Kinetika Reaksi Kimia Stabilitas Enzim

III. METODELOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei-November 2013 di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, jarum ose, pembakar spiritus, autoclave model S-90N, laminar air flow CURMA model 9005-FL, neraca analitik, waterbath shaker incubator STUART SSL2, sentrifuga, lemari pendingin, mikropipet Eppendorff, waterbath, penangas, magnetic stirrer, termometer, batang pengaduk, kantong selofan, waterbath incubator HAAKE dan spektrofotometer UV-Vis Carry Win UV 32. Sedangkan bahan-bahan yang akan digunakan adalah NA Nutrien Agar, CMC Carboxy Methyl Cellulose, pepton, NH 4 2 SO 4 , akuades, alkohol, MgSO 4 , CaCl 2 , CoCl 2 , KH 2 PO 4 , urea, FeSO 4 .7H 2 O, glukosa, ZnSO 4 .7H 2 O, Na 2 CO 3 , NaOH, reagen follin ciocelteau, NaK tartarat, CuSO 4 .5H 2 O, NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , DNS dinitrosalisilic acid, fenol, Na 2 SO 3 , Na-sitrat, asam sitrat, Bovine Serum Albumin BSA dan CC-PEG Sianurat Klorida Polietilenglikol. Bakteri penghasil enzim selulase pada penelitian ini adalah Bacillus subtilis ITBCCB148 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknologi Bioproses Jurusan Teknik Kimia, Institut Teknologi Bandung.

C. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan media inokulum, inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148

dan produksi enzim selulase a. Pembuatan media inokulum dan media fermentasi Media yang digunakan terdiri atas g.L -1 NH 4 2 SO 4 1,4; KH 2 PO 4 2,0; urea 0,3; CaCl 2 0,3; MgSO 4 0,3; FeSO 4 .7H 2 O 0,005; ZnSO 4 .7H 2 O 0,0014; CoCl 2 0,002 dan pepton 0,75. Sumber karbon utama yang digunakan dalam media inokulum adalah glukosa 7,5 g.L -1 dan digunakan buffer fosfat 0,1 M pH 5,5 sebagai pelarut. Sedangkan pada media fermentasi digunakan CMC 7,5 g.L -1 sebagai sumber karbon utama dan buffer fosfat 0,1M pH 6 sebagai pelarut. Selanjutnya media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm, selama 15 menit Sternberg, 1976. b. Inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148 Sebanyak 5 ose Bacillus subtilis ITBCCB148 dari media agar miring dipindahkan ke dalam 100 mL media inokulum secara aseptis lalu dikocok pada waterbath shaker incubator dengan kecepatan 130 rpm dan suhu 35 o C selama 48 jam. c. Produksi enzim selulase Produksi enzim selulase dilakukan dengan cara membuat media fermentasi sebanyak 1 L kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm, selama 15 menit Sternberg, 1976. Selanjutnya dipindahkan sebanyak 20 mL media inokulum setara dengan 2 dari jumlah media fermentasi ke dalam media fermentasi secara aseptis lalu dikocok pada waterbath shaker incubator dengan kecepatan 130 rpm dan suhu 32 o C selama 72 jam.

2. Isolasi enzim selulase

Isolasi enzim adalah metode pemisahan enzim dari komponen selnya. Pada penelitian ini isolasi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Media fermentasi yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran 5000 rpm pada suhu 4 o C selama 25 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim selulase. Ekstrak kasar enzim selulase kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Mandels dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.

3. Uji aktivitas dan kadar protein enzim selulase

a. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas enzim selulase metode Mandels Mandels et al,1976 Ke dalam labu ukur 100 ml, dimasukkan 1 DNS dinitrosalisilic acid, 1 NaOH, 1 mL NaK tartarat 40, 0,2 fenol dan 0,05 Na 2 SO 3, kemudian dilarutkan dalam 100 mL akuades hingga tanda batas. b. Pengujian aktivitas enzim selulase metode Mandels Metode ini berdasarkan glukosa yang terbentuk Mandels et al.,1976. Sebanyak 0,25 mL enzim, 0,25 mL larutan CMC 0,5 dalam bufer fosfat pH 5,0; dicampur lalu diinkubasi selama 60 menit pada suhu 50 o C. Kemudian ditambahkan 1 mL pereaksi DNS dinitrosalisilic acid dididihkan selama 10 menit pada penangas air dan didinginkan. Setelah dingin, campuran ditambahkan 1,5 mL akuades dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 510 nm. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan menggunakan kurva standar glukosa.

c. Pembuatan pereaksi untuk penentuan kadar protein enzim selulase

metode Lowry Pereaksi A : 2 gram Na 2 CO 3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1 N. Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO 4 .5H 2 O 1 ditambahkan ke dalam 5 mL larutan NaK tartarat 1.