Latar Belakang Genetik Domba Lokal yang Tahan terhadap Parasit Cacing Berdasarkan Control Region Genom Mitokondria
LATAR BELAKANG GENETIK DOMBA LOKAL YANG
TAHAN TERHADAP PARASIT CACING BERDASARKAN
CONTROL REGION GENOM MITOKONDRIA
DELVI RIANA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
DELVI RIANA. Latar Belakang Genetik Domba Lokal yang Tahan Parasit Cacing berdasarkan
Control Region Genom Mitokondria. Dibawah bimbingan ACHMAD FARAJALLAH dan
MULADNO.
Dalam penelitian untuk mencari gen-gen resisten terhadap cacing parasit telah ditemukan
adanya respon fisiologis yang inkonsisten pada kelompok-kelompok domba lokal terhadap uji
tantang larva cacing parasit. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis latar belakang genetik
domba lokal yang tahan terhadap infeksi parasit cacing yaitu asal usul maternal berdasarkan ruas
control region pada genom mitokondria. Tahapan metode penelitian terdiri atas isolasi DNA dari
darah 36 domba ekor gemuk dan domba ekor tipis. Analisis runutan nukleotida diperoleh data
yang tidak ambiguous ada sebanyak 13 (36 %) sampel, yang terdiri dari 4 domba dari Haplotipe A
dan 9 domba dari Haplotipe B. Analisis rata-rata nilai Famacha (FAMC) dan jumlah Fecal Eeg
Count (FEC) menunjukan adanya inkonsistensi, artinya indikasi anemia pada domba tidak
berkorelasi dengan banyaknya telur cacing yang menginfestasi. Namun begitu, nilai skor FAMC
dan jumlah FEC pada haplotipe A cenderung lebih rendah dibandingkan dengan haplotipe B.
Dengan kata lain, haplotipe domba bukan faktor yang membedakan dalam uji tantang yang
dilakukan sebelumnya.
kata kunci : tahan infeksi, latar belakang genetik, domba ekor gemuk, domba ekor tipis
ABSTRACT
DELVI RIANA. Genetic Background Parasite Resistance of Local Sheep based on Control
Region Genom Mithocondria. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and MULADNO.
In a study to find genes resistant to parasitic worms have been found inconsistent the physiological
response to groups of local sheep against parasitic worm larvae challenge test. This study to
analyze the genetic background of local sheep that resistant to the parasitic worm infection based
of maternal origin on control region in the mitochondrial genome. Stages of research methods
consisted of DNA isolated from the blood of 36 fat tail sheep and thin tail sheep. Analysis of the
data obtained traces of nucleotides that is not ambiguous as many as 13 (36%) of the sample, this
samples consisted of 4 sheeps from haplotype A and 9 sheeps from haplotype B. Analysis of the
average value score of Famacha (FAMC) and the number of Fecal Eeg Count (FEC) shows the
inconsistency, it mean is an indication of anemia in sheep did not correlate with the number of
eggs of worms that infest. However, the value score of FAMC and number of FEC on haplotype A
was lower compared with haplotype B. In other words, haplotype sheep is not a factor that
distinguishes the challenge test performed previously.
keywords: resistant infections, genetic background, fat tail sheep, thin tail sheep
LATAR BELAKANG GENETIK DOMBA LOKAL YANG
TAHAN TERHADAP PARASIT CACING BERDASARKAN
CONTROL REGION GENOM MITOKONDRIA
DELVI RIANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi
:
Nama
NIM
:
:
Latar Belakang Genetik Domba Lokal yang Tahan
terhadap Parasit Cacing Berdasarkan Control Region
Genom Mitokondria
Delvi Riana
G34080010
Menyetujui,
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
Pembimbing I
Prof. Dr. Ir. Muladno, MSA
Pembimbing II
Mengetahui,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
Ketua Departemen Biologi
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia-Nya,
sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Latar Belakang Genetik
Domba Lokal yang Tahan terhadap Parasit Cacing Berdasarkan Control Region Genom
Mitokondria” ini dilakukan mulai Januari 2012 sampai dengan Juni 2012 di Laboratorium
Molekuler Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini didanai dari Prof. Dr. Ir. Muladno,
MSA dan Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si. Oleh karena itu, saya ucapkan terima kasih.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Achmad Farajallah, M. Si. dan Prof. Dr. Ir.
Muladno, MSA atas bimbingan dan arahan yang diberikan. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada Dr. Nunik Sri Ariyanti, M. Si. selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang
telah bersedia menguji dan memberikan saran saat ujian dan penulisan karya ilmiah. Penulis
mengucapkan terima kasih kepada ayahanda Ahmad Damrah Yunus dan Ibunda Ermiwati untuk
segala pengorbanannya yang juga selalu memberi doa dan dukungan. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada Wildan Najmal Muttaqin, S.Si, M.Si. atas bantuan dan saran selama
kerja di laboratorium; Ibu Tini, Ibu Ani, kepada teman-teman di kosan pemberi semangat Isya,
Yasinta dan Nur Laeli; di biologi 45 Rani, Yanti, Lili, Dalfit, Anas, Adit, Agus, dan zoocorner
serta atas bantuan dalam kerja laboratorium; serta keluarga besar dosen di zoologi atas bantuan
dan saran selama penulis melakukan penelitian ini.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, September 2012
Delvi Riana
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Payakumbuh Provinsi Sumatra Barat pada tanggal 3 Desember 1989
dari pasangan A. Damrah Yunus dan Ermiwati. Penulis merupakan anak kedelapan dari delapan
bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar dan menengah di SDN 6 Balai Nan Tuo
Tiakar pada tahun 2002, SMPN 1 Payakumbuh pada tahun 2005, dan SMAN 1 Payakumbuh
pada tahun 2008. Setelah itu, penulis melanjutkan pendidikan tinggi di Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui Undangan
Seleksi Masuk IPB.
Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Genetika
Molekuler dan Struktur Hewan pada tahun 2012. Penulis juga memperoleh beasiswa dana
Pemerintah Daerah dari Pemda SUMBAR. Penulis juga pernah ikut serta UKM Taekwondo,
berpartisipasi dalam berbagai aktivitas keorganisasian selama masa orientasi mahasiswa tingkat
fakultas dan departemen sebagai komisi disiplin, penulis pernah menjadi staf marketing Buletin
Chepalos. Selama menempuh studi di Departemen Biologi, penulis juga pernah melakukan
penelitian dalam studi lapang mengenai Status Populasi Macaca fascicularis di Pangandaran pada
tahun 2010 dan praktik lapangan di Laboratorium Genetika, Bidang Zoologi, Puslit Biologi, LIPI
mengenai Teknologi DNA Barcode pada Nectarinidae pada tahun 2011.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................... viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1
Latar Belakang ............................................................................................................... 1
Tujuan ........................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1
Sampel Darah Domba..................................................................................................... 1
Ekstraksi dan Isolasi DNA.............................................................................................. 1
Amplifikasi dan Perunutan Nukleotida............................................................................ 2
Analisis Data.................................................................................................................. 2
HASIL ........................................................................................................................................ 2
PEMBAHASAN ......................................................................................................................... 4
SIMPULAN ................................................................................................................................ 5
SARAN ....................................................................................................................................... 5
UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................................................ 5
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 5
LAMPIRAN ................................................................................................................................ 7
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jarak genetik spesies Ovis aries .................................................................................................... 3
2 Skor nilai uji FAMC dan jumlah FEC domba yang dianalisis ...................................................... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Posisi penempelan primer AF22 dan AF23 mengacu pada genom mitokondria O. aries
(GenBank no.ACC. AF010406)..................................................................................................... 2
2 Amplikon Control Region berpita tunggal diatas gel poliakrilamid.................................................. 2
3 Pohon filogeni antar bangsa domba dengan haplotipe A dan haplotipe B berdasarkan Control
Region genom mitokondria ............................................................................................................ 3
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Laporan 2011 “Genetic Variation on the Control of Resistance to Infectious Diseases in
Indonesian Small Ruminants for Improving Animal Productivity’’............................................... 8
2 Tahapan ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid KIT................................................ 9
3 Visualisasi fragmen DNA dengan metode sensitif perak............................................................... 10
4 Runutan nukleotida Control Region Ovis Aries................................................................................. 11
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba (Ovis aries) merupakan salah
satu ternak ruminansia kecil yang memiliki
peran penting bagi kehidupan manusia, antara
lain sebagai sumber protein hewani, ternak
simpanan dan objek dalam tatanan sosial
budaya. Budidaya domba di daerah tropis
basah seperti di Indonesia sering mengalami
kendala antara lain mudah terinfeksi oleh
cacing parasit. Domba yang terinfeksi oleh
cacing parasit akan mengalami penurunan
berat badan, kualitas daging dan produksi susu
(Kusumamihardja 1992).
Haemonchus contortus merupakan
salah satu jenis cacing parasit yang paling
banyak menginfeksi ternak ruminansia kecil.
Cacing ini menyebabkan penyakit yang
disebut
haemonchosis,
yang
dapat
menyebabkan anemia dan kerusakan pada
saluran pencernaan. Cacing ini tidak
membutuhkan inang antara. Siklus hidupnya
diawali ketika di dalam tubuh inang cacing
akan bertelur, kemudian telur-telur cacing
dikeluarkan bersamaan dengan keluarnya
feses. Jika kondisi lingkungan mendukung,
maka telur cacing akan menetas yang
kemudian berkembang menjadi larva di
rerumputan. Larva cacing masuk ke dalam
tubuh bersamaan dengan masuknya makanan,
kemudian larva akan berkembang menjadi
cacing dewasa di abomasum (Browning
2006).
Domba lokal Indonesia biasanya
dikelompokkan dan dinamai berdasarkan
daerah asalnya, misalnya domba madura,
domba indramayu, domba sumbawa, domba
rote, domba kisar, domba donggala, domba
jawa, domba sumatra dan domba garut,
sedangkan berdasarkan penampilan morfologi
misalnya domba ekor tipis dan domba ekor
gemuk. Selain itu, kombinasi dari keduanya
misalnya domba sumatra ekor tipis, domba
jawa ekor tipis dan domba jawa ekor gemuk.
Artinya, domba lokal Indonesia belum bisa
dikelompokkan dalam bangsa-bangsa yang
saling berbeda.
Dalam penelitian untuk mencari gengen resisten terhadap cacing parasit telah
ditemukan adanya respon fisiologis yang
inkonsisten pada kelompok-kelompok domba
lokal terhadap uji tantang larva cacing parasit
(Muladno et al. 2011). Krisnayana (2011)
menduga bahwa domba-domba lokal di
Indonesia mempunyai
potensi kekebalan
terhadap infeksi H. contortus. Untuk itu,
dalam penelitian ini kami melakukan
pelacakan asal-usul maternal domba yang
digunakan oleh keduanya (Lampiran 1)
menggunakan penanda genetik control region
genom mitokondria. Hal ini dimaksudkan
untuk menentukan kepastian bangsa domba
lokal yang digunakan. Dengan begitu,
penelitian ini diharapkan menjadi kunci
penting untuk menerangkan adanya potensi
kekebalan domba lokal terhadap cacing H.
contortus. Gill (1991) melaporkan telah
menemukan bangsa domba Merino di
Australia yang tahan terhadap infeksi cacing
H. contortus. Bangsa-bangsa domba lain di
dunia juga banyak dilaporkan tahan terhadap
infeksi H. contortus (di-review dalam Soulsby
1982).
Meadows (2005) menyebutkan bahwa
ruas control region
genom mitokondria
banyak digunakan untuk menjelaskan
kompleksitas dan asal usul genetik pada
domba. Control region memiliki tingkat
polimorfisme tinggi dan mempunyai laju
mutasi yang lebih cepat dibandingkan dengan
ruas lain genom mitokondria, hal ini
menyebabkan urutan nukleotida control
region sangat bervariasi antar individu.
Berdasarkan runutan nukleotida ruas control
region, domba di dunia dikelompokkan
menjadi dua kelompok garis keturunan, yaitu
domba haplotipe A (Tipe Asia) dan domba
haplotipe B (Tipe Eropa) (Muttaqin 2010).
Selain itu, berdasarkan bagian yang lain dari
ruas
genom
mitokondria,
domba
dikelompokkan menjadi beberapa garis
keturunan yaitu haplotipe D, E dan F (Wood
& Phua 1996; Hiendleder 1998).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menganalisis
latar belakang genetik Ovis aries yang
menjadi sampel uji tantang larva parasit
cacing Haemonchus contortus berdasarkan
control region genom mitokondria.
BAHAN DAN METODE
Sampel Darah Domba
Sebanyak 36 sampel darah (whole
blood) domba yang merupakan koleksi Prof.
Dr. Ir. Muladno, MSA. Fakultas Peternakan,
IPB. Sampel darah tersebut diperoleh dari
domba domba ekor gemuk (DEG) dan domba
ekor tipis (DET) yang berasal dari berbagai
daerah di Pulau Jawa. Sampel darah domba
disimpan dalam alkohol 70%.
2
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Molekul DNA total diekstrasi dari selsel darah menggunakan DNA Extraction Kit
for animal blood (Geneaid) yang dimodifikasi
untuk sampel darah yang disimpan dalam
alkohol 70% (Lampiran 2).
et al. 2009). Sampel dengan kualitas amplikon
yang menampilkan pita tunggal pada gel
poliakrilamid selanjutnya dijadikan cetakan
dalam reaksi PCR for sequencing dengan
metode big dye terminator menggunakan
primer yang sama dengan amplifikasi awal.
Amplifikasi dan Perunutan Nukleotida
Amplifikasi ruas control region genom
mitokondria dilakukan menggunakan primer
foward AF22 5’GCGTACGCAATCTTACG
ATCA dan primer reverse AF23 5’ATGCA
GTTAAGTCCAGCTAC. Primer AF22 dan
AF23 menempel pada sebagian daerah Cytb,
tRNA dan sebagian besar control region
dengan ukuran 1390 bp (Gambar 1).
Komposisi pereaksi PCR dalam volume 50 l
terdiri atas sampel DNA sekitar 10-100 ng,
primer reverse dan primer forward masingmasing 2 µL, 2.5 mM dNTP, 0.4 unit Taq
Polimerase dan 0.25 mM buffer yang
mengandung MgCl2. Reaksi PCR dilakukan
dengan kondisi pradenaturasi 94oC selama 10
menit kemudian 25 siklus yang terdiri atas
tahap denaturasi pada suhu 94oC selama 4
menit, tahap penempelan primer pada suhu
60oC selama 1 menit, tahap pemanjangan ruas
DNA pada suhu 72oC selama 1,5 menit,dan
diakhiri dengan tahapan pemanjangan akhir
ruas DNA pada suhu 72oC selama 7 menit.
Total siklus PCR adalah 25 siklus.
Amplikon diuji dengan metode
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)
6% yang dijalankan pada tegangan 250 V
selama 30 menit kemudian dilanjutkan dengan
pewarnaan sensitif perak (Lampiran 3, Byun
Analisis Data
Hasil runutan nukleotida setiap sampel
diedit dan saling disejajarkan antar mereka
menggunakan ClustalW 1.8 yang terdapat
dalam MEGA v5 (Tamura et al. 2011).
Pensejajaran kemudian melibatkan runutan
nukleotida haplotipe A (tipe Asia, No. ACC.
AF010406) dan haplotipe B (tipe Eropa, No.
ACC. AF010407) (Lampiran 4). Analisis
DNA berikutnya meliputi jarak genetik
berdasarkan model substitusi Kimura 2
Parameter dan rekonstruksi pohon filogeni
menggunakan metode Neighbor Joining
dengan uji bootstrap 1000x. Jarak genetik dan
pohon filogeni kemudian diplotkan terhadap
hasil uji tantang infeksi cacing menggunakan
model linear umum (general linear model).
HASIL
Tingkat keberhasilan amplifikasi PCR
ruas CR domba dengan kualitas pita tunggal
dan tebal pada gel polyacrilamide gel
electrophoresis (PAGE) 6% (Gambar 2)
adalah 75% atau 27 dari 36 sampel. Runutan
nukleotida hasil sekuensing yang bisa dibaca
dengan baik dan tidak memberikan data yang
ambigu ada sebanyak 13 (36%) sampel.
1000 bp
Gambar 1 Posisi penempelan primer AF22 dan AF23
mengacu pada genom mitokondria O. aries
(GenBank no. ACC. AF010406 dan AF010407) [Cyt
b; tRNA Thr ; tRNA Pro; d-loop].
Dari 535 nt (nukleotida) yang saling
sejajar, 471 nt ditemukan sama antar sampel
dan 64 ditemukan berbeda. Dari 64 nt yang
berbeda, 26 nt berupa transisi dan 38 nt
transversi. Rasio antara transisi dan tranversi
rata-rata sebesar 0.68. Jarak genetik terjauh
Gambar 2 Amplikon ruas control region yang
memperlihatkan kualitas pita tunggal berukuran
1390 bp pada gel poliakrilamid. M = DNA ladder 100
bp, 1, 2 dan 3= lintasan sampel
adalah 0.22, yaitu antara sampel No. 25 DET
dengan Haplotipe A dan jarak terdekat adalah
0.03, yaitu antara sampel No. 22 DET, 23
DET, dan 26 DET dengan sampel No. 1 DEG,
serta sampel No. 11 DEG dengan sampel No.
10 DEG (Tabel 1).
3
Hasil rekonstruksi filogeni menemukan
bahwa haplotipe A mengelompok bersamasama dengan sampel No. 2 DEG, 22 DET, 23
DET
dan 26 DET ; dan haplotipe B
mengelompok bersama-sama dengan sampel
No. 2 DEG, 8 DEG, 10 DEG, 11 DEG, 13
DEG, 18 DEG, 25 DET, 27 DET, dan 40
DET (Gambar 3).
22 DET
23 DET
26 DET
2 DEG
8 DEG
10 DEG
11 DEG
13 DEG
18 DEG
25 DET
27 DET
40 DET
Hap A
1 DEG
22 DET
23 DET
26 DET
2 DEG
8 DEG
10 DEG
11 DEG
13 DEG
18 DEG
25 DET
27 DET
40 DET
Hap B
1DE G
Sampel
Hap A
Tabel 1 Jarak genetik antar sampel domba ekor gemuk (DEG), domba ekor tipis (DET), haplotipe A dan
haplotipe B berdasarkan model subtitusi Kimura 2 Parameter
0,11
0,11
0,11
0,12
0,17
0,15
0,15
0,15
0,17
0,17
0,22
0,16
0,20
0,16
0,03
0,03
0,03
0,10
0,06
0,06
0,07
0,08
0,09
0,14
0,09
0,13
0,09
0,04
0,05
0,11
0,09
0,07
0,09
0,10
0,11
0,15
0,10
0,14
0,11
0,05
0,12
0,08
0,07
0,07
0,10
0,11
0,15
0,11
0,14
0,10
0,11
0,08
0,07
0,09
0,10
0,12
0,16
0,11
0,15
0,11
0,07
0,05
0,06
0,07
0,09
0,11
0,08
0,12
0,08
0,04
0,04
0,05
0,06
0,11
0,06
0,10
0,04
0,03
0,05
0,06
0,10
0,06
0,09
0,05
0,06
0,05
0,12
0,07
0,10
0,04
0,07
0,10
0,06
0,10
0,07
0,10
0,08
0,07
0,07
0,07
0,12
0,12
0,10
0,08
0,10
Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeni antar bangsa domba ekor gemuk (DEG) dan domba ekor tipis
(DET) dengan haplotipe A dan haplotipe B berdasarkan control region genom mitokondria
menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x.
4
rata-rata Fecal Eeg Count (FEC) adalah 3412.
Kedua nilai tersebut tidak dapat dibedakan
(P
TAHAN TERHADAP PARASIT CACING BERDASARKAN
CONTROL REGION GENOM MITOKONDRIA
DELVI RIANA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
DELVI RIANA. Latar Belakang Genetik Domba Lokal yang Tahan Parasit Cacing berdasarkan
Control Region Genom Mitokondria. Dibawah bimbingan ACHMAD FARAJALLAH dan
MULADNO.
Dalam penelitian untuk mencari gen-gen resisten terhadap cacing parasit telah ditemukan
adanya respon fisiologis yang inkonsisten pada kelompok-kelompok domba lokal terhadap uji
tantang larva cacing parasit. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis latar belakang genetik
domba lokal yang tahan terhadap infeksi parasit cacing yaitu asal usul maternal berdasarkan ruas
control region pada genom mitokondria. Tahapan metode penelitian terdiri atas isolasi DNA dari
darah 36 domba ekor gemuk dan domba ekor tipis. Analisis runutan nukleotida diperoleh data
yang tidak ambiguous ada sebanyak 13 (36 %) sampel, yang terdiri dari 4 domba dari Haplotipe A
dan 9 domba dari Haplotipe B. Analisis rata-rata nilai Famacha (FAMC) dan jumlah Fecal Eeg
Count (FEC) menunjukan adanya inkonsistensi, artinya indikasi anemia pada domba tidak
berkorelasi dengan banyaknya telur cacing yang menginfestasi. Namun begitu, nilai skor FAMC
dan jumlah FEC pada haplotipe A cenderung lebih rendah dibandingkan dengan haplotipe B.
Dengan kata lain, haplotipe domba bukan faktor yang membedakan dalam uji tantang yang
dilakukan sebelumnya.
kata kunci : tahan infeksi, latar belakang genetik, domba ekor gemuk, domba ekor tipis
ABSTRACT
DELVI RIANA. Genetic Background Parasite Resistance of Local Sheep based on Control
Region Genom Mithocondria. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and MULADNO.
In a study to find genes resistant to parasitic worms have been found inconsistent the physiological
response to groups of local sheep against parasitic worm larvae challenge test. This study to
analyze the genetic background of local sheep that resistant to the parasitic worm infection based
of maternal origin on control region in the mitochondrial genome. Stages of research methods
consisted of DNA isolated from the blood of 36 fat tail sheep and thin tail sheep. Analysis of the
data obtained traces of nucleotides that is not ambiguous as many as 13 (36%) of the sample, this
samples consisted of 4 sheeps from haplotype A and 9 sheeps from haplotype B. Analysis of the
average value score of Famacha (FAMC) and the number of Fecal Eeg Count (FEC) shows the
inconsistency, it mean is an indication of anemia in sheep did not correlate with the number of
eggs of worms that infest. However, the value score of FAMC and number of FEC on haplotype A
was lower compared with haplotype B. In other words, haplotype sheep is not a factor that
distinguishes the challenge test performed previously.
keywords: resistant infections, genetic background, fat tail sheep, thin tail sheep
LATAR BELAKANG GENETIK DOMBA LOKAL YANG
TAHAN TERHADAP PARASIT CACING BERDASARKAN
CONTROL REGION GENOM MITOKONDRIA
DELVI RIANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi
:
Nama
NIM
:
:
Latar Belakang Genetik Domba Lokal yang Tahan
terhadap Parasit Cacing Berdasarkan Control Region
Genom Mitokondria
Delvi Riana
G34080010
Menyetujui,
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
Pembimbing I
Prof. Dr. Ir. Muladno, MSA
Pembimbing II
Mengetahui,
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
Ketua Departemen Biologi
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia-Nya,
sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Latar Belakang Genetik
Domba Lokal yang Tahan terhadap Parasit Cacing Berdasarkan Control Region Genom
Mitokondria” ini dilakukan mulai Januari 2012 sampai dengan Juni 2012 di Laboratorium
Molekuler Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini didanai dari Prof. Dr. Ir. Muladno,
MSA dan Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si. Oleh karena itu, saya ucapkan terima kasih.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Achmad Farajallah, M. Si. dan Prof. Dr. Ir.
Muladno, MSA atas bimbingan dan arahan yang diberikan. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada Dr. Nunik Sri Ariyanti, M. Si. selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang
telah bersedia menguji dan memberikan saran saat ujian dan penulisan karya ilmiah. Penulis
mengucapkan terima kasih kepada ayahanda Ahmad Damrah Yunus dan Ibunda Ermiwati untuk
segala pengorbanannya yang juga selalu memberi doa dan dukungan. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada Wildan Najmal Muttaqin, S.Si, M.Si. atas bantuan dan saran selama
kerja di laboratorium; Ibu Tini, Ibu Ani, kepada teman-teman di kosan pemberi semangat Isya,
Yasinta dan Nur Laeli; di biologi 45 Rani, Yanti, Lili, Dalfit, Anas, Adit, Agus, dan zoocorner
serta atas bantuan dalam kerja laboratorium; serta keluarga besar dosen di zoologi atas bantuan
dan saran selama penulis melakukan penelitian ini.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, September 2012
Delvi Riana
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Payakumbuh Provinsi Sumatra Barat pada tanggal 3 Desember 1989
dari pasangan A. Damrah Yunus dan Ermiwati. Penulis merupakan anak kedelapan dari delapan
bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar dan menengah di SDN 6 Balai Nan Tuo
Tiakar pada tahun 2002, SMPN 1 Payakumbuh pada tahun 2005, dan SMAN 1 Payakumbuh
pada tahun 2008. Setelah itu, penulis melanjutkan pendidikan tinggi di Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui Undangan
Seleksi Masuk IPB.
Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Genetika
Molekuler dan Struktur Hewan pada tahun 2012. Penulis juga memperoleh beasiswa dana
Pemerintah Daerah dari Pemda SUMBAR. Penulis juga pernah ikut serta UKM Taekwondo,
berpartisipasi dalam berbagai aktivitas keorganisasian selama masa orientasi mahasiswa tingkat
fakultas dan departemen sebagai komisi disiplin, penulis pernah menjadi staf marketing Buletin
Chepalos. Selama menempuh studi di Departemen Biologi, penulis juga pernah melakukan
penelitian dalam studi lapang mengenai Status Populasi Macaca fascicularis di Pangandaran pada
tahun 2010 dan praktik lapangan di Laboratorium Genetika, Bidang Zoologi, Puslit Biologi, LIPI
mengenai Teknologi DNA Barcode pada Nectarinidae pada tahun 2011.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................... viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1
Latar Belakang ............................................................................................................... 1
Tujuan ........................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1
Sampel Darah Domba..................................................................................................... 1
Ekstraksi dan Isolasi DNA.............................................................................................. 1
Amplifikasi dan Perunutan Nukleotida............................................................................ 2
Analisis Data.................................................................................................................. 2
HASIL ........................................................................................................................................ 2
PEMBAHASAN ......................................................................................................................... 4
SIMPULAN ................................................................................................................................ 5
SARAN ....................................................................................................................................... 5
UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................................................ 5
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 5
LAMPIRAN ................................................................................................................................ 7
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jarak genetik spesies Ovis aries .................................................................................................... 3
2 Skor nilai uji FAMC dan jumlah FEC domba yang dianalisis ...................................................... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Posisi penempelan primer AF22 dan AF23 mengacu pada genom mitokondria O. aries
(GenBank no.ACC. AF010406)..................................................................................................... 2
2 Amplikon Control Region berpita tunggal diatas gel poliakrilamid.................................................. 2
3 Pohon filogeni antar bangsa domba dengan haplotipe A dan haplotipe B berdasarkan Control
Region genom mitokondria ............................................................................................................ 3
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Laporan 2011 “Genetic Variation on the Control of Resistance to Infectious Diseases in
Indonesian Small Ruminants for Improving Animal Productivity’’............................................... 8
2 Tahapan ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid KIT................................................ 9
3 Visualisasi fragmen DNA dengan metode sensitif perak............................................................... 10
4 Runutan nukleotida Control Region Ovis Aries................................................................................. 11
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba (Ovis aries) merupakan salah
satu ternak ruminansia kecil yang memiliki
peran penting bagi kehidupan manusia, antara
lain sebagai sumber protein hewani, ternak
simpanan dan objek dalam tatanan sosial
budaya. Budidaya domba di daerah tropis
basah seperti di Indonesia sering mengalami
kendala antara lain mudah terinfeksi oleh
cacing parasit. Domba yang terinfeksi oleh
cacing parasit akan mengalami penurunan
berat badan, kualitas daging dan produksi susu
(Kusumamihardja 1992).
Haemonchus contortus merupakan
salah satu jenis cacing parasit yang paling
banyak menginfeksi ternak ruminansia kecil.
Cacing ini menyebabkan penyakit yang
disebut
haemonchosis,
yang
dapat
menyebabkan anemia dan kerusakan pada
saluran pencernaan. Cacing ini tidak
membutuhkan inang antara. Siklus hidupnya
diawali ketika di dalam tubuh inang cacing
akan bertelur, kemudian telur-telur cacing
dikeluarkan bersamaan dengan keluarnya
feses. Jika kondisi lingkungan mendukung,
maka telur cacing akan menetas yang
kemudian berkembang menjadi larva di
rerumputan. Larva cacing masuk ke dalam
tubuh bersamaan dengan masuknya makanan,
kemudian larva akan berkembang menjadi
cacing dewasa di abomasum (Browning
2006).
Domba lokal Indonesia biasanya
dikelompokkan dan dinamai berdasarkan
daerah asalnya, misalnya domba madura,
domba indramayu, domba sumbawa, domba
rote, domba kisar, domba donggala, domba
jawa, domba sumatra dan domba garut,
sedangkan berdasarkan penampilan morfologi
misalnya domba ekor tipis dan domba ekor
gemuk. Selain itu, kombinasi dari keduanya
misalnya domba sumatra ekor tipis, domba
jawa ekor tipis dan domba jawa ekor gemuk.
Artinya, domba lokal Indonesia belum bisa
dikelompokkan dalam bangsa-bangsa yang
saling berbeda.
Dalam penelitian untuk mencari gengen resisten terhadap cacing parasit telah
ditemukan adanya respon fisiologis yang
inkonsisten pada kelompok-kelompok domba
lokal terhadap uji tantang larva cacing parasit
(Muladno et al. 2011). Krisnayana (2011)
menduga bahwa domba-domba lokal di
Indonesia mempunyai
potensi kekebalan
terhadap infeksi H. contortus. Untuk itu,
dalam penelitian ini kami melakukan
pelacakan asal-usul maternal domba yang
digunakan oleh keduanya (Lampiran 1)
menggunakan penanda genetik control region
genom mitokondria. Hal ini dimaksudkan
untuk menentukan kepastian bangsa domba
lokal yang digunakan. Dengan begitu,
penelitian ini diharapkan menjadi kunci
penting untuk menerangkan adanya potensi
kekebalan domba lokal terhadap cacing H.
contortus. Gill (1991) melaporkan telah
menemukan bangsa domba Merino di
Australia yang tahan terhadap infeksi cacing
H. contortus. Bangsa-bangsa domba lain di
dunia juga banyak dilaporkan tahan terhadap
infeksi H. contortus (di-review dalam Soulsby
1982).
Meadows (2005) menyebutkan bahwa
ruas control region
genom mitokondria
banyak digunakan untuk menjelaskan
kompleksitas dan asal usul genetik pada
domba. Control region memiliki tingkat
polimorfisme tinggi dan mempunyai laju
mutasi yang lebih cepat dibandingkan dengan
ruas lain genom mitokondria, hal ini
menyebabkan urutan nukleotida control
region sangat bervariasi antar individu.
Berdasarkan runutan nukleotida ruas control
region, domba di dunia dikelompokkan
menjadi dua kelompok garis keturunan, yaitu
domba haplotipe A (Tipe Asia) dan domba
haplotipe B (Tipe Eropa) (Muttaqin 2010).
Selain itu, berdasarkan bagian yang lain dari
ruas
genom
mitokondria,
domba
dikelompokkan menjadi beberapa garis
keturunan yaitu haplotipe D, E dan F (Wood
& Phua 1996; Hiendleder 1998).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menganalisis
latar belakang genetik Ovis aries yang
menjadi sampel uji tantang larva parasit
cacing Haemonchus contortus berdasarkan
control region genom mitokondria.
BAHAN DAN METODE
Sampel Darah Domba
Sebanyak 36 sampel darah (whole
blood) domba yang merupakan koleksi Prof.
Dr. Ir. Muladno, MSA. Fakultas Peternakan,
IPB. Sampel darah tersebut diperoleh dari
domba domba ekor gemuk (DEG) dan domba
ekor tipis (DET) yang berasal dari berbagai
daerah di Pulau Jawa. Sampel darah domba
disimpan dalam alkohol 70%.
2
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Molekul DNA total diekstrasi dari selsel darah menggunakan DNA Extraction Kit
for animal blood (Geneaid) yang dimodifikasi
untuk sampel darah yang disimpan dalam
alkohol 70% (Lampiran 2).
et al. 2009). Sampel dengan kualitas amplikon
yang menampilkan pita tunggal pada gel
poliakrilamid selanjutnya dijadikan cetakan
dalam reaksi PCR for sequencing dengan
metode big dye terminator menggunakan
primer yang sama dengan amplifikasi awal.
Amplifikasi dan Perunutan Nukleotida
Amplifikasi ruas control region genom
mitokondria dilakukan menggunakan primer
foward AF22 5’GCGTACGCAATCTTACG
ATCA dan primer reverse AF23 5’ATGCA
GTTAAGTCCAGCTAC. Primer AF22 dan
AF23 menempel pada sebagian daerah Cytb,
tRNA dan sebagian besar control region
dengan ukuran 1390 bp (Gambar 1).
Komposisi pereaksi PCR dalam volume 50 l
terdiri atas sampel DNA sekitar 10-100 ng,
primer reverse dan primer forward masingmasing 2 µL, 2.5 mM dNTP, 0.4 unit Taq
Polimerase dan 0.25 mM buffer yang
mengandung MgCl2. Reaksi PCR dilakukan
dengan kondisi pradenaturasi 94oC selama 10
menit kemudian 25 siklus yang terdiri atas
tahap denaturasi pada suhu 94oC selama 4
menit, tahap penempelan primer pada suhu
60oC selama 1 menit, tahap pemanjangan ruas
DNA pada suhu 72oC selama 1,5 menit,dan
diakhiri dengan tahapan pemanjangan akhir
ruas DNA pada suhu 72oC selama 7 menit.
Total siklus PCR adalah 25 siklus.
Amplikon diuji dengan metode
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)
6% yang dijalankan pada tegangan 250 V
selama 30 menit kemudian dilanjutkan dengan
pewarnaan sensitif perak (Lampiran 3, Byun
Analisis Data
Hasil runutan nukleotida setiap sampel
diedit dan saling disejajarkan antar mereka
menggunakan ClustalW 1.8 yang terdapat
dalam MEGA v5 (Tamura et al. 2011).
Pensejajaran kemudian melibatkan runutan
nukleotida haplotipe A (tipe Asia, No. ACC.
AF010406) dan haplotipe B (tipe Eropa, No.
ACC. AF010407) (Lampiran 4). Analisis
DNA berikutnya meliputi jarak genetik
berdasarkan model substitusi Kimura 2
Parameter dan rekonstruksi pohon filogeni
menggunakan metode Neighbor Joining
dengan uji bootstrap 1000x. Jarak genetik dan
pohon filogeni kemudian diplotkan terhadap
hasil uji tantang infeksi cacing menggunakan
model linear umum (general linear model).
HASIL
Tingkat keberhasilan amplifikasi PCR
ruas CR domba dengan kualitas pita tunggal
dan tebal pada gel polyacrilamide gel
electrophoresis (PAGE) 6% (Gambar 2)
adalah 75% atau 27 dari 36 sampel. Runutan
nukleotida hasil sekuensing yang bisa dibaca
dengan baik dan tidak memberikan data yang
ambigu ada sebanyak 13 (36%) sampel.
1000 bp
Gambar 1 Posisi penempelan primer AF22 dan AF23
mengacu pada genom mitokondria O. aries
(GenBank no. ACC. AF010406 dan AF010407) [Cyt
b; tRNA Thr ; tRNA Pro; d-loop].
Dari 535 nt (nukleotida) yang saling
sejajar, 471 nt ditemukan sama antar sampel
dan 64 ditemukan berbeda. Dari 64 nt yang
berbeda, 26 nt berupa transisi dan 38 nt
transversi. Rasio antara transisi dan tranversi
rata-rata sebesar 0.68. Jarak genetik terjauh
Gambar 2 Amplikon ruas control region yang
memperlihatkan kualitas pita tunggal berukuran
1390 bp pada gel poliakrilamid. M = DNA ladder 100
bp, 1, 2 dan 3= lintasan sampel
adalah 0.22, yaitu antara sampel No. 25 DET
dengan Haplotipe A dan jarak terdekat adalah
0.03, yaitu antara sampel No. 22 DET, 23
DET, dan 26 DET dengan sampel No. 1 DEG,
serta sampel No. 11 DEG dengan sampel No.
10 DEG (Tabel 1).
3
Hasil rekonstruksi filogeni menemukan
bahwa haplotipe A mengelompok bersamasama dengan sampel No. 2 DEG, 22 DET, 23
DET
dan 26 DET ; dan haplotipe B
mengelompok bersama-sama dengan sampel
No. 2 DEG, 8 DEG, 10 DEG, 11 DEG, 13
DEG, 18 DEG, 25 DET, 27 DET, dan 40
DET (Gambar 3).
22 DET
23 DET
26 DET
2 DEG
8 DEG
10 DEG
11 DEG
13 DEG
18 DEG
25 DET
27 DET
40 DET
Hap A
1 DEG
22 DET
23 DET
26 DET
2 DEG
8 DEG
10 DEG
11 DEG
13 DEG
18 DEG
25 DET
27 DET
40 DET
Hap B
1DE G
Sampel
Hap A
Tabel 1 Jarak genetik antar sampel domba ekor gemuk (DEG), domba ekor tipis (DET), haplotipe A dan
haplotipe B berdasarkan model subtitusi Kimura 2 Parameter
0,11
0,11
0,11
0,12
0,17
0,15
0,15
0,15
0,17
0,17
0,22
0,16
0,20
0,16
0,03
0,03
0,03
0,10
0,06
0,06
0,07
0,08
0,09
0,14
0,09
0,13
0,09
0,04
0,05
0,11
0,09
0,07
0,09
0,10
0,11
0,15
0,10
0,14
0,11
0,05
0,12
0,08
0,07
0,07
0,10
0,11
0,15
0,11
0,14
0,10
0,11
0,08
0,07
0,09
0,10
0,12
0,16
0,11
0,15
0,11
0,07
0,05
0,06
0,07
0,09
0,11
0,08
0,12
0,08
0,04
0,04
0,05
0,06
0,11
0,06
0,10
0,04
0,03
0,05
0,06
0,10
0,06
0,09
0,05
0,06
0,05
0,12
0,07
0,10
0,04
0,07
0,10
0,06
0,10
0,07
0,10
0,08
0,07
0,07
0,07
0,12
0,12
0,10
0,08
0,10
Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeni antar bangsa domba ekor gemuk (DEG) dan domba ekor tipis
(DET) dengan haplotipe A dan haplotipe B berdasarkan control region genom mitokondria
menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x.
4
rata-rata Fecal Eeg Count (FEC) adalah 3412.
Kedua nilai tersebut tidak dapat dibedakan
(P