5. Modifikasi kimia enzim selulase hasil pemurnian dengan
polietilenglikol teraktivasi
Modifikasi enzim selulase dengan polietilenglikol teraktivasi dilakukan sesuai dengan prosedur yang dilaporkan oleh Hernaiz et al
. 1999 dalam
menstabilkan enzim lipase dari Candida rugosa. Modifikasi kimia enzim selulase dilakukan dengan tiga variasi perbandingan antara kadar protein
enzim hasil pemurnian dengan CC-PEG, yaitu 1:10; 1:20; dan 1:40. Reaksi dilakukan pada suhu 4
o
C dan distirrer secara perlahan selama 2 jam dalam bufer fosfat pH 8.
6. Karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian dan hasil modifikasi
Karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian dan hasil modifikasi yang dilakukan meliputi :
a. Penentuan pH optimum
Untuk mengetahui pH optimum enzim sebelum dan sesudah modifikasi kimia, digunakan bufer fosfat 0,05 M dengan variasi pH
sebagai berikut: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0. Suhunya dipertahankan pada 50
o
C. Kemudian diukur aktivitasnya menggunakan metode Mandels.
b. Penentuan suhu optimum
Suhu yang rendah menyebabkan reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu tinggi reaksi kimia akan berlangsung cepat.
Namun pada suhu tinggi, enzim dapat mengalami denaturasi. Oleh
karena itu, variasi suhu yang digunakan adalah 45; 50; 55; 60; 65; dan70, pH tetap dijaga pada pH optimum. Selanjutnya aktivitas enzim
diukur dengan metode Mandels.
c. Penentuan data kinetika enzim nilai K
M
dan V
maks
Konstanta Michaelis-Menten K
M
dan laju reaksi maksimal V
maks
enzim sebelum dan sesudah modifikasi kimia ditentukan dari kurva Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk dibuat dengan menguji
aktivitas enzim selulase dengan variasi konsentrasi substrat 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 dalam bufer fosfat pH 5
dan suhu 50
o
C selama 60 menit. Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Mandels.
d. Uji stabilitas termal dan pH enzim Yang et al., 1996
Penentuan stabilitas termal dan pH enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama periode waktu 100
menit pada suhu dan pH optimum. Caranya adalah dengan mengukur aktivitas enzim setelah proses pemanasan setelah interval waktu 10
menit. Aktivitas awal enzim tanpa proses pemanasan diberi nilai 100.
Virdianingsih, 2002
e. Perubahan waktu paruh t
12
, konstanta laju inaktivasi k
i
dan perubahan energi akibat denaturasi
ΔG
i
Perubahan nilai k
i
konstanta laju inaktivasi enzim selulase hasil pemurnian dan setelah modifikasi kimia dilakukan dengan
menggunakan persamaan kinetika inaktivasi orde 1 Kazan et al., 1997 dengan persamaan :
ln E
i
E = -k
i
t Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi
ΔG
i
enzim selulase hasil pemurnian dan setelah modifikasi kimia dilakukan
dengan menggunakan persamaan Kazan et al., 1997: ΔG
i
= - RT ln k
i
hk
B
T Keterangan:
R = konstanta gas 8,3 J K
-1
mol
-1
T = suhu absolut K k
i
= konstanta laju inaktivasi termal h = konstanta Planck 6,63 x 10
-34
J det k
B
= konstanta Boltzmann 1,381 x 10
-23
J K
-1
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang
ditunjukkan dalam Gambar 9.
Gambar 10. Diagram alir penelitian. Produksi enzim
Ekstrak kasar
Enzim hasil pemurnian
Modifikasi kimia Uji aktivitas
enzim selulase metode Mandels
dan penentuan kadar protein
metode Lowry Dialisis
Fraksinasi dengan ammonium sulfat
Uji aktivitas enzim selulase metode Mandels
Penentuan pH dan
suhu optimum
Penentuan Km dan
Vmaks Penentuan
stabilitas termal dan
pH optimum
Enzim hasil pemurnian
Enzim modifikasi
Kategori