5
2.3.2 Amplifikasi DNA dengan teknik PCR Polymerase Chain Reaction
Amplifikasi PCR dilakukan dengan cara 1 unit dry taq produk Promega ditambahkan dengan 1,5
μl DNA dan 2 μl primer. Primer yang digunakan adalah OPA 2, OPC 2, dan OPC 5. Selanjutnya ditambahkan akuades hingga total
volume menjadi 25 μl. Setelah itu dimasukkan ke mesin PCR dengan 35 siklus,
yaitu pre denaturasi pada 94ºC selama 2 menit, denaturasi pada suhu 94 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 36 ºC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72 ºC
selama 2,5 menit, elongasi akhir pada suhu 72 ºC selama 7 menit, dan proses penstabilan pada suhu 4 ºC selama 3 menit Nugroho et al., 1997..
Tabel 1. Deskripsi primer yang digunakan pada analisis RAPD ikan tambakan
Primer Urutan Basa 5’-3’
OPA 2 TGCCGAGCTG
OPC 2 GTGAGGCGTC
OPC 5 GATGACCGCCC
2.3.3 Elektroforesis
Gel agarose dibuat terlebih dahulu dengan konsentrasi 2 dengan mencampurkan bubuk Agarose dengan larutan TBE yang diaduk dengan magnetic
stirrer dan dipanaskan pada suhu 150°C sampai homogen. Selanjutnya
ditambahkan Etidium bromida sebanyak 10 μl. Agarose dituang dalam cetakan
yang berlubang. Gel Agarose diletakkan pada alat elektroforesis sampai gel terendam. Sekuen DNA sebanyak 3
μl ditambahkan dengan Loading Dye 50 mM EDTA, 30 gliserol, 0,25 bromophenol biru, dan 0,25 xylene cyanol
sebanyak 3 μl kemudian dimasukkan ke dalam lubang cetakan gel dengan
mikrotipe.elektroforesis berlangsung selama 30 menit pada tegangan 100 volt dan suhu ruang. Selanjutnya, gel Agarose diamati di atas lampu ultraviolet dan
didokumentasikan dengan kamera polaroid khusus Nugroho et al., 1997..
6
2.3.4 Karakter Morfometrik
Pengukuran karakter morfometrik dilakukan pada 10 sampel ikan untuk masing-masing populasi meliputi pengukuran titik-titik tanda yang dibuat pada
kerangka tubuh Gambar 1 dan Tabel 2 modifikasi berdasarkan Blezinsky dan Doyle 1988.
Gambar 1 Titik-titik Karakter Morfometrik Tabel 2. Deskripsi 21 karakter morfologi yang diukur untuk analisis
Variabilitas intraspesifik
Bidang Karakter No
Kode Deskripsi Jarak Kepala
1 A1
Atas mulut-atas mata 2
A2 Atas mata-awal sirip punggung
3 A3
Atas mulut-operkulum
4 A4
Atas mulut-awal sirip punggung 5
A5 Operkulum-atas
mata 6
A6 Operkulum-awal
sirip punggung
7 A7
Operkulum-Awal sirip perut 8
A8 Awal sirip punggung-awal sirip perut
Badan 9 B1
Operkulum-akhir sirip
punggung 10
B2 Awal sirip punggung-akhir sirip punggung
11 B3
Awal sirip perut-awal sirip anal 12
B4 Awal sirip perut-akhir sirip punggung
13 B5
Awal sirip anal-akhir sirip punggung 14
B6 Akhir sirip perut-akhir sirip anal
15 B7
Awal sirip anal-akhir sirip anal Ekor
16 C1
Akhir sirip anal-pangkal sirip ekor bawah 17
C2 Pangkal sirip ekor atas-pangkal sirip ekor bawah
18 C3
Akhir sirip punggung-pangkal sirip ekor atas 19
C4 Pangkal sirip ekor atas-akhir sirip anal
20 C5
Akhir sirip punggung-pangkal sirip ekor bawah 21
C6 Akhir sirip punggung-akhir sirip anal
A1 A2
A3 A4
A5 A6
A7 A8
B2
B3 B1
B4 B5 B6
B7 C1
C2 C3
C4 C5
C6
7
2.3.5 Analisis Data