Teknologi Ekstraksi Derivatisasi pada Kromatografi Gas

12 manfaat penghancur lemak dan penurun kolesterol darah tersebut, inositol menjadi bagian penting dalam diet Luckner, 1984.

2.6 Teknologi Ekstraksi

Propolis dalam bentuk mentah raw propolis belum bisa dimanfaatkan khasiatnya karena masih terselimuti dengan berbagai bahan. Komponen aktifnya harus dipisahkan dan dikeluarkan dengan cara ekstraksi. Hingga kini belum ada standarisasi tentang konsentrasi, metode ekstraksi, dan jenis pelarut yang akan dipakai. Cara ekstraksi yang paling umum adalah menggunakan pelarut organik Mahani, et al., 2011. Proses ekstraksi yang baik adalah polaritas pelarut sesuai dengan polaritas propolis, pelarut mudah diuapkandipisahkan, suhu penguapanpemisahan tidak merusak propolis dan kedap udara untuk menghindari kerusakan akibat oksidasi. Pelarut yang bersifat semi polar yang populer adalah etanol. Pelarut ini paling umum digunakan untuk mengekstrak komponen aktif dari bahan alam, termasuk untuk mengekstrak propolis. Pelarut ini memiliki sejumlah kelebihan yaitu komponen yang terbawa berasal dari golongan polar dan non polar sekaligus sehingga komponen yang terbawa lebih banyak dan beragam. Selain itu, potensi khasiat propolis yang dihasilkan lebih baik. Pelarut ini juga mudah diuapkan sehingga kemungkinan masih tertinggal sangat kecil. Artinya, propolis yang dihasilkan benar-benar bebas pelarut Mahani, et al., 2011. Beberapa metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut yaitu cara dingin maserasi, perkolasi dan cara panas refluks, digesti, sokletasi dan infundasi. Untuk ekstraksi propolis, pada umumnya menggunakan cara dingin karena kandungan senyawa propolis yang tidak tahan panas. Penyarian dengan campuran 13 etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi. Metode maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan cara perendaman menggunakan pelarut dengan sesekali pengadukan pada temperatur kamar. Maserasi yang dilakukan dengan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan terhadap maserat pertama dan seterusnya disebut remaserasi Depkes, 2000; Ditjen POM, 1979.

2.7 Kromatografi Gas – Spektrometri Massa

Kromatografi gas KG merupakan teknik instrumental yang dikenalkan pertama kali pada tahun 1950-an. Dalam metode kromatografi gas , yang sangat menentukan kehandalan metode ini adalah instrumennya sendiri yang dikenal sebagai kromatografi gas. KG merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa- senyawa gas anorganik dalam suatu campuran. Perkembangan teknologi yang signifikan dalam bidang elektronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis dengan resolusi yang meningkat Rohman, 2009. Spektrometri massa adalah alur kelimpahan abundance jumlah relatif fragmen bermuatan positif berlainan versus massa per muatan mz atau me dari fragmen tersebut. Muatan ion dari kebanyakan partikel yang dideteksi dalam spektrometer massa adalah +1; maka nilai mz sama dengan massa molekulnya M. Bagaimana suatu molekul atau ion pecah menjadi fragmen - fragmennya bergantung pada kerangka karbon dan gugus fungsional yang ada. Oleh karena itu, struktur dan massa fragmen memberikan petunjuk mengenai struktur molekul 14 induknya. Juga seringkali untuk menentukan bobot molekul suatu senyawa dari spektrum massanya Supratman, 2010.

2.7.1 Sistem peralatan kromatografi gas–spektrometri massa

Bagian-bagian yang terpenting dari sebuah kromatografi Gas– Spektrometri Massa, menurut meliputi : Gambar 2.1 Diagram Blok Kromatografi Gas–Spektrometri Massa Sumber: Anonim, 2011.

2.7.2 Prinsip Kromatografi Gas–Spektrometri Massa

Menurut Watson 2005, prinsip-prinsip alat Kromatografi Gas– Spektrometri Massa tersebut yaitu: - Injeksi sampel dapat dilakukan secara manual atau menggunakan pengambil sampel otomatis melalui sekat karet yang dapat tertutup kembali. - Sampel tersebut diuapkan pada bagian portal injeksi yang dipanaskan dan mengalami kondensasi pada bagian atas kolom - Kolom dapat berupa kolom kapiler atau kolom terkemas, yang akan dibahas lebih mendalam. Fase gerak yang digunakan untuk membawa sampel melewati kolom tersebut adalah suatu gas – biasanya nitrogen atau helium 15 - Kolom ditutup dalam suatu oven yang dapat diatur pada suhu antara suhu kamar dan lebih kurang 400 o C - Detektor yang digunakan adalah spektrometri massa MS - Sampel dimasukkan kedalam sumber instrumen dengan memanaskannya pada akhir suatu sensor sampai menguap airnya, dibantu dengan keadaan sangat hampa dalam instrumen tersebut - Jika berada dalam fase uap, analit dibombardir dengan elektron-elektron yang dihasilkan oleh filamen rhenium atau tungsten, yang diakselerasi menuju suatu target positif dengan energi sebesar 70 eV. - Dua jenis sistem biasanya digunakan untuk memisahkan ion-ion berdasarkan perbandingan muatan terhadap massanya. Prinsip dasar kromatografi Gas melibatkan volatilisasi atau penguapan sampel dalam inlet injektor, pemisahan komponen-komponen dalam campuran, dan deteksi tiap komponen dengan detektor. Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solut dan fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detektor. Penggunaan suhu yang meningkat biasanya pada kisaran 50 o C - 350 o C bertujuan untuk menjamin bahwa solut akan menguap dan karenanya akan cepat terelusi Gandjar dan Rohman, 2007. 2.7.3 Instrumentasi alat 2.7.3.1 Fase gerak Fase gerak pada kromatografi gas juga disebut dengan gas pembawa karena tujuan awalnya adalah untuk membawa solut ke kolom, oleh karena itu gas 16 pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas pembawa adalah: tidak reaktif, murnikering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor, dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi Rohman, 2009.

2.7.3.2 Ruang suntik sampel

Lubang suntik didesain untuk memasukkan sampel secara cepat dan efisien. Desain yang populer terdiri atas saluran gelas yang kecil atau tabung logam yang dilengkapi dengan septum karet pada satu ujung untuk mengakomodasi injeksi dengan syringe. Karena Helium gas pembawa mengalir melalui tabung, sejumlah volume yang diinjeksikan akan segera menguap untuk selanjutnya dibawa menuju kolom Rohman, 2009.

2.7.3.3 Kolom

Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada kromatografi gas. Ada 3 jenis kolom pada kromatografi gas yaitu kolom kemas packing column dan kolom kapiler capillary column; serta kolom preparative preparative column. Kolom kemas terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari tembaga dan aluminium. Fase diam yang digunakan pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan HP-1; DB-1; SE-30; CPSIL-5 dan fenil 5-metilpolisiloksan 95 HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL-8. Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50 - metilpolisiloksan 50 HP-17; DB-17; CPSIL-19, sementara itu fase diam yang polar adalah seperti polietilen glikol HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax- 20M Rohman, 2009. 17

2.7.3.4 Oven

Oven KG menggabungkan suatu kipas, yang memastikan distribusi panas yang merata diseluruh oven. Oven-oven ini dapat diprogram untuk menghasilkan suhu yang tetap, kondisi isotermal, atau peningkatan suhu secara berangsur- angsur. Kecepatan pemrograman oven dapat berkisar dari 1 o Cmenit sampai 40 o C menit. Program suhu yang kompleks dapat dihasilkan dengan melibatkan sejumlah peningkatan suhu berselang-seling dengan periode-periode kondisi isotermal, misalnya 60 o C1menit5 o Cmenit sampai 100 o C5menit10 o Cmenit sampai 200 o C 5menit. Keuntungan dari program-program suhu adalah bahwa bahan-bahan yang keatsiriannya sangat berbeda dapat dipisahkan dalam waktu yang rasional dan juga injeksi sampel dapat dilakukan pada suhu rendah, ketika sampel akan diperangkap pada bagian atas kolom dan kemudian suhu dapat dinaikkan sampai sampel berelusi Watson, 2005.

2.7.3.5 Detektor

Detektor adalah gawai yang memasok sinyal keluaran sebagai tanggapan terhadap cuplikan. Alat ini disambungkan dengan keluaran kolom untuk memantau efluen kolom dalam waktu sebenarnya. Fungsi detektor adalah untuk mendeteksi dan mengukur sejumlah kecil komponen yang terpisahkan pada aliran gas yang meninggalkan kolom. Keluaran dari detektor direkam oleh sebuah recorder yang akan mengahasilkan sebuah kromatogram Jeffery, et al., 1989; Johnson dan Stevenson, 1978. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan fisik komponen- komponen oleh KG disajikan oleh detektor sebagai deretan luas puncak terhadap waktu. Waktu tambat tertentu dalam kromatogram dapat digunakan sebagai data 18 kualitatif, sedangkan luas puncak dalam kromatogram dapat dipakai sebagai data kuantitatif yang keduanya telah dikonfirmasikan dengan senyawa baku. Akan tetapi apabila kromatografi gas digabung dengan instrumen yang multipleks misalnya GCMS atau yang disebut Kromatografi Gas–Spektrometri Massa, kromatogram disajikan dalam bentuk lain Gandjar dan Rohman, 2007.

2.7.3.5.1 Spektrometri massa sebagai detektor

Sumber: Lee, 2005. Menurut Lee 2005, terdapat delapan jenis sumber ionisasi yang digunakan dalam intrumen MS. Pada analisis yang divariasikan dengan GC, umumnya dan pada penelitian ini yang digunakan adalah elektron impact EI. Proses ionisasi dalam elektron impact EI yaitu, elektron dilewatkan melalui sampel fase gas dan bertubrukan dengan molekul analit M yang kemudian menghasilkan ion-ion bermuatan positif atau fragmentasi ion. Umumnya elektron memiliki energi sebesar 70 eV. Metode ini digunakan untuk semua senyawa- senyawa yang bersifat volatil. Sumber: Lee, 2005. 19

2.8 Derivatisasi pada Kromatografi Gas

Derivatisasi pada KG merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas menjadi lebih mudah menguap. Menurut Rohman 2009, alasan dilakukannya derivatisasi adalah: - Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis dengan KG terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya. - Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa senyawa tidak menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus misal puncak kromatogram saling tumpang tindih atau sampel yang dituju tidak terdeteksi, karenanya diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan KG. - Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi adalah untuk meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap non-volatil. Senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah biasanya tidak mudah menguap, karena adanya gaya tarik-menarik inter molekuler antara gugus-gugus polar karenanya jika gugus-gugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasi akan mampu meningkatkan volatilitas senyawa tersebut secara dramatis. - Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa steroid. - Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami dekomposisi parsial karena panas sehingga diperlukan derivatisasi untuk meningkatkan stabilitasnya. - Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap elektron ECD. 20 Beberapa cara derivatisasi yang dilakukan pada kromatografi gas yaitu esterfikasi, asilasi, alkilasi, sililasi, kondensasi, dan siklisasi Gandjar dan Rohman, 2007. • Sililasi Derivat silil digunakan untuk menggantikan eter alkil untuk analisis komponen sampel yang bersifat polar dan tidak mudah menguap. Salah satu contoh sampel yang menggunakan derivat ini adalah Propolis. Derivat yang paling sering dibuat adalah trimetilsilil. Urutan reaktifitas pereaksi sililasi berdasarkan pada kemampuan penyumbang silil adalah sebagai berikut: TrimetilsililimidazolTMSIMN,O-bis-trimetilsilil-trifluoroasetamid BSTFA N,O-bis-trimetilsilil-asetamidBSAN-metil-N-trimetilsililtrifluoroasetamid MSTFA Trimetilklorosilan TMCS Heksametildisilazan HMDS Gandjar dan Rohman, 2007. Urutan reaktivitas gugus-gugus penerima silil adalah sebagai berikut: alkoholfenolasam karboksilataminaamida. Faktor sterik sangat penting dalam hal penentuan kecepatan reaksi derivatisasi. Untuk setiap gugus fungsi, urutan reaktifitasnya adalah: primersekundertersier Gandjar dan Rohman, 2007. Derivatisasi dengan gugus fungsional yang sukar diderivatisasi seperti amina sekunder, alkohol tersier, dan amida perlu dilakukan pemanasan pada suhu antara 60 o C-150 o C. Laju reaksi derivatisasi juga dapat ditingkatkan dengan penambahan katalis asam seperti dengan trimetilklorosilan atau dengan katalis basa seperti piridin. Dilaporkan bahwa 95 derivat trimetilsilil TMS dapat dibuat dengan menggunakan trimetilsililimidazol TMSIM atau dengan N,O-bis- 21 trimetilsilil-trifluoroasetamidBSTFA yang kadang-kadang ditambah dengan trimetilklorosilanTMCS sebagai katalis. Kedua pereaksi ini menunjukkan selektifitas. TMSIM tidak bereaksi dengan gugus amino, sedangkan BSTFA merupakan pereaksi terpilih untuk gugus amino. Pembuatan pereaksi ini pun lebih reaktif dengan media bebas air Gandjar dan Rohman, 2007. Gambar 2.2 Struktur BSTFA dan reaksi Sililasi : Struktur BSTFA: Reaksi Sililasi : For BSTFA : For TMCS: X = Cl Sumber: Sigma-Aldrich, 1997. 22

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif eksploratif yaitu untuk menentukan komponen propolis dengan membandingkan beberapa propolis bermerek dan propolis mentah serta analisis komponennya. Penelitian ini meliputi ekstraksi propolis dengan alkohol 70, analisis komponen sampel secara kualitatif dan kuantitatif dilakukan menggunakan GC-MS Gas Chromatography- Mass Spectrometry . Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian LP Fakultas Farmasi USU dan di Laboratorium Penelitian PPKS MEDAN.

3.1 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium untuk persiapan ekstraksi beaker glass, gelas ukur, erlenmeyer, batang pengaduk, spatula, cawan penguap, mortir dan alu, gelas arloji kertas whatmann no.1, corong, neraca analitik, rotavapor vakum, freeze dryer, freezer, syringe perfection 100µl, mikropipet, botol berwarna gelap, vial kaca 5 ml berwarna gelap, vial 2 ml, karet ptfe, plastik parafilm M, oven, GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry model Shimadzu QP 2010 S untuk analisis.

3.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah propolis mentah yang berasal dari daerah Sragen Jawa tengah, propolis bermerek dagang Melia Propolis, Propolis Platinum, HDI Propoelix ® , HDI Propoelix ® Plus, HD Bee