Alat – Alat Bahan-Bahan Bagan Skrining Fitokimia

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat – Alat

1. Gelas ukur 50 ml100 ml Pyrex 2. Gelas Beaker 250 ml1000 ml Pyrex 3. Gelas Erlenmeyer 250 ml Pyrex 4. Corong kaca 5. Corong pisah 500 ml Pyrex 6. Bejana maserasi 10 l Schott Duran 7. Kolom kromatografi Pyrex 8. Tabung reaksi Pyrex 9. Plat tetes 10. Rotari evaporator Büchi R-114 11. Alat pengukur titik lebur Fisher 12. Statif dan klem 13. Lampu UV 254 nm 356 nm UVGL 58 14. Spatula 15. Neraca analitis Mettler AE 200 16. Pipet tetes 17. Penangas air Büchi B-480 18. Botol vial 19. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 20. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 21. Spektrometer 1 22. Spektrofotometer UV-Visible H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.2 Bahan-Bahan

1. Daun Tumbuhan Rambutan Nephelium Lappaceum L.

2. MetanolMe-OH Teknis 3. N-heksana Teknis 4. Etil asetat EtOAc Teknis 5. Etanol p.a 6. Aquadest 7. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA 8. FeCl 3 9. NaOH 10 5 10. Mg-HCl 11. H 2 SO 12. Silika gel 60 F 4p 254 13. Aluminiun Foil 7,6m x 300 mm Total Wrap untuk plat E.Merck.Art 554 14. Kertas SaringNo.42 Whattman

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun rambutan yang diperoleh dari Jalan Bunga Mawar 18 No 19 , Pasar 5 Padang Bulan Medan. Daun Rambutan dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun Rambutan sebanyak 2000 g.

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Rambutan

Serbuk daun rambutan diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1.Skrining fitokimia 2.Analisis Kromatografi Lapis Tipis UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun rambutan , maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut : Prosedur : - Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun rambutan Nephelium Lappaceum L. yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 ml - Didiamkan - Disaring - Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I : dengan FeCl 3 b. Tabung II : dengan H 5 menghasilkan larutan berwarna hitam 2 SO 4 p c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda menghasilkan larutan orange kekuningan d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom.Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etanol p.a . Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etanol p.a dengan perbandingan9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 vv. Prosedur: Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etanol p.a 9:1vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT UNIVERSITAS SUMATERA UTARA yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etanol p.a dengan perbandingan 8 :2vv ; 7:3vv; dan 6:4vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun rambutan terkandung senyawa flavonoida, yaitu hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-heksana : etanol p.a dengan perbandingan 7:3vv.

3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Daun Tumbuhan Rambutan

Nephelium Lappaceum L. Serbuk daun tumbuhan rambutan ditimbang sebanyak 2000 g, kemudian dimaserasi dengan methanol sebanyak± 10L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ±3 hari. Maseratditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring.Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 15 g.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh UNIVERSITAS SUMATERA UTARA ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etanol p.a Prosedur : dengan perbandingan 90:10 vv, 80 : 20 vv, 70:30vv dan 60:40vv. Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n- heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 15 g ekstrak metanol daun tumbuhan rambutan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etanol pa 90:10vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etanol p.a dengan perbandingan 80:20vv, 70:30vv dan 60:40vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.

3.3.5 Pemurnian

Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom harus dimurnikan. Prosedur : Senyawa hasil isolasi dipreparatif dengan menggunakan KLT preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada batas bawah dengan jarak 2cm, kemudian dimasukkan kedalam chamber untuk dielusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluen n-heksan : etil asetat 30:70vv. Dielusi + 2 jam, kemudian dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV engan panjang gelombang yang berbeda, dilakukan penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama, dilakukan pelarutan dengan menggunakan metanol, ditampung kembali senyawa murni tersebut dan diuapkan di udara terbuka hingga membentuk kristal. Kristal yang diperoleh dilarutkan kembali dengan aseton, UNIVERSITAS SUMATERA UTARA diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan di udara terbuka sisa pelarut dari kristal hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut.

3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat p.a 2:8vv ; 3:7 vv dan 4:6vv. Prosedur: Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.

3.3.7 Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat pengukur titik lebur, diatur suhu. Lalu diamati suhu sampai kristal melebur. UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut. Mula-mula sampel ditimbang secara akurat lalu dilarutkan dengan metanol, kemudian sampel dibuat dalam kedaan segar dan diencerkan hingga 100 ml untuk kemudian dianalisis dengan alat spektofotometri UV- Visible.Hasil analisis spektrum UV-Visible dapat dilihat dalam LAMPIRAN D.

3.3.8.2. Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisis dengan alat Spektrometer 1 H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut. Mula-mula sampel dilarutkan dengan aseton dalam kapiler 5 mm lalu diletakkan dalam suatu tempat probe kemudian dianalisis dengan spektrofotometri 1 H-NMR.Hasil analisis spektrum 1 H-NMR dapat dilihat dalam LAMPIRAN F.

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR

Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan KBr sebagai pelarut. Mula-mula sampel dilarutkan dengan pelarut KBr, selanjutnya larutan dimasukkan kedalam sel larutan yang mempunyai jendela transparan dan pelarut murni pada sel kedua diletakkan pada berkas baku, sehingga serapan dari pelarut ditiadakan dan diperoleh spektrum serapan dari sampel. Hasil analisis spektrum FT-IR dapat dilihat dalam LAMPIRAN E. UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

diekstraksi maserasi denganmetanol disaring dipekatkan dibagi ke dalam 4 tabung reaksi ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan pereaksi FeCl 3 pereaksi NaOH pereaksi Mg-HCl pereaksi 5 10 H 2 SO diamati peruba- diamati peruba- diamati peruba- diamati peru- 4p han warna han warna han warna bahan warna Larutan biru violet Larutan merah muda Larutan orange kekuningan Larutan hitam 10 g serbuk daun tumbuhan rambutan Nephelium Lappaceum L. Tabung I Tabung II Tabung III Tabung IV Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 3.5 Bagan Penelitian UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2000 g serbuk daun tumbuhan rambutan Nephelium Lappaceum L. dimaserasi dengan metanol sebanyak 8 L didiamkan selama 3 hari diulangi sebanyak 3 kali Ekstrak metanol Residu diskrining fitokimia diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap dilarutkan dengan etil asetat disaring Filtrat Residu padatan dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga semua etil asetat menguap dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksan sampai bening Lapisan metanol Lapisan n - heksan tidak dilanjutkan diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator Ekstrak pekat metanol di-KLT untuk mengetahui sistem eluen yang sesuai pada kromatografi kolom dipisahkan tiap fraksi melalui kromatografi kolom dengan fase gerak yaitu campuran pelarut n-heksana:etanol p.a dengan perbandingan 90:10 vv ; 80:20 vv ; 70:30 vv ; 60:40 vv ditampung tiap fraksi sebanyak 12 mL dalam botol vial di-KLT untuk mengetahui harga Rf digabung fraksi dengan harga Rf yang sama Fraksi 1 - 60 90:10 Fraksi 61-120 80:20 Fraksi 121 - 280 70:30 Fraksi 281 - 360 60:40 diuji dengan FeCl 3 5 diuji dengan FeCl 3 5 diuji dengan FeCl 3 5 diuji dengan FeCl 3 5 Hasil negatif Hasil positif Hasil positif Hasil negatif dipreparatif dengan eluen n-heksan:etanol p.a dengan perbandingan 30:70 vv dikeringkan digerus dari plat dengan menggunakan spatula dilarutkan dengan metanol disaring Senyawa murni dianalisis KLT direkristalisasi diukur massanya diuji titik leburnya dianalisis dengan spektrofotometer UV-Visibel, spektrofotometer FT-IR, spektrofotometer 1 H- NMR Hasil analisis BAB 4 UNIVERSITAS SUMATERA UTARA HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian