Isolasi, pengklonan dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock proteins (HSPs) dari ulat sutera Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301
ISOLASI, PENGKLONAN DAN ANALISIS EKSPRESI GEN
PENYANDI HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs) DARI ULAT
SUTERA Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301
DISERTASI
Oleh
MASITTA TANJUNG
NIM. 108104009
Program Doktor (S3) Ilmu Pertanian
PROGRAM DOKTOR ILMU PERTANIAN
PASCASARJANA FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
i
Universitas Sumatera Utara
ISOLASI, PENGKLONAN DAN ANALISIS EKSPRESI GEN
PENYANDI HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs) DARI ULAT
SUTERA Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301
DISERTASI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dalam
Program Doktor Ilmu Pertanian pada Program Pascasarjana
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dibawah
pimpinan Rektor Universitas Sumatera Utara
Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum.
Dipertahankan di hadapan sidang Terbuka Senat Universitas
Sumatera Utara pada tanggal 23 Maret 2017
Oleh
MASITTA TANJUNG
Nim. 108104009
Program Doktor (S3) Ilmu Pertanian
PROGRAM DOKTOR ILMU PERTANIAN
PASCASARJANA FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
ii
Universitas Sumatera Utara
iii
Universitas Sumatera Utara
Diuji pada Ujian Disertasi Terbuka (Promosi Doktor)
Tanggal : 23 Maret 2017
PANITIA PENGUJI DISERTASI
Pemimpin Sidang
Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum. (Rektor USU)
Ketua
: Prof. Dr. Maryani Cyccu Tobing, M.S.
Anggota : Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed.
: Prof. Dr. Ir. Darma Bakti, M.S.
: Prof. Dr. Ir. Rosmayati, M.S.
: Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.
: Dr. Lisnawita, S.P., M.Si.
Pertanian USU
Biologi USU
Pertanian USU
Pertanian USU
Biologi USU
Pertanian USU
iv
Universitas Sumatera Utara
PERNYATAAN
ISOLASI, PENGKLONAN DAN ANALISIS EKSPRESI GEN PENYANDI
HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs) DARI ULAT SUTERA Bombyx mori L.
(Lepidoptera: Bombycidae) C301
Dengan ini penulis menyatakan bahwa disertasi ini sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Doktor dalam Program Doktor Ilmu Pertanian pada
Program Pascasarjana Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara adalah
benar merupakan hasil karya penulis sendiri. Pengutipan-pengutipan yang penulis
lakukan pada bagian-bagian tertentu dari karya orang lain dalam penulisan
disertasi ini, telah penulis cantumkan sumbernya secara jelas sesuai dengan
norma, kaidah dan etika penulisan ilmiah.
Apabila dikemudian hari ternyata ditemukan seluruh atau sebagian disertasi
ini bukan hasil karya penulis sendiri atau adanya flagiat dalam bagian-bagian tertentu, penulis bersedia menerima sanksi pencabutan gelar akademik yang penulis
sandang dan sanksi-sanksi lainnya sesuai dengan peraturan perundangan yang berlaku.
Medan, Maret 2017
Penulis,
Masitta Tanjung
v
Universitas Sumatera Utara
SUMMARY
MASITTA TANJUNG. Isolation, cloning and expression analysis of gene
coding heat shock proteins (HSPs) from silkworm Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301. Supervised by MARYANI CYCCU TOBING,
SYAFRUDDIN ILYAS and DARMA BAKTI
Growth, development and productivity of silkworm (Bombyx mori) are strongly influenced by environmental temperature changes. Temperature becomes
major factor in increasing the production of silk thread. Silkworm breeding in tropical climate are facing many challenges and obstacles, because silkworm eggs are originally from subtropical areas. In an effort to increase the production of in
the cultivation, is expected to have silkworm which can withstand in environmental factor changes, especially temperature changes. Natural silk business development in the tropical areas is required a thermotolerant silkworm eggs. Thermotolerant to environmental factors are controlled by genes. Genes that function to the
body's defense against temperature are heat shock proteins (Hsp) genes. Hsp genes can be isolated by providing a heat shock that could induce the expression of
the genes. Hsp is a protein that allows cells to overcome the problem of protein
that reduced after stress. Hsp is a molecule chaperones that can prevent inappropriate interactions with other cellular components, and stabilizes the protein and
cell degradation. Hsp perform this role by establishing a new polypeptides or proteins during normal cellular processes. Hsp gene is functioning to response for
stress induced protein denaturation. This research aims to isolate, clone and analyze the expression of genes encoding heat shock protein (Hsps) of silkworms. Silkworm eggs used in this research are derived from the local crossbreeding in Pusat
Pembibitan Ulat Sutera (PPUS) Candiroto Temanggung Jawa Tengah. Hsp genes
are induced by giving heat shock treatment to the silkworms. The treatment is given at 34, 38 and 42oC, and without heat shock as a control.
The research was conducted in three stages: (1) Growth and development of
silkworm by heat shock, (2) isolation of cDNA fragments actin gene (cDNA BmAct1) and (3) isolation, cloning and the expression analysis of genes encoding
Hsp genes silkworm (B. mori) C301. The research began to get an overview of the
growth and development of silkworm by heat shock with temperature 34, 38 and
42oC, and without heat shock as a control. Heat shock was conducted in early 4th
instar for 3 hours. The results showed that heat shock treatment increase the percentage of mortality and accelerate the larval stage, in addition treatment decrease
body weight by reducing growth, feed intake and digestibility. Furthermore, it also reduced productivity and lead to failure of the formation of cocoon, pupa, imago and fecundity. The next step is the isolation of total RNA in 5th instar stage
from several organs, include the head, silk gland, cuticle and rectum using Trizol
reagent. The results showed that the isolation of total RNA was found in the head,
silk gland and rectum meanwhile the cuticle occurs lime clotting. The results of
RNA quality and quantity analysis based on nanospectrophotometer uv-vis total
vi
Universitas Sumatera Utara
RNA was not detected on the network cuticle due to deposition because of the insoluble total RNA by the provision of DEPC water and ddH2O. The PCR continue
using total RNA that isolated for silkworm head. PCR applied QIAGEN one step
(Invitrogen) with three specific primers (HspBmC, Hsp20,4 and Hsp70). The of
nucleotide sequence analysis showed that the HspBmC gene fragment has a size
of 712 bp homologous with B. mori heat shock proteins 25.4 with E value 0.0
(max identity 99%). Hsp20.4 gene fragment size 535 bp homologous with B. mori
heat shock proteins 20.4 mRNA by E value 3e-105 (max identity 99%) and Hsp70
size 240 bp homologous with B. mori heat shock proteins 70 mRNA by E value
5e-96 (max identity 99%). To study the gene expression in silkworm quantitatively, is needed housekeeping genes as an internal controls. Housekeeping genes are
often used as an internal control is actin gene. Total RNA from the larva's head
used as a template for synthesis of total cDNA via reverse transcription. cDNA
fragments that encode actin of B. mori C301 has been isolated. Primer used forward (5’-ATC ACC ATC GGA AAC GAA AG-3’) and reverse (5’-GGT GTT
GGC GTA CAA GTC CT-3’)]. Subsequent cDNA gene fragment was named
BmAct1. Alignment analysis based on the nucleotide sequences showed that BmAct1 has a high similarity with the B. mori isolate W5-30 actin-4 mRNA. Analysis of gene expression was performed by RT-qPCR. The results showed that the
gene expression of Hsp25.4 and Hsp70 the were highest in heat shock 34oC,
Hsp20.4 was highest in heat shock 42oC. Heat shock 34oC and 38oC at Hsp20.4
showed similar expression. The lowest is on Hsp70 gene expression after exposure to a temperature of 38oC. Hsp gene expression patterns which isolated from
the head of the silkworm (Bombyx mori L.) C301 are having different expression
patterns from other strains.
Key words : actin gene, Bombyx mori, heat shock, Hsp, RNA
vii
Universitas Sumatera Utara
RINGKASAN
MASITTA TANJUNG. Isolasi, pengklonan dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock proteins (HSPs) dari ulat sutera Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301. Dibimbing oleh MARYANI CYCCU TOBING,
SYAFRUDDIN ILYAS dan DARMA BAKTI
Pertumbuhan, perkembangan dan produktivitas ulat sutera (Bombyx mori)
sangat dipengaruhi oleh perubahan suhu lingkungan. Suhu menjadi faktor utama
dalam meningkatkan produksi benang sutera. Pemeliharaan ulat sutera pada daerah tropis menghadapi banyak tantangan dan hambatan karena bibit ulat sutera
berasal dari daerah subtropis. Usaha dalam meningkatkan produksi benang diharapkan adanya bibit ulat sutera yang bisa tahan terhadap perubahan faktor lingkungan terutama suhu. Untuk mengembangan usaha persuteraan alam di daerah
tropis diperlukan bibit ulat sutera yang termotoleran. Termotoleran terhadap faktor lingkungan dikontrol oleh gen. Gen yang berfungsi untuk proses pertahanan
tubuh terhadap faktor suhu adalah gen Hsp (heat shock proteins). Gen Hsp dapat
diisolasi dengan cara memberikan kejut panas sehingga bisa menginduksi ekspresi
gen tersebut. Hsp adalah protein yang memungkinkan sel untuk mengatasi masalah protein setelah adanya stres (cekaman). Hsp merupakan molekul chaperone
yang dapat mencegah interaksi yang tidak pantas dengan komponen seluler lainnya, serta menstabilkan protein dan dapat menghindari terjadinya degradasi sel.
Hsp melakukan peran ini dengan membentuk polipeptida baru atau protein selama
proses seluler normal. Gen Hsp berfungsi menanggapi denaturasi protein akibat
stres. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengkloning dan menganalisis ekspresi gen penyandi heat shock protein (Hsp) pada ulat sutera. Bibit ulat sutera
yang digunakan adalah yang berasal dari hasil persilangan lokal Pusat Pembibitan
Ulat Sutera (PPUS) Candiroto Temanggung Jawa Tengah. Gen Hsp diinduksi
dengan memberikan kejut panas pada ulat sutera. Kejut panas yang diberikan
adalah suhu, antara lain 34, 38 dan 42oC serta tanpa kejut panas sebagai kontrol.
Penelitian dilakukan dalam 3 tahap yaitu (1) Pertumbuhan dan perkembangan ulat sutera yang diberi kejut panas, (2) isolasi fragmen cDNA gen penyandi aktin (BmAct) dan (3) isolasi, kloning dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock
protein (Hsp) ulat sutera (B. mori) C301. Penelitian diawali untuk mendapatkan
gambaran pertumbuhan dan perkembangan ulat sutera yang diberi kejut panas
yaitu suhu 34, 38 dan 42oC serta tanpa kejut panas. Kejut panas dilakukan pada
awal instar IV selama 3 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian kejut panas dapat meningkatkan persentase mortalitas, mempercepat stadium instar,
menurunkan bobot tubuh dengan cara menurunkan pertumbuhan, konsumsi pakan
dan daya cerna. Selain itu juga menurunkan produktivitas serta menimbulkan kegagalan pembentukan kokon, pupa dan imago serta keperidian. Selanjutnya dilakukan isolasi RNA total ulat sutera instar V dari beberapa organ tubuh meliputi
kepala, kelenjar sutera, kutikula dan rektum dengan menggunakan reagen Trizol.
viii
Universitas Sumatera Utara
Hasil penelitian menunjukkan bahwa RNA total ditemukan pada kepala, kelenjar
sutera dan rektum sedangkan pada kutikula terjadi penggupalan. Hasil analisis
kualitas dan kuantitatif RNA menggunakan nanospectrophotometer uv-vis tidak
terdeteksi adanya RNA total pada jaringan kutikula karena endapan RNA total
tidak larut dengan pemberian DEPC water dan ddH2O. Isolasi fragmen gen Hsp
dengan PCR menggunakan QIAGEN one step (Invitrogen) dengan 3 primer
spesifik, antara lain : HspBmC, Hsp20,4 dan Hsp70. Analisis urutan nukleotida
menunjukkan bahwa fragmen gen HspBmC memiliki ukuran 712 pb homolog
dengan B. mori heat shock proteins 25.4 dengan E value 0.0 (max identity 99%).
Fragmen gen Hsp20,4 berukuran 535 pb homolog dengan B. mori heat shock
proteins 20.4 mRNA dengan E value 3e-105 (max identity 99%) dan Hsp70 berukuran 240 pb homolog dengan B. mori heat shock proteins 70 mRNA dengan E
value 5e-96 (max identity 99%). Untuk mempelajari ekspresi gen secara kuantitatif pada ulat sutera dibutuhkan housekeeping gen sebagai kontrol internal.
Housekeeping gen yang sering digunakan sebagai internal kontrol adalah gen
aktin. RNA total diisolasi dari bagian kepala larva dan dijadikan cetakan untuk
sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Fragmen cDNA yang menyandikan
aktin dari B. mori C301 telah berhasil diisolasi. Primer yang digunakan adalah
forward (5’-ATC ACC ATC GGA AAC GAA AG-3’) dan reverse (5’-GGT GTT
GGC GTA CAA GTC CT-3’)]. Fragmen gen cDNA selanjutnya diberi nama BmAct1. Analisis kesejajaran berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan bahwa
BmAct1 memiliki kemiripan yang tinggi (99%) dengan B. mori isolat W5-30
actin-4 mRNA. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan RT-qPCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi gen Hsp25,4 dan Hsp70 tertinggi pada kejut
panas 34oC, sedangkan Hsp 20,4 tertinggi pada kejut panas 42oC. Kejut panas
34oC dan 38oC pada Hsp20,4 menunjukkan ekspresi yang hampir sama. Ekspresi
gen terendah pada Hsp70 setelah pemaparan suhu 38oC. Pola ekspresi gen Hsp
yang diisolasi dari kepala ulat sutera (Bombyx mori L.) C301 memiliki pola
ekspresi yang berbeda dengan strain lainnya.
Kata kunci : Bombyx mori, gen aktin, Hsp, kejut panas, RNA
ix
Universitas Sumatera Utara
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sibolga pada tanggal 10 September 1971. Ayah
bernama H. Hasan Zahar (almarhum) dan Ibunda Hj. Zahirni. Penulis merupakan
anak keenam dari sepuluh bersaudara dan telah menikah tahun 2001 dengan
Porman Siregar, Amd.IP., S.H. M.H serta mempunyai dua orang putra dan satu
putri : Aditiya Raja Parlindungan Siregar (2003), Asyifah Marwah Siregar (2005)
dan Adzin Muttaqien Siregar (2007).
Penulis lulus Sekolah Dasar pada SD Negeri 081225 Sibolga tahun 1983,
lulus Sekolah Menengah Pertama pada SMP Negeri 3 Sibolga tahun 1986, lulus
Sekolah Menengah Atas pada SMA Negeri 2 Sibolga tahun 1989, lulus Sarjana
Sains tahun 1994 pada jurusan Biologi dari Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Andalas Padang dan lulus Magister Biologi tahun 2001
dari Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Pada tahun 2000 sampai sekarang menjadi staf pengajar di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera
Utara Medan.
Penulis mengikuti pendidikan doktor (S3) pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera utara sejak tahun 2010, yang semula atas bantuan BPPS dan
selanjutnya biaya mandiri.
x
Universitas Sumatera Utara
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah
memberikan berkah-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penulisan
disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan di
Laboratorium Fisiologi Hewan dan Genetika Departemen Biologi FMIPA USU,
Laboratorium Dasar USU, Laboratorium Biologi Molekuler Balai Karantina Ikan
dan Pengendalian Mutu Klas I Medan serta Pusat Penelitian Bioteknologi dan
Bioindustri Indonesia Bogor. Disertasi ini berisikan tentang isolasi, pengklonan
dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock proteins (HSPs) dari ulat sutera
Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301.
Selama melakukan penelitian dan penulisan disertasi, penulis banyak memperoleh bantuan moril dan material dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus kepada Ibu Prof. Dr. Maryani
Cyccu Tobing, M.S. selaku promotor, Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. dan Prof. Dr. Ir. Darma Bakti, M.S. selaku co-promotor yang telah memberikan arahan, bimbingan dan dukungan selama masa perkuliahan dan penelitian mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan dan penulisan disertasi ini. Demikian juga
ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu,
S.H., M.Hum. selaku Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Dr. Hasanuddin,
M.S. selaku Dekan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan Bapak
Prof. Dr. Ir. Abdul Rauf, M.P., M.S. selaku Ketua Program Studi Doktor Ilmu
Pertanian Universitas Sumatera Utara. Ucapan terimakasih penulis haturkan juga
kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Rosmayati, M.S., Bapak Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.
dan Ibu Dr. Lisnawita, S.P., M.Si. selaku penguji yang telah banyak memberikan
bimbingan dan arahannya.
Terimakasih penulis sampaikan kepada Tim Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS), Hibah Disertasi Doktor dibiayai oleh DIPA Universitas Sumatera
Utara Tahun Anggaran 2014, sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Penugasan Penelitian Disertasi Doktor nomor : 1086/UN5.1.R/KEU/2014, tanggal 17
Februari 2014 dan Penelitian Hibah Bersaing yang dibiayai oleh Direktorat Riset
xi
Universitas Sumatera Utara
dan Pengabdian Masyarakat Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi sesuai dengan Surat
Perjanjian Penugasan Pelaksanaan Program Penelitian Nomor: 017/SP2H/LT/
DRPM/II/2016, tanggal 17 Februari 2016, terimakasih atas bantuan dalam penyediaan dana pendidikan dan penelitian. Penulis juga menyampaikan terimakasih
kepada seluruh staf pengajar dan administrasi serta laboran di lingkungan Program Doktor Ilmu pertanian dan Departemen Biologi atas bantuannya dalam melancarkan pelaksanaan pendidikan dan penelitian di lingkungan kampus dan
laboratorium.
Ucapan terimakasih yang tulus dan ikhlas penulis haturkan kepada Ayahanda tercinta H. Hasan Zahar (almarhum) dan Ibunda Hj. Zahirni serta seluruh
keluarga yang senantiasa memberikan semangat, doa, cinta dan kasih sayangnya
serta dorongan moril dan material sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan ini. Kepada Suami tercinta Porman Siregar, Amd. IP, S.H., M.H dan anakanakku tersayang, Aditiya Raja Parlindungan Siregar, Asyifah Marwah Siregar
dan Adzin Muttaqien Siregar, terimakasih atas segala perhatian, kasih sayang,
pengorbanan, pengertian dan dorongan moril serta doa yang diberikan selama ini.
Penulis menyadari masih banyak memiliki kekurangan dan jauh dari kesempurnaan. Harapan penulis semoga disertasi ini bermanfaat dan dapat memberikan
sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Semoga kiranya Tuhan Yang
Maha Kuasa memberkati kita semua.
Medan, Maret 2017
Penulis,
Masitta Tanjung
xii
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR ISI
SUMMARY
RINGKASAN
RIWAYAT HIDUP
KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
vi
viii
x
xi
xiii
xv
xvi
xviii
BAB I.
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
1.2 Perumusan masalah
1.3 Tujuan penelitian
1.4 Hipotesa penelitian
1.5 Manfaat penelitian
Kerangka berpikir
1
1
7
9
10
10
12
BAB II.
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Biologi ulat sutera Bombyx mori L. (Lepidoptera:
Bombycidae)
2.1.1 Morfologi ulat sutera
2.1.2 Perbedaan antara ulat jantan dan betina
2.1.3 Tahapan pupa
2.1.4 Tahapan imago
2.2 Ras ulat sutera
2.3 Genetika dan pemuliaan ulat sutera
2.3.1 Seleksi
2.3.2 Persilangan
2.3.3 Efek heterosis dan maternal
2.4 Fenomena heat shock
2.4.1 Jenis dan fungsi heat shock proteins (Hsp)
2.4.2 Bibit ulat toleran terhadap panas
13
13
BAB III.
PERTUMBUHAN DAN PERKEMBANGAN ULAT
SUTERA (Bombyx mori L.) C301 YANG DIBERI
KEJUT PANAS (HEAT SHOCK )
Abstrak
3.1 Pendahuluan
3.2 Bahan dan metode
3.3 Hasil dan pembahasan
3.4 Kesimpulan dan saran
14
16
21
22
22
23
24
25
26
28
30
31
34
34
34
36
42
57
xiii
Universitas Sumatera Utara
BAB IV.
BAB V.
BAB VI.
ISOLASI FRAGMEN cDNA GEN PENYANDI AKTIN
ULAT SUTERA (Bombyx mori L.) C301
Abstrak
4.1 Pendahuluan
4.2 Bahan dan metode
4.3 Hasil dan pembahasan
4.4 Kesimpulan dan saran
ISOLASI, PENGKLONAN DAN ANALISIS EKSPRESI
GEN PENYANDI HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs)
DARI ULAT SUTERA (Bombyx mori L.) C301
Abstrak
5.1 Pendahuluan
5.2 Bahan dan metode
5.3 Hasil dan pembahasan
5.4 Kesimpulan dan saran
PEMBAHASAN UMUM
58
58
58
60
62
66
67
67
67
72
77
97
98
BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
7.2 Saran
103
103
104
DAFTAR PUSTAKA
105
LAMPIRAN
122
xiv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR TABEL
No
Judul
Halaman
2.1
Ciri-ciri dan karakteristik ras ulat sutera.
23
3.1
Persentase mortalitas ulat sutera (B. mori) C301 yang
diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
42
3.2
Rataan lama stadium instar ulat sutera (B. mori) C301
yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
45
3.3
Rataan pertambahan bobot ulat sutera (B. mori) C301
yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
46
3.4
Rataan konsumsi bahan kering, daya cerna, ECI, ECD
dan konversi pakan akhir instar IV ulat sutera (B. mori)
C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda
49
3.5
Rataan konsumsi bahan kering, daya cerna, ECI, ECD
dan konversi pakan akhir instar V ulat sutera (B. mori)
C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
50
3.6
Rataan bobot kokon, kulit kokon, dan pupa ulat sutera
(B. mori) C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang
berbeda.
52
5.1
Sekuensing primer (5'-3').
74
5.2
Sekuen primer yang digunakan untuk RT-qPCR
76
5.3
Kuantitas RNA total hasil isolasi dari beberapa bagian
tubuh ulat sutera (B. mori) C301 instar V dengan
nanospektrofotometer UV-Vis.
78
5.4
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp BmC ulat sutera (B.
mori) C301.
85
5.5
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp 20,4 ulat sutera (B.
mori) C301.
87
5.6
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp70 ulat sutera
mori) C301.
88
(B.
xv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR GAMBAR
No
Judul
Halaman
2.1
Ulat sutera (Bombyx mori) instar V.
14
2.2
Kepala ulat sutera dilihat dari depan.
15
2.3
Toraks dan abdomen ulat sutera.
16
2.4
Perbedaan ulat jantan dan betina bagian abdomen
segmen belakang.
17
2.5
Perkembangan proses pembentukan pupa ulat sutera
21
2.6
Organ seksual dari pupa.
22
3.1
Morfologi ulat sutera (B. mori) C301 yang mati setelah
diberi kejut panas pada suhu yang berbeda.
44
3.2
Kegagalan pembentukan pupa ulat sutera (B. mori)
C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang
berbeda.
54
3.3
Gambaran keperidian ulat sutera (B. mori) C301 yang
diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
55
4.1
Fragmen BmAct1 hasil PCR dengan menggunakan
primer aktin universal untuk B. mori.
62
4.2
Hubungan filogenetik antara aktin BmAct dengan aktin
B. mori dari data gen bank.
63
4.3
Urutan nukleotida fragmen gen BmAct 1 B. mori C301.
64
5.1
RNA total dari beberapa organ ulat sutera (B. mori)
C301.
77
5.2
RNA total dari kepala ulat sutera B. mori C301.
82
5.3
Hasil PCR optimalisasi suhu primer Hsp70.
82
5.4
Hasil PCR optimalisasi suhu primer HspBmC dan 20,4.
83
xvi
Universitas Sumatera Utara
5.5
Fragmen gen Hsp hasil PCR dengan primer HspBmC,
Hsp 20,4 dan Hsp70.
83
5.6
Urutan nukleotida gen HspBmC ulat sutera (B. mori)
C301.
85
5.7
Hubungan filogenetik gen HspBmC dari ulat sutera (B.
mori) C301.
86
5.8
Urutan nukleotida gen Hsp 20,4 ulat sutera (B. mori)
C301.
86
5.9
Hubungan filogenetik gen Hsp20,4 ulat sutera
mori) C301.
87
5.10
Urutan nukleotida gen Hsp70 ulat sutera (B. mori)
C301.
5.11
Hubungan filogenetik gen Hsp70 dari ulat sutera
mori) C301.
5.12
Fragmen gen Hsp B. mori yang diberi kejut panas pada
beberapa perlakuan suhu yang berbeda hasil PCR
menggunakan primer Hsp 25,4, 70 dan 20,4.
90
5.13
Plot amplifikasi RT-qPCR gen Hsp25,4 yang diberi
kejut panas dengan beberapa suhu yang berbeda.
92
5.14
Plot amplifikasi RT-qPCR gen Hsp70 yang diberi kejut
panas dengan beberapa suhu yang berbeda.
92
5.15
Plot amplifikasi RT-qPCR gen Hsp20,4 yang diberi
kejut dengan beberapa suhu yang berbeda.
93
5.16
Pola ekspresi gen Hsp24,5, Hsp70 dan Hsp20,4 pada
ulat sutera (B. mori) C301 yang diberi kejut panas
dengan suhu yang berbeda
94
(B.
88
(B.
89
xvii
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR LAMPIRAN
No.
Judul
Halaman
1.
Uji kuantitas RNA total ulat sutera (B. mori) C301
instar V dengan nanospektrofotometer uv-vis yang
diberi kejut panas dengan suhu berbeda
122
2.
Data ekpresi gen Hsp pada B. mori C301 yang diberi
kejut panas pada beberapa suhu yang berbeda
123
3.
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp 25,4 ulat sutera
(B. mori) C301
124
4.
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp20,4 ulat sutera
(B. mori) C301
125
5.
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp70 ulat sutera (B.
mori) C301
126
xviii
Universitas Sumatera Utara
PENYANDI HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs) DARI ULAT
SUTERA Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301
DISERTASI
Oleh
MASITTA TANJUNG
NIM. 108104009
Program Doktor (S3) Ilmu Pertanian
PROGRAM DOKTOR ILMU PERTANIAN
PASCASARJANA FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
i
Universitas Sumatera Utara
ISOLASI, PENGKLONAN DAN ANALISIS EKSPRESI GEN
PENYANDI HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs) DARI ULAT
SUTERA Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301
DISERTASI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dalam
Program Doktor Ilmu Pertanian pada Program Pascasarjana
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dibawah
pimpinan Rektor Universitas Sumatera Utara
Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum.
Dipertahankan di hadapan sidang Terbuka Senat Universitas
Sumatera Utara pada tanggal 23 Maret 2017
Oleh
MASITTA TANJUNG
Nim. 108104009
Program Doktor (S3) Ilmu Pertanian
PROGRAM DOKTOR ILMU PERTANIAN
PASCASARJANA FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
ii
Universitas Sumatera Utara
iii
Universitas Sumatera Utara
Diuji pada Ujian Disertasi Terbuka (Promosi Doktor)
Tanggal : 23 Maret 2017
PANITIA PENGUJI DISERTASI
Pemimpin Sidang
Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum. (Rektor USU)
Ketua
: Prof. Dr. Maryani Cyccu Tobing, M.S.
Anggota : Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed.
: Prof. Dr. Ir. Darma Bakti, M.S.
: Prof. Dr. Ir. Rosmayati, M.S.
: Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.
: Dr. Lisnawita, S.P., M.Si.
Pertanian USU
Biologi USU
Pertanian USU
Pertanian USU
Biologi USU
Pertanian USU
iv
Universitas Sumatera Utara
PERNYATAAN
ISOLASI, PENGKLONAN DAN ANALISIS EKSPRESI GEN PENYANDI
HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs) DARI ULAT SUTERA Bombyx mori L.
(Lepidoptera: Bombycidae) C301
Dengan ini penulis menyatakan bahwa disertasi ini sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Doktor dalam Program Doktor Ilmu Pertanian pada
Program Pascasarjana Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara adalah
benar merupakan hasil karya penulis sendiri. Pengutipan-pengutipan yang penulis
lakukan pada bagian-bagian tertentu dari karya orang lain dalam penulisan
disertasi ini, telah penulis cantumkan sumbernya secara jelas sesuai dengan
norma, kaidah dan etika penulisan ilmiah.
Apabila dikemudian hari ternyata ditemukan seluruh atau sebagian disertasi
ini bukan hasil karya penulis sendiri atau adanya flagiat dalam bagian-bagian tertentu, penulis bersedia menerima sanksi pencabutan gelar akademik yang penulis
sandang dan sanksi-sanksi lainnya sesuai dengan peraturan perundangan yang berlaku.
Medan, Maret 2017
Penulis,
Masitta Tanjung
v
Universitas Sumatera Utara
SUMMARY
MASITTA TANJUNG. Isolation, cloning and expression analysis of gene
coding heat shock proteins (HSPs) from silkworm Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301. Supervised by MARYANI CYCCU TOBING,
SYAFRUDDIN ILYAS and DARMA BAKTI
Growth, development and productivity of silkworm (Bombyx mori) are strongly influenced by environmental temperature changes. Temperature becomes
major factor in increasing the production of silk thread. Silkworm breeding in tropical climate are facing many challenges and obstacles, because silkworm eggs are originally from subtropical areas. In an effort to increase the production of in
the cultivation, is expected to have silkworm which can withstand in environmental factor changes, especially temperature changes. Natural silk business development in the tropical areas is required a thermotolerant silkworm eggs. Thermotolerant to environmental factors are controlled by genes. Genes that function to the
body's defense against temperature are heat shock proteins (Hsp) genes. Hsp genes can be isolated by providing a heat shock that could induce the expression of
the genes. Hsp is a protein that allows cells to overcome the problem of protein
that reduced after stress. Hsp is a molecule chaperones that can prevent inappropriate interactions with other cellular components, and stabilizes the protein and
cell degradation. Hsp perform this role by establishing a new polypeptides or proteins during normal cellular processes. Hsp gene is functioning to response for
stress induced protein denaturation. This research aims to isolate, clone and analyze the expression of genes encoding heat shock protein (Hsps) of silkworms. Silkworm eggs used in this research are derived from the local crossbreeding in Pusat
Pembibitan Ulat Sutera (PPUS) Candiroto Temanggung Jawa Tengah. Hsp genes
are induced by giving heat shock treatment to the silkworms. The treatment is given at 34, 38 and 42oC, and without heat shock as a control.
The research was conducted in three stages: (1) Growth and development of
silkworm by heat shock, (2) isolation of cDNA fragments actin gene (cDNA BmAct1) and (3) isolation, cloning and the expression analysis of genes encoding
Hsp genes silkworm (B. mori) C301. The research began to get an overview of the
growth and development of silkworm by heat shock with temperature 34, 38 and
42oC, and without heat shock as a control. Heat shock was conducted in early 4th
instar for 3 hours. The results showed that heat shock treatment increase the percentage of mortality and accelerate the larval stage, in addition treatment decrease
body weight by reducing growth, feed intake and digestibility. Furthermore, it also reduced productivity and lead to failure of the formation of cocoon, pupa, imago and fecundity. The next step is the isolation of total RNA in 5th instar stage
from several organs, include the head, silk gland, cuticle and rectum using Trizol
reagent. The results showed that the isolation of total RNA was found in the head,
silk gland and rectum meanwhile the cuticle occurs lime clotting. The results of
RNA quality and quantity analysis based on nanospectrophotometer uv-vis total
vi
Universitas Sumatera Utara
RNA was not detected on the network cuticle due to deposition because of the insoluble total RNA by the provision of DEPC water and ddH2O. The PCR continue
using total RNA that isolated for silkworm head. PCR applied QIAGEN one step
(Invitrogen) with three specific primers (HspBmC, Hsp20,4 and Hsp70). The of
nucleotide sequence analysis showed that the HspBmC gene fragment has a size
of 712 bp homologous with B. mori heat shock proteins 25.4 with E value 0.0
(max identity 99%). Hsp20.4 gene fragment size 535 bp homologous with B. mori
heat shock proteins 20.4 mRNA by E value 3e-105 (max identity 99%) and Hsp70
size 240 bp homologous with B. mori heat shock proteins 70 mRNA by E value
5e-96 (max identity 99%). To study the gene expression in silkworm quantitatively, is needed housekeeping genes as an internal controls. Housekeeping genes are
often used as an internal control is actin gene. Total RNA from the larva's head
used as a template for synthesis of total cDNA via reverse transcription. cDNA
fragments that encode actin of B. mori C301 has been isolated. Primer used forward (5’-ATC ACC ATC GGA AAC GAA AG-3’) and reverse (5’-GGT GTT
GGC GTA CAA GTC CT-3’)]. Subsequent cDNA gene fragment was named
BmAct1. Alignment analysis based on the nucleotide sequences showed that BmAct1 has a high similarity with the B. mori isolate W5-30 actin-4 mRNA. Analysis of gene expression was performed by RT-qPCR. The results showed that the
gene expression of Hsp25.4 and Hsp70 the were highest in heat shock 34oC,
Hsp20.4 was highest in heat shock 42oC. Heat shock 34oC and 38oC at Hsp20.4
showed similar expression. The lowest is on Hsp70 gene expression after exposure to a temperature of 38oC. Hsp gene expression patterns which isolated from
the head of the silkworm (Bombyx mori L.) C301 are having different expression
patterns from other strains.
Key words : actin gene, Bombyx mori, heat shock, Hsp, RNA
vii
Universitas Sumatera Utara
RINGKASAN
MASITTA TANJUNG. Isolasi, pengklonan dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock proteins (HSPs) dari ulat sutera Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301. Dibimbing oleh MARYANI CYCCU TOBING,
SYAFRUDDIN ILYAS dan DARMA BAKTI
Pertumbuhan, perkembangan dan produktivitas ulat sutera (Bombyx mori)
sangat dipengaruhi oleh perubahan suhu lingkungan. Suhu menjadi faktor utama
dalam meningkatkan produksi benang sutera. Pemeliharaan ulat sutera pada daerah tropis menghadapi banyak tantangan dan hambatan karena bibit ulat sutera
berasal dari daerah subtropis. Usaha dalam meningkatkan produksi benang diharapkan adanya bibit ulat sutera yang bisa tahan terhadap perubahan faktor lingkungan terutama suhu. Untuk mengembangan usaha persuteraan alam di daerah
tropis diperlukan bibit ulat sutera yang termotoleran. Termotoleran terhadap faktor lingkungan dikontrol oleh gen. Gen yang berfungsi untuk proses pertahanan
tubuh terhadap faktor suhu adalah gen Hsp (heat shock proteins). Gen Hsp dapat
diisolasi dengan cara memberikan kejut panas sehingga bisa menginduksi ekspresi
gen tersebut. Hsp adalah protein yang memungkinkan sel untuk mengatasi masalah protein setelah adanya stres (cekaman). Hsp merupakan molekul chaperone
yang dapat mencegah interaksi yang tidak pantas dengan komponen seluler lainnya, serta menstabilkan protein dan dapat menghindari terjadinya degradasi sel.
Hsp melakukan peran ini dengan membentuk polipeptida baru atau protein selama
proses seluler normal. Gen Hsp berfungsi menanggapi denaturasi protein akibat
stres. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengkloning dan menganalisis ekspresi gen penyandi heat shock protein (Hsp) pada ulat sutera. Bibit ulat sutera
yang digunakan adalah yang berasal dari hasil persilangan lokal Pusat Pembibitan
Ulat Sutera (PPUS) Candiroto Temanggung Jawa Tengah. Gen Hsp diinduksi
dengan memberikan kejut panas pada ulat sutera. Kejut panas yang diberikan
adalah suhu, antara lain 34, 38 dan 42oC serta tanpa kejut panas sebagai kontrol.
Penelitian dilakukan dalam 3 tahap yaitu (1) Pertumbuhan dan perkembangan ulat sutera yang diberi kejut panas, (2) isolasi fragmen cDNA gen penyandi aktin (BmAct) dan (3) isolasi, kloning dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock
protein (Hsp) ulat sutera (B. mori) C301. Penelitian diawali untuk mendapatkan
gambaran pertumbuhan dan perkembangan ulat sutera yang diberi kejut panas
yaitu suhu 34, 38 dan 42oC serta tanpa kejut panas. Kejut panas dilakukan pada
awal instar IV selama 3 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian kejut panas dapat meningkatkan persentase mortalitas, mempercepat stadium instar,
menurunkan bobot tubuh dengan cara menurunkan pertumbuhan, konsumsi pakan
dan daya cerna. Selain itu juga menurunkan produktivitas serta menimbulkan kegagalan pembentukan kokon, pupa dan imago serta keperidian. Selanjutnya dilakukan isolasi RNA total ulat sutera instar V dari beberapa organ tubuh meliputi
kepala, kelenjar sutera, kutikula dan rektum dengan menggunakan reagen Trizol.
viii
Universitas Sumatera Utara
Hasil penelitian menunjukkan bahwa RNA total ditemukan pada kepala, kelenjar
sutera dan rektum sedangkan pada kutikula terjadi penggupalan. Hasil analisis
kualitas dan kuantitatif RNA menggunakan nanospectrophotometer uv-vis tidak
terdeteksi adanya RNA total pada jaringan kutikula karena endapan RNA total
tidak larut dengan pemberian DEPC water dan ddH2O. Isolasi fragmen gen Hsp
dengan PCR menggunakan QIAGEN one step (Invitrogen) dengan 3 primer
spesifik, antara lain : HspBmC, Hsp20,4 dan Hsp70. Analisis urutan nukleotida
menunjukkan bahwa fragmen gen HspBmC memiliki ukuran 712 pb homolog
dengan B. mori heat shock proteins 25.4 dengan E value 0.0 (max identity 99%).
Fragmen gen Hsp20,4 berukuran 535 pb homolog dengan B. mori heat shock
proteins 20.4 mRNA dengan E value 3e-105 (max identity 99%) dan Hsp70 berukuran 240 pb homolog dengan B. mori heat shock proteins 70 mRNA dengan E
value 5e-96 (max identity 99%). Untuk mempelajari ekspresi gen secara kuantitatif pada ulat sutera dibutuhkan housekeeping gen sebagai kontrol internal.
Housekeeping gen yang sering digunakan sebagai internal kontrol adalah gen
aktin. RNA total diisolasi dari bagian kepala larva dan dijadikan cetakan untuk
sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Fragmen cDNA yang menyandikan
aktin dari B. mori C301 telah berhasil diisolasi. Primer yang digunakan adalah
forward (5’-ATC ACC ATC GGA AAC GAA AG-3’) dan reverse (5’-GGT GTT
GGC GTA CAA GTC CT-3’)]. Fragmen gen cDNA selanjutnya diberi nama BmAct1. Analisis kesejajaran berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan bahwa
BmAct1 memiliki kemiripan yang tinggi (99%) dengan B. mori isolat W5-30
actin-4 mRNA. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan RT-qPCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi gen Hsp25,4 dan Hsp70 tertinggi pada kejut
panas 34oC, sedangkan Hsp 20,4 tertinggi pada kejut panas 42oC. Kejut panas
34oC dan 38oC pada Hsp20,4 menunjukkan ekspresi yang hampir sama. Ekspresi
gen terendah pada Hsp70 setelah pemaparan suhu 38oC. Pola ekspresi gen Hsp
yang diisolasi dari kepala ulat sutera (Bombyx mori L.) C301 memiliki pola
ekspresi yang berbeda dengan strain lainnya.
Kata kunci : Bombyx mori, gen aktin, Hsp, kejut panas, RNA
ix
Universitas Sumatera Utara
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Sibolga pada tanggal 10 September 1971. Ayah
bernama H. Hasan Zahar (almarhum) dan Ibunda Hj. Zahirni. Penulis merupakan
anak keenam dari sepuluh bersaudara dan telah menikah tahun 2001 dengan
Porman Siregar, Amd.IP., S.H. M.H serta mempunyai dua orang putra dan satu
putri : Aditiya Raja Parlindungan Siregar (2003), Asyifah Marwah Siregar (2005)
dan Adzin Muttaqien Siregar (2007).
Penulis lulus Sekolah Dasar pada SD Negeri 081225 Sibolga tahun 1983,
lulus Sekolah Menengah Pertama pada SMP Negeri 3 Sibolga tahun 1986, lulus
Sekolah Menengah Atas pada SMA Negeri 2 Sibolga tahun 1989, lulus Sarjana
Sains tahun 1994 pada jurusan Biologi dari Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Andalas Padang dan lulus Magister Biologi tahun 2001
dari Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Pada tahun 2000 sampai sekarang menjadi staf pengajar di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera
Utara Medan.
Penulis mengikuti pendidikan doktor (S3) pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera utara sejak tahun 2010, yang semula atas bantuan BPPS dan
selanjutnya biaya mandiri.
x
Universitas Sumatera Utara
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah
memberikan berkah-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penulisan
disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan di
Laboratorium Fisiologi Hewan dan Genetika Departemen Biologi FMIPA USU,
Laboratorium Dasar USU, Laboratorium Biologi Molekuler Balai Karantina Ikan
dan Pengendalian Mutu Klas I Medan serta Pusat Penelitian Bioteknologi dan
Bioindustri Indonesia Bogor. Disertasi ini berisikan tentang isolasi, pengklonan
dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock proteins (HSPs) dari ulat sutera
Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301.
Selama melakukan penelitian dan penulisan disertasi, penulis banyak memperoleh bantuan moril dan material dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus kepada Ibu Prof. Dr. Maryani
Cyccu Tobing, M.S. selaku promotor, Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. dan Prof. Dr. Ir. Darma Bakti, M.S. selaku co-promotor yang telah memberikan arahan, bimbingan dan dukungan selama masa perkuliahan dan penelitian mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan dan penulisan disertasi ini. Demikian juga
ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu,
S.H., M.Hum. selaku Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Dr. Hasanuddin,
M.S. selaku Dekan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan Bapak
Prof. Dr. Ir. Abdul Rauf, M.P., M.S. selaku Ketua Program Studi Doktor Ilmu
Pertanian Universitas Sumatera Utara. Ucapan terimakasih penulis haturkan juga
kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Rosmayati, M.S., Bapak Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.
dan Ibu Dr. Lisnawita, S.P., M.Si. selaku penguji yang telah banyak memberikan
bimbingan dan arahannya.
Terimakasih penulis sampaikan kepada Tim Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS), Hibah Disertasi Doktor dibiayai oleh DIPA Universitas Sumatera
Utara Tahun Anggaran 2014, sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Penugasan Penelitian Disertasi Doktor nomor : 1086/UN5.1.R/KEU/2014, tanggal 17
Februari 2014 dan Penelitian Hibah Bersaing yang dibiayai oleh Direktorat Riset
xi
Universitas Sumatera Utara
dan Pengabdian Masyarakat Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi sesuai dengan Surat
Perjanjian Penugasan Pelaksanaan Program Penelitian Nomor: 017/SP2H/LT/
DRPM/II/2016, tanggal 17 Februari 2016, terimakasih atas bantuan dalam penyediaan dana pendidikan dan penelitian. Penulis juga menyampaikan terimakasih
kepada seluruh staf pengajar dan administrasi serta laboran di lingkungan Program Doktor Ilmu pertanian dan Departemen Biologi atas bantuannya dalam melancarkan pelaksanaan pendidikan dan penelitian di lingkungan kampus dan
laboratorium.
Ucapan terimakasih yang tulus dan ikhlas penulis haturkan kepada Ayahanda tercinta H. Hasan Zahar (almarhum) dan Ibunda Hj. Zahirni serta seluruh
keluarga yang senantiasa memberikan semangat, doa, cinta dan kasih sayangnya
serta dorongan moril dan material sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan ini. Kepada Suami tercinta Porman Siregar, Amd. IP, S.H., M.H dan anakanakku tersayang, Aditiya Raja Parlindungan Siregar, Asyifah Marwah Siregar
dan Adzin Muttaqien Siregar, terimakasih atas segala perhatian, kasih sayang,
pengorbanan, pengertian dan dorongan moril serta doa yang diberikan selama ini.
Penulis menyadari masih banyak memiliki kekurangan dan jauh dari kesempurnaan. Harapan penulis semoga disertasi ini bermanfaat dan dapat memberikan
sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Semoga kiranya Tuhan Yang
Maha Kuasa memberkati kita semua.
Medan, Maret 2017
Penulis,
Masitta Tanjung
xii
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR ISI
SUMMARY
RINGKASAN
RIWAYAT HIDUP
KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
vi
viii
x
xi
xiii
xv
xvi
xviii
BAB I.
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
1.2 Perumusan masalah
1.3 Tujuan penelitian
1.4 Hipotesa penelitian
1.5 Manfaat penelitian
Kerangka berpikir
1
1
7
9
10
10
12
BAB II.
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Biologi ulat sutera Bombyx mori L. (Lepidoptera:
Bombycidae)
2.1.1 Morfologi ulat sutera
2.1.2 Perbedaan antara ulat jantan dan betina
2.1.3 Tahapan pupa
2.1.4 Tahapan imago
2.2 Ras ulat sutera
2.3 Genetika dan pemuliaan ulat sutera
2.3.1 Seleksi
2.3.2 Persilangan
2.3.3 Efek heterosis dan maternal
2.4 Fenomena heat shock
2.4.1 Jenis dan fungsi heat shock proteins (Hsp)
2.4.2 Bibit ulat toleran terhadap panas
13
13
BAB III.
PERTUMBUHAN DAN PERKEMBANGAN ULAT
SUTERA (Bombyx mori L.) C301 YANG DIBERI
KEJUT PANAS (HEAT SHOCK )
Abstrak
3.1 Pendahuluan
3.2 Bahan dan metode
3.3 Hasil dan pembahasan
3.4 Kesimpulan dan saran
14
16
21
22
22
23
24
25
26
28
30
31
34
34
34
36
42
57
xiii
Universitas Sumatera Utara
BAB IV.
BAB V.
BAB VI.
ISOLASI FRAGMEN cDNA GEN PENYANDI AKTIN
ULAT SUTERA (Bombyx mori L.) C301
Abstrak
4.1 Pendahuluan
4.2 Bahan dan metode
4.3 Hasil dan pembahasan
4.4 Kesimpulan dan saran
ISOLASI, PENGKLONAN DAN ANALISIS EKSPRESI
GEN PENYANDI HEAT SHOCK PROTEINS (HSPs)
DARI ULAT SUTERA (Bombyx mori L.) C301
Abstrak
5.1 Pendahuluan
5.2 Bahan dan metode
5.3 Hasil dan pembahasan
5.4 Kesimpulan dan saran
PEMBAHASAN UMUM
58
58
58
60
62
66
67
67
67
72
77
97
98
BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
7.2 Saran
103
103
104
DAFTAR PUSTAKA
105
LAMPIRAN
122
xiv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR TABEL
No
Judul
Halaman
2.1
Ciri-ciri dan karakteristik ras ulat sutera.
23
3.1
Persentase mortalitas ulat sutera (B. mori) C301 yang
diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
42
3.2
Rataan lama stadium instar ulat sutera (B. mori) C301
yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
45
3.3
Rataan pertambahan bobot ulat sutera (B. mori) C301
yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
46
3.4
Rataan konsumsi bahan kering, daya cerna, ECI, ECD
dan konversi pakan akhir instar IV ulat sutera (B. mori)
C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda
49
3.5
Rataan konsumsi bahan kering, daya cerna, ECI, ECD
dan konversi pakan akhir instar V ulat sutera (B. mori)
C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
50
3.6
Rataan bobot kokon, kulit kokon, dan pupa ulat sutera
(B. mori) C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang
berbeda.
52
5.1
Sekuensing primer (5'-3').
74
5.2
Sekuen primer yang digunakan untuk RT-qPCR
76
5.3
Kuantitas RNA total hasil isolasi dari beberapa bagian
tubuh ulat sutera (B. mori) C301 instar V dengan
nanospektrofotometer UV-Vis.
78
5.4
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp BmC ulat sutera (B.
mori) C301.
85
5.5
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp 20,4 ulat sutera (B.
mori) C301.
87
5.6
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp70 ulat sutera
mori) C301.
88
(B.
xv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR GAMBAR
No
Judul
Halaman
2.1
Ulat sutera (Bombyx mori) instar V.
14
2.2
Kepala ulat sutera dilihat dari depan.
15
2.3
Toraks dan abdomen ulat sutera.
16
2.4
Perbedaan ulat jantan dan betina bagian abdomen
segmen belakang.
17
2.5
Perkembangan proses pembentukan pupa ulat sutera
21
2.6
Organ seksual dari pupa.
22
3.1
Morfologi ulat sutera (B. mori) C301 yang mati setelah
diberi kejut panas pada suhu yang berbeda.
44
3.2
Kegagalan pembentukan pupa ulat sutera (B. mori)
C301 yang diberi kejut panas dengan suhu yang
berbeda.
54
3.3
Gambaran keperidian ulat sutera (B. mori) C301 yang
diberi kejut panas dengan suhu yang berbeda.
55
4.1
Fragmen BmAct1 hasil PCR dengan menggunakan
primer aktin universal untuk B. mori.
62
4.2
Hubungan filogenetik antara aktin BmAct dengan aktin
B. mori dari data gen bank.
63
4.3
Urutan nukleotida fragmen gen BmAct 1 B. mori C301.
64
5.1
RNA total dari beberapa organ ulat sutera (B. mori)
C301.
77
5.2
RNA total dari kepala ulat sutera B. mori C301.
82
5.3
Hasil PCR optimalisasi suhu primer Hsp70.
82
5.4
Hasil PCR optimalisasi suhu primer HspBmC dan 20,4.
83
xvi
Universitas Sumatera Utara
5.5
Fragmen gen Hsp hasil PCR dengan primer HspBmC,
Hsp 20,4 dan Hsp70.
83
5.6
Urutan nukleotida gen HspBmC ulat sutera (B. mori)
C301.
85
5.7
Hubungan filogenetik gen HspBmC dari ulat sutera (B.
mori) C301.
86
5.8
Urutan nukleotida gen Hsp 20,4 ulat sutera (B. mori)
C301.
86
5.9
Hubungan filogenetik gen Hsp20,4 ulat sutera
mori) C301.
87
5.10
Urutan nukleotida gen Hsp70 ulat sutera (B. mori)
C301.
5.11
Hubungan filogenetik gen Hsp70 dari ulat sutera
mori) C301.
5.12
Fragmen gen Hsp B. mori yang diberi kejut panas pada
beberapa perlakuan suhu yang berbeda hasil PCR
menggunakan primer Hsp 25,4, 70 dan 20,4.
90
5.13
Plot amplifikasi RT-qPCR gen Hsp25,4 yang diberi
kejut panas dengan beberapa suhu yang berbeda.
92
5.14
Plot amplifikasi RT-qPCR gen Hsp70 yang diberi kejut
panas dengan beberapa suhu yang berbeda.
92
5.15
Plot amplifikasi RT-qPCR gen Hsp20,4 yang diberi
kejut dengan beberapa suhu yang berbeda.
93
5.16
Pola ekspresi gen Hsp24,5, Hsp70 dan Hsp20,4 pada
ulat sutera (B. mori) C301 yang diberi kejut panas
dengan suhu yang berbeda
94
(B.
88
(B.
89
xvii
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR LAMPIRAN
No.
Judul
Halaman
1.
Uji kuantitas RNA total ulat sutera (B. mori) C301
instar V dengan nanospektrofotometer uv-vis yang
diberi kejut panas dengan suhu berbeda
122
2.
Data ekpresi gen Hsp pada B. mori C301 yang diberi
kejut panas pada beberapa suhu yang berbeda
123
3.
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp 25,4 ulat sutera
(B. mori) C301
124
4.
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp20,4 ulat sutera
(B. mori) C301
125
5.
Hasil analisis blastn sekuen gen Hsp70 ulat sutera (B.
mori) C301
126
xviii
Universitas Sumatera Utara