BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1. Alat – alat
1. Gelas
ukur 50
ml pyrex
2. Gelas Beaker
250 ml pyrex
3. Gelas Erlenmeyer
250 ml pyrex
4. Corong Saring
5. Corong Pisah
500 ml pyrex
6. Kolom Kromatografi
2040 pyrex
7. Tabung
Reaksi 8.
Neraca Analitis
Mettler PM
480 9.
Alat Pengering
Memmers 10.
Rotari Evaporator
Buchi B-480
11. Labu Alas 500 ml
pyrex 12.
Alat pengukur titik lebur 13.
Statif dan klem 14.
Lampu UV 15.
Spatula 16.
Pipet Tetes 17.
Botol Vial 18.
Bejana Kromatografi lapis tipis 19.
Spektrofotometer FT – IR Jasco
20. Spektrofotometer
1
H-NMR Hitahci FT-NMR R 1986
21. Spektrofotometer UV – Visibel
22. Kertas Saring
23. Plat KLT
24. Statif dan klem
Universitas Sumatera Utara
3.2. Bahan – bahan
1. Kulit batang tumbuhan Seri Muntingia calabura L
2. Metanol
teknis 3.
N-heksana teknis
4. Etil Asetat
teknis 5.
H
2
SO4
p
6. Silikagel 60 G type E
E.merck Art. 7734 7.
Pereaksi Ferri Klorida 1 8.
Pereaksi Natrium Hidroksida 10 9.
Akuades
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1.Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit batang tumbuhan Seri yang diperoleh dari daerah Pasar Baru, Padang Bulan, Medan. Kulit batang tumbuhan Seri segar dirajang halus
sebanyak 1000 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak kulit batang tumbuhan Seri
Kulit batang tumbuhan Seri diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1.
Uji Busa 2.
Skrining Fitokimia 3.
Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1.Uji Busa
Hasil rajangan kulit batang tumbuhan Seri diambil secukupnya dan dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml akuades dan dipanaskan pada
Universitas Sumatera Utara
penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam kulit
batang tumbuhan Seri tidak terdapat senyawa saponin.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan
seri muntingia calabura L. maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan
reaksi warna sebagai berikut :
Prosedur : -
Dimasukkan 10 gram serbuk tumbuhan seri Muntingia calabura L. yang
telah dirajang ke dalam erlenmeyer -
Ditambahkan metanol 100 ml -
Didiamkan selama 24 jam -
Disaring -
Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi -
Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I
: dengan FeCl
3
1 menghasilkan larutan berwarna hitam b.
Tabung II : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutaan orange kekuningan c.
Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda d.
Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet
3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran Metanol : Etil Asetat dengan perbandingan 90 : 10 vv ; 80 : 20 vv ;
70: 30 vv ;60 : 40vv; 50 :50 vv.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur :
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak metanol : etil asetat dengan perbandingan 90 : 10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat
metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari
bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dibawah sinar Ultra Violet dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
1 kemudian dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut metanol:etil
asetat 80:20vv; 70:30vv; 60:40vv; 50:50vv. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan metanol : etil asetat 80:20vv.
3.3.3. Prosedur untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak Kulit Batang Tumbuhan Seri
Kulit batang tumbuhan Seri yang telah dirajang ditimbang sebanyak 1000 gram, dimasukkan ke dalam bejana dan dimaserasi dengan pelarut metanol sampai semua
terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Hasil dari maserasi disaring dan diperoleh ekstrak berwarna coklat. Maserasi dilakukan 2 kali
dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa
flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 68
C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan hingga
lapisan n-heksan bening yaitu sebanyak 6 kali dan kemudian lapisan metanol ditampung dan diuapkan dengan waterbath sampai pekat dan selanjutnya dilarutkan
dengan etil asetat , lalu disaring hingga didapat filtrat ekstrak etil asetat dan residunya ekstrak metanol. Ekstrak etil asetat yang diperoleh diskrining fitokimia
kemudian dipekatkan dengan rotari evaporator dan diperoleh ekstrak pekat etil asetat sebanyak 21, 26 gram .
Universitas Sumatera Utara
3.3.4. Analsisi Kromatografi Kolom Hasil Isolasi Senyawa Flavonoida
Analisis kromatografi kolom hasil isolasi senyawa flavonoida dilakukan terhadap ekstrak pekat etil asetat. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa
gerak adalah campuran pelarut metanol:etil asetat dengan perbandingan 90: 10vv ; 80:20vv ; 70:30vv ; 60:40vv ; 50:50vv.
Prosedur : Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel
60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan
100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 21,26 gram ekstrak pekat etil asetat ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak
kolom, lalu ditambahkan fasa gerak metanol : etil asetat dengan perbandingan 80:20vv secara perlahan-lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom
sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan
harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoida dan diuapkan pelarutnya.
3.3.5. Pemurnian Rekristalisasi
Prosedur : Kristal pada fraksi 10-50 dilarutkan dengan etil asetat, diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan dengan n-heksana secara
perlahan-lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari kristal.
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis TipisKLT
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak metanol : etil asetat 80:20vv
Universitas Sumatera Utara
Prosedur : Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak metanol : etil asetat ke dalam bejana
kromatografi , lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi
yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana , dikeringkan ,dan difikasasi dengan menggunakan pereaksi
Feri Klorida 1 menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya
senyawa flavonoida. Lampiran C
3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis spektrum UV-Visible dilakukan di Laboratorium Ilmu Pengetahuan
Indonesia LIPI Serpong Lampiran D
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di Laboratorium
Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Serpong Lampiran E
3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis ini dilakukan di Laboratorium Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Serpong
dengan menggunakan CD
3
OD sebagai pelarut . Lampiran F
3.4. Bagan Isolasi Senyawa Flavonoida dari Kulit Batang Tumbuhan Seri
Universitas Sumatera Utara
Diskrining fitokimia Dimaserasi dengan methanol selama ±72 jam
Disaring
Dipekatkan dengan rotarievaporator
Diekstraksi partisi dengan n- heksana
Diuapkan dengan waterbath sampai pekat Diskrining
fitokimia Dilarutkan dengan etil asetat
Disaring
Diskrinning fitokimia Dipekatkan dengan rotarievaporator
Di analisis KLT untuk menentukan eluen pada pemisahan kromatografi kolom Dibuburkan sampel dengan silika gel
Dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 GE netral dan fasa gerakeluen metanol : etil asetat 80:20 vv
Ditampung setiap fraksi sebanyak 10 ml dalam botol vial Di KLT
Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
Di KLT Ditentukan
Rf
Diuapkan
Direkristalisasi
Dianalisis
UV-Visible 1000 gram kulit batang
tumbuhan seri
residu
Filtrat Residu
Lapisan metanol Ekstrak n-hexan
Ekstrak pekat metanol Ekstrak metanol
FT-IR Ekstrak pekat etil asetat
1
H-NMR Titik Lebur
Kristal Coklat
Kristal coklat murni Fraksi 10-50
Fraksi 51-80 Fraksi 81-100
Fraksi 101-130 Hasil negatif
Uv-Visible
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Kategori