Keragaman Bakteri Endofit Tanaman Kunyit Putih (Curcuma zedoaria) dan Toksisitasnya terhadap Embrio Ikan Zebra

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Endofit merupakan mikrob yang mengolonisasi bagian dalam tanaman terutama daun, batang, akar dan dapat tinggal untuk seluruh atau sebagian dari siklus hidupnya tanpa menyebabkan kerusakan atau penyakit bagi inangnya. Ratusan spesies mikrob endofit dapat diisolasi dari satu jenis tanaman, dan sedikitnya satu spesies dapat menunjukkan karakteristik dari tanaman inangnya (Tan dan Zou 2001). Kondisi lingkungan tempat tumbuh tanaman inang, jenis tanaman, dan umur tanaman akan berpengaruh terhadap populasi dan profil dari mikrob endofit di dalamnya (Tan dan Zou 2001; Mano dan Morisaki 2008, Jalgaonwala dan Mahajan 2011), dan umumnya tanaman dengan sejarah etnobotani tinggi memiliki prospek keragaman mikrob endofit yang tinggi pula.

Zingiberaceae merupakan famili penting dari kelompok tanaman obat dan aromatik. Banyak senyawa aktif telah terdeteksi dalam spesies Zingiberaceae, diantaranya flavonoid, turmerin, seskuiterpen, steroid dan minyak atsiri (Joy et al. 1998). Beberapa genus penting dalam famili ini adalah Curcuma, Kaempferia, Hedychium, Amomum, Zingiber, Alpinia, Elettaria, Costus, dan masing-masing memiliki senyawa yang berbeda yang dapat dimanfaatkan dalam industri kesehatan. Curcuma zedoaria yang dikenal sebagai kunyit putih paling menarik untuk dikaji keragaman dan manfaat mikrob endofitnya dikarenakan secara tradisional tanaman ini dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai obat herbal untuk mengobati penyakit yang berhubungan dengan kanker (Dalimartha 2003).

Beberapa studi ilmiah menunjukkan bahwa rimpang kunyit putih memiliki efek farmakologis, diantaranya antikanker (Muthu-Kumar et al. 2012), antibakteri (Banisalam et al. 2011), antifungi (Shinobu-Mesquita et al. 2011), antioksidan (Riaz et al. 2011; Dhal et al. 2012), dan antitirosin (Narayanaswamy et al. 2011).

Fraksi polisakarida kunyit putih mampu mengurangi ukuran tumor sarkoma 180 pada tikus, mencegah mutasi kromosom, dan diduga mampu berperan sebagai biological response modifier melalui stimulasi aktivitas makrofag (Kim et al. 2001). Hasil penelitian Hartati et al. (2003) dan Lakshmi et al. (2011) juga menunjukkan bahwa minyak atsiri yang dihasilkan oleh rimpang kunyit putih mampu mendorong apoptosis serta menghambat proliferasi sel hati manusia dan sel-sel kanker servik. Senyawa bioaktif yang terkandung dalam kunyit putih diduga erat kaitannya dengan keberadaan mikrob endofit dalam tanaman tersebut. Keragaman mikrob endofit dari tanaman kunyit putih sangat memungkinkan untuk diteemukan berbagai macam senyawa kimia baru yang berpotensi besar sebagai bahan baku obat.

Penelitian yang mempelajari potensi mikrob endofit dalam menghasilkan senyawa bioaktif telah dilakukan. Senyawa bioaktif yang dihasilkan diantaranya senyawa antikanker, antimikrob, antioksidan, antiinflamasi, dan senyawa kimia lainnya yang bermanfaat dalam bidang kesehatan (Tan dan Zou 2001; Strobel dan Daisy 2003). Pseudomonas, Bacillus dan Burkholderia adalah genus bakteri endofit yang paling sering terisolasi dan berpotensi sebagai penghasil senyawa bioaktif. Taxomyces andreanae yang diisolasi dari tanaman Taxus brevifolia mampu menghasilkan senyawa antikanker taxol (Ryan et al. 2007), Bacillus

amyloliquefaciens dari Ophiopogon japonicus menunjukkan aktivitas antitumor (Chen et al. 2013). Pseudomonas Syringae menghasilkan senyawa antifungi yang mampu menghambat pertumbuhan C. albicans dan Cryptococcus neoformans (Harrison et al. 1991) serta Bacillus sp. (BF1-2 dan BF3-5) dari Platycodon grandiflorum memiliki aktivitas antimikrob dalam melawan mikrob patogen manusia. Mikrob endofit yang diisolasi dari rimpang C. zeodaria mampu menghasilkan senyawa antimikrob (Srikandace et al. 2007), dan menurut Pujiyanto et al. (2012) bahwa aktinomisetes dari rimpang Curcuma aeruginosa memiliki aktivitas penghambatan terhadap α-glukosidase.

Pemanfaatan sumber daya alam terutama mikrob yang mampu menghasilkan obat kanker baru perlu dilakukan untuk mengatasi permasalahan harga obat antikanker yang relatif mahal, kombinasi obat yang sering digunakan, serta kebutuhan senyawa antikanker yang semakin meningkat. Beberapa hasil penelitian senyawa antikanker dari bahan alami terutama tanaman dan mikrob endofit mampu memberikan hasil yang menjanjikan dalam pengembangan senyawa-senyawa antikanker baru. Banyak sistem dan model yang telah digunakan dalam rangka pengembangan obat-obatan jenis baru. Salah satu model organisme yang dapat digunakan adalah penggunaan embrio ikan zebra (Truong et al. 2013). Pengukuran viabilitas dan proliferasi sel merupakan salah satu dasar untuk mengetahui respon uji in vitro dan in vivo dari faktor eksternal.

Keragaman bakteri endofit pada tanaman obat diketahui sangat tinggi dan sebagian besar studi hanya mengkaji tentang kemampuan bakteri endofit dalam menghasilkan senyawa bioaktif. Berkaitan dengan manfaat kunyit putih sebagai obat, studi yang mempelajari tentang keragaman dan potensi bakteri endofit dalam menghasilkan senyawa yang berpotensi sebagai obat antikanker dari tanaman kunyit putih di Indonesia belum dilakukan. Oleh sebab itu eksplorasi keragaman dan potensi bakteri endofit dari tanaman kunyit putih perlu dipelajari dan diharapkan keragaman bakteri endofit yang tinggi dapat memberikan peluang untuk ditemukannya spesies langka dan spesies baru yang mampu menghasilkan senyawa aktif untuk kandidat obat baru.

Perumusan Masalah

1. Setiap tanaman mengandung bakteri endofit yang mampu mengolonisasi jaringan tanaman pada periode tertentu.

2. Tanaman yang digunakan sebagai obat tradisional dengan sejarah etnobotani tinggi memiliki keragaman bakteri endofit yang tinggi pula.

3. Bakteri endofit asal tanaman obat berpeluang sebagai novel spesies antimikrob yang dapat dimanfaatkan dalam bidang kesehatan.

4. Sejumlah bakteri endofit berhasil diisolasi dari bagian akar, batang, dan daun tanaman kunyit putih asal Bojong Gede, Cibinong dan Dramaga.

5. Penelitian mengenai keragaman bakteri endofit asal tanaman kunyit putih (C. zedoaria) dan potensinya sebagai penghasil senyawa toksik yang diduga sebagai kandidat obat belum dilakukan.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji keragaman bakteri endofit yang terdapat pada tanaman kunyit putih dan mengetahui kemampuannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat dimanfaatkan sebagai kandidat obat.

Manfaat Penelitian

Luaran yang diharapkan dari penelitian ini yaitu tersedianya isolat bakteri endofit penghasil senyawa bioaktif yang dapat dijadikan sebagai kandidat obat yang akan memberikan kontribusi bagi pengembangan penelitian dalam bidang kesehatan.

Hipotesis Penelitian

Terdapat banyak spesies bakteri endofit yang berbeda yang berasosiasi dengan tanaman kunyit putih dan bakteri endofit dari tanaman kunyit putih diduga berpotensi sebagai penghasil senyawa bioaktif kandidat obat.

Ruang Lingkup Penelitian

Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi isolasi bakteri endofit, seleksi berdasarkan karakteristik morfologi, identifikasi berdasarkan sekuen 16S rDNA, serta analisis kemampuannya dalam menghasilkan senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai kandidat obat melalui uji pendahuluan uji toksisitas menggunakan embrio ikan zebra. Karakteristik morfologi yang diamati antara lain warna, tepian, permukaan dan penentuan sifat Gram menggunakan uji KOH, sedangkan analisis 16S rDNA meliputi ekstraksi DNA, amplifikasi dan konstruksi pohon filogenetik.

2 TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Endofit

Bakteri endofit dikategorikan sebagai mikrob yang banyak manfaatnya terutama dalam bidang pertanian dan kesehatan. Bakteri endofit mempunyai arti ekonomi yang sangat berharga dalam bidang kesehatan dikarenakan beberapa spesies endofit memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa bioaktif. Beberapa penelitian dalam bidang kesehatan menunjukkan bahwa bakteri endofit mampu menghasilkan berbagai jenis senyawa bioaktif seperti antikanker, antioksidan, antibiotik, dan anti inflamasi (Strobel dan Daisy 2003; Ryan et al. 2007; Pimentel et al. 2011). Bakteri endofit penghasil senyawa fitokimia biasanya berhubungan dengan karakteristik fitokimia dari tanaman inangnya (Tan dan Zou 2001). Hal ini kemungkinan diakibatkan oleh adanya transfer genetik antara tanaman dan endofit dan diperkirakan bahwa efek menguntungkan atau merugikan merupakan kombinasi dari aktivitas mikrob dengan tanaman. Bakteri

endofit penghasil senyawa bioaktif yang bermanfaat dalam bidang kesehatan sangat beragam. Keragaman bakteri tersebut sebagian besar diisolasi dari tanaman obat, walaupun beberapa diisolasi dari tanaman non-obat. Senyawa bioaktif yang dihasilkan diantaranya bermanfaat sebagai antimikrob, antidiabetes, dan antitumor (Tabel 1).

Ratusan spesies bakteri endofit dapat diisolasi dari satu jenis tanaman, dan sedikitnya satu spesies tersebut menunjukkan karakteristik dari tanaman inangnya (Tan dan Zou 2001). Tanaman obat dengan sejarah etnobotani tinggi memiliki peluang ditemukannya spesies mikrob endofit yang membawa karakteristik tanaman inangnya. Penggunaan mikrob endofit spesifik dari bagian tanaman tertentu diperkirakan mampu mengurangi pemakaian bagian tanaman dalam jumlah yang sangat banyak. Hal ini lebih efisien dan diharapkan mampu menghasilkan sejumlah senyawa bioaktif yang sama dengan tanaman inangnya tanpa harus mengekstrak dari tanamannya.

Tabel 1 Beberapa bakteri endofit yang bermanfaat dalam bidang kesehatan

Bakteri Tanaman Senyawa yang

dihasilkan Referensi Pseudomonas syringe Antifungi pseudomycin

Harrison et al. 1991 Streptomyces spp.

strain NRRL 30562

Kennedia nigriscans

Munumbicin Castillo et al. 2002 Streptomyces spp.

strain NRRL 30566

Grevillea pteridifolia

Antibiotik

kakadumycin A dan echinomycin

Castillo et al. 2003

Streptomyces ssp. Monstera sp. Antibiotik coronamycin

Ezra et al. 2004 Pseudomonas

viridiflava

Rumput Ecomycin Radji 2005

Pseudomassaria sp. Tanaman hutan lindung

Antidiabetes Radji 2005 Mikrob endofit C. zedoaria Senyawa

Antimikrob

Srikandace et al. 2007

Paenibacillus polymyxa

Stemona japonica

Antioksidan Fengxia et al. 2007 Paenibacillus

polymyxa

Canola Antifungi fusaricidin A-D

Ryan et al. 2007 Bacillus pumilus Cassava Antifungi

pumilacidin

Melo et al. 2009 Bacillus sp. Platycodon

grandiflorum

Antimikrob Jalgaonwala dan Mahajan 2011 Serratia marcescens Rhyncholacis

penicillata

Antifungioocydin Jalgaonwala dan Mahajan 2011 Bacillus subtilis Mulbery Antimikrob Qiong-Ying et al.

2012 Aktinomisetes Curcuma

aeruginosa

mampu menghambat

α-glukosidase

Pujiyanto et al. 2012 Bacillus

amyloliquefaciens

Ophiopogon japonicas

Keragaman Mikroba Endofit pada Famili Zingiberaceae

Famili Zingiberaceae merupakan kelompok penting dari tanaman obat dan aromatik yang disebabkan oleh kandungan minyak atsiri dan oleoresin. Beberapa genus yang penting dari famili ini adalah Curcuma, Kaempferia, Hedychium, Amomum, Zingiber, Alpinia, Elettaria, Costus dan masing-masing memiliki senyawa aktif yang bervariasi yang dapat dimanfaatkan dalam bidang kesehatan. Manfaat yang beragam ini diduga karena adanya interaksi antara tanaman dan endofit yang dikontrol oleh gen dari kedua organisme dan diatur oleh lingkungan. Banyak mikrob endofit yang berhasil diisolasi dari famili Zingiberaceae dan mampu menghasilkan senyawa aktif yang dapat dimanfaatkan dalam bidang kesehatan. Mikrob endofit yang berhasil diisolasi antara lain Streptomyces aureofaciens dari CMUAc130 dari Zingiber officinale (Taechowisan dan Lumyong 2003). Streptomyces sp. Tc052 dari Alpinia galanga (Taechowisan et al. 2008), Pyricularia kookicola, Pyricularia longispora dan Pyricularia variabilis dari Alpinia malaccensis dan Amomum siamense (Bussaban et al. 2001), Colletotrichum "gloeosporioides" (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz., Glomerella spp., Phomopsis spp., Gaeumannomyces amomi, Leiosphaerella amomi, dan Pyricularia telah diisolasi dari Amomum siamense (Lumyong et al. 2003). Cylindrocephalum sp. dari Alpinia calcarata (haw.) Roscoe (Sunitha et al. 2012).

Kunyit Putih (C. zedoaria) Tanaman Kunyit Putih

Kunyit putih secara ilmiah memiliki nama latin C. zedoaria dan nama daerah antara lain kunyit putih, kunir putih, temu bayangan, temu poh (Jawa), temu pao (Madura), temu mangga, temu putih (Melayu), koneng joho, koneng lalap, koneng pare (Sunda). Secara ilmiah kunyit putih diklasifikasikan sebagai berikut:

kingdom : Plantae divisi : Angiosperma subdivisi : Monocots

kelas : Commelinids ordo : Zingiberales famili : Zingiberacea genus : Curcuma species : C. zedoaria Gambar 1 Tanaman kunyit putih

Tanaman kunyit putih sering dianggap sebagai kunyit mangga, akan tetapi yang dipercaya mampu membunuh sel-sel kanker adalah kunyit putih. Tanaman kunyit putih secara tradisional sering digunakan sebagai bumbu masak dan tanaman obat di banyak negara, terutama di negara-negara bagian Asia Tenggara (Maua et al. 2003; Wilson et al. 2005). Tanaman ini dapat ditemukan tumbuh liar pada kondisi iklim di daerah tropik seperti Asia Tenggara. Asal usul kunyit putih

tidak diketahui dengan pasti, tetapi diduga dari India bagian barat laut, dan di Indonesia banyak ditemukan di daerah Jawa Barat, Jawa Tengah, Sumatera, Ambon, hingga Irian. Kunyit putih ini lebih menyukai daerah-daerah dengan curah hujan musiman 900-1250 mm dengan musim kering yang pasti, dan ditemukan pada tempat-tempat basah yang rindang dengan ketinggian mencapai 1000 m dpl, dapat tumbuh pada semua macam tipe tanah, tetapi lebih menyukai tanah berpasir dengan drainase yang bagus. Tanaman tahunan ini tingginya dapat mencapai 2 m dengan batang semu yang dibentuk dari pelepah-pelepah daun yang tumbuh dari rimpang. Daun tunggal, bertangkai panjang, helaian daun berbentuk runcing dengan tepian rata, pertulangan menyirip, warna hijau dengan sisik kiri-kanan, ibu tulang daun terdapat semacam pita memanjang berwarna merah gelap atau lembayaung, panjang 25-70 cm, lebar 8-15 cm (Gambar 1) (Joy et al. 1998; Dalimartha 2003).

Rimpang utama berdaging berbentuk membulat telur lebar dengan cabang-cabang rimpang berbentuk memanjang, berukuran lebih kecil, dan tumbuh ke arah samping. Bagian rimpang keluar akar-akar yang kaku dan pada ujungnya terdapat kantong air. Rimpang berwarna kuning pucat sampai putih dengan hati yang berwarna kuning muda. Buah berbentuk bundar, berserat, segitiga, serta kulit lunak dan tipis. Biji berbentuk lonjong, berselaput, dengan ujung bewarna putih (Joy et al. 1998; Dalimartha 2003).

Khasiat Kunyit Putih

Tanaman kunyit putih memiliki banyak manfaat di masyarakat. Seluruh bagian tanaman dapat dimanfaatkan mulai dari daun, bunga, rimpang muda, dan rimpang tua, akan tetapi bagian tanaman yang paling banyak dimanfaatkan adalah rimpang tua. Daun kunyit putih dimanfaatkan dalam pembuatan minyak wangi di India dan Indonesia.

Rimpang kunyit putih dalam pengobatan tradisional lebih cocok untuk mengobati penyakit yang terkait dengan kanker. Beberapa penyakit yang bisa diobati dengan tanaman ini adalah kanker mulut rahim, kista rahim, nyeri haid, tumor rahim, perangsang, pembersih, obat luka bernanah, obat kulit, obat sakit perut, melancarkan peredaran darah, masalah pernafasan, salesma, dan terutama digunakan setelah melahirkan (Dalimartha 2003; Chen et al. 2008). Pemanfaatan kunyit putih secara tradisional untuk pengobatan kanker dilakukan dengan meminum air perasan atau rebusan rimpang kunyit putih yang direbus dengan beberapa tanaman obat lain seperti daun dewa, herba baru cina segar, rumput mutiara segar, sambiloto kering dan biji jali (Dalimartha 2003).

Senyawa Kimia Rimpang Kunyit Putih

Rimpang kunyit putih mengandung minyak atsiri dengan komposisi α -pinene, d-camphene, cineole, d-camphor, sesquiterpen, dan sesquiterpene alkohol. Kelompok sesquiterpen yang berhasil diisolasi adalah curzerenone (zedoarin), epicurzerenon, isofuranogermerene, curcumadiol, curcumol, curcumenol, isocurcumenol, procurcumenol, dehydrocurdion, germacrone-4,5-epoxid, germacrone, germacrone furanodienon, curcumenon, pyrocurcuzerenon, curcumin, epicurcumenol, isofuranodienon, furanodien, zederon, dan curdion (Joy et al. 1998; Dalimartha 2003). Flavonoid, sulfur, gum, resin, tepung, dan sedikit lemak juga ditemukan pada rimpang kunyit putih (Dalimartha 2003). Kelompok

sesquiterpen pada kunyit putih yang berkhasiat sebagai antikanker adalah curcumol, curdion (Dalimartha 2003), dan isocurcumenol (Lakshmi et al. 2011).

Beberapa penelitian menyatakan bahwa rimpang kunyit putih memiliki efek farmakologis diantaranya memiliki aktivitas analgesik pada tikus albino (Ali et al. 2004), antikanker (Muthu-Kumar et al. 2012), aktivitas insektisida (Hewage et al. 1997), antibakteri (Banisalam et al. 2011), antifungi (Shinobu-Mesquita et al. 2011), antioksidan (Dhal et al. 2012; Muthu-Kumar et al. 2012), antitirosin (Narayanaswamy et al. 2011), antihiperglikemi (Rahmatullah et al. 2012), antiinflamasi (Kaushik dan Jalalpure 2011),dan antihiperlipidemi (Srividya et al. 2012). Beberapa senyawa bioaktif yang telah diisolasi dari C. zedoaria seperti kurkumin mampu menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap sel kanker ovarium (Ovcar-3).

Bioassay Senyawa Aktif

Banyak sistem bioassay yang telah diketahui dan digunakan untuk mengkaji penemuan kandidat obat baru. Berdasarkan mekanisme patologi, dapat dilakukan secara in vitro dan in vivo. Embrio ikan zebra (Danio rerio) merupakan salah satu model yang secara in vivo dapat digunakan untuk skrining awal toksisitas dari suatu senyawa. Embrio ikan zebra tidak hanya digunakan sebagai model pengembangan, tetapi juga sebagai alat untuk mempelajari berbagai penyakit manusia termasuk kanker (Truong et al. 2013). Assay menggunakan embrio ikan zebra memiliki beberapa kelebihan yaitu pembuahan terjadi secara eksternal, mudah dirawat, telur yang transparan sehingga perkembangan embrionya mudah diamati, permeabel terhadap molekul yang kecil, pematangan embrio yang cepat, homologi dengan perkembangan mamalia, dan urutan genom yang hampir lengkap (Seabra dan Bhogal 2010) (Gambar 2).

Ikan zebra adalah vertebrata yang memiliki kekerabatan lebih dekat dengan manusia daripada yang umum digunakan di laboratorium. Ikan zebra populer di sebagian besar laboratorium biologi sebagai organisme model yang potensial untuk uji toksisitas, teratogenisitas, embriotoksisitas yang dapat dilakukan secara cepat dan efisien. Ikan ini dapat dijadikan model dengan mengkombinasikan assay biokimia, seluler, dan molekuler melalui pengamatan struktur dan fungsi-fungsi tertentu dalam suatu individu (de Esch et al. 2012). Ikan zebra muncul sebagai model yang ideal untuk skrining senyawa kandidat obat dengan toksisitas rendah (Scholz 2013). Hasil uji toksisitas pada embrio ikan zebra telah terbukti memiliki korelasi positif dengan hasil uji toksisitas pada mamalia (Ma et al. 2007). Pengujian senyawa antikanker (Jianhong et al. 2013) dan hiperglikemia (Eunji et al. 2012) telah dilakukan secara in vivo pada embrio ikan zebra.

Gambar 2 Tahap perkembangan ikan zebra (A) embrio dan (B) dewasa

3 METODE

Kerangka Penelitian

Kerangka penelitian meliputi isolasi bakteri endofit, identifikasi bakteri endofit terseleksi berdasarkan sekuen 16S rDNA, uji antimikrob bakteri teridentifikasi serta uji toksisitas bakteri endofit terpilih menggunakan embrio ikan zebra (Gambar 3).

Gambar 3 Diagram alur penelitian

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2012 sampai April 2014 di Laboratorium Biosistematika dan Kultur Koleksi Mikrob, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kunyit putih (C. zedoaria), media Nutrient Agar (NA), media Water Yeast Extract Agar

Isolasi Bakteri Endofit

Seleksi Bakteri Endofit Berdasar Karakteristik Morfologi Koloni

Uji Potensi Bakteri Endofit Terpilih dalam Menghasilkan Senyawa Toksik Menggunakan

Embrio Ikan Zebra Identifikasi Bakteri Endofit Berdasar Analisis 16S rDNA

Isolat Bakteri Endofit Teridentifikasi

Uji Aktivitas Antimikrob Bakteri Endofit Teridentifikasi

(WYEA) (Lampiran 1), media Nutrient Broth (NB), media Potato Dextrose Agar (PDA), media Potato Dextrose Broth (PDB), etanol 70%, larutan natrium hipoklorit, Gotaq Green Master Mix, bahan-bahan PCR, dan embrio ikan zebra. Alat-alat yang digunakan antara lain inkubator, micropippet, mesin PCR, alat elektroforesis, UV transilluminator, spektrofotometer, sentrifugasi, evaporator, mikroskop, plate multiwell, serta alat-alat gelas.

Sampel Tanaman

Tanaman kunyit putih (C. zedoaria) diambil dari tiga lokasi yang berbeda. Sampel tanaman diambil dari kebun pribadi di Bojong Gede (BG), kebun percobaan Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, (CBN), dan kebun koleksi tanaman obat, Pusat Penelitian Biofarmaka, IPB, Dramaga (DRMG) (Tabel 2). Masing-masing sampel diambil tiga tanaman. Sampel tanaman diambil pada bulan November 2012–April 2013. Tanaman yang diambil adalah tanaman sehat bebas kontaminasi patogen tanaman. Sampel selanjutnya dibawa ke laboratorium dan dalam waktu 24 jam sampel sudah diisolasi. Sampel tanaman diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI. Identifikasi dilakukan berdasarkan karakteristik morfologi dengan mengacu pada buku identifikasi tanaman ‘Flora of Java’ (Backer dan van den Brink 1968) dan membandingkan dengan spesimen herbarium yang terdapat di Herbarium Bogoriense.

Tabel 2 Lokasi sampel tanaman kunyit putih (C. zedoaria)

Asal tanaman Lokasi tanaman Umur tanaman Bagian tanaman Balitro Bojong Gede 11 bulan Seluruh bagian Rimbo Panti, Padang LIPI Cibinong 8 bulan Seluruh bagian Cimas, Sukabumi IPB Dramaga 12 bulan Seluruh bagian

Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit Putih Sterilisasi Permukaan Jaringan Tanaman Kunyit Putih

Sampel tanaman (rimpang, batang, dan daun) dibersihkan dari kotoran dengan cara dicuci dengan air mengalir selama 5–10 menit. Tanaman dipotong-potong dan direndam dalam larutan etanol 70% selama 3 menit. Potongan tanaman direndam kembali dengan larutan natrium hipoklorit 3% selama 5 menit, dibilas dengan etanol 70% selama 30 detik, dan dilanjutkan dengan akuades steril selama 2 menit. Pencucian dengan akuades steril diulang selama tiga kali. Potongan sampel kemudian dikeringkan menggunakan kertas tisu steril. Efisiensi sterilisasi permukaan diuji dengan menyebar 100 µL akuades hasil pencucian terakhir pada beberapa jenis media yang sudah ditambah sikloheksamida 50 µg/mL untuk menghambat pertumbuhan cendawan. Media yang digunakan adalah NA, NA dengan 2% ekstrak tanaman kunyit putih (NAT), WYEA, WYEA dengan 2% ekstrak tanaman kunyit putih (WYEAT). Akuades hasil pencucian yang menunjukkan adanya pertumbuhan mikrob tidak dapat digunakan sebagai sampel isolasi bakteri endofit.

Isolasi Bakteri Endofit

Isolasi bakteri endofit dilakukan dengan metode plant piece untuk potongan sampel dan metode spread plate untuk sampel yang dihaluskan. Sampel yang telah steril, bagian rimpang, batang dan daun dipotong menjadi potongan-potongan kecil (4–6 mm). Sampel kemudian diletakkan di atas media yang telah ditambah sikloheksamida 50 µg/mL. Cawan Petri selanjutnya diinkubasi selama 2–15 hari pada suhu 28 oC (Araujo et al. 2002). Isolasi menggunakan metode spread plate dilakukan dengan sampel dihaluskan terlebih dahulu menggunakan mortar steril. Sebanyak 1 g sampel yang sudah dihaluskan dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 mL akuades steril, kemudian dilakukan pengenceran secara berseri. Sebanyak 100 µL dari pengenceran 10-1 dan 10-2 disebar di atas permukaan media. Media selanjutnya diinkubasi selama 2–15 hari pada suhu 28 o

C. Koloni bakteri yang tumbuh dari metode spread plate dihitung dan data populasi ditransformasikan dalam nilai log (CFU per gram sampel). Bakteri yang tumbuh dari metode spread plate dan plant piece diisolasi dan dipurifikasi. Selanjutnya bakteri endofit yang memiliki karakteristik morfologi berbeda dipilih untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Karakteristik morfologi yang diamati adalah warna, tepian, permukaan dan juga penentuan sifat Gram menggunakan uji KOH. Interpretasi uji KOH yaitu bakteri merupakan Gram negatif apabila campuran sel dengan larutan KOH 3% berubah menjadi kental dan berlendir, Gram positif apabila campuran sel dan larutan KOH 3% tidak berubah menjadi kental dan berlendir setelah satu menit (Powers 1995).

Pemurnian Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit Putih

Koloni bakteri yang telah tumbuh dimurnikan pada media NA dengan digores berdasarkan metode kuadran. Pemurnian dilakukan beberapa kali sampai diperoleh koloni tunggal. Koloni yang telah murni selanjutnya ditanam dalam tabung reaksi yang berisi agar miring NA dan disimpan pada suhu 4 oC. Isolat murni selanjutnya dipelihara dengan baik dan digunakan pada uji selanjutnya.

Penyimpanan Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit

Bakteri endofit yang sudah murni disimpan dalam media NA miring. penyimpanan jangka panjang dilakukan dalam bentuk gliserol 10% kemudian disimpan dalam suhu –80 oC.

Identifikasi berdasar sekuen 16S rDNA Isolasi DNA Bakteri Endofit

Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode PCR koloni (Packeiser et al. 2013). Sel dari koloni tunggal pada permukaan media padat diambil menggunakan tusuk gigi steril dan disuspensikan ke dalam 50 µL air bebas nuklease. Lisis sel dilakukan dengan suspensi divortex selama 10 detik dan diinkubasi pada suhu 98 oC selama 5 menit. Lisat selanjutnya di spin down untuk memisahkan supernatan dan debris sel. Supernatan diambil dan digunakan sebagai cetakan DNA pada amplifikasi PCR.

Amplifikasi PCR 16S rDNA

Amplifikasi fragmen 16S rDNA dilakukan menggunakan GoTaq (Promega) dengan primer 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan 1492R (5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) (Palaniappan et al. 2010). Komposisi amplifikasi fragmen 16S rDNA terdiri dari 9.75 µL Ultrapure water, 12.5 µL GoTaq Green Master Mix 2x, 0.625 µL primer 27F (10 µM), 0.625 µL primer 1492R (10 µM), 0.5 µL DMSO, dan 1 µL sampel DNA dengan total volume 25 µL. Amplifikasi dilakukan dengan kondisi PCR: denaturasi awal 95C selama 90 detik, dilanjutkan (95 C, 30 detik denaturasi; 50 oC, 30 detik annealing; 72 oC, 90 detik pemanjangan) selama 30 siklus dan final extension pada 72 oC selama 5 menit, 4 oC selama 20 menit.

Elektroforesis

Sebanyak 3 μl dari produk PCR dianalisis menggunakan gel agarosa 1% dengan aliran listrik bertegangan 100 V selama 25 menit. Setelah selesai, gel direndam dalam larutan ethidium bromide 5 µg/mL selama 30 menit dan dibilas menggunakan bufer TAE 1x. Hasil elektroforesis dilihat menggunakan alat UV transilluminator. DNA dikatakan teramplifikasi apabila pada hasil elektroforesis diperoleh 1 pita tunggal berukuran 1500 pb.

Sekuensing 16S rDNA, Analisis Bioinformatika dan Konstruksi Pohon Filogenetik

Produk PCR disekuensing secara parsial menggunakan primer 27F di Laboratorium Macrogen Korea menggunakan automated DNA sequencer (ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer) (Applied Biosystems). Data hasil sekuensing selanjutnya diolah dengan program Bioedit. Homologi sekuen 16S rDNA dicari menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide (BLASTN) pada website National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Sekuen referensi diperoleh dari bank data DNA NCBI secara online melalui internet www.ncbi.nlm.nih.gov. Konstruksi pohon filogenetik dianalisis dengan metode neighbor-joining (Saitou & Nei 1987) yang terimplementasi dalam program MEGA 5.05 (Tamura et al. 2011) dan nilai bootstrap 1000x.

Bioassay Antimikrob

Persiapan Seed Culture

Mikrob uji yang digunakan adalah B. subtilis InaCCB1, P. aeruginosa InaCCB3, S. aureus InaCCB4, E. coli InaCCB5, C. albicans InaCCY116, dan S. cerevisiae InaCCY728. Seed culture mikrob uji dibuat dengan menginokulasikan 1 ose mikrob uji pada media cair. B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, E. coli diinokulasi pada media NB, sedangkan C. albicans dan S. cerevisiae diinokulasi pada media PDB. Bakteri diinkubasi pada suhu 37 oC

dan yeast diinkubasi pada suhu 30 oC selama 20 jam.

Pembuatan Media Bioassay

Media yang digunakan untuk uji antimikrob adalah media dua lapis terdiri atas 20 mL lapisan bawah dan 4 mL lapisan atas. Bioassay terhadap bakteri menggunakan media NA, dan bioassay terhadap yeast menggunakan media PDA.

Komposisi media lapisan atas sama dengan komposisi media lapisan bawah tetapi dengan konsentrasi bacto agar lapisan atas adalah setengah dari konsentrasi bacto agar lapisan bawah. Seed culture ditumbuhkan pada media NB selama 20 jam. Pada jam ke-20, dilakukan pemeriksaan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm untuk bakteri dan 530 nm untuk yeast. Konsentrasi bakteri dan yeast yang digunakan adalah 106 dan 105 CFU/ml. Setelah diperoleh konsentrasi yang diinginkan, seed culture ditambahkan pada media lapisan atas sebelum media tersebut dituangkan ke permukaaan cawan Petri.

Uji Antimikrob

Uji antimikrob dilakukan berdasarkan metode antagonisme langsung. Bakteri endofit terlebih dahulu ditumbuhkan pada media NA selama 5 hari. Bakteri endofit pada media agar selanjutnya dibuat dalam bentuk lempengan bulat menggunakan sedotan steril. Lempengan kemudian diletakkan di atas permukaan media bioassay. Cawan Petri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk bakteri, dan suhu 30 oC selama 48 jam untuk yeast. Zona hambat yang terbentuk diamati pada jam ke-24 dan 48. Uji antimikrob masing-masing bakteri endofit dilakukan tiga pengulangan. Kriteria kekuatan daya hambat bakteri yang digunakan adalah sangat kuat (zona hambat >20 mm), kuat (zona hambat10–20 mm), sedang (zona bening 5–10 mm), lemah (<5 mm) (Davis dan Stout 1971).

Produksi Filtrat Kultur Bakteri Endofit dan Ekstraksi Senyawa Aktif

Produksi filtrat dilakukan pada empat bakteri endofit terseleksi yaitu bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan lebih dari satu mikrob patogen dan memiliki ukuran daya hambat yang besar (>10 mm). Satu ose penuh biakan bakteri endofit diinokulasikan ke dalam 5 mL media NB dan diinkubasi selama 24 jam. Kultur bakteri yang sudah berumur 24 jam diinokulasikan ke dalam 100 mL media NB dan diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 120 rpm suhu 28 oC selama 5 hari. Kultur kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang diperoleh selanjutnya diekstrak menggunakan pelarut organik etil asetat (Arunachalam dan Gayathri 2010). Etil asetat kemudian dievaporasi menggunakan evaporator suhu 40 oC. Ekstrak kering yang diperoleh ditimbang dan dilarutkan dalam akuades apabila akan digunakan.

Uji Toksisitas Akut Ekstrak Terhadap Embrio Ikan Zebra Uji Toksisitas

Larutan fase ekstrak etil asetat dan fase air dibuat dalam konsentrasi 50, 100, 150, 200, dan 250 ppm. Satu telur embrio ikan zebra dalam 150 µ L air tawar dan 150 µ L ekstrak dimasukkan ke dalam plate multiwell. Satu ulangan dibuat dalam lima sumur dan ulangan dilakukan sebanyak 3 kali. Multiwell ditutup dan diinkubasi selama 72 jam pada suhu ruang (Lampiran 2).

Pengamatan Embrio Ikan Zebra

Embrio ikan zebra yang telah terpapar dengan ekstrak aktif selama 72 jam diamati morfologinya setiap 24 jam inkubasi menggunakan mikroskop stereo.

Bagian organ larva ikan zebra yang diamati meliputi sumbu tubuh, panjang tubuh, pigmentasi, kantong kuning telur, jantung, warna mata, telinga, dan sirkulasi darah (Kumar et al. 2013)

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Identitas Sampel Tanaman Kunyit Putih

Identifikasi sampel tanaman dilakukan untuk mengkonfirmasi kembali kebenaran dari identitas sampel yang digunakan. Karakteristik morfologi yang diamati antara lain warna rimpang, bentuk rimpang, aroma rimpang, bentuk daun, dan warna tulang tengah daun. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa ketiga sampel tanaman tersebut adalah C. zedoaria (Christm.) Roscoe, yang termasuk dalam genus Curcuma dalam famili Zingiberaceae (Tabel 3).

Tabel 3 Hasil identifikasi sampel tanaman kunyit putih di Herbarium Bogoriense

Lokasi sampel Nama koleksi Famili Species

Bojong Gede Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe

LIPI, Cibinong Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe

IPB, Dramaga Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe

Kelimpahan Bakteri Endofit

Isolasi bakteri endofit dilakukan dari tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi tanam yang berbeda berdasarkan metode sterilisasi permukaan. Metode sterilisasi permukaan yang digunakan pada penelitian ini dikatakan berhasil karena tidak ada pertumbuhan mikrob pada cawan Petri kontrol. Hasil isolasi menunjukkan bahwa bakteri endofit ditemukan pada semua bagian tanaman kunyit putih meliputi bagian rimpang, batang dan daun. Keberadaan bakteri endofit ditemukan hampir pada semua bagian tanaman inang termasuk akar, batang, daun, biji, buah, umbi, dan juga dalam nodul tanaman legum (Sturz et al. 1997; Jalgaonwala dan Mahajan 2011). Struktur populasi bakteri endofit pada suatu tanaman dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya adanya rotasi tanaman, kondisi tanah, umur tanaman, musim ketika dilakukan isolasi, jaringan tanaman, dan keberadaan patogen tanaman.

Populasi bakteri endofit berbeda antar lokasi, umur, bagian tanaman (rimpang, batang, daun), dan hal ini juga dipengaruhi oleh jenis media isolasi yang digunakan. Tiga sampel tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi berbeda diisolasi menggunakan empat macam media dan dua jenis metode menunjukkan kelimpahan bakteri endofit yang berbeda. Sampel tanaman dari CBN menunjukkan kelimpahan bakteri 3 log (CFU/g) sampel, sampel dari BG adalah berkisar 2 sampai 3 log (CFU/g) sampel, dan sampel dari DRMG adalah 3 sampai 4 log (CFU/g) sampel (Gambar 4).

Bagian organ larva ikan zebra yang diamati meliputi sumbu tubuh, panjang tubuh, pigmentasi, kantong kuning telur, jantung, warna mata, telinga, dan sirkulasi darah (Kumar et al. 2013)

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Identitas Sampel Tanaman Kunyit Putih

Identifikasi sampel tanaman dilakukan untuk mengkonfirmasi kembali kebenaran dari identitas sampel yang digunakan. Karakteristik morfologi yang diamati antara lain warna rimpang, bentuk rimpang, aroma rimpang, bentuk daun, dan warna tulang tengah daun. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa ketiga sampel tanaman tersebut adalah C. zedoaria (Christm.) Roscoe, yang termasuk dalam genus Curcuma dalam famili Zingiberaceae (Tabel 3).

Tabel 3 Hasil identifikasi sampel tanaman kunyit putih di Herbarium Bogoriense

Lokasi sampel Nama koleksi Famili Species

Bojong Gede Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe

LIPI, Cibinong Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe

IPB, Dramaga Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe

Kelimpahan Bakteri Endofit

Isolasi bakteri endofit dilakukan dari tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi tanam yang berbeda berdasarkan metode sterilisasi permukaan. Metode sterilisasi permukaan yang digunakan pada penelitian ini dikatakan berhasil karena tidak ada pertumbuhan mikrob pada cawan Petri kontrol. Hasil isolasi menunjukkan bahwa bakteri endofit ditemukan pada semua bagian tanaman kunyit putih meliputi bagian rimpang, batang dan daun. Keberadaan bakteri endofit ditemukan hampir pada semua bagian tanaman inang termasuk akar, batang, daun, biji, buah, umbi, dan juga dalam nodul tanaman legum (Sturz et al. 1997; Jalgaonwala dan Mahajan 2011). Struktur populasi bakteri endofit pada suatu tanaman dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya adanya rotasi tanaman, kondisi tanah, umur tanaman, musim ketika dilakukan isolasi, jaringan tanaman, dan keberadaan patogen tanaman.

Populasi bakteri endofit berbeda antar lokasi, umur, bagian tanaman (rimpang, batang, daun), dan hal ini juga dipengaruhi oleh jenis media isolasi yang digunakan. Tiga sampel tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi berbeda diisolasi menggunakan empat macam media dan dua jenis metode menunjukkan kelimpahan bakteri endofit yang berbeda. Sampel tanaman dari CBN menunjukkan kelimpahan bakteri 3 log (CFU/g) sampel, sampel dari BG adalah berkisar 2 sampai 3 log (CFU/g) sampel, dan sampel dari DRMG adalah 3 sampai 4 log (CFU/g) sampel (Gambar 4).

Gambar 4 Populasi bakteri endofit tanaman kunyit putih yang diambil dari tiga lokasi menggunakan metode spread plate

NA adalah media yang lebih cocok untuk isolasi bakteri endofit dibandingkan dengan WYEA. Bakteri endofit yang diisolasi menggunakan media NAT dan WYEAT menunjukkan jumlah populasi bakteri endofit yang lebih rendah dibandingkan dengan media NA dan WYEA dan hal ini juga berpengaruh terhadap jumlah isolat yang diperoleh. Berdasarkan metode isolasi, jumlah bakteri endofit yang diperoleh menggunakan metode spread plate lebih tinggi dibandingkan dengan metode plant piece. Hal ini disebabkan oleh perbedaan pada saat persiapan sampel. Metode spread plate, sampel dihaluskan terlebih dahulu dan disebar di atas permukaan media. Metode ini tampaknya memberikan peluang lebih banyak bagi bakteri endofit untuk tumbuh. Bakteri endofit tumbuh lebih terbatas pada metode plant piece, dikarenakan sampel tanaman dipotong menjadi potongan kecil dan langsung diletakkan di atas permukaan media.

Jumlah populasi tertinggi ditemukan pada sampel yang diambil dari DRMG, dan jumlah populasi bakteri dari masing-masing bagian tanaman berbeda antara rimpang, batang dan daun. Jumlah populasi tertinggi dari ketiga bagian tanaman adalah pada bagian rimpang. Family Zingiberaceae tidak memiliki akar, dan dalam hal ini keberadaan rimpang adalah sama dengan akar. Jumlah populasi mikrob endofit pada hampir semua tanaman, akar menunjukkan angka yang lebih tinggi dibandingkan dengan jaringan lain (Rosenblueth dan Martinez 2006), dan berdasarkan McInroy dan Kloepper (1995) jumlah tertinggi bakteri endofit ditemukan pada akar tanaman yang berkisar 4-6 log (CFU/g) sampel. Akar menunjukkan populasi tertinggi, diikuti daun dan batang, dikarenakan akar merupakan tempat paling awal untuk masuknya segala sesuatu ke dalam tanaman (Dalal dan Kulkarni 2013).

Tanaman obat merupakan salah satu tanaman yang sensitif terhadap lingkungan tumbuh. Lingkungan tumbuh yang tidak sesuai akan mengurangi kualitas maupun kuantitas yang dihasilkan tanaman obat. Hal ini juga berpengaruh terhadap mikrob yang terdapat pada tanaman tersebut. Sampel dari CBN memiliki kelimpahan bakteri endofit paling rendah dikarenakan sampel tanaman pada awalnya merupakan hasil kultur jaringan yang selanjutnya didomestikasi di kebun percobaan Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong (Tabel 4). Lama waktu

aklimatisasi juga berpengaruh terhadap populasi mikroba yang terdapat dalam tanaman. Mikrob tertentu yang mampu menyesuaikan dengan habitat baru yang akan hidup dan berkembang biak. Keragaman tanaman di lingkungan CBN relatif lebih rendah jika dibandingkan dengan kebun di BG dan DRMG. Kebun percobaan CBN lebih banyak didominasi oleh tanaman hortikultura dengan curah hujan yang relatif lebih rendah sekitar 217 mm/tahun dibandingkan DRMG 1000-1500 mm/tahun. Kondisi ini berbeda dengan kebun koleksi tanaman obat Biofarmaka DRMG yang mempunyai diversitas tanaman yang sangat tinggi. Kebun dengan luas lahan sekitar 3,5 ha tersebut memiliki sekitar tiga ratus jenis tanaman obat yang berasal dari berbagai daerah di Indonesia. Hal ini menunjukkan bahwa populasi endofit dipengaruhi oleh beberapa faktor termasuk kondisi lingkungan, lokasi geografis dan aklimatisasi.

Bakteri endofit terseleksi dari lokasi tanam yang berbeda menunjukkan jumlah yang berbeda pula. Sampel yang digunakan memiliki tingkat umur yang berbeda. Tahap reproduksi C. zedoaria adalah 11-12 bulan, sehingga sampel yang digunakan diharapkan berada pada masa reproduksi. Sampel dari DRMG adalah paling tua (12 bulan), diikuti sampel dari BG (11 bulan), dan kemudian sampel dari CBN (8 bulan). Jumlah bakteri endofit akan bervariasi tergantung pada lokasi dan umur tanaman. Usia tanaman dapat mempengaruhi variasi komunitas endofit dalam tanaman gingseng (Vendan et al. 2010). Keragaman mikrob endofit merupakan suatu fungsi dari tahap pematangan yang berbeda untuk setiap tanaman, yang mungkin berpengaruh terhadap jenis dan jumlah eksudat akar yang dihasilkan (Ferreira et al. 2008).

Tabel 4 Jumlah bakteri endofit terisolasi dari tanaman kunyit putih (C. zedoaria) pada media dan metode isolasi yang berbeda

Asal sampel Bagian tanaman

NA NAT WYEA WYEAT

S P S P S P S P

Bojong Gede

Rimpang 6 - 1 3 2 1 1 -

Batang 7 2 2 3 2 2 3 1

Daun 4 4 7 3 4 2 8 2

Cibinong

Rimpang 2 - 3 3 1 1 1 1

Batang 3 5 1 3 4 - 2 2

Daun 5 6 1 6 4 - 3 -

Dramaga

Rimpang 4 4 4 5 5 2 4 2

Batang 5 4 3 4 3 2 4 3

Daun 3 2 2 4 3 2 5 1

39 27 24 34 28 12 31 12

Total 207

Populasi bakteri endofit dipengaruhi oleh fase pertumbuhan tanaman. Kondisi fase reproduksi, populasi mikrob akan mencapai maksimal dibandingkan dengan fase pertumbuhan lainnya. Perbedaan yang signifikan dalam jumlah populasi bakteri ditemukan oleh Kuklinsky-Sobral (2004) dan hal ini dipengaruhi oleh fase pertumbuhan dan jenis jaringan tanaman. Penurunan jumlah populasi endofit dari fase vegetatif ke reproduksi dikarenakan tidak tersedianya nutrisi penting selama pematangan dan penuaan tanaman. Tahap tanaman dewasa, semua nutrisi yang diperlukan oleh bakteri berada dalam kondisi optimum dan akan diperoleh populasi endofit yang stabil (Dalal dan Kulkarni 2013).

Sebanyak 207 isolat bakteri berhasil diisolasi dari tanaman kunyit putih dari tiga lokasi yang berbeda. Berdasarkan karakteristik morfologi sebagian besar isolat bakteri endofit berwarna putih susu, bentuk circular, tepian entire, elevasi raised dan convex, serta permukaan shiny/opaque (Gambar 5 dan Lampiran 3). Isolat selanjutnya dipilih berdasarkan koloni morfologi dan berdasarkan karakteristik morfologi yang berbeda dari masing-masing lokasi sampel diperoleh total 73 isolat terseleksi, yaitu 23 isolat dari BG (32%), 16 isolat dari CBN (22%) dan 34 isolat dari DRMG (46%). Sebanyak 28 isolat dari rimpang (38%), 23 isolat dari batang (32%) dan 22 isolat dari daun (30%) (Gambar 6). Hasil penentuan sifat Gram melalui uji antara bakteri endofit terisolasi dengan larutan KOH 3% (w/v) menunjukkan bahwa terdapat 30 isolat bakteri Gram positif dan 44 isolat bakteri Gram negatif. Hal ini dapat dikatakan bahwa bakteri endofit di tanaman kunyit putih didominasi oleh bakteri Gram negatif.

Gambar 5 Beberapa karakteristik fenotip bakteri endofit terseleksi

Gambar 6 Total bakteri endofit terseleksi dari tiga lokasi tanaman (A); total bakteri endofit terseleksi dari bagian rimpang, batang dan daun (B)

1500 pb

Hasil Analisis Berdasar Sekuen 16S rDNA

Isolat bakteri terpilih selanjutnya diidentifikasi pada tingkat spesies dengan analisis 16S rDNA. Sekuen 16S rDNA merupakan komponen subunit kecil 30S dari ribosom prokariot bakteri dengan panjang 1.542 bp. Sekuen ini bersifat spesifik, conserve antara spesies yang berbeda pada bakteri dan arkea, sangat akurat dan bermanfaat dalam klasifikasi dan identifikasi bakteri, dan dapat digunakan untuk membuat pohon kekerabatan dalam identifikasi bakteri (Xiang 2006; Sun et al. 2008). Amplifikasi sekuen 16S rDNA pada penelitian ini menggunakan primer universal, yaitu primer forward dan reverse (27F dan 1492R), sehingga diperoleh daerah teramplifikasi sebanyak ~ 1500 bp (Gambar 7) (Palaniappan et al. 2010). Identifikasi bakteri endofit berdasar sekuen 16S rDNA dilakukan sekuensing secara parsial menggunakan primer 27F dan diperoleh jumlah basa yang teramplifikasi sekitar 700−1200 pb. Sekuen 16S rDNA bakteri terisolasi yang diperoleh ditentukan dan dicocokkan dengan strain referensi yang terdapat di bank data NCBI dalam rangka memperoleh sekuen yang memiliki kesamaan maksimal, dan hanya hasil sekuen yang bersih yang digunakan dalam identifikasi 16S rDNA. Semua sekuen yang dihasilkan oleh program BLAST

menunjukkan kesamaan yang tinggi (≥ 97%) dengan spesies terdekat. M - 1 2 3 4 5 6 7

M

Gambar 7 Hasil amplifikasi sekuen 16S rDNA ~ 1500 bp (M: marker; -: kontrol negatif; 1−7 : sampel DNA teramplifikasi)

Keragaman Bakteri Endofit asal Bojong Gede (BG)

Sebanyak 23 isolat diperoleh dari sampel yang diambil di BG. Delapan isolat diisolasi dari bagian rimpang, 9 isolat dari batang dan 6 isolat dari daun. Populasi mikrob endofit pada bagian batang adalah lebih tinggi jika dibandingkan dengan bagian daun (Bhore et al. 2010). Jumlah isolat Gram positif (12 dari 23 isolat) yang diperoleh lebih banyak dengan jumlah Gram negatif (11 dari 23 isolat). Hasil analisis seken 16S rDNA seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5, sebanyak 22 isolat menunjukkan kesamaan yang tinggi antara 99% dan 100%, dan satu kandidat spesies baru yaitu isolat BB.S.5. Dua organisme yang memiliki homologi sekuen 16S rDNA kurang dari 97.5%, maka kedua organisme tersebut merupakan spesies yang berbeda (Stackebrandt dan Goebel 1994). Isolat BB.S.5

yang teridentifikasi sebagai Microbacterium hominis dengan homologi 97% merupakan kandidat spesies baru. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat didominasi oleh genus Klebsiella, Microbacterium dan diikuti oleh Pseudomonas. Populasi bakteri endofit terdiri dari genus Pseudomonas (3 isolat), Microbacterium (5 isolat), Bosea (2 isolat), Klebsiella (4 isolat), Bacillus (2 isolat), Agrobacterium, Mycobacterium, Erwinia, Xanthobacter, Enterobacter, Pantoea, dan Cellulomonas (Tabel 5). Isolat bakteri terbagi ke dalam 4 kelompok yaitu -Proteobacteria (10 isolat), Actinobacteria (7 isolat), α-Proteobacteria (4 isolat) dan Firmicutes (2 isolat). Genus Klebsiella ditemukan pada semua bagian tanaman dan kelompok -Proteobacteria diantaranya Pseudomonas, Erwinia, Pantoea, dan Klebsiella tersebar pada semua bagian tanaman.

Tabel 5 Tingkat kesamaan sekuen 16S rDNA dari bakteri endofit tanaman kunyit putih asal Bojong Gede (BG)

Isolat Bagian tanaman

Identitas terdekat dengan referensi bank data NCBI

Nomor asesi

Persen kesamaan DB.S.1 D Pseudomonas stutzeri strain TRA27A JQ782508 99% DB.S.2 D Microbacterium laevaniformans strain G24a KC136835 100% DB.S.3 D Bosea thiooxidans strain RpPl3-VS AJ250798 99% DB.S.4 D Micrococcus yunnanensis strain UAC-84 KC634108 100% DB.P.1 D Klebsiella pneumoniae strain EB55-THQ GQ166865 99% DB.P.2 D Agrobacterium larrymoorei strain EG27 KC122702 100% BB.P.1 B Bacillus pumilus strain BVC9 JQ660592. 100% BB.P.3 B Klebsiella pneumoniae strain SC FJ232952 99% BB.P.4 B Erwinia chrysanthemi strain D4 JF779683 100% BB.S.1 B Microbacterium laevaniformans strain G24a KC136835 99% BB.S.3 B Microbacterium trichothecenolyticum strain

YNA102

JQ039976 99% BB.S.5 B Microbacterium hominis strain B-LS-R2A3 HM629351 97% BB.S.6 B Mycobacterium simiae strain AW27-2 KF028777 99% BB.S.7 B Xanthobacter flavus strain ICS1 JQ995474 100%

BB.S.8 B Enterobacter oryzae JX088114 99%

RB.P.1 R Bacillus subtilis strain KtRA5-91 KF017557 100% RB.P.2 R Klebsiella pneumoniae strain SI-2 KC211309 99% RB.P.3 R Pseudomonas denitrificans strain

ATCC 13867

NR102805 100% RB.P.4 R Pseudomonas stutzeri strain PW1 KF000099 100% RB.S.2 R Pantoea dispersa strain XJ18 KC510017 100% RB.S.3 R Klebsiella variicola strain ALK036 KC456523 100% RB.S.4 R Cellulomonas hominis strain R6-344 JQ659804 99%

RB.S.5 R Bosea thiooxidans FN392632 99%

D: daun; B: batang; R: rimpang

Keragaman Bakteri Endofit asal Cibinong (CBN)

Keragaman bakteri endofit yang diisolasi dari CBN, diperoleh 13 spesies yang berbeda dari 16 isolat terseleksi. Tujuh isolat dari bagian daun, 5 isolat dari rimpang dan 4 isolat dari bagian batang. Keragaman bakteri endofit pada sampel kurang beragam dibandingkan sampel lainnya. Jumlah bakteri Gram negatif (9 dari 16 isolat) lebih banyak daripada bakteri Gram positif (7 isolat). Hasil analisis sekuen 16S rDNA menunjukkan semua isolat memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dengan referensi yaitu 99%-100% (Tabel 6). Genus Bacillus ditemukan

pada semua bagian tanaman, sedangkan Pseudomonas dan Stenotrophomonas hanya ditemukan pada bagian daun dan batang. Populasi bakteri endofit terdiri dari genus Bacillus (3 isolat), Pseudomonas (2 isolat), Enterobacter (2 isolat), Stenotrophomonas (2 isolat), Microbacterium, Methylobacterium, Providencia, Mycobacterium, Phenylobacterium, dan Roseomonas. Empat kelompok bakteri ditemukan dari analisis hubungan kekerabatan bakteri dari tanaman yang diambil dari CBN, diantaranya adalah -Proteobacteria (7 isolat), Actinobacteria (2 isolat), Firmicutes (4 isolat) dan α-Proteobacteria (3 isolat). Populasi bakteri dari sampel ini didominasi bakteri dari kelompok -Proteobacteria, dengan jumlah Bacillus lebih tinggi dibanding lainnya.

Tabel 6 Tingkat kesamaan sekuen 16S rDNA dari bakteri endofit tanaman kunyit putih asal Cibinong (CBN)

Isolat Bagian tanaman

Identitas terdekat dengan referensi bank data NCBI

Nomor Asesi

Persen kesamaan DL.P.1 D Microbacterium testaceum strain: StLB018 AB478964 100% DL.P.2 D Stenotrophomonas maltophilia strain SO HQ631975 99% DL.P.3 D Pseudomonas denitrificans

strain ATCC 13867

NR102805 100% DL.P.4 D Enterobacter cancerogenus

strain GRM903b

HM209774 99% DL.P.5 D Bacillus safensis strain BAB-1846 KF535137 100% DL.P.6 D Bacillus subtillis strain yxw5 KF278951 100% DL.S.1 D Methylobacterium organophilum strain: NS8 AB298393 100% RL.P.1 R Providencia vermicola strain Cu12a KF471514 99% RL.P.4 R Phenylobacterium koreense isolate MKC7 EF173338 99% RL.S.1 R Bacillus safensis strain AL-A32 KC844810 100% RL.S.2 R Enterobacter aerogenes strain NC4211 AB244472 99% RL.S.3 R Roseomonas mucosa strain ES_21con EU934085 100% BL.P.1 B Stenotrophomonas maltophilia strain Kb2 KC878468 100% BL.P.2 B Bacillus safensis strain WBD7 KF550439 100% BL.S.1 B Pseudomonas otitidis strain PB5 KC967287 99% BL.S.2 B Mycobacterium cosmeticum

strain 2003-11-06

AY44929 99% D: daun; B: batang; R: rimpang

Keragaman Bakteri Endofit asal Dramaga (DRMG)

Sebanyak 34 isolat dipilih dari sampel tanaman yang diambil dari DRMG. Lima belas isolat diisolasi dari bagian rimpang, 10 isolat dari batang dan 9 isolat dari daun. Bakteri endofit dari sampel ini lebih beragam dibanding sampel yang lain. Keragaman bakteri endofit pada rimpang dan batang lebih bervariasi dibandingkan bagian daun. Jumlah bakteri Gram negatif lebih banyak (23 dari 34 isolat) dibandingkan dengan bakteri Gram positif (11 dari 34 isolat). Hasil analisis 16S rDNA menunjukkan bahwa 33 isolat memiliki persentase kesamaan yang tinggi dengan referensi yaitu antara 99% - 100% dan satu kandidat spesies baru isolat BI.P.1 dengan homologi 98% (Tabel 7). Nilai persentase homologi untuk penentuan spesies baru pada tahun 2006 meningkat menjadi 98.7% (Stackebrandt dan Ebers 2006), sehingga isolat BI.P.1 yang teridentifikasi sebagai Microbacterium resistens dengan homologi 98% merupakan kandidat spesies baru.

Genus pada sampel ini lebih beragam dibanding sampel yang lain dan sampel ini didominasi oleh bakteri genus Microbacterium. Populasi bakteri endofit terdiri dari genus Microbacterium (6 isolat), Pseudomonas (5 isolat), Enterobacter (4 isolat), Klebsiella (4 isolat), Bacillus (2 isolat), Stenotrophomonas (2 isolat), Acinetobacter (2 isolat), Citrobacter, Ralstonia, Brevibacterium, Alcaligenes, Pantoea, Rhizobium, dan Burkholderia. Bakteri dari genus Microbacterium, Pseudomonas, Bacillus, dan Enterobacter ditemukan pada semua bagian tanaman. Hal ini berbeda dengan genus Stenotrophomonas, Bacillus dan Acinetobacter yang hanya ditemukan pada bagian rimpang dan batang.

Tabel 7 Tingkat kesamaan sekuen 16S rDNA dari bakteri endofit tanaman kunyit putih asal Dramaga

D: daun; B: batang; R: rimpang Isolat Bagian

tanaman

Identitas terdekat dengan referensi bank data NCBI

Nomor asesi

Persen kesamaan DI.P.1 D Enterobacter cancerogenus strain cifa_chp29 KC895920 99% DI.P.2 D Brevibacterium epidermidis strain CICR-G1 JQ284034 100% DI.P.3 D Alcaligenes faecalis subsp. Faecalis strain fwzb2 KF208485 100% DI.P.4 D Klebsiella variicola strain R5-431 JQ659780 99% DI.S.1 D Pseudomonas moraviensis strain IARI-HHS1-33 KF054775 100% DI.S.2 D Microbacterium resistens strain DMMZ NR026437 99% DI.S.3 D Microbacterium testaceum strain BAC2029 HM355620 99% DI.S.4 D Microbacterium laevaniformans strain G24a KC136835 100% DI.S.5 D Rhizobium tarimense strain PL-41 HM371420 99% RI.P.1 R Burkholderia cenocepacia AU 1054 CP000378 99% RI.P.2 R Enterobacter cloacae strain FCC56 JF772094 99% RI.P.3 R Pantoea dispersa strain REB2 KF036178 100% RI.P.4 R Microbacterium trichothecenolyticum strain A5 JX426095 100% RI.P.5 R Bacillus cereus strain IAM 1561257 JX519363 100% RI.P.6 R Pseudomonas geniculata strain R6-798 JQ659864 100% RI.P.7 R Stenotrophomonas maltophilia strain JN263 KF150498 100% RI.P.8 R Enterobacter ludwigii strain EG16 KC122712 99% RI.S.2 R Klebsiella pneumoniae strain cifa_chp15 KC895887 99% RI.S.3 R Acinetobacter calcoaceticus strain c33 JQ781531 100% RI.S.4 R Pseudomonas nitroreducens strain B30 KC415112 99% RI.S.5 R Burkholderia phenoliruptrix BR3459a NR102849 99% RI.S.6 R Pseudomonas gessardii strain KMBMa1 KF481916 99% RI.S.7 R Pantoea agglomerans strain BJCP3 HM130694 99% RI.S.8 R Klebsiella variicola strain DPMH JX968498 100% BI.P.1 B Microbacterium resistens strain 3352 EU714361 98% BI.P.2 B Stenotrophomonas maltophilia strain JN263 KF150498 100% BI.P.3 B Enterobacter ludwigii strain EG16 KC122712 99% BI.P.4 B Acinetobacter calcoaceticus strain EU04 JF681282 100% BI.P.6 B Microbacterium laevaniformans strain G24a KC136835 100% BI.P.7 B Bacillus cereus strain IAM 1561257 JX519363 100% BI.S.1 B Ralstonia mannitolilytica strain PapInBa6 EU839654 99% BI.S.2 B Klebsiella variicola strain R5-431 JQ659780 99% BI.S.3 B Citrobacter freundii strain: GTC 09502 AB741675 100% BI.S.4 B Pseudomonas moraviensis

strain IARI-HHS1-33

Tabel 8 Keragaman bakteri endofit tanaman kunyit putih berdasarkan analisis 16S rDNA

Gram Bojong Gede Cibinong Dramaga Total

Rimpang +

1. Bacillus subtilis 2. Cellulomonas hominis

1. Bacillus safensis 1. Bacillus cereus 2. Microbacterium

trichothecenolyticum

5

-

1. Klebsiella pneumoniae 2. Klebsiella variicola

3. Pseudomonas denitrificans 4. Pseudomonas stutzeri 5. Pantoea dispersa 6. Bosea thiooxidans

1. Providencia vermicola 2. Phenylobacterium koreense 3. Enterobacter cancerogenes 4. Roseomonas mucosa

1. Burkholderia cenocepacia 2. Burkholderia phenoliruptrix 3. Enterobacter cloacae 4. Enterobacter ludwigii 5. Pantoea dispersa 6. Pantoea agglomerans 7. Pseudomonas geniculata 8. Pseudomonas gessardii 9. Pseudomonas nitroreducens 10. Stenotrophomonas maltophilia 11. Klebsiella pneumoniae

12. Klebsiella variicola

13. Acinetobacter calcoaceticus

23

Batang +

1. Bacillus pumilus 2. Microbacterium

laevaniformans 3. Microbacterium

trichothecenolyticum 4. Microbacterium hominis 5.Mycobacterium simiae

1. Bacillus safensis

2. Mycobacterium cosmeticum

1. Bacillus cereus

2. Microbacterium resistens 3. Microbacterium laevaniformans

Tabel 8 Keragaman bakteri endofit tanaman kunyit putih berdasarkan analisis 16S rDNA (Lanjutan)

+: Gram positif; -: Gram negatif

Gram Bojong Gede Cibinong Dramaga Total

Batang -

1. Klebsiella pneumoniae 2. Erwinia chrysanthemi 3. Xanthobacter flavus 4. Enterobacter oryzae

1. Stenotrophomonas maltophilia 2. Pseudomonas otitidis

1. Stenotrophomonas maltophilia 2. Enterobacter ludwigii

3. Acinetobacter calcoaceticus 4. Ralstonia mannitolilytica 5. Klebsiella variicola 6. Citrobacter freundii

3. 7. Pseudomonas moraviensis

13

Daun

+

1. Microbacterium laevaniformans

2. Micrococcus yunnanensis

1. Bacillus safensis 2. Bacillus subtillis

3. Microbacterium testaceum

1. Microbacterium resistens 2. Microbacterium testaceum 3. Microbacterium laevaniformans 4. Brevibacterium epidermidis

9

-

1. Pseudomonas stutzeri 2. Klebsiella pneumoniae 3. Agrobacterium larrymoorei 4. Bosea thiooxidans

1. Stenotrophomonas maltophilia 2. Pseudomonas denitrificans 3. Enterobacter cancerogenus 4.Methylobacterium

organophilum

1. Enterobacter cancerogenus 2. Alcaligenes faecalis subsp.

faecalis

3. Klebsiella variicola 4. Pseudomonas moraviensis 5. Rhizobium tarimense

13

Total

Gambar 8 Dendogram bakteri endofit berdasarkan sekuen gen 16S rDNA menggunakan metode neighbor-joining, model Kimura-2-parameter dan Gamma distributed dengan nilai bootstrap 1000 replikasi

-Proteobacteria

α-Proteobacteria -Proteobacteria

Firmicutes Actinobacteria

Hubungan kekerabatan yang terbentuk antara isolat dan referensi ditunjukkan pada Gambar 8. Berdasarkan hasil analisis, bakteri endofit dikelompokkan menjadi lima kelompok yang berbeda: Firmicutes, Actinobacteria, α-Proteobacteria, -Proteobacteria, dan -Proteobacteria. Kelompok -Proteobacteria 37 isolat (51%) adalah kelompok yang paling dominan di antara isolat bakteri endofit terseleksi, meliputi genus Stenothropomonas, Pseudomonas, Enterobacter, Providencia, Klebsiella, Dickeya, Pantoea, Acinetobacter, dan Citrobacter, diikuti oleh kelompok Actinobacteria 16 isolat (21.92%) termasuk Mycobacterium, Cellulomonas dan didominasi oleh Microbacterium. Kelompok α-Proteobacteria 8 isolat (10.96%) meliputi Methylobacterium, Penylobacterium, Roseomonas, Agrobacterium, Bosea, Xanthobacter, Rhizobium, kelompok Firmicutes 8 isolat (10.96%) didominasi oleh Bacillus, dan gugus -Proteobacteria 4 isolat (5.48%) terdiri dari Burkholderia, Ralstonia, dan Alcaligenes (Gambar 8).

Bakteri endofit yang berhasil diisolasi sangat beragam dan genus yang paling banyak ditemukan adalah Entrobacter, Klebsiella, dan Pseudomonas. Kelompok -Proteobacteria mendominasi semua sampel tanaman kunyit putih. Bakteri yang termasuk dalam genus Pseudomonas, Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, dan Microbacterium ditemukan pada semua sampel. Keberadaan mikrob dalam tanaman inang dapat dipengaruhi oleh senyawa yang terkandung dalam tanaman tersebut (Strobel and Daisy 2003) dan tanaman dengan spesies yang sama kemungkinan menghasilkan senyawa bioaktif yang relatif sama (Bernhoft 2010). Genus Enterobacter, Pseudomonas, dan Bacillus merupakan bakteri endofit yang paling banyak ditemukan pada tanaman legum dan lainnya seperti kentang dan sorgum (Wang et al. 2006). Hasil penelitian menunjukkan keberadaan dan distribusi yang luas dari genus Pseudomonas and Bacillus, yaitu ditemukannya kedua genus tersebut pada semua sampel tanaman. Hal ini dikarenakan genus Pseudomonas dan Bacillus sangat mudah untuk ditumbuhkan dan berpotensi sebagai agen biokontrol (Miller et al. 2012). Sifat ini menyebabkan Pseudomonas dan Bacillus dapat ditemukan pada semua tanaman. Hal yang hampir sama juga dilaporkan oleh Vendan et al. (2010), yang menyatakan bahwa bakteri dari genus Bacillus mendominasi pada semua umur tanaman.

Gambar 9 Komposisi kelompok bakteri endofit yang ditemukan pada bagian rimpang, batang, dan daun tanaman kunyit putih (C. zedoaria)

Beberapa studi melaporkan bahwa telah banyak mikrob endofit yang berhasil diisolasi dari famili Zingiberaceae, namun mikrob tersebut bukan berasal dari tanaman C. zedoaria dan sebagian besar mikrob terisolasi merupakan kelompok cendawan dan aktinomisetes. Hasil penelitian ini menambah daftar jumlah jenis mikrob endofit terutama bakteri dari famili Zingiberaceae khususnya tanaman C. zedoaria. Sebanyak 73 bakteri endofit yang termasuk dalam 23 genus yang berbeda, merepresentasikan 46 spesies telah berhasil diidentifikasi dari tiga lokasi, usia dan bagian tanaman kunyit putih yang berbeda (Tabel 8). Sebanyak 13 genus yang berbeda dari 63 isolat endofit berhasil diisolasi dari bagian akar gingseng yang dibudidayakan di tiga wilayah yang berbeda (Cho et al. 2007). Hasil penelitian Vendan et al. (2010) telah berhasil mengisolasi 51 isolat bakteri endofit dari tanaman gingseng yang terdiri atas sembilan genus dalam empat kelompok besar. Akar dan batang dari tanaman kapas dan jagung manis memiliki 1029 bakteri endofit yang terdiri dari 34 genus berbeda (McInroy dan Klopper 1995). Sebanyak 114 isolat endofit dalam 23 genus yang berbeda telah diisolasi dari tanaman bit oleh Lilley et al. (1996). Akar tanaman Canola yang ditanam pada tiga lokasi berbeda juga mengandung 220 isolat yang terdiri dari 18 genus berbeda (Germida et al. 1998). Beberapa hasil penelitian ini menunjukkan bahwa keragaman bakteri endofit dalam tanaman kunyit putih yang diambil di Bogor, Jawa Barat, Indonesia dapat memberikan perkiraan bahwa keragaman bakteri pada tanaman obat yang tumbuh di Indonesia lebih beragam dibandingkan dengan hasil penelitian yang diperoleh negara lain.

Bakteri Endofit Penghasil Senyawa Antimikrob

Mikrob endofit dipercaya berperan dalam resistensi terhadap serangan patogen melalui senyawa metabolit sekunder yang dihasilkannya (Tan dan Zou 2001). Beberapa studi melaporkan bahwa sejumlah senyawa antimikrob telah berhasil diperoleh dari mikrob endofit, diantaranya senyawa yang termasuk dalam alkaloid, peptida, steroid, terpenoid, fenol, quinon, dan flavonoid (Yu et al. 2010). Penemuan senyawa antimikrob baru dari mikrob endofit merupakan alternatif penting untuk mengatasi peningkatan masalah resistensi obat terhadap tanaman dan patogen manusia. Senyawa antimikrob tidak hanya digunakan sebagai obat oleh manusia. Senyawa ini juga digunakan sebagai pengawet makanan dalam mengontrol pembusukan makanan dan penyakit terbawa makanan yang merupakan salah satu masalah serius di dunia.

Mikrob uji yang digunakan dalam penelitian adalah B. subtilis dan S. aureus mewakili bakteri Gram positif, P. aeruginosa dan E. coli mewakili bakteri Gram negatif, C. albicans, dan S. cerevisiae mewakili yeast. Mikrob tersebut merupakan mikrob patogen terhadap manusia dan hewan yang sudah banyak dipelajari dan diketahui informasi genetiknya. Hasil uji antimikrob menunjukkan bahwa beberapa bakteri endofit tanaman kunyit putih memiliki potensi dalam menghasilkan senyawa antimikrob. Sebanyak 16 bakteri endofit dari 73 bakteri terseleksi mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang aktif terhadap bakteri Gram positif, Gram negatif dan yeast. Bakteri endofit penghasil antimikrob sebagian besar merupakan bakteri yang diisolasi dari DRMG (68.75%) diikuti CBN (18.75%) dan BG (12.5%). Perbedaan ini kemungkinan disebabkan oleh asal lokasi pengambilan sampel. DRMG merupakan kebun koleksi tanaman

obat yang mempunyai diversitas tanaman obat yang sangat tinggi. Sebanyak tiga ratus jenis tanaman obat dapat ditemukan di tempat ini dan hal ini akan berpengaruh terhadap senyawa yang terkandung dalam tanaman tersebut.

Aktivitas antimikrob yang dihasilkan bervariasi dari 1−22 mm. Berdasarkan spektrum aktivitas penghambatannya, sebagian besar bakteri menunjukkan diameter penghambatan yang relatif kecil dan berspektrum sempit. B. subtilis (RB.P.1) dan B. cenocepacia (RI.P.1) hanya mampu menghambat satu jenis mikrob uji dengan diameter penghambatan yang cukup besar yaitu >10 mm. B. subtilis (RB.P.1) aktif terhadap C. albicans dan S. cerevisiae, sedangkan B. cenocepacia (RI.P.1) aktif terhadap B. subtilis. Bakteri endofit lain yang menghasilkan senyawa antimikrob adalah P. otitidis (BL.S.1) dan C. freundii (BI.S.3) dengan spektrum penghambatan luas dan mampu menghambat bakteri Gram positif dan negatif. P. otitidis (BL.S.1) mampu menghambat pertumbuhan B. subtilis, S. aureus, dan P. aeruginosa, sedangkan C. freundii (BI.S.3) mampu menghambat B. subtilis dan E. coli (Tabel 9 dan Gambar 10). Data diameter zona hambat pada Tabel 9 menunjukkan bahwa sebagian besar senyawa antimikrob yang dihasilkan bersifat lemah dikarenakan diameter zona hambat aktivitas antimikrob yang dihasilkan adalah di bawah 5 mm. Daya hambat kuat dihasilkan oleh dua bakteri endofit yaitu B. subtilis (RB.P.1) dan B. cenocepacia (RI.P.1) dengan diameter sebesar 13 mm.

Tabel 9 Aktivitas antimikrob bakteri endofit tanaman kunyit putih Bakteri endofit

Mikrob uji

Gram positif Gram negatif Yeast

BS SA EC PA CA SC

B. subtillis (RB.P.1) - - - - ++++ +++

P. denitrificans (RB.P.3) + - - - - -

P. otitidis (BL.S.1) + ++ - + - -

M. cosmeticum (BL.S.2) + - - - - -

P. denitrificans (DL.P.3) ++ - - - - -

E. cancerogenus (DI.P.1) + - - - - -

B. cenocepacia (RI.P.1) +++ - - - - -

B. cereus (RI.P.5) + - - - - -

P. geniculata (RI.P.6) + - - - - -

E. ludwigii (RI.P.8) + - - - - -

P. nitroreducens (RI.S.4) + - - - - -

S. maltophilia (BI.P.2) + - - - - -

E. ludwigii (BI.P.3) + - - - - -

A. calcoaceticus (BI.P.4) ++ - - - - -

C. freundii (BI.S.3) + - + - - -

P. moraviensis (BI.S.4) + - - - - -

-: tidak menghambat; +: menghambat < 2 mm; ++ : < 5 mm; +++:>10 mm; ++++: >20 mm; BS:

Senyawa antimikrob yang dihasilkan relatif lebih aktif terhadap bakteri dibandingkan yeast. Bakteri cenderung lebih sensitif terhadap komponen antibiotik jika dibandingkan dengan yeast. Bakteri merupakan sel prokariot dengan struktur dinding sel yang sederhana terbuat dari peptidoglikan sehingga memudahkan senyawa antibiotik masuk ke dalam sasaran untuk bekerja sedangkan yeast merupakan sel eukariot yang memiliki komponen struktur dinding sel yang ekstensif terdiri dari beta-glukan dan mannan-oligo-sakarida (Aguilar-Uscanga dan Francois 2003). Hasil juga menunjukkan bahwa senyawa antimikrob yang dihasilkan lebih aktif terhadap bakteri Gram positif dibandingkan Gram negatif. Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan sensitifitas yang dapat dilihat dari perbedaan morfologi antara bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif lebih rentan karena pada bagian luar hanya memiliki lapisan peptidoglikan yang tidak efektif sebagai penghalang, sedangkan bakteri Gram negatif memiliki membran luar polisakarida yang menyebabkan dinding sel tidak dapat ditembus oleh antibiotik, pewarna dan deterjen (Pandey et al. 2011).

Beberapa bakteri endofit telah dilaporkan mampu menghasilkan senyawa antimikrob, diantaranya Bacillus pumilus dari cassava yang mampu menghasilkan lipopeptida pumilacidin (Melo et al. 2009), Serratia, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, dan Enterobacter dari tanaman Rhizophora mucronata mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang aktif terhadap bakteri dan cendawan patogen (Jose dan Christy 2013), Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas poae, Bacillus sp. dari tanaman gingseng mampu menghasilkan senyawa antifungi berspektrum luas (Cho et al. 2007). P. otitidis memiliki aktivitas antimikrob yang kuat terhadap C. albicans and E.coli (Kristija et al. 2013). Burkholderia cepacia mampu menghasilkan senyawa antimikrob berspektrum luas phenylpyrole yang aktif terhadap cendawan, yeast, dan bakteri Gram positif (El-Banna dan Winkelmann 1998).

Tanaman obat dengan sejarah etnobotani tinggi memiliki peluang ditemukannya spesies bakteri endofit yang membawa karakteristik tanaman inangnya. Hal ini sesuai dengan pendapat Tan dan Zou (2001) yang menyatakan bahwa beberapa bakteri endofit penghasil senyawa bioaktif biasanya berhubungan dengan karakteristik tanaman inangnya. Hasil ini juga sesuai dengan hasil studi Banisalam et al. (2012), bahwa ekstrak rimpang kunyit putih memiliki efek farmakologis sebagai antibakteri terhadap bakteri patogen E. coli, P. aeruginosa, B. cereus dan Staphylococcus aureus. Hasil ini diharapkan mampu menghasilkan senyawa antimikrob baru yang relatif sama dengan karakter tanaman kunyit putih yang dapat diaplikasikan pada bidang kesehatan.

Gambar 10 Hasil uji aktivitas antimikrob terhadap mikrob uji (A: aktif terhadap C. albicans; B: S. cerevisiae; C: B. subtilis)

c

A

B C

Toksisitas Akut terhadap Embrio Ikan Zebra

Bakteri endofit terpilih yang memiliki aktivitas antimikrob yang besar dalam menghambat pertumbuhan mikrob uji dilanjutkan dengan uji in vitro dan in vivo toksisitas terhadap embrio ikan zebra. Bakteri terpilih yang digunakan untuk uji toksisitas diantaranya C. freundii (BI.S.3), B. subtilis (RB.P.1), P. otitidis (BL.S.1), dan B. cenocepacia (RI.P.1). Uji toksisitas akut dilakukan melalui uji in vitro dengan penentuan nilai LC50. Lethal Concentration 50 (LC50) adalah konsentrasi yang menyebabkan kematian pada 50% hewan percobaan. Penentuan nilai LC50 menggunakan ikan zebra membantu lebih baik untuk memahami pengaruh toksik dari senyawa obat terhadap mamalia (Kari et al. 2007).

Penentuan toksisitas akut dilakukan terhadap embrio ikan zebra yang telah terpapar ekstrak selama 72 jam. Bakteri endofit yang digunakan adalah isolat BI.S.3, RB.P.1, BL.S.1, RI.P.1 dengan identitas berturut-turut C. freundii, B. subtilis, P. otitidis, dan B. cenocepacia. Tingkat kematian embrio serta kelainan dalam pertumbuhannya diamati setelah pemberian fase ekstrak etil asetat dan fase air. Tingkat kematian embrio disajikan dalam nilai LC

50. Hasil nilai LC50 menunjukkan bahwa ekstrak dari semua bakteri endofit terpilih bersifat toksik terhadap embrio ikan zebra. Fase ekstrak etil asetat lebih toksik dibandingkan dengan fase air. Hal ini terlihat dari nilai LC50 fase ekstrak etil asetat lebih rendah dibandingkan fase air. Ekstrak etil asetat dari C. freundii (BI.S.3), B. subtilis (RB.P.1), P. otitidis (BL.S.1), dan B. cenocepacia (RI.P.1) memiliki nilai LC50 berturut-turut 63.5 ppm, 24.7 ppm, 13.4 ppm, dan 12.6 ppm, sedangkan nilai LC50 dari fase air adalah 109.9 ppm, 252.3 ppm, 132.4 ppm, 120.8 ppm (Lampiran 4 sampai 7). Hasil ini diringkaskan pada Gambar 11.

Gambar 11 menunjukkan bahwa nilai LC50 yang diperoleh berbeda antara fase ekstrak etil asetat dan fase air. Konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% embrio ikan zebra pada fase ekstrak etil asetat lebih rendah dibandingkan fase air. Hal ini disebabkan senyawa aktif sebagian besar sudah terbawa oleh etil asetat, meskipun sebagian dari senyawa aktif yang dihasilkan oleh bakteri endofit masih tertinggal dalam fase air. Rendahnya nilai LC50 fase etil asetat mengindikasikan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh bakteri endofit sangat toksik dengan tingkat urutan toksisitas B. cenocepacia (RI.P.1), diikuti P. otitidis (BL.S.1), B. subtilis (RB.P.1), dan C. freundii (BI.S.3). Semakin toksik senyawa yang dihasilkan, maka semakin rendah konsentrasi yang diperlukan untuk mematikan 50% dari total hewan percobaan.

Gambar 11 Nilai LC

Efek Ekstrak Bakteri Endofit terhadap Organ Embrio Ikan Zebra

Langkah pertama dalam pengujian obat ke tahap penggunaan manusia setelah uji in vitro adalah melalui uji in vivo yaitu bagaimana tubuh dapat memetabolisme obat tersebut. Ikan zebra adalah vertebrata yang telah terbukti menjadi model untuk analisis penyakit manusia, dikarenakan tingginya tingkat kesamaan antara genom manusia dengan ikan zebra. Studi menunjukkan bahwa ikan zebra dapat digunakan dalam pengembangan jenis obat tumor (Feitsma dan Cuppen 2008), sehingga sangat bermanfaat untuk mengobati karsinoma manusia. Uji in vivo yang dilakukan melalui pengamatan morfologi bertujuan untuk mengetahui apakah toksisitas dari suatu senyawa hanya terfokus pada organ-organ tertentu dalam tubuh ikan zebra. Pengamatan morfologi dilakukan terhadap embrio ikan zebra yang telah terpapar ekstrak bakteri endofit selama periode tertentu. Pengaruh pemberian ekstrak tersebut dapat menyebabkan kelainan pada organ-organ tertentu pada larva ikan, diantaranya sumbu tubuh, otak, sirip, sirkulasi darah, mata, telinga, rahang, jantung, tulang belakang, panjang tubuh, pigmentasi, dan kantong kuning telur. Nilai LC50 dari uji in vitro yang dihasilkan menunjukkan bahwa fase ekstrak etil asetat dan fase air memberikan nilai yang berbeda dan hal ini juga akan memberikan pengaruh yang berbeda terhadap organ ikan zebra.

A B C D

Gambar 12 Embrio ikan zebra dengan penambahan fase ekstrak etil asetat bakteri (A) C. freundii; (B) B. subtilis; (C) P. otitidis; (D) B. cenocepacia (a: 0 ppm; b: 50 ppm; c: 100 ppm; d: 150 ppm; e: 200 ppm; f: 250 ppm) a

b

a a a

b _{b b}

c c c _c

d d d d

e e

e e

f

f

46

Lampiran 6 Hasil uji toksisitas embrio ikan zebra ekstrak bakteri P. otitidis (BL.S.1)

Konsentrasi (ppm)

Fase ekstrak etil asetat Fase air

Rerata % kematian Rerata % kematian

0 0.0 0.0 0.7 13.4

50 3.7 73.4 0.7 13.4

100 4.0 80.0 1.3 26.6

150 4.3 86.6 2.0 40.0

200 4.7 93.4 3.3 66.6

250 5.0 100.0 5.0 100.0

Contoh perhitungan LC 50: y = 37.11x + 8.197 50 = 37.11x + 8.197 50 - 8.197 = 37.11x x = 41.803/37.11 x = 1.126

LC50 = 101.126 LC50 = 13.4 ppm

Fase ekstrak etil asetat bakteri P. otitidis (BL.S.1)

47 Lampiran 7 Hasil uji toksisitas embrio ikan zebra ekstrak bakteri B. cenocepacia

(RI.P.1) Konsentrasi

(ppm)

Fase ekstrak etil asetat Fase air

Rerata % kematian Rerata % kematian

0 0.0 0.0 0.7 13.4

50 3.7 73.4 0.0 0.0

100 4.3 86.6 2.0 40.0

150 5.0 100.0 2.7 53.4

200 5.0 100.0 4.0 80.0

250 5.0 100.0 5.0 100.0

Contoh perhitungan LC 50: y = 41.34x + 4.554 50 = 41.34x + 4.554 50 - 4.554 = 41.34x x = 45.446/41.34 x = 1.099

LC50 = 101.099 LC50 = 12.6 ppm

Fase ekstrak etil asetat bakteri B. cenocepacia (RI.P.1)

RINGKASAN

TRI RATNA SULISTIYANI. Keragaman Bakteri Endofit Tanaman Kunyit Putih (Curcuma zedoaria) dan Toksisitasnya terhadap Embrio Ikan Zebra. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan PUSPITA LISDIYANTI.

Kunyit putih merupakan tanaman herbal yang secara tradisional banyak digunakan untuk pengobatan penyakit yang berhubungan dengan kanker. Keragaman dan potensi bakteri endofit dalam tanaman kunyit putih perlu dikaji. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji keragaman bakteri endofit yang berasosiasi dengan tanaman kunyit putih (Curcuma zedoaria) dan toksisitasnya terhadap embrio ikan zebra.

Tanaman kunyit putih diambil dari tiga lokasi yang berbeda di Bogor, Jawa Barat, Indonesia. Isolasi bakteri endofit dilakukan menggunakan empat media yang berbeda (Nutrient Agar (NA), NA yang mengandung ekstrak kunyit putih (NAT), Water Yeast Extract Agar (WYEA), WYEA yang mengandung ekstrak kunyit putih), dan dua metode isolasi yaitu metode spread plate dan plant piece. Populasi bakteri endofit dihitung dengan menumbuhkan bakteri pada 4 jenis media yang berbeda dan identifikasi isolat terseleksi menggunakan analisis molekuler berdasarkan 16S rDNA. Uji aktivitas antimikrob pada bakteri terseleksi dilakukan terhadap enam mikrob uji yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans, dan Sacharomyces cerevisiae. Empat bakteri endofit penghasil senyawa antimikrob selanjutnya dilihat potensinya dalam menghasilkan senyawa toksik melalui uji toksisitas terhadap embrio ikan zebra.

Sebanyak 207 isolat bakteri endofit telah berhasil diisolasi dari bagian akar, batang dan daun tanaman kunyit putih, dan 73 isolat yang berbeda diperoleh berdasarkan perbedaan karakteristik morfologi. Tiga puluh dua persen isolat diperoleh dari kebun Bojong Gede, 22% isolat dari kebun percobaan Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong dan 46% isolat berasal dari kebun koleksi tanaman obat Pusat Penelitian Biofarmaka IPB Dramaga. Bakteri endofit didominasi oleh bakteri dari rimpang yaitu sebanyak 38%, dari batang sebanyak 32%, dan dari daun sebanyak 30%. Berdasarkan hasil analisis sekuen 16S rDNA, bakteri yang diperoleh termasuk dalam kluster Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, dan Actinobacteria, dengan 23 genus yang berbeda yaitu Stenothropomonas, Pseudomonas, Enterobacter, Providencia, Klebsiella, Dickeya, Pantoea, Bacillus, Acinetobacter, Citobacter, Mycobacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Methylobacterium, Penylobacterium, Roseomonas, Agrobacterium, Bosea, Xanthobacter, Rhizobium, Burkholderia, Ralstonia, and Alcaligenes. Bakteri dari kluster Gammaproteobacteria mendominasi semua sampel kunyit putih dan bakteri genus Pseudomonas, Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, Microbacterium ditemukan dari semua bagian tanaman sampel.

Berdasarkan hasil uji antimikrob, enam belas isolat dari 73 bakteri endofit terseleksi menunjukkan aktivitas setidaknya terhadap satu mikrob uji. Empat isolat terpilih (Citrobacter freundii (BI.S.3), Bacillus subtilis (RB.P.1), Pseudomonas otitidis (BL.S.1), and Burkholderia cenocepacia (RI.P.1) memiliki

diameter penghambatan yang besar dan mampu menghambat lebih dari satu mikrob uji. Hasil uji toksisitas fase ekstrak etil asetat terhadap embrio ikan zebra

dari C. freundii (BI.S.3), B. subtilis (RB.P.1), P. otitidis (BL.S.1), dan B. cenocepacia (RI.P.1) memiliki nilai LC50 berturut-turut 63.5 ppm, 24.7 ppm,

13.4 ppm, dan 12.6 ppm, sedangkan nilai LC50 fase air adalah 109.9 ppm, 252.3 ppm, 132.4 ppm, 120.8 ppm. Hasil uji toksisitas ini merupakan langkah awal untuk penapisan senyawa yang berpotensi menghasilkan senyawa antikanker. Hasil menunjukkan bahwa aktivitas tertinggi diperoleh pada ekstrak bakteri endofit B. cenocepacia (RI.P.1) diikuti P. otitidis (BL.S.1), B. subtilis (RB.P.1), dan C. freundii (BI.S.3).

Kata kunci : antimikrob, bakteri endofit, Curcuma zedoaria, keragaman, uji toksisitas, 16S rDNA

SUMMARY

TRI RATNA SULISTIYANI. Diversity of Endophytic Bacteria Associated with Medicinal Plant Curcuma zedoaria and Their Toxicity to Zebrafish Embryo. Supervised by YULIN LESTARI and PUSPITA LISDIYANTI.

Traditionally white turmeric (Curcuma zedoaria) known as herbal medicine which possesing many biological activities. Diversity and potential of endophytic bacteria associated with white turmeric need to be studied. The main interest of this study was to investigate the endophytic bacterial diversity associated with white turmeric and their toxicity to zebrafish embryo.

White turmerics were collected from three locations in Bogor, West Java, Indonesia. The isolation of endophytic bacteria was carried out using 4 kinds media (Nutrient Agar (NA), NA contained white turmeric extract (NAT), Water Yeast Extract Agar (WYEA), WYEA contained white turmeric extract (WYEAT)), and 2 isolation methods of spread plate and plant piece methods. The identification of selected isolates was conducted using molecular analysis based on 16S rDNA sequencing. The antimicrobial activity of selected endophytic bacteria were screened against six microbial pathogens Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans, and Sacharomyces cerevisiae. Four of endophytic bacteria producing antimicrobial compound were tested in producing toxic compound through the zebrafish toxicity tests.

Two hundred and seven endophytes were isolated from rhizomes, stems, and leaves of white turmeric and 73 endophytic bacteria were selected based on morphological characteristics. From them, 32% isolates from Bojong Gede, 22% isolates from experimental garden of Research Center for Biology, Indonesian Institute of Sciences, Cibinong and 46% isolates from medicinal plants collection garden of Biopharmaca Research Center, Bogor Agricultural University, Dramaga were obtained. Endophytic bacteria were predominated 38% in the rhizomes, 32% in the stems, and 30% in the leaves. Based on 16S rDNA sequence analysis, the isolates were belonging to the cluster Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, and Actinobacteria, with twenty three different genera includes Stenothropomonas, Pseudomonas, Enterobacter, Providencia, Klebsiella, Dickeya, Pantoea, Bacillus, Acinetobacter, Citrobacter, Mycobacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Methylobacterium, Penylobacterium, Roseomonas, Agrobacterium, Bosea, Xanthobacter, Rhizobium, Burkholderia, Ralstonia, and Alcaligenes. The cluster Gammaproteobacteria dominated all samples of white turmerics and bacteria belonging to the genera Pseudomonas, Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, and Microbacterium were found in all part of the samples.

Based on the antimicrobial assay, 16 isolates of 73 selected isolates showed antimicrobial activities against at least one of the test organisms. Four of endophytic bacteria showed broad spectrum activity and high antimicrobial activity, they were Citrobacter freundii (BI.S.3), Bacillus subtilis (RB.P.1), Pseudomonas otitidis (BL.S.1), and Burkholderia cenocepacia (RI.P.1), respectively. The phase of ethyl acetate extracts of endophytic bacteria which

produced antimicrobial compound e.g. C. freundii (BI.S.3), B. subtilis (RB.P.1), P. otitidis (BL.S.1), and B. cenocepacia (RI.P.1) had LC50 values 63.5 ppm, 24.7 ppm, 13.4 ppm, and 12.6 ppm, respectively. Meanwhile, LC50 values of water phase were higher compared to the phase of ethyl acetate extracts. The values were 109.9 ppm, 252.3 ppm, 132.4 ppm, 120.8 ppm respectively. The results showed that the highest activity was obtained from ethyl acetate extract of B. cenocepacia (RI.P.1), followed by P. otitidis (BL.S.1), B. subtilis (RB.P.1), and C. freundii (BI.S.3).

Keywords: antimicrobes, Curcuma zedoaria, diversity, endophytic bacteria, toxicity test, 16S rDNA sequence