4 Bacillus subtilis
diperoleh dari Fakultas Farmasi UGM, disk antibiotik Oxoid, etanol 96, akuades, Media Mueller Hinton MH, Brain Heart Infusion BHI,
Manitol Salt Agar MSA, cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, dan cat Gram D,
DMSO, silika gel GF
254
, Silika gel 60, n-heksan:etil asetat, dan peraksi semprot.
Jalannya Penelitian 1.
Fraksinasi dengan KCV
Eluen terbaik yaitu kloroform-heksan-metanol. Perbandingan campuran pelarut disesuaikan dengan tingkat kepolaran senyawa seperti pada tabel 1.
Tabel 1. Hasil Orientasi Pemilihan Eluen untuk proses KCV
Pelarut Perbandingan Pelarut
Banyaknya Elusi
Kloroform:Heksan 6:4 2
kali Kloroform:Heksan 7:3
4 kali
Kloroform:Heksan 8:2 3
kali Kloroform:Heksan 9:1
3 kali
Kloroform:Etil asetat 8:2
2 kali Metanol 1
2 kali
Pemasukan sampel ke dalam kolom KCV dilakukan tidak dalam bentuk larutan tetapi dalam bentuk teradsorpsi ke dalam silika gel 60. Untuk satu kali
elusi dibutuhkan 200 mL dan hasil KCV ditampung dalam botol. Setelah penampungan selesai hasilnya diuji KLT. Dari pengamatan hasil uji KLT dapat
dikelompokkan menjadi beberapa fraksi menurut pola kromatogram yang didapat.
2. Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan pengecetan Gram A, B, C, dan D pada bakteri dan uji biokimiawi media MSA untuk Staphyloccus aureus dan media Simmon
sitrat untuk Bacillus subtilis.
3. Uji Sensitivitas
Sensitivitas dilakukan dengan menanam disk antibiotik ampisilin, eritromisin, vankomisin, dan kloramfenikol pada media yang telah diberi suspensi bakteri
4. Uji aktivitas antibakteri dengan metode Difusi sumuran
Media MH sebanyak 20 mL dipadatkan pada cawan petri, kemudian dimasukkan 200 µL suspensi bakteri 1,5x10
8
CFUmL dan diratakan menggunkan spreader glass
. Pembuatan sumuran menggunakan cockborner yang sudah steril dengan diameter 7 mm. Masing-masing media terdapat 7 sumuran yang
dimasukkan pada masing-masing lubang sebanyak 20 µL dengan seri konsentrasi
5 yaitu 1; 2; 3; 4; dan 5mgsumuran, kontrol positif antibiotik yaitu streptomisin
0,25, dan kontrol negatif pelarut DMSO 2,5. Media yang telah mengalami perlakuan kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam dan diukur diameter zona hambatnya.
5. Uji Kromatografi Lapis Tipis
Sampel yang berupa fraksi nonpolar, semipolar, dan polar ekstrak etanol daun buni ditotolkan pada lempeng plat KLT dan dibiarkan mengering. Setelah kering
plat dimasukkan pada bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase gerak. Setelah elusi selesai, plat diambil dan dikeringkan sampai fase gerak yang ada
pada plat menguap dan mengering. Plat KLT diambil dan diamati hasilnya pada UV 254 nm dan 366 nm kemudian bercak dideteksi dengan pereaksi semprot
FeCl
3
, sitroborat, Liebermann-Burchard, dan anisaldehid-asam sulfat.
HASIL DAN PEMBAHASAN A.
Hasil Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Vakum KCV. Pada proses KCV menggunakan fase diam silika G
60
dan fase gerak gradien menggunakan gradien kepolaran bertingkat perbandingan kloform
dengan heksan. Agar diperoleh hasil fraksinasi yang baik dilakukan optimasi fase gerak. Volume satu kali elusi adalah jumlah pelarut yang dipakai untuk mengisi
volume kolom yang digunakan. Profil KLT diamati, fraksi yang mempunyai profil KLT yang sama dijadikan satu fraksi sehingga diperoleh fraksi nonpolar,
semipolar dan polar. Hasil fraksi yang didapatkan dari 20 gram ekstrak seperti pada tabel 2. Hasil fraksinasi hanya ±50, hal ini dikarenakan masih banyak
ekstrak yang tertinggal pada kolom KCV.
Tabel 2. Hasil Fraksinasi
Rendemen hasil fraksinasi Volume Pelarut
Berat Ekstrak yang difraksinasi
g Fraksi Nonpolar
g Fraksi Semipolar
g Fraksi Polar
g 200 mL
20 2,16
2,02 5,37
B. Identifikasi bakteri
