30
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni sederhana rancangan pola searah.
B. Identifikasi Variabel
1. Variabel bebas : Kitosan yang ditambahkan dalam preparasi sediaan biomaterial selulosa bakteri.
2. Variabel tergantung : Karakteristik polimer yang dihasilkan, diameter zona hambat sediaan biomaterial selulosa bakteri terhadap pertumbuhan
bakteri Staphylococcus aureus. 3. Variabel pengacau terkendali : asal air cucian beras diperoleh, media
pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus MHA, suhu inkubasi 37
o
C, lama inkubasi 24 jam. 4. Variabel pengacau tak terkendali : kelembaban dan kemurnian kitosan.
C. Definisi Operasional
1. Selulosa bakteri merupakan polimer glukosa yang dihasilkan oleh bakteri Acetobacter xylinum
dengan cara fermentasi selama 7 hari. 2. Air cucian beras adalah limbah cair berwarna putih yang diperoleh dari
hasil pencucian beras varietas rajalele. 3. Kitosan merupakan biopolimer yang dibentuk dari proses deasetilasi kitin
dengan derajat deasetilasi 74,94. 4. Staphylococcus aureus merupakan bakteri coccus gram positif yang
diperoleh dari Balai Kesehatan Kota Yogyakarta dengan nomor ATCC 25923.
5. Zona hambat adalah zona jernih yang ditimbulkan oleh sampel membran setelah masa inkubasi 24 jam pada media Mueller Hinton agar yang telah
ditumbuhi bakteri Staphylococcus aureus. 6. Diameter zona hambat adalah pengukuran zona hambat yang diukur tanpa
dikurangi oleh diameter sampel membran.
D. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer IR IR Shimadzu Prestige-21, seperangkat instrumen SEM Jeol JSM T300,
fine coat ion sputter Jeol JFC 1100, alat XRD Rigaku Multiflex 2 kW,
pendingin Rigaku, timbangan digital Mettler-Toledo B.V.PC 2000, oven drying
Memmert BE 500, autoklaf ALP Co.,Ltd. Model KT-40, magnetic
stirrer-hot plate Heidolph MR 2002, seperangkat alat gelas Pyrex dan Duran
, Nampan Lion Star dengan dimensi 230x176x39 mm, spatula, magnetic stirrer,
timbangan, pisau, talenan, gunting Han Kwang Korea, blender Moulinex, baskom, cawan petri Pyrex, kain mori, kain warna
hitam, plastik, toples, spuit injeksi i.p. ukuran 1 mL Terumo, jangka sorong Mitutuyo, incubator Memmert, cawan petri pyrex, lidi kapas steril Kirby
bauer.
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah air limbah cucian beras, kitosan dari p.a E.Merck, urea dari p.a E.Merck, asam asetat
25 dari p.a.E.Merck, glukosa, supratul, aquades, Staphylococcus aureus ATCC 25923, starter Bakteri Acetobacter xylinum yang diperoleh dari
Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta, kloramfenikol. media Mueller-Hinton Agar MHA, media Brain Heart Infusion broth BHI
broth.
E. Tata Cara Penelitian
1. Pemilihan bahan
Beras yang dipilih adalah beras yang diambil dari satu jenis merk beras, yaitu Raja lele. Bahan ini diperoleh dari pembelian di supermarket Indogrosir.
2. Pembuatan limbah air cucian beras
Beras sebanyak 0,5 kg ditampung di baskom, lalu diberi air 1 liter. Beras diaduk
– aduk hingga air menjadi keruh. Air disaring dari berasnya dan
didiamkan selama 1 jam. Lalu terbentuk 2 lapisan, lapisan airnya ini diambil dan digunakan pada tahap selanjutnya.
3. Pembuatan membran kitosan
Sejumlah 2 g dan 10 g kitosan masing-masing dilarutkan dalam 100 mL asam asetat dengan konsentrasi 2 di atas hot plate sambil diaduk dengan
magnetic stirrer . Larutan kitosan lalu dituang ke atas nampan yang telah
dicuci alkohol 70 dan dikeringkan lalu diletakkan selama beberapa hari di udara terbuka untuk menjamin penguapan solven secara sempurna. Setelah
beberapa hari maka akan terbentuk produk membran yang transparan dan fleksibel. Membran kitosan yang terbentuk lalu disimpan di dalam toples yang
sebelumnya telah diberi silika gel.
4. Pembuatan material selulosa bakteri
Sebanyak 200 mL air cucian beras hasil penyaringan dituangkan ke dalam erlenmeyer yang telah dilengkapi dengan pengaduk magnet stirer,
kemudian ditambahkan 20 g gula pasir dan 1,0 g urea, dan diaduk hingga larut. Selanjutnya pH dicek, apabila pH larutan masih berkisar antara 5-6,
maka campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat 25 hingga pH = 4 dan diaduk hingga larut. Selanjutnya campuran didinginkan sebentar dan
ditambahkan gliserol sebanyak 1,0 g lalu dituangkan dalam keadaan hangat ke dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70 dan telah ditutup
sebagian dengan koran sambil didinginkan hingga tercapai suhu kamar. Lalu campuran ditambahkan 40 mL Acetobacter xylinum dan nampan ditutup
dengan rapat menggunakan koran dan difermentasi selama 7 hari pada suhu kamar.
Setelah 7 hari, penutup koran dibuka dan lapisan pelikel yang terbentuk diambil lalu dicuci berturut-turut dengan air PAM, dengan aquades,
dengan air panas kemudian lapisan pelikel ini ditimbang dengan timbangan digital. Lapisan pelikel lalu direndam dengan larutan Natrium hidroksida 3
selama 48 jam dimana tiap 24 jam sekali larutan Natrium hidroksida 3 ini diganti lalu setelah 48 jam, lapisan pelikel ini dicuci kembali dengan aquades
setelah dicuci dengan aquades lalu lapisan pelikel ini direndam dengan larutan asam klorida 3 selama kurang lebih 24 jam. Setelah 24 jam, lapisan pelikel
ini lalu dicuci kembali dengan aquades dan dicek pH-nya dengan pH stik, jika pH pada pH stik sudah menunjukkan pH mendekati range pH netral,
pencucian dengan aquades ini dihentikan kemudian air di lapisan pelikel ini dibuang lalu lapisan pelikel ini ditimbang. Setelah ditimbang, lapisan pelikel
ini lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 40
o
C selama kurang lebih dua minggu.
Setelah 2 minggu atau setelah air pada nampan ini kering, lapisan pelikel ini dikeluarkan dari oven dan dijemur dibawah cahaya matahari
selama kurang lebih 1 minggu dengan sebelumnya nampan yang berisi pelikel ini ditutup dengan kain hitam. Setelah 1 minggu atau setelah lapisan pelikel
ini membentuk lembaran tipis, lapisan pelikel ini ditimbang lalu disimpan di
dalam plastik dan diletakkan di dalam toples yang sebelumnya telah diberi silika
gel.
5. Pembuatan Material Selulosa Kitosan Bakteri
Sebanyak 200 ml air cucian beras hasil penyaringan dituangkan ke dalam Erlenmeyer yang telah dilengkapi dengan pengaduk magnet,
ditambahkan 20,0 g gula pasir dan 1,0 g urea, selanjutnya diaduk hingga larut. Campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat glasial hingga pH
berkisar antara 3-4. Selanjutnya campuran didinginkan sebentar dan ditambahkan gliserol sebanyak 1,0 g lalu dituangkan dalam keadaan hangat ke
dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70 dan ditutup dengan koran sambil didinginkan hingga sesuai suhu kamar. Lalu campuran
ditambahkan 40 mL Acetobacter xylinum dan wadah ditutup dengan rapat menggunakan koran dan difermentasi selama 7 hari pada suhu kamar.
Lapisan pelikel yang terbentuk dicuci beberapa kali dengan air kran, lalu dengan aquades, lalu dengan air panas, lalu lapisan pelikel ini ditimbang
dengan timbangan digital. Lapisan pelikel lalu direndam dengan larutan natrium hidroksida 3 selama 48 jam dimana tiap 24 jam sekali larutan
natrium hidroksida 3 ini diganti lalu setelah 48 jam, lapisan pelikel ini dicuci kembali dengan aquades setelah dicuci dengan aquades lalu lapisan
pelikel ini direndam dengan larutan asam klorida 3 selama kurang lebih 15 menit. Setelah 15 menit, lapisan pelikel ini lalu dicuci kembali dengan
aquades dan dicek pH-nya dengan pH stik, jika pH pada pH stik sudah
menunjukkan pH mendekati range pH netral, pencucian dengan aquades ini dihentikan kemudian air di lapisan pelikel ini dibuang dan lapisan pelikel
ditimbang. Setelah ditimbang lalu larutan kitosan 2 yang telah dibuat
dituangkan ke atas lapisan pelikel. Lapisan pelikel+larutan kitosan ini lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 40
o
C selama kurang lebih 2 minggu atau sampai lapisan pelikel berbentuk lembaran tipis. Setelah lapisan pelikel itu
berbentuk lembaran tipis yang kering dikeluarkan dari oven lalu disimpan di dalam plastik dan diletakkan di dalam toples yang telah diberi silica gel
supaya biomaterial tetap terjaga kekeringannya.
6. Analisa karakteristik biomaterial :
a. Analisis FT – IR
Analisis ini menggunakan seperangkat alat FTIR dan dilakukan di Laboratorium Analisis Farmasi Fakultas Farmasi UII. Langkah-
langkahnya adalah lapisan tipis atau pelikel yang diperoleh dari hasil fermentasi dijepit pada tempat sampel kemudian diletakkan pada alat ke
arah sinar inframerah. Hasilnya akan direkam ke dalam kertas berskala berupa alur kurva bilangan gelombang terhadap intensitas.
b. Analisa SEM Material selulosa kitosan bakteri dipotong sedemikian rupa,
kemudian ditempatkan di atas tempat sampel yang terbuat dari kuningan .Sampel disepuh dengan dengan emas coating dengan alat ion coater
selama kurang lebih 5 menit. Selanjutnya sampel dimasukkan ke unit elektron gun melalui bilik pergantian sampel. Kemudian sampel diset
dengan bantuan mikrostage sampai mendapatkan fokus yang tepat. Tombol utama pada posisi ON dan diset detector Acceleratevoltage set, 20
kilo volt. c. Analisa XRD
Uji XRD ini dilakukan dengan memakai instrumen X-Ray Diffraction
yang dilakukan di Laboratorium XRD, Jurusan Teknik Kimia UNY. Langkah-langkahnya adalah lembaran film dipotong dengan ukuran
2x2 cm. Sampel tersebut kemudian dipasang di sample holder dan sampel diusahakan rata di atas sample holder. Selanjutnya pendingin alat XRD
dihidupkan dan instrumen XRD dihidupkan lalu diatur kondisi alat dengan sudut putar 2θ = 2° sampai 80°, scan step = 0,04 dan scan speed = 4
°menit serta tegangan dan arus pada instrumen disesuaikan dengan standard measurenment
dari instrumen dan dirotasikan agar benar-benar terorientasi secara acak. Hasil uji ini berupa difraktrogram hubungan
antara intensitas dan sudut 2θ.
7. Sterilisasi produk
Saat akan digunakan, produk biomaterial yang sudah dikeringkan disterilkan dengan etanol 96 selama 15 menit, kemudian dibilas dengan
laurat buffer fosfat PBS.
8. Pengujian aktivitas antimikroba
a. Pembuatan suspensi bakteri uji Isolat murni Staphylococcus aureus ditambahkan ke dalam media BHI
broth yang diinkubasi pada 37
o
C selama kurang lebih 4 jam sampai kekeruhan Brain Heart Infusion broth BHI broth menyamai
kekeruhannya McFarland no.0,5. b. Pembuatan media
Media yang digunakan untuk uji aktivitas antimikroba adalah MHA. Larutan MHA dituangkan ke dalam cawan petri sebanyak 20 mL dan
dibiarkan beberapa saat hingga memadat. c. Penanaman bakteri uji
Hasil suspensi bakteri uji dimasukkan ke dalam media Mueller-Hinton Agar
MHA dengan cara dioleskan secara merata dengan menggunakan lidi kapas steril Kirby bauer , lalu didiamkan kurang lebih selama 5
menit. d. Pemberian kontrol positif pada bakteri uji
Sebagai kontrol positif, digunakan paper disk antibiotik amoxicillin. Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar kemudian
diberi paper disk amoxicillin tadi sebanyak 1 disk per plate. Kemudian inkubasikan pada 37
o
C selama 24 jam. e. Pemberian kontrol negatif pada bakteri uji
Sebagai kontrol negatif, digunakan asam asetat. Sebanyak 20 µl asam asetat diteteskan pada paper disk. Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada
Mueller-Hinton Agar kemudian diberi paper disk berisi asam asetat tadi
sebanyak 4 disk per plate. Kemudian inkubasikan pada 37
o
C selama 24 jam.
f. Pemberian biomaterial,selulosa dan kitosan pada bakteri uji Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar
kemudian diberi potongan biomaterial. Biomaterial ini dipotong serupa dengan bentuk dan ukuran paper disk yang bertindak sebagai kontrol
positif dan kontrol negatif tadi dan sudah disterilisasi menggunakan etanol 96 dan buffer phosphat. Potongan masing-masing biomaterial
kemudian diletakkan sebanyak 4 potongan biomaterial per plate. Kemudian inkubasikan pada 37
o
C selama 24 jam. Hal yang sama juga dilakukan untuk membran kitosan dan selulosa bakteri.
g. Pengukuran zona hambat Pengukuran zona hambat dilakukan dengan mengukur diameter zona
hambat dalam millimeter, kemudian dihitung dengan menggunakan program statistik SPSS untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan
bermakna diantara ketiga membran.
F. Analisis Data
1. Analisis karakteristik dari biomaterial yang terbentuk ini meliputi analisis gugus fungsional, kristalinitas dan topografi permukaan dari biomaterial.
2. Analisis hasil untuk pengamatan makroskopis dilakukan dengan cara pengamatan zona hambat setelah pemberian biomaterial pada bakteri
Staphylococcus aureus .
3. Analisis sifat mekanik dan diameter luka diuji dengan statistik Kruskal wallis distribusi tidak normal dan Uji Post Hoc
– Mann Whitney
distribusi tidak normal atau distribusi normal dengan variasi berbeda.
41
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik
biomaterial selulosa bakteri dari air cucian beras dengan penambahan kitosan dan untuk mengetahui aktivitas antimikroba sediaan biomaterial selulosa
bakteri dari air cucian beras dengan penambahan kitosan sebagai material penutup luka pada bakteri Staphylococcus aureus.
A. Pembuatan Biomaterial Selulosa Bakteri
Dalam penelitian ini, digunakan beras dengan jenis dan merk yang sama, supaya adanya variabel pengacau bisa sedikit dikendalikan. Beras yang
digunakan adalah jenis rojolele. Pembelian beras juga dilakukan di tempat yang sama, agar memudahkan peneliti untuk memperoleh beras dengan jenis
dan merk yang sama. Sebelum
melakukan pembuatan
biomaterial selulosa,
beras diidentifikasi terlebih dahulu melalui pembuktian bahwa yang digunakan
dalam penelitian ini adalah beras. Dilakukan juga pengujian terhadap kandungan amilum dari beras tersebut. Alasan dilakukan identifikasi amilum
ini karena gula merupakan sumber utama media pertumbuhan Acetobacter xylinum
. Hal ini sesuai dengan pernyataan Hidayat 2006 yang mengatakan bahwa Acetobacter xylinum ini mensintesis selulosa dari gula yang
Kategori