Amplifikasi DNA dengan teknik PCR Polymerase Chain Reaction Elektroforesis Karakter Morfometrik

5

2.3.2 Amplifikasi DNA dengan teknik PCR Polymerase Chain Reaction

Amplifikasi PCR dilakukan dengan cara 1 unit dry taq produk Promega ditambahkan dengan 1,5 μl DNA dan 2 μl primer. Primer yang digunakan adalah OPA 2, OPC 2, dan OPC 5. Selanjutnya ditambahkan akuades hingga total volume menjadi 25 μl. Setelah itu dimasukkan ke mesin PCR dengan 35 siklus, yaitu pre denaturasi pada 94ºC selama 2 menit, denaturasi pada suhu 94 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 36 ºC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72 ºC selama 2,5 menit, elongasi akhir pada suhu 72 ºC selama 7 menit, dan proses penstabilan pada suhu 4 ºC selama 3 menit Nugroho et al., 1997.. Tabel 1. Deskripsi primer yang digunakan pada analisis RAPD ikan tambakan Primer Urutan Basa 5’-3’ OPA 2 TGCCGAGCTG OPC 2 GTGAGGCGTC OPC 5 GATGACCGCCC

2.3.3 Elektroforesis

Gel agarose dibuat terlebih dahulu dengan konsentrasi 2 dengan mencampurkan bubuk Agarose dengan larutan TBE yang diaduk dengan magnetic stirrer dan dipanaskan pada suhu 150°C sampai homogen. Selanjutnya ditambahkan Etidium bromida sebanyak 10 μl. Agarose dituang dalam cetakan yang berlubang. Gel Agarose diletakkan pada alat elektroforesis sampai gel terendam. Sekuen DNA sebanyak 3 μl ditambahkan dengan Loading Dye 50 mM EDTA, 30 gliserol, 0,25 bromophenol biru, dan 0,25 xylene cyanol sebanyak 3 μl kemudian dimasukkan ke dalam lubang cetakan gel dengan mikrotipe.elektroforesis berlangsung selama 30 menit pada tegangan 100 volt dan suhu ruang. Selanjutnya, gel Agarose diamati di atas lampu ultraviolet dan didokumentasikan dengan kamera polaroid khusus Nugroho et al., 1997.. 6

2.3.4 Karakter Morfometrik

Pengukuran karakter morfometrik dilakukan pada 10 sampel ikan untuk masing-masing populasi meliputi pengukuran titik-titik tanda yang dibuat pada kerangka tubuh Gambar 1 dan Tabel 2 modifikasi berdasarkan Blezinsky dan Doyle 1988. Gambar 1 Titik-titik Karakter Morfometrik Tabel 2. Deskripsi 21 karakter morfologi yang diukur untuk analisis Variabilitas intraspesifik Bidang Karakter No Kode Deskripsi Jarak Kepala 1 A1 Atas mulut-atas mata 2 A2 Atas mata-awal sirip punggung 3 A3 Atas mulut-operkulum 4 A4 Atas mulut-awal sirip punggung 5 A5 Operkulum-atas mata 6 A6 Operkulum-awal sirip punggung 7 A7 Operkulum-Awal sirip perut 8 A8 Awal sirip punggung-awal sirip perut Badan 9 B1 Operkulum-akhir sirip punggung 10 B2 Awal sirip punggung-akhir sirip punggung 11 B3 Awal sirip perut-awal sirip anal 12 B4 Awal sirip perut-akhir sirip punggung 13 B5 Awal sirip anal-akhir sirip punggung 14 B6 Akhir sirip perut-akhir sirip anal 15 B7 Awal sirip anal-akhir sirip anal Ekor 16 C1 Akhir sirip anal-pangkal sirip ekor bawah 17 C2 Pangkal sirip ekor atas-pangkal sirip ekor bawah 18 C3 Akhir sirip punggung-pangkal sirip ekor atas 19 C4 Pangkal sirip ekor atas-akhir sirip anal 20 C5 Akhir sirip punggung-pangkal sirip ekor bawah 21 C6 Akhir sirip punggung-akhir sirip anal A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 B2 B3 B1 B4 B5 B6 B7 C1 C2 C3 C4 C5 C6 7

2.3.5 Analisis Data