7
Bahan Volume
Tris 1 M pH 7,8 18 µl
NaCl 5 M 1 µl
MgCl
2
2,7 µl DTT 100 mM
4,5 µl DNase
3 µl RNase inhibitor
1 µl DEPC
Ditambahkan hingga volume total 450 µl
Larutan yang telah dibuat kemudian divortex dan dispindown, serta diinkubasi dalam suhu 37
O
C selama 30 menit. Setelah itu larutan ditambah dengan phenol chloroform sebanyak 450 µ l dan disentrifuse selama 10 menit
dengan kecepatan 12.000rpm, 4
O
C. Supernatan yang berwarna bening diambil sebanyak ± 450 µ l dan dipindahkan ke dalam microtube yang baru. Larutan
tersebut ditambah dengan ethanol absolute sebanyak 2 kali volume larutan 900 µ l, NaOAC 3 M pH 5,2 sebanyak 10 larutan 45µl dan glikogen 1 µ l.
Sampel divortex dan dimasukkan ke dalam freezer -80
O
C selama semalaman. Larutan diambil dari dalam freezer dan disentrifugasi 12.000rpm,4
O
C selama 15- 30 menit, seluruh supernatan dibuang dan ditambahkan dengan larutan etanol
70 dingin. Larutan disentrifugasi kembali selama 5 menit, 12.000rpm, 4
O
C dan seluruh pellet RNA dikeringudarakan pada suhu ruang. RNA yang sudah kering
ditambahkan DEPC elusi 20 µ l lalu dihitung konsentrasi RNA dengan menggunakan GeneQuant
®
.
2.7 Sintesis cDNA dan Amplifikasi PCR
RNA dibuat dengan konsentrasi 3 µg30 µ l DEPC, kemudian divortex dengan kecepatan rendah. Setelah itu sampel diinkubasi dalam suhu 65
O
C selama 10 menit dan selanjutnya disimpan dalam es selama 2 menit. RNA dipindahkan
dari dalam es ke dalam tabung “first strand reaction mix beads” white tube yang berisi 2 buah bola putih. Kemudian ditambah 3 µl primer “dT3’RACE-VECT 1
µg3 µl lalu dibiarkan selama 1 menit. Sampel divortex dengan kecepatan rendah. Kemudian microtube diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
O
C. Hasil dari cDNA ditambah dengan SDW steril sebanyak 50 µ l.
cDNA yang didapat langsung digunakan untuk proses PCR. Amplifikasi PCR dilakukan dengan program: pre-denaturasi pada suhu 95
o
C selama 7 menit; 45 siklus pada suhu 95
o
C selama 30 detik, 64
o
C selama 30 detik dan 72
o
C selama 30 detik ; serta pada suhu 72
o
C selama 7 menit.
8
1,5 kbp
1 kbp
200b
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat dilihat bahwa vaksin DNA GP11 masuk ke dalam organ target. Hal ini tampak pada visualisasi hasil
PCR DNA seperti Gambar 3.
M U
1-1
G
1-1
I
1-1
U
1-2
G
1-2
I
1-2
U
2-2
G
2-2
I
2-2
U
2-3
G
2-3
I
2-3
U
1-3
G
1-3
I
1-3
+ -
M U
1-1
G
1-1
I
1-1
U
1-2
G
1-2
I
1-2
U
2-2
G
2-2
I
2-2
U
2-3
G
2-3
I
2-3
U
1-3
G
1-3
I
1-3
-
.Gambar 1. Visualisasi hasil PCR DNA ikan mas bervaksinasi. M = marker; U
1-1
, G
1-1
, I
1-1
= perlakuan 1 dan 2, sampling ke-1 pada usus U, ginjal G, insang I; U
1-2
, G
1-2
, I
1-2
= perlakuan 1, sampling ke-2 pada usus U, ginjal G, insang I; U
2-2
, G
2-2
, I
2-2
= perlakuan 2, sampling ke-2 pada usus U, ginjal G, insang I; U
2-3
, G
2-3
, I
2-3
= perlakuan 2, sampling ke-3 pada usus U, ginjal G, insang I; U
1-3,
G
1-3
, I
1-3
= perlakuan 1, sampling ke-3 pada usus U, ginjal G, insang I; + = kontrol
positif; - = kontrol negatif ; A = β-aktin sebagai kontrol internal;
perlakuan U
1-1
G
1-1
I
1-1
= perlakuan U
2-1
G
2-1
I
2-1
. Dari hasil pemeriksaan visualisasi DNA dapat dilihat bahwa plasmid Krt-
GP11 tampak pada perlakuan G
1-1
, I
1-1
, U
1-2
, G
1-2
, I
1-2
, U
2-2
, G
2-2
, I
2-2
, G
2-3
, G
1-3
, I
1- 3
. Namun pada minggu ke-2, tidak seluruh sample DNA organ tervisualisasi. Perlakuan I visualisasi hanya terdapat pada ginjal, sedangkan perlakuan II
visualisasi terdapat pada ginjal dan insang. Isolasi RNA dilakukan sebagai salah satu tahap pemeriksaan ekspresi
plasmid Krt-GP11 di tubuh ikan mas. Isolasi RNA dilakukan 10 hari setelah selesai pemberian vaksin. Organ yang diambil untuk isolasi RNA adalah ginjal.
M G
1
G
1
G
2
G
2
K + -
M G
1
G
1
G
2
G
2
K -
Gambar 2. Hasil sintesis cDNA. M = marker; G
1
= ginjal perlakuan 1; G
2
= ginjal perlakuan 2; + = kontrol positif; - = kontrol negatif;
A = β-aktin sebagai kontrol internal.
A
1,5 kbp 600bp
200bp
A
9
Sintesis cDNA berhasil dilakukan, hal ini dapat dilihat dari munculnya pita β-aktin sebagai kontrol internal. Ikan mas berusia 3 minggu mampu
mengekspresikan gen GP11 yang dapat terdeteksi setelah 10 hari pemberian vaksin pada organ ginjal di setiap perlakuan.
3.2 Pembahasan
