Metallokolagenase terdiri dari zink yang mengandung enzim yang membutuhkan kalsium untuk kestabilan. Selain itu, metallokolagenase termasuk
dalam enzim ekstraseluler yang terlibat dalam pembentukan kembali matriks ekstraseluler. Jenis enzim ini telah banyak dipelajari dari berbagai jaringan
mamalia, dari bakteri, dan bisa ular Park et al. 2002. Penggunaan kolagenase yang cukup penting dalam bidang biomedis
adalah dalam perbaikan jaringan pada peradangan, transplantasi klinis, fungsi seluler dalam penggumpalan darah, fibrinolisis dan fertilisasi Simpson 2000
dan mempercepat proses penyembuhan luka Rilley Herman 2005. Kolagenase sangat efektif untuk mengempukan daging, sehingga pengeraman
tidak lama untuk memperoleh daging dengan tekstur yang lunak. Penggunaan kolagenase berkembang untuk mencegah penuaan kulit pada manusia.
Kolagenase dari hepatopankreas kepiting telah digunakan untuk deskinning pada cumi-cumi Lopez Carreno 2000.
2.6 Ekstraksi dan Pemurnian Enzim
Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda, biasanya air dan
yang lainnya pelarut organik. Metode ekstraksi enzim pada perinsipnya mempertimbangkan beberapa hal, diantaranya adalah: sumber enzim, jenis, sifat
serta bentuk ekstrak atau preparat yang diinginkan. Enzim-enzim hewan pada umumnya terletak pada organ-organ khusus seperti organ pencernaan dan
jaringan. Ekstraksi enzim dari organ tersebut dilakukan dengan cara memisahkan enzim kasar dari lemak kemudian dihancurkan dengan pengontrolan suhu
sehingga tidak terjadi denaturasi protein enzim Suhartono 1989. Pemisahan berbagai partikel non enzim yang tercampur dengan enzim
dapat dilakukan dengan pengendapan partikel tersebut tanpa menggumpalkan enzim. Tahap ini disebut klarifikasi. Penambahan senyawa dapat membantu
mempermudah penggumpalkan partikel non enzim. Contoh senyawa tersebut adalah ammonium sulfat, asam askorbat, garam-garam kalsium, serat selulosa,
sistein, tanah diatome, gelatin, asam fosfat, garam Na fosfat, Na sulfat, dan Na sitrat Suhartono 1989.
Apabila diinginkan produk enzim yang lebih murni, sebelum pengeringan, dilakukan penggumpalan enzim terlebih dahulu. Tahap ini disebut presipitasi.
Tahap ini dapat dilakukan dengan dua jenis metode kimiawi, yaitu penambahan pelarut organik dan garam. Penambahan pelarut organik dapat menurunkan
konstanta dielektrik dan menyebabkan medium kurang cocok untuk permukaan enzim yang polar. Ion garam seperti ion dari garam ammonium sulfat, yaitu ion
NH
4 +
dan SO
4 2-
yang ditambahkan mempengaruhi kelarutan protein. Pada konsentrasi rendah, ion-ion garam tersebut akan melingkungi molekul protein dan
mencegah bersatunya molekul-molekul ini, sehingga protein melarut. Peristiwa ini disebut salting in. Pada konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan listrik
disekitar protein, yang akan menarik mantel air dari koloid protein. Interaksi hidrofobik diantara sesama molekul protein pada suasana ionik yang tinggi akan
menurunkan kelarutan protein. Peristiwa ini disebut salting out Suhartono 1989. Proses pemurnian enzim dapat dilakukan menggunakan metode
kromatografi dan elektroforesis. Kromatografi didefinisikan sebagai sistem pengaliran suatu fluida melalui kolom yang mengandung matriks bahan pengisi
dan substanta yang ingin dipisahkan menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan daya ikat terhadap bahan pengisi. Harris dan Angel 1989 membagi
metode kromatografi menjadi empat kelompok, yaitu: a.
kromatografi adsorbsi yang bekerja berdasarkan perbedaan polaritas komponen sampel;
b. kromatografi penukar ion untuk melakukan pemisahan berdasarkan perbedaan
jenis muatan adsorben dan komponen sampel; c.
kromatografi filtrasi gel yang memisahkan molekul berdasarkan ukurannya; d.
kromatografi afinitas yang memisahkan komponen sampel berdasarkan interaksi biokimia antara sampel dengan ligan yang terlibat pada matriks
adsorban. Mekanisme kromatografi penukar ion disajikan pada Gambar 7 dan gel filtrasi
disajikan pada Gambar 8.
Gambar 7 Mekanisme kromatografi penukar ion 1 media kromatografi sebagai fase diam, mengandung resin bermuatan + di dalam kolom dialiri
buffer, 2 larutan molekul yang bermuatan +, -, dan tidak bermuatan dialiri ke media, 3 molekul yang bermuatan berlawanan
berikatan dengan resin, 4 dielusi dengan buffer, atau larutan yang mempunyai kekuatan ionik tertentu fase bergerak, 5 buffer akan
mengganti sampel yang bermuatan untuk berikatan dengan media fase diam. Sumber: Boyer 1993.
Gambar 8 Mekanisme kromatografi gel filtrasi A Sampel terdiri dari molekul besar dan kecil, B Molekul yang besar tidak terperangkap dalam
matriks gel sehingga keluar dari kolom lebih cepat, C Pengelusian molekul-molekul sampel. Sumber: Boyer 1993.
Media yang digunakan dalam memisahkan molekul-molekul yang berbeda ukurannya pada kromatografi gel filtarasi adalah dekstran yang telah mengalami
reaksi cross linkage dengan bantuan epikhlorhidrin. Hasilnya adalah dekstran yang tidak larut air, tetapi dapat menyerap air dalam molekulnya sendiri. Daya
serap tergantung pada jumlah cross linkage atau ikatan silang yang terjadi. Makin banyak ikatan silang, maka daya serapnya kurang baik Scopes 1982; Harris
Angal 1989. Dekstran bersifat hidrofilik, karena akan membentuk partikel gel
hidrofilik. Istilah yang terkenal adalah sephadex. Sifat-sifatnya adalah tahan terhadap garam atau basa pada konsentrasi yang tinggi, tetapi rusak oleh asam
pH2 dan oleh oksidator kuat. Sifat-sifat sephadex tersebut dikembangkan swelling dengan air. Nomor belakang menunjukkan besarnya pengembangan.
Misalnya 100, berarti pengembangannya 100 kali setelah direndam dalam air. Tipe matriks kolom dan fraksinya disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Tipe matriks kolom jenis dextran Sephadex dan kisaran fraksinasinya. Tipe
Kisaran fraksinasi Air yang diserap
gg gel kering Volume kolom gel
mgg gel kering G10 Sampai
700 1,0
2 G15 Sampai
1500 1,5
3 G25 1000-5000
2,5 5
G50 1500–30000 5,0
10 G75
3000–80000 7,5
12 – 15 G100
4000–150000 10,0
15 – 20 G150
5000–400000 15,0
20 – 30 G200
5000–800000 20,0
30 - 40 Sumber: Scopes 1982.
2.7 Elektroforesis
