice cv. Ciherang. Amplification of OsCKX
gene was done by PCR (Polymerase Chain Reaction) technique using specific
primer pairs and cDNA template of rice cv. Ciherang. Subsequently, OsCKX gene
fragment was cloned into a cloning vector pGEM-T Easy using T4-ligase enzyme
and transformed into competent cell Escherichia coli Dh5α through heat shock
method, and grown on LB agar medium containing ampicillin. Result showed that
amplification with specific primers of OsCKX gene generated an amplicon
fragment with size of ± 2000 bp. The gene fragment was succesfully cloned into
pGEM-T vector and transformed into cells of E. coli Dh5α. Verification of
recombinant clone by cutting using two restriction enzymes SmaI and KpnI
regenerated two bands of 3015 bp (pGEM-T Easy vector) and 2000 bp (OsCKX
gene fragment).
Keywords : Cloning, gene isolation, OsCKX gene, pGEM-T Easy vector,
restriction enzymes, rice (Oryza sativa L.)

v

ISOLASI DAN KLONING GEN SITOKININ OKSIDASE (OsCKX)

PENGENDALI SIFAT PRODUKTIVITAS DARI PADI
VARIETAS CIHERANG

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

vii

Judul Skripsi : Isolasi dan Kloning Gen Sitokinin Oksidase (OsCKX) Pengendali
Sifat Produktivitas dari Padi Varietas Ciherang
Nama

: Sisca Resha Saputri
NIM
: G84090041

Disetujui oleh

Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Pembimbing I

Dr. Tri Joko Santoso, S.P, M.Si
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan
rahmat, taufik, serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan dan
penyusunan laporan penelitian dengan baik dan lancar. Shalawat dan salam
semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW dan keluarga dan
sahabatnya.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
memberikan bantuan dalam pembuatan laporan ini. Ucapan terima kasih terutama
ditujukan kepada ibu Suryani selaku dosen pembimbing utama dan bapak Tri
Joko Santoso selaku pembimbing lapangan yang telah membimbing serta
memberi saran dan kritik yang membangun. Ucapan terima kasih penulis juga
sampaikan kepada para peneliti, teknisi, staf, Dewi Praptiwi, Falin, Mira Sitepu,
Dendi, Siska, Hilda, Clara, Vita, Sari, Kiki, Tuhfah, serta sesama mahasiswa yang
juga melakukan penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian,
Jl. Tentara Pelajar No.3A, Cimanggu, Bogor. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada kedua orang tua atas dukungan yang selalu diberikan.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari kesempurnaan, maka
saran dan kritik yang konstruktif dari semua pihak sangat diharapkan demi
pelaksanaan penelitian. Akhir kata penulis berharap semoga tulisan ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak, khususnya bagi penulis dan pembaca pada

umumnya.

Bogor, Juli 2013

ix

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

x 

DAFTAR GAMBAR

x 

DAFTAR LAMPIRAN

x 

PENDAHULUAN

1 

METODE

2 

Bahan

2 

Alat

2 

Prosedur Analisis Data

2 

HASIL DAN PEMBAHASAN

5 

Hasil

5 

Pembahasan

8 

SIMPULAN DAN SARAN

13 

Simpulan

13 

Saran

13 

DAFTAR PUSTAKA

13 

LAMPIRAN

16 

DAFTAR TABEL
1 Komposisi larutan ligasi vektor pGEM-T Easy
2 Komposisi larutan digest pGEM-T OsCKX dengan enzim restriksi
SmaI dan KpnI
3 Kuantitas dan kemurnian RNA padi

4

 

5
5

 

DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram
hasil amplifikasi gen OsCKX menggunakan
primer spesifik dengan cetakan cDNA
2 Hasil transformasi gen OsCKX ke plasmid pGEM-T Easy melalui
bakteri Escherichia coli
3 Elektroforegram hasil amplifikasi pGEM-T 9 CKX dan pGEM-T 10
CKX
4 Elektroforegram hasil digest dengan enzim restriksi SmaI dan KpnI
5 Tanaman padi varietas Ciherang

6 
6 
7 
7
8 

 

DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Peta plasmid vektor pGEM-T Easy
3 Koloni sel transforman Escherichia coli yang ditumbuhkan di media
LB cair
4 Isolasi plasmid metode lisis alkali
5 Komposisi larutan sediaan
6 Ekstraksi DNA dengan menggunakan kit Gene Clean
 

15 
15 
16
16 
17 
18 

1

PENDAHULUAN
Padi memegang peranan paling penting dalam penyediaan pangan yang
mendukung ke arah ketahanan pangan nasional dan pemberdayaan ekonomi
petani. Bukan hanya dari segi kuantitas, tetapi kualitas padi yang menyangkut
selera pasar, rasa, aroma, dan kandungan nutrisi menjadi hal penting yang perlu
diperhatikan dalam pengembangan padi ke depan (Krishnan & Puepke 1983).
Hal tersebut dipengaruhi tingkat kebutuhan padi masyarakat yang semakin tinggi
seiring bertambahnya penduduk sehingga produktivitas serta kualitas perlu
ditingkatkan (Kibria et al. 2008).
Upaya yang dapat dilakukan untuk mengatasi permasalahan produktivitas
adalah dengan mengintensifkan teknik peningkatan produktivitas padi melalui
teknologi DNA rekombinan dengan cara mengisolasi gen pengendali karakter
jumlah biji per malai (gen OsCKX) pada tanaman padi. Berdasarkan penelitian
yang dilakukan Li Shuyu et al. (2012) menunjukkan bahwa protein sitokinin
oksidase positif mengatur kegiatan dan fungsi meristem apikal tunas (SAM) yang
merupakan parameter utama penentu produksi benih. Peningkatan aktivitas
meristem menyebabkan peningkatan produksi malai bercabang sebagai akibat
peningkatan jumlah gabah. Pertama kali sitokinin ditemukan sebagai hormon
tanaman yang mengatur pembelahan sel yang mempengaruhi berbagai aspek
pertumbuhan dan perkembangan tanaman, termasuk perkecambahan biji,
dominasi apikal, perluasan daun, dan perkembangan alat reproduksi. Gen ini
diidentifikasi dapat mengkode protein sitokinin oksidase yang berpengaruh pada
pembelahan sel sehingga pemanfaatan gen OsCKX tersebut berguna untuk
memperbaiki sifat tanaman padi agar produktivitas semakin meningkat (Ashikari
et al. 2005).
Perbaikan sifat tanaman padi seperti jumlah dan kualitas tidak kalah
penting dari usaha perbaikan karakter lain, karena pengaruhnya terhadap hasil
panen cukup signifikan. Pemanfaatan gen OsCKX ini selain untuk perbaikan sifat,
diharapkan pula dapat membantu usaha penyediaan gen-gen penting pada
tanaman padi. Molekul DNA yang mengandung gen OsCKX dapat diperbanyak
melalui amplifikasi dan ditransformasikan ke dalam sel inang Escherichia coli
(Tsen et al. 2002). Penyisipan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang ini
menggunakan vektor berupa plasmid seperti pGEM-T Easy. Peristiwa ini akan
menghasilkan sel transforman yang mengandung gen OsCKX untuk diaplikasikan
pada tanaman padi guna mengetahui tingkat produktivitas padi Ciherang sebagai
hasil rekayasa teknologi DNA rekombinan melalui tahap kloning gen.
Pada penelitian ini dilakukan isolasi gen OsCKX dari pada padi varietas
Ciherang yang merupakan padi lokal dari Jawa Barat. Padi Ciherang merupakan
jenis padi unggul yang cukup banyak dibudidayakan oleh petani Indonesia karena
memiliki kualitas dan kuantitas hasil produksi yang baik (LITBANG-Balai
Penelitian Bahan Pangan 2006). Apabila gen OsCKX tersebut berhasil diisolasi
dan dikarakterisasi, maka pemulia tanaman dapat memanfaatkan gen tersebut
sebagai sumber gen baru dalam memperbaiki produktivitas suatu varietas padi,
seperti melalui penyisipan gen tersebut ke dalam tanaman melalui teknologi
rekayasa genetik. Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi dan kloning gen
OsCKX dari jaringan padi varietas Ciherang ke dalam vektor pGEM-T Easy agar

2

dapat menambah koleksi penyediaan gen-gen penting pada padi. Hasil isolasi gen
OsCKX tersebut dapat diaplikasikan pada tanaman padi varietas lain untuk
meningkatkan produktivitas.

METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman padi varietas
Ciherang, akuades, nitrogen cair, mini kit RNeasy Qiagen (buffer RLT[Qiagen],
buffer RPE[Qiagen], buffer RW1[Qiagen]), kit Transcriptor First Strand
Synthesis [Roche] (dNTP 0.2 mM, oligo dT, ddH2O DEPC (dietil pirokarbonat),
transcriptor RT reaction buffer 5x, MgCl2 1.5 mM , protector RNase inhibitor (40
U/ l), dan transcriptor reverse transcriptase 0.02 U/ L), buffer PCR, primer gen
OsCKX (forward dan reverse), enzim Taq DNA Polimerase, agarosa, buffer TAE
1x (asam borat 0.83 M, Tris HCl 1 M pH 8.3, etilendiamina tetra-asetat 10 mM),
akuades, marker DNA invitrogen 1 kb, loading dye, gel red (BIOTIUM), DNA
plasmid pGEM-T Easy, enzim restriksi (SmaI dan KpnI), buffer restriksi, kultur
bakteri Escherichia coli, media LB (Luria bertani), media agar, dan antibiotik
ampisilin.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan Petri, autoklaf,
mortar, tabung mikrosentrifugasi 1.5 mL dan 2 mL, vortex, Microwave [Sanyo],
neraca analitik, labu Erlenmeyer, pipet volumetrik, QIAshredder spin column,
tabung RNeasy mini column, sentrifus, Nanodrop 2000/200c Spectrophotometer
V1.0 User Manual with package Laptop [Thermo Scientific], mesin PCR DNA
Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler [Bio-Rad], stopwatch, perangkat alat
elektroforesis, komputer, UV Illuminator ChemiDocTM Gel System EQ [Bio-Rad]
(Sistem XRS, Image Lab™ Software, dan kamera CCD), laminar, dan alat-alat
gelas.
Prosedur
Penanaman Padi
Penanaman padi dilakukan secara bertahap. Padi yang digunakan adalah
padi varietas Ciherang. Padi disemai dalam cawan Petri yang telah dialasi kertas
saring basah. Proses penyiraman dilakukan setiap hari untuk menjaga kelembaban
media sehingga kekeringan pada tanaman padi dapat dicegah. Penyemaian
tanaman padi dalam cawan Petri dilakukan selama 1 minggu. Padi yang sudah
cukup tinggi sekitar 5 cm kemudian dipindahkan ke dalam bak penanaman berisi
tanah yang kondisinya sesuai bagi media persemaian. Setelah sekitar 2 minggu

3

dalam bak penanaman, padi dipindahkan ke dalam ember dan disimpan di rumah
kaca. RNA padi diisolasi pada umur sekitar 2 bulan setelah malai padi keluar.
Isolasi RNA (Qiagen 2010)
Jaringan yang digunakan untuk isolasi RNA padi adalah jaringan malai.
Isolasi RNA dilakukan berdasarkan metode Qiagen 2010. Semua peralatan yang
akan digunakan terlebih dahulu disterilisasi dengan autoklaf. Isolasi RNA diawali
dengan pemanenan sampel malai padi varietas Ciherang. Sebanyak 0.3 gram
malai dimasukkan ke dalam mortar, dan ditambahkan nitrogen cair secukupnya.
Malai digerus hingga halus dan ditambahkan dengan 450 µL buffer RLT yang
mengandung merkaptoetanol 5 µL. Hasil gerusan dimasukan ke dalam tabung
mikro 2 mL dan divorteks selama 1 menit hingga homogen lalu diinkubasi pada
suhu 56 ºC selama 3 menit. Kemudian suspensi dipindahkan ke dalam tabung
QIAshredder spin column. Sampel disentrifus selama 2 menit dengan kecepatan
12000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5
mL yang baru dan ditambahkan etanol absolut (96%) sebanyak setengah dari
volume total. Selanjutnya sebanyak 650 µL supernatan dipindahkan ke dalam
tabung RNeasy mini column disentrifus kembali selama 15 detik pada kecepatan
1200 g.
Supernatan yang dihasilkan pada tahap sentrifus sebelumnya dibuang dan
ditambahkan dengan larutan RW1 sebanyak 700 µL ke dalam kolom RNeasy.
Suspensi disentrifus kembali dengan kecepatan 1200 g selama 15 detik.
Supernatan yang dihasilkan dibuang, ditambahkan buffer RPE sebanyak 500 µL
dan disentrifus selama 2 menit dengan kecepatan 1200 g. Kolom RNeasy
dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL kemudian ditambahkan 50 µL air
bebas RNase, didiamkan selama 15 menit, kemudian disentrifus pada kecepatan
1200 g selama 1 menit sehingga diperoleh RNA total tanaman padi.
Uji Kuantitas dan Kemurnian RNA Padi dengan Spektrofotometer (Thermo
Fisher Scientific 2009)
Sebanyak 2 µL sampel RNA hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan
menggunakan spektrofotometer nanodrop. Blanko yang digunakan adalah larutan
akuades. Larutan akuades dimasukkan ke dalam lubang optik sebanyak 2 µL dan
bersihkan dengan tisu. Selanjutnya sampel RNA sebanyak 2 µL dimasukkan ke
dalam lubang optik. Hasil pengukuran berupa konsentrasi ng/µL dan kemurnian
RNA dapat dilihat langsung berdasarkan nilai rasio absorbansi pada panjang
gelombang 230, 260, dan 280 nm.
Sintesis cDNA dengan Kit Transcriptor first strand synthesis (RT-PCR)
Sintesis cDNA dilakukan berdasarkan protokol kit Roche untuk
mendapatkan cDNA dari RNA total hasil isolasi yang akan digunakan sebagai
cetakan. Sampel RNA yang digunakan, yaitu RNA yang berasal dari malai padi
Ciherang bagian atas (Cih A3) dan bagian bawah (Cih B1). Campuran reaksi
untuk masing-masing sampel terdiri atas 1 L dNTP mix 0.2 mM, 2 L RNA total
(2 g/mL), 1 L oligo dT, dan ddH2O DEPC sehingga total larutan menjadi 13 L.
Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 65°C selama 5 menit. Setelah itu

4

diinkubasi dalam es selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 L transcriptor
RT reaction buffer 5X, 4 L MgCl2, 2 L dNTP, dan 0.5 L protector RNAse
inhibitor (40 U/ L), kemudian campuran diinkubasi kembali pada suhu 42°C
selama 2 menit. Setelah itu ditambahkan 1 L transcriptor reverse transcriptase
(20 U/ L), diinkubasi kembali pada suhu 55°C selama 30 menit. Inaktivasi
transcriptor reverse transcriptase pada suhu 85°C selama 5 menit dan disimpan
pada suhu -20°C.
DNA komplementer yang diperoleh digunakan sebagai cetakan untuk
reaksi PCR. Tabung mikro diisi dengan campuran reaksi PCR (total volum reaksi
20 µL ) yang terdiri atas 2 µL buffer PCR, 0.6 µL MgCl2 50 mM, 0.4 µL dNTP
mix 10 Mm, 2 µL campuran primer gen OsCKX (Forward 5’- GCC CCG GGA
CAC ACA CAC TGA CAC ACA -3’, sedangkan Reverse 5’- GCG GTA CCT
TCA TGC GAG TGG TGA CGT G -3’), 0.16 U/µL Taq polymerase, 1 µL DNA
50 ng/µL, dan 13.24 µL ddH2O. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan tahap
denaturasi pada suhu 94ºC selama 30 detik , penempelan primer pada suhu 55ºC
selama 1 menit, dan pemanjangan pada suhu 72ºC selama 2 menit sebanyak 35
siklus dan diikuti proses pemanjangan akhir pada suhu 72ºC selama 7 menit.
Selanjutnya produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1% yang
telah ditambahkan gel red dan divisualisasi menggunakan UV Illuminator
ChemiDoc EQ (Bio-rad). Fragmen gen OsCKX berukuran 2000 pb yang muncul
pada gel agarosa selanjutnya dielusi dan diekstrak untuk memisahkan DNA
fragmen dari matriks gel dengan metode ekstraksi gel menggunakan kit komersial
Gene Clean.
Ligasi Gen OsCKX pada Vektor pGEM-T Easy (Promega 2010)
Gen OsCKX (2000 pb) yang didapatkan dari pemurnian hasil PCR
selanjutnya diligasikan pada vektor pGEM-T Easy dan diinkubasi pada suhu 4ºC
selama semalam. Larutan mix dalam ligasi memiliki komposisi seperti pada
Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi larutan mix ligasi vektor pGEM-T Easy
Larutan
2x buffer TE
Plasmid pGEM-T Easy
Fragmen DNA
T4 ligase
Volume total

Volume
5.0 µL
1.0 µL
3.0 µL
1.0 µL
10 µL

Transformasi Plasmid Rekombinan OsCKX Padi ke dalam Sel Escherichia
coli (Sambrook & Rusell 2001)
Sampel hasil ligasi antara vektor pGEM-T Easy dan gen OsCKX sebanyak
10 L dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi yang telah diisi dengan sel
kompeten E. coli sebanyak 50 L, kemudian diinkubasi di dalam es selama 30
menit. Selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu 42ºC selama 90 detik, dan
segera disimpan dalam es selama 2 menit. LB cair ditambahkan sebanyak 950 µL
dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Setelah itu dilakukan sentrifugasi
pada 5000 rpm 1 menit dan disebar pada media LB padat yang mengandung
ampisilin (100 mg/mL), dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 16 jam. Koloni

5

yang tumbuh kemudian diperbanyak dalam 5 mL LB cair yang mengandung 5 µL
ampisilin (100 mg/mL) dan diinkubasi pada shaker incubator 37ºC selama 16
jam. Transforman yang tumbuh diisolasi DNA plasmid dengan metode lisis alkali
(Lampiran 4).
Restriksi Plasmid Rekombinan OsCKX E. coli (Takara 2012)
Plasmid hasil isolasi plasmid kemudian dipotong dengan enzim restriksi
SmaI dan KpnI. Campuran reaksi enzimatis disajikan pada Tabel 2. Campuran
tersebut diinkubasi pada suhu 37ºC semalam. Selanjutnya hasil restriksi
diverifikasi dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%.
Tabel 2 Komposisi larutan digest pGEM-T OsCKX dengan SmaI dan KpnI
Larutan
Buffer SmaI
Buffer KpnI
Enzim SmaI
Enzim KpnI
DNA
NF water
Volume total

Volume
1.5 µL + 0.4 µL BSA
1.5 µL
2.0 µL
2.0 µL
10 µL
13 µL
30 µL

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kuantitas dan Kemurnian RNA Padi
RNA padi Ciherang dari jaringan malai yang telah diisolasi diuji secara
kuantitatif dan kualitatif melalui pengukuran absorban pada panjang gelombang
230, 260 dan 280 nm. Sampel RNA yang diukur merupakan hasil isolasi RNA
malai padi bagian atas dan bagian bawah seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Konsentrasi RNA dihitung dengan perbandingan bahwa nilai 1 pada serapan 260
nm merupakan serapan RNA dengan konsentrasi 40 ng/µL. Hasil konsentrasi
yang diperoleh pada masing-masing sampel cukup tinggi, yaitu sebesar 1414.4
ng/µL untuk sampel Ciherang atas (Cih A) dan 2010.3 ng/µL untuk sampel
Ciherang bawah (Cih B1). Adapun nilai kemurnian RNA hasil isolasi diukur pada
rasio 260/280 dan 260/230.
Tabel 3 Kuantitas dan kemurnian RNA padi
No

Sampel

[RNA]
(ng/µL)

A 260

A 280

A 260/280

A 260/230

1

Ciherang atas
( A3)

1414.4

35.36

17.154

2.06

2.22

2

Ciherang bawah
(Cih B1)

2010.3

50.258

24.403

2.06

2.13

6

Amplikon Gen OsCKX Hasil Sintesis cDNA
Sintesis cDNA dilakukan untuk mendapatkan cDNA dari RNA total hasil
isolasi yang akan digunakan sebagai cetakan untuk isolasi gen OsCKX
menggunakan PCR. Sampel yang digunakan untuk sintesis cDNA adalah RNA
dari sampel Cih A3 dan Cih B1. Produk sintesis berupa cDNA tersebut
selanjutnya diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer spesifik untuk
gen OsCKX. Pasangan primer spesifik akan menghasilkan amplikon DNA yang
berukuran sekitar 2000 pb. Elektroforegram hasil amplifikasi cDNA dapat dilihat
pada Gambar 1. Gen OsCKX berhasil diamplifikasi dari cDNA sampel Ciherang
atas (Cih A3) yang diindikasikan dengan dihasilkannya fragmen berukuran sekitar
2000 pb yang merupakan ukuran dari gen tersebut setelah dibandingkan dengan
marker 1 kb plus (kisaran 100 pb hingga 12000 pb).

Gambar 1 Elektroforegram amplikon gen OsCKX menggunakan primer spesifik
dengan cetakan cDNA. (1) Marker 1 kb plus ladder, (2) Sampel Cih
B1, dan (3) Sampel Cih A3
Transforman Plasmid Rekombinan OsCKX
Fragmen gen OsCKX hasil amplifikasi dan elusi selanjutnya diligasikan
dengan vektor kloning pGEM-T Easy dan selanjutnya ditransformasikan ke sel
bakteri E. coli Dh5α. Hasil menunjukkan bahwa transformasi ke E. coli telah
menghasilkan koloni-koloni tunggal bakteri. Koloni hasil transformasi gen
OsCKX pada sel E.coli yang tumbuh pada media LB agar yang mengandung
ampisilin dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Hasil transformasi gen OsCKX pada plasmid pGEM-T melalui bakteri
Escherichia coli

7

Karakterisasi Plasmid Rekombinan OsCKX
Verifikasi gen OsCKX pada plasmid rekombinan dapat dianalisis melalui
ampifikasi PCR. Sebanyak 10 koloni tunggal bakteri diisolasi DNA plasmidnya
dan diberi kode pGEM-T CKX 1 sampai pGEM-T CKX 10. Hasil isolasi
menunjukkan bahwa DNA plasmid hanya diperoleh dari koloni 9 (pGEM-T CKX
9) dan koloni 10 (pGEM-T CKX 10). Untuk menentukan apakah kedua DNA
plasmid tersebut merupakan plasmid rekombinan yang membawa gen OsCKX
maka dilakukan verifikasi dengan amplifikasi PCR. Hasil verifikasi menunjukkan
bahwa kedua plasmid tersebut membawa gen OsCKX dan menghasilkan pita
DNA berukuran 2000 pb setelah amplifikasi. Elektroforegram hasil verifikasi
DNA plasmid rekombinan dengan PCR dapat dilihat pada Gambar 3. Pita tersebut
menunjukan fragmen gen OsCKX telah berhasil disisipkan ke dalam plasmid
pGEM-T Easy.

Gambar 3 Elektroforegram amplikon gen OsCKX dari plasmid pGEM-T 9 CKX
dan pGEM-T 10 CKX. (1) pGEM-T 9 CKX, (2) pGEM-T 10CKX,
dan (3) Marker 1 kb
Selain itu, verifikasi gen OsCKX pada plasmid rekombinan dapat dilakukan
dengan pemotongan DNA plasmid rekombinan pGEM-T CKX 9 dan pGEMT-T
CKX 10 menggunakan enzim restriksi SmaI dan KpnI. Hasil restriksi dari plasmid
pGEM-T CKX 9 dan pGEMT-T CKX menghasilkan 2 fragmen, yaitu fragmen
pertama merupakan plasmid pGEM-T Easy sebagai vektor (3015 pb) dan
fragmen kedua merupakan fragmen gen OsCKX (2000 pb) (Gambar 4).

Gambar 4 Elektroforegram gen OsCKX dari pemotongan plasmid rekombinan
menggunakan enzim restriksi SmaI dan KpnI. (1) Marker 1 kb, (2)
Sampel pGEM-T 9 CKX, dan (3) pGEM-T 10 CKX

8

Pembahasan
Padi Ciherang yang digunakan sebagai bahan penelitian merupakan padi
unggul yang telah dikembangkan oleh Balai Besar Tanaman Padi, berasal dari
persilangan IR 18349-53-1-3-1-3/IR19661-131-3-1//IR19661-131-3-1-///IR64////
IR64 (Hermanto 2006). Tanaman padi varietas Ciherang memiliki karakteristik
umur tanam yang cukup singkat, yaitu 116 hingga 125 hari, menghasilkan anakan
produktif 14 hingga 17 batang, warna gabah kuning bersih, tekstur nasi pulen,
potensi hasil 8.5 ton/ha dilihat dari jumlah malai padi tersebut seperti pada
Gambar 5. Padi Ciherang termasuk dalam sub-spesies Sinica yang tahan terhadap
penyakit bakteri hawar daun strain III dan IV (Balitbang-Pertanian 2000).
Peningkatan produktivitas padi dapat dilakukan salah satunya diawali dengan
pencarian gen yang berperan terhadap tingginya jumlah malai padi. Jumlah malai
per tanaman merupakan komponen hasil yang secara langsung mempengaruhi
hasil padi. Identifikasi gen yang mengendalikan jumlah malai akan berperan
penting dalam produktivitas tanaman padi. Salah satu gen target untuk tujuan
tersebut adalah gen OsCKX. Gen ini berperan dalam meningkatkan jumlah bulir
pada padi. Gen OsCKX ini diidentifikasi dapat mengkode protein sitokinin
oksidase/dehidrogenase yang berpengaruh pada pembelahan sel (Ashikari et al.
2005).
Padi (Oryza sativa L.) memiliki gen Gn1a/OsCKX (Grain nomor
1a/Sitokinin oksidase) yang mengkode oksidase sitokinin. Gen tersebut telah
diidentifikasi sebagai lokus sifat kuantitatif utama yang berkontribusi terhadap
peningkatan jumlah biji pada tiap pemuliaan padi yang dilakukan (Li Shuyu et al.
2012). Sitokinin fitohormon (CK) positif mengatur aktivitas dan fungsi dari
meristem apikal tunas (SAM), yang merupakan parameter utama yang
menentukan produksi benih. Ekspresi gen OsCKX mengatur akumulasi CK di
SAM sehingga dapat mengontrol jumlah organ reproduksi. Peningkatan aktivitas
gen OsCKX ini menyebabkan aktivitas meristem meningkat yang ditandai dengan
peningkatan malai bercabang sebagai akibat peningkatan jumlah gabah. Tahap
pertama dari isolasi gen OsCKX tersebut adalah melakukan isolasi RNA dari
malai padi Ciherang .

(a)

(b)

Gambar 5 Tanaman padi varietas Ciherang. (a) Morfologi tanaman padi
Ciherang dan (b) Malai padi Ciherang

9

RNA diperlukan untuk digunakan sebagai materi dalam mengisolasi gen
spesifik pada jaringan tertentu. Pada penelitian ini dilakukan isolasi RNA total
dari jaringan malai padi dengan harapan akan didapatkan gen OsCKX penyandi
sitokinin oksidase yang berperan dalam meningkatkan jumlah malai padi. Gen
OsCKX banyak diekspresikan pada jaringan malai padi. Isolasi RNA dilakukan
pada bagian malai tanaman padi yang berumur 2 bulan. Secara umum isolasi
RNA lebih sulit dibandingkan dengan DNA karena RNA sangat mudah
terdegradasi oleh RNase (ribonuklease) sehingga membutuhkan penanganan
khusus dalam mengisolasinya. Metode yang digunakan dalam isolasi RNA pada
penelitian ini mengacu pada protokol kit Qiagen.
Prinsip dasar metode isolasi RNA tersebut adalah pemecahan sel (lisis sel)
dibantu dengan mekanik melalui penggerusan, dilanjutkan dengan penjerapan
menggunakan kolom yang menyebabkan asam nukleat berupa DNA dan RNA
akan terjerap dalam kolom, dan adanya pencucian kolom yang mengakibatkan
hanya RNA saja yang kita peroleh. Penghancuran dinding sel bertujuan untuk
membebaskan sitoplasma dan DNA dalam sel (Brown 1991). Penggunaan
nitrogen cair merupakan cara efektif untuk membekukan jaringan sehingga
jaringan mudah untuk dihancurkan dan kondisi suhu yang dingin dapat menjaga
RNase berada dalam keadaan tidak aktif . Penggunaan merkaptoetanol dan
senyawa pengekstrak seperti fenol : klorofom: isoamilalkohol
dapat
menyebabkan denaturasi senyawa nukleoprotein, dan selanjutnya membuang
kontaminan DNA serta protein (Promega 2009).
Kuantitas dan Kemurnian RNA Padi
Adanya ikatan rangkap terkonjugasi pada basa heterosiklik purin dan
pirimidin menyebabkan nukleosida, nukleotida, dan polinukleotida dapat
menyerap sinar ultra violet (UV) (Murray et al. 2003). Konsentrasi dan kemurnian
RNA ditentukan melalui pengukuran absorbansi sampel RNA pada panjang
gelombang 260 nm, 280 nm, dan 230 nm. Konsentrasi suatu RNA ditentukan
dengan nilai absorban yang diperoleh pada panjang gelombang ( ) 260 nm. Nilai
tersebut kemudian dimasukan ke dalam rumus perhitungan yaitu, A260 × faktor
konversi × faktor pengenceran. Faktor konversi yang digunakan merupakan nilai
1 unit absorbansi pada 260 nm yang sebanding dengan 40 g/ml RNA (Wilson
& Walker 2000). Konsentrasi RNA padi yang diperoleh dari hasil isolasi cukup
tinggi, yaitu sebesar 1414.4 ng/µL untuk sampel Ciherang atas (Cih A) dan
2010.3 ng/µL untuk sampel Ciherang bawah (Cih B1). Perbedaan nilai
konsentrasi tersebut dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu, perbedaan jenis
sampel, hasil gerusan sampel yang kurang halus, dan pengocokan yang kurang
kuat saat melakukan ekstraksi sehingga seluruh isi sel tidak dapat terlisis dengan
sempurna (Couch & Fritz 1990).
Selain konsentrasi yang diperoleh, dapat pula dilihat kemurnian dari hasil
isolasi tersebut sehingga dapat diketahui ada tidaknya komponen kontaminan pada
sampel. Nilai kemurnian dari sampel Cih A3 dan Cih B1, yaitu 2.06. Berdasarkan
hasil tersebut maka dapat dikatakan hasil isolasi RNA total mempunyai
kemurnian yang tinggi. Isolasi RNA dikatakan murni jika mempunyai nilai OD
(Optical Density) A260/280 sebesar 1.9-2.1 (Qiagen 2006). Nilai kemurnian RNA
yang diperoleh pada rasio A260/280 berada pada kisaran tersebut menunjukkan
bahwa RNA terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi masing-masing

10

sampel Cih A3 dan Cih B1 pada A260/230, yaitu 2.22 dan 2.13. Rasio A260/230
digunakan sebagai indikator tingkat kontaminasi oleh polisakarida dan polifenol
(Loulakakis et al. 1996 dan Schultz et al. 1994).
Amplikon Gen OsCKX Padi Varietas Ciherang
Gen OsCKX diisolasi menggunakan teknik RT-PCR melalui sintesis
cDNA dari RNA total yang digunakan sebagai cetakan (Watson et al 1987). Hal
tersebut dilakukan karena untuk mengisolasi gen-gen yang diekspresikan secara
spesifik pada jaringan tertentu dari kromosom eukariot diperlukan cDNA yang
merupakan DNA yang komplemen dengan mRNA (Dale 1994), sedangkan
mRNA adalah transkrip dari gen-gen yang terekspresi yang mebawa pesan berupa
informasi genetik dari DNA ke dalam bentuk protein (Darnell et al 1990). cDNA
digunakan sebagai cetakan (template) untuk mengampifikasi gen OsCKX dengan
teknik RT-PCR yang banyak digunakan untuk menganalisis ekspresi gen tunggal
(Campbell et al. 2008). Untuk mendapatkan gen tersebut digunakan primer
spesifik gen OsCKX yang dapat menempel dan mengamplifikasi gen tersebut
secara spesifik sehingga cDNA dapat diketahui mengandung gen OsCKX.
Keuntungan penggunaan cDNA untuk isolasi gen adalah bahwa cDNA untai
ganda merupakan manifestasi dari gen yang diharapkan, tetapi gen tersebut tidak
mengandung intron.
Amplifikasi gen OsCKX menggunakan sepasang primer OsCKX forward
dan OsCKX reverse yang dirancang spesifik mengamplifikasi gen CKX berukuran
2000 pb. Primer yang dirancang harus dapat menghasilkan produk yang
diinginkan dengan konsentrasi tinggi, dan mengurangi amplifikasi sekuens yang
tidak diinginkan (Sambrook & Russell 2001). Hasil amplifikasi gen OsCKX
dengan optimasi suhu annealing pada mesin PCR, dianalisis dengan elektroforesis
gel agarosa 1%. Berdasarkan hasil verifikasi pada elektroforesis gel agarosa
terlihat adanya gen OsCKX yang diperoleh dari ukuran fragmen yang terbentuk
2000 pb (Gambar 1). Namun, terdapat fragmen lain yang terbentuk dari pita yang
dihasilkan pada gel agarosa. Hal tersebut dapat disebabkan karena penggunaan
suhu annealing yang belum optimal dan primer yang digunakan kurang spesifik.
Suhu annealing adalah suhu dimana primer akan menempel pada template DNA.
Pencarian kondisi optimal dari suhu annealing sangat penting, karena berkaitan
dengan spesifitas dan sensitifitas produk PCR. Apabila primer yang digunakan
kurang spesifik dan nilai suhu annealing yang digunakan terlalu rendah maka
primer tidak hanya menempel pada gen target tetapi juga menempel pada gen lain
sehingga akan terbentuk dua pita atau lebih. Sedangkan jika nilai suhu annealing
yang digunakan saat PCR lebih besar maka akan dihasilkan produk yang sedikit
atau pita yang muncul akan tipis karena kemampuan primer untuk menempel pada
target menjadi lebih rendah (Sasmito Bayu 2010).
Sepasang primer oligonukleotida yang akan dipolimerisasi masing-masing
harus menempel pada sekuen target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang
akan diamplifikasi. Primer yang dirancang memiliki sekuen yang komplemen
dengan template DNA agar dapat menempel dan mengapit daerah tertentu yang
diinginkan. Salah satu faktor penentu keberhasilan amplifikasi ditentukan oleh
spesifitas antara sekuens primer-primer yang digunakan untuk amplifikasi dengan
DNA yang berfungsi sebagai template sehingga hanya sekuens-sekuens fragmen
yang memiliki daerah homologi dengan sekuen fragmen saja yang akan

11

diamplifikasi, sementara sekuens fragmen yang tidak memiliki homologi dengan
sekuens primer tidak akan teramplifikasi. Hal tersebut dapat memaksimalkan
keberhasilan amplifikasi untuk memperoleh sekuens target sehingga kemungkinan
terjadinya kesalahan penempelan primer (mispriming) tidak dapat terjadi, yaitu
penempelan primer di luar sekuens target. Urutan basa dari primer yang
komplementer setidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa
kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi untuk mempermudah
penempelan pada gen target. Primer yang dirancang tidak boleh mengamplifikasi
gen atau daerah lain yang homolog dengan gen target yang dapat menyebabkan
produk PCR tidak spesifik dan menghasilkan lebih dari satu produk
(Retnoningrum DS 1997).
Selain itu, struktur sekunder pada primer dapat menyebabkan masalah
selama proses PCR, sehingga perlu dihindari sekuens yang saling berkomplemen
di dalam primer (hairpin) atau sekuen yang saling berkomplemen antara primer
forward dan reverse (primer-dimer) itu sendiri (Newton & Graham 1997;
McDowell 1999; Birt 2000; Rapley 2000). Penentuan urutan basa pasangan
primer perlu dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui
kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (selfhomology) atau homologi silang (cross-homology) sehingga tidak terbentuk
produk-produk non spesifik yang muncul pada saat visualisasi produk PCR
dengan elektroforesis gel agarosa. Oleh karena itu, perancangan primer yang
spesifik sangat dibutuhkan untuk memperoleh gen target yang diinginkan.
Fragmen yang terbentuk pada gel agarosa dengan ukuran 2000 pb yang
menunjukkan gen OsCKX selanjutnya dipotong dan dimurnikan.ang spesifik.
Pemurnian dilakukan dengan pemotongan fragmen pita 2000 pb pada gel
agarosa dengan menggunakan kit Gene Clean. Hal tersebut bertujuan memurnikan
fragmen DNA yang diinginkan (gen OsCKX) dan menghilangkan pengotorpengotor lain berupa nukleotida, sisa-sisa garam, dan enzim yang dapat
mengganggu proses selanjutnya (Dobhal et al. 2010). Fragmen DNA yang sudah
murni diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy. Plasmid pGEM-T Easy
digunakan sebagai vektor kloning yang merupakan agen pembawa fragmen DNA
masuk ke dalam sel makhluk hidup yang berfungsi untuk memperbanyak fragmen
DNA (Primrose dan Twiman 2006). Gen OsCKX yang telah dimurnikan tersebut
kemudian diligasikan ke vektor pGEM-T Easy agar dapat ditransformasikan ke
dalam sel inang.
Transforman yang Membawa Gen OsCKX
Suatu vektor kloning harus dapat disambungkan atau menyatu dengan
fragmen DNA yang yang ingin ditransfer kemudian dapat dimasukkan ke dalam
sel dan diperbanyak. Beberapa pertimbangan dalam pemilihan vektor kloning
yang harus diperhatikan adalah ukuran fragmen DNA yang akan ditransfer,
jumlah salinan inkompatibilitas (ketidaksesuaian), marka pemilihan (selectable
marker) untuk seleksi, situs kloning, dan fungsi khusus dari suatu vektor (Casali
et al. 2003). Pemilihan plasmid pGEM-T Easy (berukuran 3015 pb) dalam
penelitian ini didukung dengan adanya MCS (multiple cloning site) dan banyak
digunakan dalam pengklonan DNA karena relatif mudah dalam penanganannya
(Suharsono dan Widyastuti 2006).

12

Fragmen yang sudah diligasikan kemudian ditransformasikan ke dalam sel
bakteri Escherichia coli menggunakan metode heatshock, yaitu dengan pemberian
kejut panas pada suhu 42°C selama 90 detik. Prinsip dari proses tersebut adalah
terjadinya lonjakan suhu dari 0°C ke 42°C terhadap sel kompeten yang telah
diberi perlakuan CaCl2. Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas membran sel
sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap
molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel. Sel bakteri yang
digunakan dalam proses transformasi umumnya adalah sel E.coli ini merupakan
sel inang yang paling umum digunakan dalam teknologi DNA rekombinan. Setiap
sel memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap molekul DNA. Kemampuan
sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan perlakuan khusus, sehingga
sel tersebut menjadi kompeten.
Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam
medium padat, sehingga membentuk koloni seperti pada Gambar 2. Koloni yang
terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah
sel. Media seleksi yang digunakan pada penelitian ini adalah media LB agar yang
mengandung antibiotik ampisilin. Hasil yang diperoleh dari pembiakan sel E.coli
rekombinan, yaitu terbentuknya koloni-koloni berwarna putih pada media agar.
Terbentuknya koloni tersebut disebabkan adanya marka seleksi pada vektor
pGEM-T Easy dan koloni tunggal yang terbentuk akan dianalisis selanjutnya
untuk menentukan keberadaan gen OsCKX yang diinginkan. Marka seleksi
biasanya berupa gen yang membawa sifat resisten antibiotik tertentu dan vektor
pGEM-T Easy memiliki marka seleksi berupa gen resisten ampisilin dapat dilihat
pada peta plasmid pGEM-T Easy pada Lampiran 2. Setelah diperoleh transforman
yang membawa gen OsCKX pada koloni yang tumbuh dalam media agar,
dilakukan konfirmasi pada plasmid pembawa gen tersebut melalui amplifikasi
PCR dan pemotongan enzim restriksi.
Plasmid rekombinan pembawa gen OsCKX berhasil dikonstruksi dengan
menyisipkan gen tersebut ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Teknik ini dilakukan
dengan mengisolasi plasmid pGEM-T yang membawa gen OsCKX dari kultur
bakteri Escherichia coli yang ditumbuhkan pada media LB cair sebelumnya.
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menggunakan metode lisis alkali. Adapun
prinsip dari metode ini adalah merusak dinding sel dan membran sel dari E.coli
(Sambrook dan Russel 2001). Penggunaan etilen diamin tetra asetat (EDTA)
bertujuan untuk merusak dinding sel dengan menghilangkan ion magnesium pada
selubung sel sehingga dinding sel bakteri pecah (Zhiwen et al. 2006). Sodium
Deodosil Sulfat (SDS) berfungsi untuk menghilangkan molekul lipid, sehingga
akan menyebabkan kerusakan pada membran sel (Davis et al. 2004).
Keberhasilan kontstruksi gen OsCKX dapat dilihat dari hasil amplifikasi
PCR pada Gambar 3. Hasil amplifikasi yang diperoleh pada pGEM-T 9 CKX dan
pGEM-T 10 CKX terbentuk fragmen berukuran 2000 pb pada gel agarosa. Hal
tersebut menunjukkan bahwa kedua plasmid membawa gen OsCKX yang berhasil
disisipkan ke dalam sel E.coli dengan ukuran fragmen 2000 pb. Adapun
konfirmasi keberhasilan dapat pula dilihat melalui pemotongan terhadap vektor
dan fragmen gen OsCKX menggunakan enzim restriksi SmaI dan KpnI.
Pemotongan vektor pGEM-T Easy dan gen OsCKX dengan enzim yang sama
bertujuan agar proses ligasi dapat terjadi karena kedua ujung vektor dan DNA
sisipan saling berkomplemen. Sedangkan penggunaan dua enzim berbeda

13

bertujuan untuk memastikan arah orientasi gen OsCKX ketika berligasi dengan
vektor pGEM-T Easy. Hasil elektroforegram (Gambar 3) menunjukan bahwa
plasmid pGEM-T Easy yang membawa gen OsCKX berhasil diisolasi dari kultur
E.coli, dibuktikan dengan adanya 2 pita DNA yang dihasilkan dari pemotongan
dengan SmaI dan KpnI dengan ukuran pita 1 vektor pGEM-T Easy (3015 pb) dan
pita 2 fragmen gen OsCKX (2000 pb) . Verifikasi jumlah fragmen yang diperoleh
dari hasil pemotongan dengan kedua enzim restriksi tersebut dapat dilihat pada
peta restriksi pGEM-T Easy Lampiran 2.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen OsCKX dari jaringan malai padi telah berhasil diisolasi. Amplifikasi
gen OsCKX hasil isolasi dan verifikasi gen pada plasmid rekombinan berukuran
2000 pb dan pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim restriksi SmaI dan
KpnI menghasilkan 2 fragmen DNA yang berukuran 3015 pb (vektor pGEM-T
Easy) dan 2000 pb (gen OsCKX).
Saran
Perlu dilakukan penentuan spesifisitas primer dan penentuan tingkat
homologi dari urutan basa primer yang digunakan menggunakan program
komputer agar dapat diperoleh sekuen yang spesifik dari gen target OsCKX yang
diinginkan.

DAFTAR PUSTAKA
Ashikari M, Sakakibara H, Lin S, Yamamoto T, Takashi T, Nishimura A, Angeles
ER, Qian Q, Kitano H, dan Matsuoka M. 2005. Cytokinin Oxidase
Regulates Rice Grain Production. J Science AAAS 309: 741.
Balitbang-Pertanian.
2000.
Varietas
ciherang.
[terubung
berkala].
http://www.litbang.deptan.go.id/ varietas/one/130. (Diakses pada 10
Februari 2013)
Birt TP, Baker AJ, Baker AJ. 2000. Molecular Methods in Ecology. London:
Blackwell Science Ltd.
Brown TA. 1991. Pengantar Kloning Gen. Yogyakarta: Esentica Medica.Faatih
M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi 10: 61 – 67.
Campbell NA, Reece JB, Urry LA, Chain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, dan
Jackson RB. 2008. Biology, Eight Edition. Pearson Benjamin Cummings.
San Francisco.
Casali N, Andrew P, Preston A. 2003. E coli plasmid vectors: methods and
applications. Humana Press 12:19-25

14

Couch JA, Fritz PJ. 1990. Isolation of DNA from plants high in polyphenolics.
Plant Mol Biol Rep 8: 8-12 Dale JW. 1994. Molecular Genetic of Bacteria
England: John Wiley and Sons.
Darnell et al. 1990. Molecular CellBiology. New York:Scientific American Books.
Davis L, Kuehl M, dan Battey J. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Appleton dan Lange, Norwola.
Dobhal S, P Dinesh, K Anil, A Sanjeev. 2010. Studies on plant regeneration and
transformation efficiency of Agrobacterium mediated transformationusing
neomycin phospotransferase II (nptII) dan glucuronidase (GUS) as a
reporter gene. Afr J Biotech 9(41):6853-6859.
Hermanto. 2006. Padi Ciherang makin populer. Warta Penelitian dan
Pengembangan
Pertanian
28:14-15.
[terhubung
berkala].
http://crifc@indo.net.id/journal/warta [25 Juni 2013].
Kibria et al. 2008. Screening of aromatic rice lines by phenotypic and molecular
markers. J Bot. 37:141-147.
Krishnan HB, Puepke SG. 1983. Nucleotide sequence of an abundant rice seed
globulin. J Biophys. 193:460-466.
Lee MD, Fairchild A. 2006. Sample Preparation for PCR. In: Maurer, J (ed.).
Food Microbiology and Food Safety: PCR Methods in Foods. USA:
Springer.
Li Shuyu et al. 2012. Rice zinc finger protein DST enhances grain production
through controlling Gn1a/OsCKX2 expression. Journal of lant Biology,
PNAS Early Edition 5:1-6.
[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB
Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang
12:1-6.
Loulakakis KA. 1996. Isolation of functional RNA from grapevine tissues poor in
nucleic acid content. J Enol Vitic 47:181-185.
McDowell D, Saunders, Parkes. 1999. Analytical Molecular Biology Quality and
Validation. Cambridge: Royal Society of Chemistry.
Murray RK, Graner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. Andry
H, penerjemah; Anna PB, Tiara MN, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan
dari: Harper’s Biochemistry.
Nanodrop. 2000. NanoDrop 2000 Packaged with Laptop Computer [Themo
Scientific]. US.
Newton CM, Graham A. 1997. PCR Ed ke-2. New York: Springer-verlag.
Pestana EA, Belak S, Diallo A, Crowther JR, Viljoen GJ. 2010. Early, Rapid, and
ensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real-Time PCR Application.
Dordrecht: Springer.
Primrose SB, Twyman RM. 2006. Induksi kalus dan optimasi regenerasi empat
varietas padi melalui kultur In Vitro. J Agro Biogen 2 (2): 74-80.
Promega. 2009. Technical Manual. Woods Hollow Road: Promega.
Promega. 2010. pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems. Promega
Corporation, Madison.
Rapley R, Walker JM & Rapley R. 2002. Molecular Biology and Biotechnology.
Cambridge: Royal Society of Chemistry.
Qiagen. 2006. Rneasy mini handbook, hal:66. US : Qiagen Inc.
Qiagen. 2010. Rneasy mini handbook, hal:80. US : Qiagen Inc.

15

Retnoningrum DS. 1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk
diagnosis penyakit infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory manual. 3rd
Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pr, Cold Spring
Harbor.
Sasmito Bayu. 2010. Ekspresi Gen Aminocyclopropane Carboxylic Synthase pada
Klon Tanaman Karet Akibat Pemberian Etefon [skripsi]. Bogor: Institut
Pertanian Bogor.
Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar
Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI
DIKNAS, Bogor.
Takara. 2012. Buffer Activity Chart: relative restriction enzyme activity in
universal
and
basal
buffers.
[terhubung
berkala]
http://www.clontech.com/takara/US/Support/Applications/Restriction_En
zymes/ Bufer_Activity_Chart [03 Juli 2013]
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrophotometer V1.0
User Manual. Wilmington: Thermo Fisher Scientific.
Tsen et al. 2002. Natural
plasmid transformation in Escherichia coli. Journal
of
Biomedical Science 9:246-252.
Watson et al. 1987. Molecular Biology of the Gene. USA: The Benjamin
Publishing Company.
Wilson K, Walker J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry.
Ed ke-4. United Kingdom: Cambridge University.
Zhiwen Yuan, Jeanne M. Van Briesen. 2006. The formation of intermediates in
EDTA and biodegradation. Environ Eng Sci 23:533-544.

16

LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Isolasi RNA malai padi
Sintesis cDNA
Ligasi ke pGEM-T Easy dan transformasi ke sel E.coli
Isolasi plasmid rekombinan dengan metode lisis alkali
Amplifikasi plasmid rekombinan
Pemotongan dengan enzim restriksi SmaI dan KpnI
Elektroforesis gel agarosa
Lampiran 2 Peta plasmid pGEM-T Easy

Peta restriksi vektor pGEM-T Easy (Promega 2009)

16
15
Lampiran 3 Koloni sel transforman Escherichia coli yang ditumbuhkan di
media LB cair

Hasil perbanyakan bakteri transforman E.coli
Lampiran 4 Isolasi plasmid dengan metode lisis alkali (Sambrook & Rusell
2001)

17

18
16

17

Lampiran 5 Komposisi larutan sediaan
Komposisi larutan isolasi plasmid
Stok Larutan 1

Pembuatan 100 mL

Konsentrasi akhir

Glukosa

0.9 gram

50 mM

1 M Tris HCl pH 8.0

2.5 mL

25 mM

0.5 M EDTA pH 8.0

2 mL

10 mM

Larutan diautoklaf selama 15 menit dan disimpan pada suhu 4 °C
Stok Larutan 2

Pembuatan 1 mL

Konsentrasi akhir

10 N NaOH

20 µl

0.2 N

10% SDS

100 µl

1%

NF water

880 µl

Stok Larutan 3

Pembuatan 100 mL

Konsentrasi akhir

5 M Potasium asetat

60 mL

50 mM

Asan asetat glacial

11.5 mL

NF water

28.5 mL

Komposisi media Luria Bertani (LB)
LB cair

Pembuatan 100 mL

Trypton

1.0 gram

NaCl

1.0 gram

Ekstrak yeast

0.5 gram

Akuades
LB padat
(agar)
Trypton

ditera hingga 100 mL (pH 7.0)

NaCl

1.0 gram

Ekstrak yeast

0.5 gram

Bacto agar

0.5 gram

Akuades

ditera hingga 100 mL (pH 7.0)

Pembuatan 100 mL
1.0 gram

Komposisi bufer TAE 50x
Bahan

Pembuatan 1000 mL

Tris 242 gram
Asam asetat glacial 57.1 mL

ditera dengan akuades hingga 1000 mL

0.5 EDTA (pH 8.0) 100 mL

Pembuatan bufer TAE 1x (dari stok bufer TAE 50x) :
V1 x
M1
=
V2
x
M2
V1 x
50
=
1
x
2000 mL
V1
=
40 mL (stok bufer TAE
akuades hingga 2000 mL)

50x ditera dengan

16
15
Lampiran 6 Ekstaksi DNA dengan menggunakan kit Gene Clean
Gel agarosa yang mengandung DNA ditimbang,
dan NF water sebanyak 20 µL dipanaskan pada
water bath pada suhu 56-60°C

100 mg gel agarosa ditambahkan 300 µL buffer
agarose solubiluation

Gel diresuspensi dengan ditambahkan 20 µL glass
milk hingga homogen,

Campuran diinkubasi pada water bath suhu 56-60°C
selama 10 menit dan kocok setiap 3 menit

Campuran disentrifugasi 1800 g
selam 30 detik

Supernatan dibuang dan pelet ditambahkan larutan nucleic acid binding
buffer sebanyak 500 µL, disentrifus 1800 g selama 30 detik

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan larutan washing
buffer sebanyak 500 µL, disentrifus 1800 g selama 30 detik

Supernatan dibuang dan pelet dicuci kembali dengan larutan washing
buffer sebanyak 500 µL, disentrifus 1800 g selama 30 detik

Pelet dikeringkan pada suhu ruang sekitar 3 jam

Setelah kering tambahkan NF water yang sudah dipanaskan sebelumya, divortex
dan diinkubasi pada suhu 56-60°C selama 10 menit dan kocok setiap 3 menit

Larutan disentrifus 1800 g selama 30 detik, dan
supernatant diambil dan disimpan pada suhu -20°C

19

16
15

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 25 September 1991 dari ayah
Hasan M dan ibu Ida Kurniali. Penulis adalah putri pertama dari empat bersaudara.
Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Cianjur dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur PMDK
IPB dan diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Penulis juga aktif dalam organisasi kampus sebagai staf Departemen
Biokimia Analisis di CREBS IPB 2011, staf Biro Foundrishing di CREBs IPB
2012, dan aktif menjadi panitia di berbagai kegiatan di IPB. Bulan Juli – Agustus
2012 penulis melaksanakan Praktik Lapangan di Balai Besar Pascapanen Bogor
dan Balai Besar Tanaman Padi Subang dengan judul Analisis Senyawa Aromatik
pada Minyak Pala dan Emulsi Minyak Pala Menggunakan GC-MS.