dan diferensial yaitu Eosine Methylene Blue Agar EMBA. Hasil dari tahap pertama yang terdapat gelembung udara, digoreskan pada media EMBA tersebut
lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 35 ˚C. Bila hasil goresan berwarna
hijau metalik, maka sampel uji positif mengandung E. coli.
Variabel Pengamatan
Variabel pengamatan yang akan diamati dalam penelitian ini adalah parameter bakteriologis meliputi terbentuknye gas dan perubahan warna pada
hasil uji, adanya kekeruhan pada media dan bentuk morfologi.
Isolasi Bakteri Coliform Fekal dan non Fekal a.
Uji Dugaan Presumptive Test
Sampel air terlebih dahulu dikocok sebanyak 25 kali dengan tujuan sampel air tersebut homogen. 9 tabung reaksi steril yang berisi tabung durham dengan
medium LB dipersiapkan sebagai wadah isolasi. 10 ml sampel air diisolasikan ke dalam 3 tabung reaksi yang berisi 9 ml medium LB. 1 ml dan 0,1 ml sampel air
juga diisolasikan pada medium LB. Semua tabung selanjutnya diinkubasi pada suhu 35º selama 2x24 jam. Tabung durham yang menunjukkan positif ditandai
dengan terbentuknya gas pada tabung durham dan adanya perubahan warna. Untuk menghilangkan keraguan dapat dilakukan tes uji kepastian Confirmed
Test.
b. Uji Kepastian Confirmed Test
Tabung LB yang menunjukkan hasil positif selanjutnya diinokulasikan pada tabung berisi media BGLB dengan tabung durham. Inkubasi dilakukan pada
suhu 45ºC untuk fekal, selama 2x24 jam.
c. Inokulasi Bakteri Pada Medium TSI Agar TSIA
Media TSIA merupakan medium deferensial untuk bakteri Gram-negatif. Cara pengerjaannya adalah dengan mengambil pertumbuhan bakteri sedikit
dengan menggunakan ose steril kemudian diinokulasi ke dalam dasar agar. Selanjutnya seluruh permukaannya diinkubasi pada suhu 35º-37º selama 18-24
jam. Hal-hal yang dinilai: - Dasar
: Merah K: Alkali kuning A: acid - Lereng
: Merah K: alkali kuning A: acid - H
2
S : Warna hitam antara dasar dan lereng
- Gas : Agar bagian dasar pecahada gelembung
Perubahan pH karena adanya fermentasi menyebabkan terjadinya warna kuning, dengan adanya indikator fenol red. Jika hanya dekstros yang difermentasi
maka dasarnya saja yang berwarna kuning, tetapi jika dekstrosa maupun laktosa keduanya difermentasi maka dasar dan lerengnya akan berwarna kuning.
Terbentuknya H
2
S adalah berasal dari natrium tiosulfat dan ferric ammonium citrat sebagai sumber sulfur.
c. Pengamatan Morfologi
Pengamatan morfologi dilakukan dengan pewarnaan Gram dari setiap koloni terduga. Pewarnaan Gram bertujuan untuk melihat bentuk atau morfologi
dan sifat pewarnaan dari mikroorganisme tersebut. Adapun prosedur kerja pewarnaan Gram adalah dengan menyiapkan kaca objek yang bersih, bebas dari
kotoran terutama minyak. Secara aseptik, diambil kultur bakteri dan dioleskan pada kaca objek dengan menggunakan ose bulat dan diberi setetes air steril untuk
membantu menyebarkan bakteri secara merata pada kaca objek. Olesan bakteri
dibiarkan mengering kemudian difiksasi diatas lampu bunsen sampai olesan bakteri benar-benar kering.
Kristal ungu diambil dengan pipet tetes dan diteteskan diatas olesan bakteri sampai semua olesan terendam, lalu dibiarkan selama satu menit.
Kemudian olesan dicuci dengan air mengalir sampai Kristal larutan ungu tidak tercuci lagi. Di atas olesan bakteri ditambahkan larutan iodin dan dibiarkan
terendam selama satu menit dan dicuci dengan air mengalir. Usapan bakteri ditetesi dengan etanol 95 selama 30 detik hingga seluruh
warna birunya hilang. Kemudian usapan bakterinya dicuci kembali dengan air mengalir. Larutan safranin dibubuhkan selama 1 menit dan dicuci kembali dengan
air mengalir setelah dikering anginkan. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa okuler 10x dan lensa objektif 100x. Apabila
penampakan sel bakteri berwarna ungu maka bakteri bersifat Gram positif, tetapi jika berwarna merah maka bakteri bersifat Gram-negatif.
e. Uji Biokimia untuk Bakteri Coliform
