Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum B134 dan β-Galaktosidase dengan Natrium Alginat dan Potensi Hidrolisisnya pada Susu UHT Skim dan Berlemak
AMOBILISASI SEL Lactobacillus plantarum B134 DAN β-GALAKTOSIDASE
DENGAN NATRIUM ALGINAT DAN POTENSI HIDROLISISNYA PADA
SUSU UHT SKIM DAN BERLEMAK
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Amobilisasi Sel Lactobacillus
plantarum B134 dan β-Galaktosidase dengan Natrium Alginat dan Potensi
Hidrolisisnya pada Susu Skim dan Susu Berlemak UHT adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
Perguruan Tinggi mana pun. Tema dan penelitian ini merupakan bagian dari proyek
penelitian yang didanai oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI (Proyek PKPP 2012 dan
DIPA 2013). Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya ini milik Institut
Petanian Bogor. Namun, data yang berada dalam tesis ini milik Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia.
Bogor, September 2014
Lusiana Kresnawati Hartono
NIM G851130446
RINGKASAN
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum
B134 dan β-Galaktosidase dengan Natrium Alginat dan Potensi Hidrolisisnya pada Susu
UHT Skim dan Berlemak. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TATIK
KHUSNIATI.
Susu merupakan salah satu produk pangan yang memiliki nilai gizi yang baik.
Sayangnya, konsumsi susu Indonesia hanya 11.09 per liter per kapita per tahun.
Minimnya konsumsi susu dapat disebabkan karena intoleransi laktosa yaitu
ketimakmampuan tubuh untuk mencerna laktosa karena tidak memiliki β-galaktosidase.
Solusi alternatifnya adalah mengolah susu sampai kadar laktosanya menjadi rendah
menggunakan β-galaktosidase dari mikroorganisme. L. plantarum B134 merupakan
bakteri asam laktat dari Indonesia yang memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi.
Penggunaan β-galaktosidase lebih efisien apabila dilakukan teknik penjebakan
(amobilisasi) sehingga dapat digunakan berulang dan dapat menurunkan biaya produksi.
Natrium alginat merupakan matriks penjebak yang murah dan aman untuk
mengamobilisasi enzim dan sel.
Penelitian ini bertujuan untuk menghidrolisis laktosa susu UHT berlemak dan
skim dengan menggunakan sel L. plantarum B134 amobil dan β-galaktosidase amobil.
Tahapan penelitian ini meliputi (1) optimasi amobilisasi sel L.plantarum B134 dan βgalaktosidase dengan natrium alginat, (2) pengaruh pH dan suhu pada sel L.plantarum
B134 dan β-galaktosidase amobil, (3) stabilitas pH dan suhu β-galaktosidase amobil,
(4) hidrolisis laktosa pada susu UHT berlemak dan skim, (5) keterulangan pemakaian
beads sel L. plantarum B134 amobil dan β-galaktosidase amobil, dan (6) penyimpanan
β-galaktosidase amobil.
Sel L. plantarum B134 amobil mencapai optimum pada 1% natrium alginat, 0.1
M CaCl2, dan 12% b/v sel. Aktivitas β-galaktosidase mencapai optimum pada pH 6.5
dan suhu 45ºC selama 5 menit. Efisiensi amobilisasi sel L. plantarum B134 amobil
adalah 28.95%. Laktosa susu UHT berlemak terhidrolisis sebesar 85.45% selama 12 jam
sedangkan pada susu UHT skim sebesar 91.26% selama 9 jam. Sel L. plantarum B134
amobil dapat digunakan untuk kedua tipe susu UHT sebanyak 4 kali.
β-Galaktosidase amobil mencapai optimum pada 1% natrium alginat, 0.1 M
CaCl2, dan 26 U β-galaktosidase. Aktivitas β-galaktosidase amobil mencapai optimum
pada pH 5.5, suhu 35ᵒC selama 15 menit. Efisiensi amobilisasi β-galaktosidase amobil
adalah 96.69%. Stabiltas pH tercapai pada pH 5 dan stabilitas suhu pada 30ºC. Nilai Km
dan Vmaks β-galaktosidase masing-masing sebesar 30.487 mM dan 1.742 μmol/menit.
β-Galaktosidase amobil mereduksi 80.55% laktosa UHT belemak selama 15 jam dan
93.06% laktosa UHT skim selama 6 jam. β-Galaktosidase amobil dapat digunakan 3
kali untuk hidrolisis laktosa susu UHT berlemak dan 6 kali untuk susu UHT skim.
Setelah penyipanan 35 hari pada suhu 4ºC, β-galaktosidase masih memiliki aktivitas
relatif β-galaktosidase sebesar 52.01%.
Kata kunci: amobil, β-galaktosidase, Lactobacillus plantarum B134, natrium alginat,
UHT.
SUMMARY
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Immobilization of Lactobacillus plantarum
B134 Cell and β-Galactosidase using Sodium Alginate and Its Hydrolysis Potency in
UHT Skim and Whole Milk. Supervised by I MADE ARTIKA and TATIK
KHUSNIATI.
Milk is a food product with a high level of nutrition. Milk consumption in
Indonesia is only 11.09 per capita per liter per year. Lactose intolerance is being the
factor. Lactose intolerant individuals can not hydrolyse lactose byself because lack of βgalactosidase. As a solution, lactose in milk can be reduced using microorganism βgalactosidase. L. plantarum B134 is local lactic acid bacterial strain from Indonesia
which has high activity of β-galactosidase. The use of β-galactosidase is more efficient
when conducted with trapping techniques (immobilization) so that it can be used over
and over and can lower the cost of production. Sodium alginate matrix trapper is a
cheap and safe for immobilization of enzymes and cells.
The aim of this research was to immobilize cells and β-galactosidase for
reducuction of lactose in UHT whole and skim milk. Stages of this research were (1)
optimization of immobilized L. plantarum B134 cells and β-galactosidase using sodium
alginate, (2) effect of pH and temperature on immobilized L. plantarum B134 cells and
β-galactosidase, (3) stability of pH and temperature on immobilized β-galactosidase, (4)
lactose hydrolysis in UHT whole and skim milk, (5) reusability of immobilized L.
plantarum B134 cells and β-galactosidase, (6) immobilized β-galactosidase stored.
The optimum immobilization of L. plantarum B134 cells was in 1% sodium
alginate, 0.1 M CaCl2, and 12% w/v suspension cells. The optimum immobilization of
β-galactosidase was in 1% sodium alginate, 0.1 M CaCl2, and 26 U v/v enzymes. The
optimum activity of β-galactosidase in immobilized cells was reached in pH 6.5;
temperature 45ºC; incubation time 5 minutes, while the immobilized β-galactosidase
was in pH 5.5; temperature 35ºC; incubation time 15 minutes. Immobilized efficiency
was 28.95% for immobilized cells and 96.69% for immobilized enzyme. Immobilized
β-galactosidase was stable at pH 30ºC and temperature 30ºC. Km and Vmax value of
immobilized β-galactosidase were 30.487 mM and 1.742 μmol/minute, respectively.
The higest percentage of UHT whole milk hydrolyzed by immobilized cells was
reached for 12 hours with value 85.45, while that by immobilized enzyme was 15 hours
with value 80.55%. The higest of UHT skim milk hydrolyzed by immobilized cells was
reached for 9 hours with value 91.26% while that by immobilized enzyme was 6 hours
with value 93.06%. Immobilized cells can be re-used 4 times in both of milk.
Immobilized enzymes can be re-used 3 times in UHT whole milk and 6 times in UHT
skim milk. Immobilized β-galactosidase could be stored at 4ºC for 35 days with the
retained activity was 52.01%.
Key words: β-galactosidase, immobilization, Lactobacillus plantarum B134, sodium
alginates.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu
masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AMOBILISASI SEL Lactobacillus plantarum B134 DAN β-GALAKTOSIDASE
DENGAN NATRIUM ALGINAT DAN POTENSI HIDROLISISNYA PADA
SUSU UHT SKIM DAN BERLEMAK
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Syamsul Falah, S. Hut, M. Sc.
Judul Tesis : Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum B134 dan β-Galaktosidase
dengan Natrium Alginat dan Potensi Hidrolisisnya pada Susu UHT Skim
dan Berlemak
Nama
: Lusiana Kresnawati Hartono
NIM
: G851130446
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir I Made Artika, M.App. Sc
Ketua
Dr Ir Tatik Khusniati, M.App. Sc
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian: 29 Agustus 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah swt atas segala nikmat dan
karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Penelitian ini merupakan
bagian dari penelitian di Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
yang dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Mikroba, Bidang Mikrobiologi dari bulan
Oktober 2013 hingga Februari 2014. Tesis ini berjudul Amobilisasi Sel Lactobacillus
plantarum B134 dan β-Galaktosidase dengan Natrium Alginat dan Potensi
Hidrolisisnya pada Susu Skim dan Susu Berlemak UHT.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
sebagai pembimbing utama dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc sebagai pembimbing
kedua serta sebagai peneliti utama dalam penelitian ini atas arahan penyusunan tesis ini.
Penulis juga mengucapkan kepada keluarga dan teman-teman yang selalu mendukung
penulis.
Penyusunan tesis ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Oleh karena itu,
penulis sangat mengharapkan adanya saran dan kritik yang bermanfaat dalam
pelaksanaan penelitian ini.
Bogor, September 2014
Lusiana Kresnawati Hartono
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
1
1
2
3
3
3
METODE
Bahan
Alat
Prosedur
3
3
3
4
HASIL
Keadaan Amobilisasi Sel L. plantarum B134
Keadaan Amobilisasi β-Galaktosidase dari L. plantarum B134
Pengukuran dan Stabilitas β-Galaktosidase Amobil
Kinetika β-Galaktosidase Amobil
Hidrolisis Laktosa Susu Berlemak dan Skim UHT
Keterulangan Pemakaian Sel L. plantarum B134 Amobil dan
β-Galaktosidase Amobil
Penyimpanan β-Galaktosidase Amobil
8
8
10
11
13
14
16
17
PEMBAHASAN
Produksi Sel L. plantarum B134 dan β-Galaktosidase
Pengaruh pH dan Suhu terhadap β-Galaktosidase setelah Proses Amobil
Stabilitas β-Galaktosidase Amobil
Kinetika β-Galaktosidase Amobil
Hidrolisis Laktosa Susu UHT Skim dan Berlemak
Keterulangan Pemakaian Beads Sel L. plantarum B134 Amobil dan
β-Galaktosidase Amobil
Penyimpanan β-Galaktosidase Amobil
17
17
19
21
22
22
SIMPULAN
25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
35
24
25
DAFTAR GAMBAR
1. Produk oNP yang dihasilkan pada variasi CaCl2
2. Produk yang dihasilkan pada variasi natrium alginat
3. Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai konsentrasi sel
L. plantarum B134
4. Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai pH
5. Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai suhu
6. Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada variasi waktu
pengukuran β-galaktosidase
7. Produk oNP pada berbagai konsentrasi CaCl2 dalam optimasi
amobilisasi β-galaktodisase
8. Produk oNP pada berbagai konsentrasi natrium alginat dalam
optimasi amobilisasi β-galaktodisase
9. Produk oNP pada berbagai konsentrasi β-galaktosidase dalam
optimasi amobilisasi β-galaktodisase
10. Aktivitas β-galaktosidase dalam β-galaktosidase amobil pada
berbagai pH
11. Aktivitas β-galaktosidase dalam β-galaktosidase amobil pada
berbagai suhu
12. Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada berbagai variasi
waktu
13. Stabilitas pH β-galaktosidase amobil
14. Stabilitas suhu β-galaktosidase amobil
15. Kurva Michaelis Menten β-galaktosidase amobil
16. Kurva Line-Weaver Burk β-galaktosidase amobil
17. Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan sel selama 24
jam
18. Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan sel L. plantarum
B134 selama 24 jam
19. Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam
20. Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam
21. Keterulangan pemakaian sel L. plantarum B134 amobil
22. Keterulangan pemakaian β-galaktosidase amobil
23. Peyimpangan β-galaktosidase selama 35 hari
24. Butiran gel
25. Reaksi hidrolisis laktosa
26. Reaksi hidrolisis oNPGal oleh β-galaktosidase
8
9
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
14
15
15
16
17
17
18
18
19
19
20
21
22
22
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Diagram alur penelitian
Perhitungan aktivitas β-galaktosidase
Kurva standar oNP
Kurva standar protein
Optimasi keadaan amobilisasi
Pengaruh pH, suhu, dan waktu inkubasi
Stabilitas pH dan suhu dari β-galaktosidase amobil
Hidrolisis laktosa susu UHT berlemak dan skim
Penyimpanan β-galaktosidase pada suhu 4ᵒC selama 35 hari
Parameter kinetik β-galaktosidase amobil
Riwayat hidup
36
37
38
39
40
41
42
43
44
44
45
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Susu merupakan sumber protein hewani yang mengandung komponen gizi
yang lengkap serta kompleks. Para ahli gizi menyarankan konsumsi susu dan
produknya setiap hari sesuai dengan piramida makanan. Indonesia menjadi negara
terendah di Asia Tenggara dalam konsumsi susu. Wakil Menteri Pertanian
mengatakan bahwa konsumsi susu di Indonesia hanya 11.09 kg per kapita
pertahun, sedangkan Malaysia dan Filipina konsumsinya mencapai 22.1 liter per
kapita per tahun, Thailand 33.7 liter per kapita per tahun, Vietnam 12.1 liter per
kapita per tahun, dan India mencapai 42.08 liter per kapita per tahun (Biro Umum
dan Humas Deptan 2012). Salah satu golongan masyarakat yang tidak
mengonsumsi susu adalah penderita intoleransi laktosa.
Kejadian intoleransi laktosa banyak terjadi pada orang Asia, Afrika, Timur
Tengah, beberapa negara Mediterania, dan juga ras Aborigin Australia
dibandingkan ras Kaukasia. Laktase merupakan enzim yang berperan dalam
pemecahan laktosa yang terdapat dalam mukosa usus halus. Enzim ini akan
memecah laktosa menjadi monosakarida berupa glukosa dan galaktosa yang
mudah diserap oleh tubuh. Keterbatasan laktase akan mengganggu pencernaan
laktosa. Laktosa dalam susu dipecah oleh bakteri dalam usus halus. Proses
fermentasi dapat menyebabkan kembung dan rasa sakit pada perut. Sebagian
laktosa yang tidak dicerna tetap berada dalan saluran pencernaan yang
menyebabkan tidak terjadinya penyerapan air dari feses sehingga akan terjadi
diare (BPOM 2008).
Orang yang kekurangan laktase akan mengalami intoleransi laktosa.
Gejala seseorang mengalami intoleransi laktosa seperti sakit perut, perut kembung,
dan diare. Penyebab terjadinya intoleransi laktosa sebagian besar karena faktor
genetik, yaitu jumlah laktase yang dimiliki lebih sedikit daripada orang normal.
Faktor lain penyebab intoleransi laktosa antara lain gastroenteritis, infeksi parasit,
dan defisiensi besi. Gastroenteritis dapat memicu penguraian enzim laktase yang
dapat berlangsung hingga beberapa minggu. Infeksi parasit dapat menyebabkan
pengurangan jumlah laktase sementara waktu (BPOM 2008).
Susu merupakan salah satu produk pangan yang memiliki kandungan gizi
yang baik. Namun. kandungan laktosa dalam susu sapi segar sekitar 4%
(Sumarjiana 2011). Hal ini menyebabkan penderita intoleransi laktosa tidak dapat
mengonsumsi susu. Salah satu alternatifnya adalah menggunakan β-galaktosidase
(laktase) untuk menghidrolisis laktosa tanpa menurunkan nilai gizi dalam susu.
Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan salah satu golongan bakteri yang dapat
menghasilkan β-galaktosidase. Lactobacillus sp. merupakan salah satu BAL yang
sering digunakan dalam produk makanan dan minuman fermentasi sehingga
keamanannya sudah terjamin (Sumathy et al. 2012). Lactobacillus bulgaricus
mampu menurunkan kandungan laktosa hingga 50-60% (Wierzbicki dan
Kosikowski 1973). β-Galaktosdase yang dipurifikasi parsial dari Lactobacillus
plantarum strain B123 indigenous mampu menurunkan laktosa dalam susu UHT
2
berlemak hingga 60% dan pada susu UHT rendah lemak hingga 81.1% (Mariyani
2013).
Enzim ini dapat dipakai berulang bila menggunakan teknik amobilisasi.
Amobilisasi enzim sering dilakukan karena kualitas produk yang dihasilkan baik
dan enzim dapat dipakai secara berulang (Illanes et al. 2008). Penelitian yang
dilakukan oleh Tanrisven dan Dogan (2002), Pessela et al. (2003, 2004, 2007)
Mariotti et al. (2008), Numano dan Sungur (2004), Goel et al. (2006), Grosova et
al. (2009), Yuningtyas (2011), Klein et al.(2013) menunjukkan bahwa βgalaktosidase amobil dapat menurunkan kadar laktosa dalam susu hingga 70%.
Amobolisasi juga dapat dilakukan pada sel mikroba penghasil β-galaktosidase.
Penurunan kadar laktosa dalam susu skim mencapai 87.8% setelah ditambahkan
sel amobil Kluyveromyces marxianus (Panesar 2007). Sel amobil dari
Kluyveromyces marxianus dapat menurunkan kadar laktosa dalam whey hingga
81.2% (Singh dan Singh 2012).
Alginat tersusun atas heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan
L-guluronat (Najafpour et al. 2004). Alginat merupakan salah satu bahan
penjerap dalam amobilisasi enzim yang sering digunakan. Kelebihan dari alginat
adalah aman, efisien, murah, dan kekuatan gelnya baik sehingga mampu
mempertahankan aktivitas dan stabilitas enzim (Goksungur dan Zorlu 2001).
Yuningtyas (2011) dan Prihantini (2013) menggunakan alginat untuk
mengamobilisasi β-galaktosidase dari bakteri indigen asal Indonesia. Penelitian
Yuningtyas (2011) menunjukkan bahwa aktivitas hidrolisis relatif susu UHT
menggunakan β-galaktosidase amobil mencapai 28.09% dan sel Enterobacter
cloacae amobil mencapai 22.01%. Aktivitas relatif hidrolisis susu UHT dari sel
BAL indigenos D210 sebesar 76.72% dan β-galaktosidase amobil sebesar 62.68%
(Prihantini 2013).
Lactobacillus plantarum B134 merupakan salah satu BAL asal Indonesia
yang diisolasi dari makanan tradisional asal Bogor oleh Sulistiani (Komunikasi
Pribadi 2013). Karakter β-galaktosidase dari bakteri tersebut juga telah diteliti
(Hartono 2013). Hasil penelitian tersebut mendasari penelitian ini untuk melihat
potensi β-galaktosidase dan sel amobil dari Lactobacillus plantarum stain B134
terhadap penurunan kadar laktosa pada susu UHT skim dan berlemak serta
stabilitas penyimpanan β-galaktosidase amobil. Hasil penelitian ini diharapkan
dapat menjadi landasan untuk pengembangan suatu produk susu UHT rendah
laktosa di Indonesia yang saat ini belum ada.
Perumusan Masalah
Potensi dari β-galaktosidase pada Lactobacillus sp. yang berasal dari
Indonesia belum banyak diungkap. Penapisan awal mengenai aktivitas βgalaktosidase pada beberapa
isolat Lactobacillus sp., koleksi Bidang
Mikrobiologi, Puslit Biologi LIPI, telah dilakukan Lactobacillus plantarum B134
merupakan salah satunya. β-Galaktosidase dari L. plantarum strain B1334 telah
dimurnikan secara parsial dan diungkap karakternya oleh Hartono (2013). Namun,
amobilisasi β-galaktosidase dan sel dari L. plantarum B134 menggunakan Naalginat belum dilakukan. Salah satu aplikasi β-galaktosidase dalam produk pangan
sebagai agen penghidrolisis laktosa susu UHT. Karakter β-galaktosidase amobil
dan penyimpanannya juga belum diketahui.
3
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengamobilisasi β-galaktosidase dan sel dari
L. plantarum B134 yang dapat menghidrolisis laktosa yang terkandung dalam
susu UHT.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai karakter βgalaktosidase dan sel dari L. plantarum dan teknik amobilisasinya sehingga dapat
bermanfaat dalam pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi bidang industri
pengolahan makanan khususnya mengenai potensi hidrolisis laktosa susu UHT
oleh β-galaktosidase.
Hipotesis
Sel bakteri dan β-galaktosidase yang berasal dari L. plantarum B134 dapat
diamobilisasi menggunakan natrium alginat dan dapat dipakai berulang. Karakter
β-galaktosidase amobil (pH dan suhu) dapat terdeteksi. Selain itu, sel dan βgalaktosidase amobil mampu menghidrolisis laktosa dalam susu skim dan susu
berlemak UHT.
2 METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan bakteri L.
plantarum B134 yang merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong,
buffer tris-HCl 0.1 M, buffer fosfat 0.05 M, buffer tris-HCl 0.01 M, susu UHT
(skim dan berlemak), β-galaktosidase, commasie brilian blue 0.1%, o-Nitrofenilβ-D-Galaktosida (oNPGal), Na2CO3 1 M, o-Nitrofenol (ONP), bovine serum
albumin (BSA), Na-alginat pa, CaCl2, dan ammonium sulfat pa.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikropipet,, laminar air
flow cabinet, tabung Eppendorf, neraca analitik, vortex, penangas air Memmert,
stopwatch, pH meter HM-25G TOADKK, kuvet spektrofotometer UV-Vis 1700
shimadzu, inkubator Isuzu, sonikator Eyela, tabung dialisis (Novagen), dan
magnetic stirrer.
4
Prosedur
Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997)
Inokulum L. plantarum B134 diambil sebanyak 2% dengan kerapatan
optik 0.7 yang diinokulasikan dalam 2400 mL media produksi steril dan
diinkubasi pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi selama 18 jam, sel dipanen
sedangkan untuk enzim dipanen setelah inkubasi 24 jam. Sel dipanen dengan
mensetrifus media selama 15 menit dengan kecepatan 9.500 rpm pada suhu 4ºC.
Pelet yang diperoleh merupakan sel bakteri dan disimpan pada suhu 4ºC, Enzim
dipanen dengan mensentrifus media 15 menit dengan kecepatan 9.500 rpm pada
suhu 4ºC. Pelet yang dihasilkan dicuci dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5 lalu
disentrifus kembali. Pencucian pellet dilakukan sebanyak dua kali. Pelet yang
diperoleh setelah pencucian yang kedua ditimbang dan ditambahkan buffer fosfat
0.05 M pH 6.5 dengan perbandingan 1:5 (pellet:buffer). Kemudian pemecahan sel
dilakukan dengan sonikator 50 hHz selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan
yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim β-galaktosidase.
Pengendapan dengan Ammonium Sulfat (Scopes 1987)
Ekstrak kasar β-galaktosidase sebanyak 20 mL diendapkan dalam
ammonium sulfat. Penambahan ammonium sulfat dilakukan secara bertahap.
Konsentrasi ammonium sulfat yang digunakan yaitu 0-40% dan 40-50%. Larutan
kemudian diaduk dengan magnetic stirrer secara perlahan selama 1 jam. Larutan
disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Pelet
yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam 1 mL buffer fosfat 0.05 M pH 6.5.
Kejenuhan ammonium sulfat yang optimum akan ditunjukkan oleh aktivitas yang
tinggi.
533 (�2 −�1 )
Jumlah ammonium sulfat (gram/liter) =
100−0.352
Keterangan:
S1
: Konsentrasi awal ammonium sulfat
S2
: Konsentrasi akhir ammonium sulfat
NB: Nilai 533 menunjukkan bahwa dibutuhkan 533 gram ammonium sulfat per
liter untuk membuat larutan jenuh 100%.
Dialisis. Tabung dialisis diisi β-galaktosidase hasil pengendapan amonium
sulfat. Tabung kemudian direndam dalam 2 liter buffer PO4 0.01 M pH 6.5 yang
diletakkan diatas stirer dan disimpan dalam Cool Room bersuhu 4ºC selama 15
jam.
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Pengukuran Kurva Standar. Standar protein yang digunakan adalah
bovine serum albumin (BSA) pada berbagai konsentrasi dari 0.005-1.00 mg/mL
yang dilarutkan dalam NaCl 0.15 M. Sebanyak 20 µl BSA ditambahkan dalam 1
mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban
larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
Pengukuran Sampel. Sebanyak 20 µl β-galaktosidase ditambahkan dalam
1 mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit.
Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
5
Pembuatan Blanko. Sebanyak 40 µl NaCl 0.15 M ditambahkan dalam 2
mL lautan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban
larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
Uji Aktivitas β-Galaktosidase (modifikasi Liu et al. 2009)
Pengukuran Sampel. Uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara
sebanyak 1 mL buffer tris-HCl 0.1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke
dalam tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Kemudian
ditambahkan 200 µl o-nitrofenil-β-D-galaktosida (oNPGal) 2 mg/ml dan
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Pada menit ke-5 ditambahkan 1 mL
Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis dengan mengukur
absorban pada λ=420 nm.
Pengukuran Kurva Standar. Berbagai konsentrasi oNP dari 0-2.5 mM
yang dilarutkan dalam buffer tris-HCl 0.01 M pH 7. Sebanyak 1 mL buffer trisHCl 0.1 M pH 7 dan 100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi
kemudian ditambahkan 200 µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu
37ºC selama 5 menit. Selanjutnya campuran ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M.
Larutan di vortex dan intensitas warna kuning yang terbentuk diukur
absorbansinya pada λ=420 nm. Hasil pembacaan aktivitas β-galaktosidase
dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1
µmol oNP dari substrat oNPGal per menit pada kondisi percobaan.
Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum (Becerra et al. Modifikasi 2001)
Hasil panen sel Lactobacillus plantarum B134 ditambahkan ke dalam
natrium alginat (konsentrasi optimum). Butiran sel dibuat dengan meneteskan
suspensi sel ke dalam natrium alginat dengan syringe kedalam 50 ml larutan
CaCl2 (konsentrasi optimum) sambil diaduk dengan pengaduk bermagnet dengan
kecepatan 100 rpm. Butiran sel yang telah terbentuk diinkubasi selama 1 jam
dalam larutan CaCl2 pada suhu 4ºC hingga gel mengeras. Butiran sel kemudian
disaring dengan kertas saring dan dipindahkan dalam labu erlenmeyer untuk
dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali.
Amobilisasi β-Galaktosidase (Haider dan Husain modifikasi 2007)
Hasil dialisis β-galaktosidase ditambahkan ke dalam natrium alginat
(konsentrasi optimum). Butiran gel dibuat dengan meneteskan suspensi dengan
syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 (konsentrasi optimum) kemudian diaduk
dengan pengaduk bermagnet. Setelah butiran gel terbentuk, butiran gel
ditambahkan dalam larutan CaCl2 kemudian diinkubasi selama 1 jam. Setelah 1
jam, butiran gel disaring menggunakan kertas saring dan dipindahkan dalam labu
erlenmeyer, kemudian dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali. Hasil butiran gel
diaplikasikan dalam susu UHT untuk menurunkan kadar laktosa dalam susu UHT
tersebut.
Optimasi Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum B134 (Becerra et al.
Modifikasi 2001)
Natrium alginat yang digunakan bervariasi yaitu 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,
dan 6%. Larutan CaCl2 yang digunakan bervariasi yaitu 0.1 M, 0.3 M, dan 0.5 M.
Selain itu, bobot sel yang digunakan juga bervariasi yaitu 10%, 20%, dan 40%
6
(b/v). Setelah butiran gel yang bervariasi telah diperoleh, gel tersebut diuji
aktivitasnya. Konsentrasi alginat dan bobot sel yang menghasilkan produk paling
tinggi akan digunakan sebagai komposisi untuk amobilisasi sel Lactobacillus
plantarum B134.
Optimasi Amobilisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus plantarum B134
(Becerra et al. Modifikasi 2001)
Natrium alginat yang digunakan bervariasi yaitu 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,
dan 6%. Larutan CaCl2 yang digunakan bervariasi yaitu 0.1 M, 0.3 M, dan 0.5 M.
Selain itu, unit enzim yang digunakan juga bervariasi yaitu 6.5 U, 13 U, dan 26 U.
Setelah butiran gel yang bervariasi telah diperoleh, gel tersebut diuji aktivitasnya.
Konsentrasi alginat dan unit enzim yang menghasilkan produk paling tinggi akan
digunakan sebagai komposisi untuk amobilisasi β-galaktosidase dari
Lactobacillus plantarum B134.
Karakterisasi β-Galaktosidase
Pengaruh pH terhadap Aktivitas dan Stabilitas β-Galaktosidase
amobil. Optimasi pH dilakukan dengan menggunakan buffer tris-HCl pada
variasi pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0. Pengujian aktivitas dilakukan pada
suhu 37ºC selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas βgalaktosidase amobil menunjukkan pH optimum β-galaktosidase. Stabilitas enzim
amobil terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim pada larutan
buffer pada berbagai pH (5-8 dengan selang 0.5) selama 1 jam. Setelah inkubasi
selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan dalam penangas es selama 10
menit. Aktivitas enzim yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase
pada pH optimum. Nilai aktivitas enzim amobil tersisa dinyatakan dalam
persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim
amobil tanpa perlakuan).
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas dan Stabilitas β-Galaktosidase
Amobil. Uji aktivitas enzim amobil dengan variasi suhu 25, 30, 35, 40, 45, 50,
dan 55 ºC dilakukan untuk penentuan suhu optimum. Pengujian aktivitas
dilakukan berdasarkan pH optimum selama 5 menit. Aktivitas tertinggi
berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase menunjukkan suhu optimum enzim βgalaktosidase. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan
larutan enzim pada berbagai suhu (25-55oC dengan selang 5oC) selama 1 jam
dalam buffer dengan pH hasil stabilitas. Setelah inkubasi selesai larutan enzim
dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas enzim amobil yang
tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase pada pH dan suhu optimum.
Nilai aktivitas enzim amobil tersisa dinyatakan dalam persentase dari aktivitas
setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan).
Penentuan Kinetika Enzim Amobil. Analisis KM dan Vmaks dilakukan
pada enzim amobil. Sebanyak 1000 µl tris-HCl 0.1 pada pH optimum, 100 µl
enzim, dan 200 µl substrat oNPGal yang diujikan pada konsentrasi 0.01, 0.05, 0.1,
0.5, 1, 2, 4, dan 5 mg/ml diinkubasi selama 5-30 menit. Setiap 5 menit, sebanyak
1000 µl Na2CO3 1 M ditambahkan agar reaksi berhenti kemudian larutan
dianalisis menggunakan spektrofotometer UV Vis pada λ=420 nm. Grafik dibuat
dengan memplotkan hubungan antara waktu (sumbu X) dan kadar oNP yang
terbentuk (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal dimana nilai
7
kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya
grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk menentukan nilai KM dan Vmaks. Grafik
Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v
sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan pembentukan
produk persatuan waktu.
Aplikasi β-Galaktosidase pada Susu UHT (Haider dan Husein modifikasi
2007, Kishore dan Katasya 2012)
Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT. Sel bebas, enzim bebas, sel amobil,
dan enzim amobil ditambahkan dalam 5 mL susu UHT. Konsentrasi sel dan enzim
yang ditambahkan sesuai dengan hasil optimasi amobilisasi. Sampel diinkubasi
suhu optimum selama 24 jam. Setiap 3 jam sekali, pengambilan sampel dilakukan
sebanyak 250 µl. Analisis pengukuran kadar laktosa menggunakan kit enzimatik
analisis glukosa GOD-POD (glukosa oksidase-peroksidase).
Keterulangan Pemakaian Sel Amobil dan Enzim Amobil. Sebanyak 5
mL susu UHT ditambahkan sel dan enzim amobil. Sampel diinkubasi pada suhu
dan waktu optimum untuk menghidrolisis laktosa susu UHT. Sel dan enzim
amobil digunakan kembali untuk menghidrolisis laktosa susu UHT. Analisa
pengukuran kadar laktosa menggunakan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD
(glukosa oksidase-peroksidase).
Analisis Penurunan dengan GOD-POD. Sebanyak 10 µl enzim
ditambahkan reagen GOD-POD kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu
37ºC. Larutan kemudian dianalisis dengan spektrofotometri UV-VIS pada λ
sebesar 500 nm. Hasil absorbansi kemudian dibandingkan dengan standar glukosa
100 mg/dl. Jumlah laktosa yang mengalami hidrolisis akan setara dengan jumlah
glukosa yang terbentuk pada percobaan.
������� ���� ��������� ����� ���������
% laktosa yang tidak terhidrolisis = �������
���� ��������� ������ ℎ ���������
× 100
Stabilitas Penyimanan Beads β-Galaktosidase
Beads β-galaktosidase disimpan dalam suhu 4ºC selama 35 hari. Setiap 5
hari sekali, aktivitas beads β-galaktosidase diuji aktivitasnya.
Analisis Statistika
Amobilisasi sel L.plantarum B134 dan β-galaktosidase menggunakan
rancangan acak lengkap dengan ulangan 3 kali. Variabel yang digunakan dalam
menentukan amobilisisasi yaitu: konsentrasi CaCl2 (0.1 M, 0.3 M, dan 0.5 M),
natrium alginat (0.5%, 1%, 2%, and 3% b/v), sel L. plantarum B134 (4%, 8%,
12% b/v), β-galaktosidase (6.5 U, 13 U, dan 26 U), pH (5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5,
dan 8.0), suhu (25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, dan 55oC), stabilitas pH (5.0,
5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0), dan stabilitas suhu (25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC,
50oC, dan 55oC). Model linier (Matjik dan Sumertajaya 2002) yang digunakan
adalah:
�ij = � + �� + �� + ���
Keterangan:
Yij = pengamatan ke j pada unit percobaan ke i
8
µ
��
��
���
= pengaruh rataan umum
= pengaruh variabel amobilisasi pada jam ke-i
= pengaruh ulangan ke-j
= pengaruh galat variable amobilisasi pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
Data yang diperoleh akan dianalisis dengan Analysis of Variance
(ANOVA) pada selang kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data
menggunakan SPSS 16.0. Jika hasil uji berbeda nyata makan akan dilanjutkan
dengan uji Duncan.
3 HASIL
Amobilisasi Sel L. plantarum B134
Produk oNP (μmol)
Konsentrasi natrium alginat, CaCl2, dan sel sangat penting agar beads sel
dapat terbentuk sempurna. Konsentrasi CaCl2 yang digunakan adalah 0.1 M, 0.3
M, dan 0.5 M. Gambar 1 menunjukkan produk oNP tertinggi tercapai pada
konsentrasi CaCl2 0.1 M sebesar yaitu 0.899 μmol. Natrium alginat divariasikan
dengan konsentrasi 0.5%, 1%, 2%, dan 3%. Produk oNP tertinggi tercapai pada
saat konsentrasi natrium alginat 1% sebesar 2.5 μmol (Gambar 2). Massa sel juga
divariasikan untuk mengisi beads sel dengan konsentrasi 4% b/v, 8% b/v, dan
12% b/v. Produk oNP tertinggi dihasilkan pada massa sel 12% b/v yaitu sebesar
1.227 μmol (Gambar 3).
1.000
0.899a
0.755b
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000c
0.000
0.1
0.3
0.5
[CaCl2] (M)
Produk oNP (μmol)
Gambar 1 Produk oNP yang dihasilkan pada variasi CaCl2 pada amobilisasi L.
plantarum B134. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
pada uji Duncan 5%.
2.500b
3.000
2.000
1.405a
0.914c
1.000
0.491d
0.000
0.5
1
2
3
Natrium Alginat (%)
Gambar 2 Produk yang dihasilkan pada variasi natrium alginat pada amobilisasi L.
plantarum B134. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
pada ada uji Duncan 5%.
Produk oNP (μmol)
9
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
1.227c
0.476b
0.142a
4
8
12
Konsentrasi sel (% b/v)
Gambar 3 Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai konsentrasi sel
L. plantarum B134. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda
nyata pada uji Duncan 5%.
Pengukuran β-Galaktosidase pada Sel L. plantarum B134 Amobil
Aktivitas β-galaktosidase dalam sel L. plantarum B134 amobil
dipengaruhi oleh pH, suhu, dan waktu inkubasi dalam pengukurannya. Nilai pH
divariasikan antara 5 hingga 8 dengan selang 0.5. Aktivitas β-galaktosidase diukur
dengan terbentuknya produk oNP pada selang pH tersebut. Aktivitas βgalaktosidase mencapai optimum pada pH 6.5 dengan produk oNP yang
dihasilkan yaitu sebesar 1.512 μmol (Gambar 4). Variasi suhu yang digunakan
untuk pengukuran aktivitas β-galaktosidase yaitu 25oC, 30oC, 35 oC, 40 oC, 45 oC,
50 oC, dan 55 oC. Aktivitas β-galaktosidase mencapai optimum pada suhu 45 oC
dengan produk oNP yang dihasilkan yaitu sebesar 1.979 μmol (Gambar 5). Waktu
inkubasi β-galaktosidase divariasikan antara 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 menit.
Produk oNP yang dihasilkan meningkat sebanding dengan lamanya waktu
inkubasi yang dilakukan. Nilai absorbansinya secara berurutan adalah sebagai
berikut 0.465 A, 0.647 A, 0.672 A, 0.744 A, 0.776 A, dan 0.859 A (Gambar 6).
Waktu inkubasi yang dipilih untuk pengukuran β-galaktosidase adalah 5 menit.
Efesiensi amobilisasi sel L. plantarum B134 yang diujikan pada keadaan optimum
aktivitas β-galaktosidase adalah 28.95%.
Produk oNP (μmol)
2.000
1.512d
1.500
1.089a
1.270b
1.197e
1.172c
1.000
0.329f
0.500
0.040g
0.000
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
pH
Gambar 4 Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai pH. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Produk oNP (μmol
oNP)
10
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
1.979e
1.577c
0.979f
0.770d
0.163a
0.727g
0.390b
25
30
35
40
45
50
55
Suhu (oC)
Gambar 5 Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai suhu. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
1
8
0.8
6
0.6
4
0.4
Produk oNP (µmol
ONP)
2
0
Absorban
si (A)
Produk oNP (μmol
oNP)
10
0.2
0
0
5
10
15
20
Waktu (menit)
25
30
Gambar 6 Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada variasi waktu
pengukuran β-galaktosidase
Amobilisasi β-Galaktosidase dari L. plantarum B134
Produk oNP (μmol
oNP)
Amobilisasi β-galaktosidase yang baik perlu ditentukan komposisi
konsentrasi natrium alginat, CaCl2, dan enzim yang tepat. Konsentrasi CaCl2
divariasikan 0.1 M, 0.3 M, dan 0.5M. Produk oNP tertinggi diperoleh pada
konsentrasi CaCl2 0.1 M sebesar 0.813 μmol (Gambar 7). Natrium alginat yang
digunakan adalah 0.5%, 1%, 2%, dan 3%. Saat konsentrasi natrium alginat 1%,
oNP tertinggi yang dihasilkan yaitu 1.494 μmol (Gambar 8). Konsenstrasi enzim
divariasikan antara 6.5 unit, 13 unit, dan 26 unit. Gambar 9 menunjukkan bahwa
26 unit β-galaktosidase masih dapat ditampung oleh beads alginat dan
menghasilkan produk oNP tertinggi sebesar 4.996 μmol.
1.000
0.813a
0.691b
0.608b
0.500
0.000
0.1
0.3
0.5
[CaCl2] (M)
Gambar 7 Produk oNP pada berbagai konsentrasi CaCl2 dalam amobilisasi βgalaktodisase. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
pada uji Duncan 5%.
11
Produk oNP (μmol)
1.800
1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
1.494b
0.770a
0.743a
0.5
1
0.666a
2
3
Konsentrasi Natrium Alginat (%)
Gambar 8 Produk oNP pada berbagai konsentrasi natrium alginat dalam
amobilisasi β-galaktodisase. Huruf yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Produk oNP (μmol)
6.000
4.996b
5.000
4.000
3.000
2.736a
3.116a
2.000
1.000
0.000
6.5
13.0
26.0
[β-Galaktosidase] (unit)
Gambar 9 Produk oNP pada berbagai konsentrasi β-galaktosidase dalam
amobilisasi β-galaktodisase. Huruf yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Pengukuran dan Stabilitas β-Galaktosidase Amobil
Keadaan pengukuran β-galaktosidase yang diperhatikan adalah pH, suhu,
dan waktu inkubasi. Nilai pH buffer tris-HCl yang digunakan dalam pengukuran
β-galaktosidase divariasikan antara 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, dan 8. Gambar 10
menunjukkan aktivitas β-galaktosidase mencapai optimum pada pH 5.5 yaitu
sebesar 4.403 U/mL. Suhu untuk pengukuran β-galaktosidase divariasikan antara
25, 30, 35, 40, 45, dan 50ºC. Suhu pengukuran 35ºC menghasilkan aktivitas βgalaktosidase optimum yaitu sebesar 2.345 U/mL (Gambar 11). Waktu inkubasi
yang digunakan juga diuji pada 5, 10, 15, dan 20, 25, dan 30 menit. Absorbansi
oNP secara berurutan adalah 0.027 A, 0.096 A, 0.162 A, 0.108 A, 0.133, dan
0.196 A. Produk oNP yang terbentuk pada waktu pengukuran diatas secara
berurutan adalah 1.427 μmol, 2.921 μmol, 4.638 μmol, 8.255 μmol, 9.666 μmol,
dan 12.242 μmol (Gambar 12). Efisiensi amobilisasi β-galaktosidase sebesar
96.69%
Aktivitas
β-Galaktosidase (U/mL)
12
4.403b
5.0
4.0
3.0
3.385c
2.731d
2.573a
2.0
1.0
0.384e
0.259f
0.121g
7.0
7.5
8.0
0.0
5.0
5.5
6.0
6.5
pH
Aktivitas
β-Galaktosidase (U/ml)
Gambar 10 Aktivitas β-galaktosidase amobil pada berbagai pH. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.345c
1.920d
0.904a
1.270e
1.021b
0.000f
25
30
35
40
45
50
Suhu (oC)
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
Produk oNP (μmol)
1.2
1
0.8
0.6
0.4
Produk oNP…
Absorban (A)
0.2
0
0
5
10
15
20
Waktu (menit)
25
Absorban
(A)
Gambar 11 Aktivitas β-galaktosidase amobil pada berbagai suhu. Huruf yang
sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
30
Gambar 12 Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada berbagai variasi
waktu.
Penyimpanan β-galaktosidase ditentukan oleh kestabilan terhadap pH dan
suhu. Kestabilan β-galaktosidase terhadap perlakuan penyimpanan pH selama 1
jam divariasikan menggunakan buffer tris-HCl pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, dan 8.
Aktivitas β-galaktosidase pada variasi penyimpanan pH dibandingkan dengan
aktivitas β-galaktosidase pada pH dan suhu optimum. Aktivitas β-galaktosidase
tersisa dari berbagai variasi pH secara berurutan adalah 54.38%, 47.18%, 46.82%,
42.42%, 34.68%, 19.51%, dan 0.86% (Gambar 13). Kestabilan β-galaktosidase
diujikan pada variasi suhu 25, 30, 35, 40, 45, dan 50ºC. Aktivitas β-galaktosidase
13
Aktivitas
β-galaktosidase tersisa (%)
terisisa setelah perlakuan secara berurutan adalah 77.51%, 79.69%, 60.16%,
56.59%, 25.82%, dan 0% (Gambar 14).
100
80
54.38a
60
47.18b
45.82c
42.42d
34.68e
40
19.51f
20
0.86g
0
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
pH
Aktivitas
β-galaktosidase tersisa (%)
Gambar 13 Stabilitas pH β-galaktosidase amobil. Huruf yang sama menunjukkan
tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
100
78.15a
80
79.63a
59.95b
60
56.90c
40
26.24d
20
0.00e
0
25
30
35
40
45
50
Suhu (˚C)
Gambar 14 Stabilitas suhu β-galaktosidase amobil. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Kinetika β-Galaktosidase Amobil
V (µmol/menit)
Parameter kinetik β-galaktosidase amobil ditentukan menggunakan kurva
Michaelis-Menten dan Lineweaver-Burk. Kurva Michaelis-Menten menunjukkan
hubungan antara konsentrasi oNPGal dngan kecepatan β-galaktosidase amobil
(Gambar 15). Kurva Lineweaver-Burk digunakan untuk menentukan nilai Km dan
Vmaks (Gambar 16). Persamaan Lineweaver-Burk yaitu y=17.50x-1.742 dengan
R2 sebesar 0.976. Nilai Km dan Vmaks ditentukan dari persamaan tersebut
sebesar 30.487 mM dan 1.742 μmol/menit.
2
1.5
1
0.5
0
0.000
5.000
10.000
15.000
20.000
[S] (mM)
Gambar 15 Kurva Michaelis Menten β-galaktosidase amobil
14
12
10
y = 17.50x - 0.574
R² = 0.976
1/V
8
6
4
2
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
1/S
Gambar 16 Kurva Lineweaver-Burk β-galaktosidase amobil
Hidrolisis Laktosa Susu Berlemak dan Skim UHT
Laktosa susu UHT dari tipe UHT berlemak dan UHT skim dihidrolisis
menggunakan sel L. plantarum B134 dan β-galaktosidase semipurifikasi dengan
sistem batch. Sel L. plantarum B134 amobil dan sel L. plantarum B134 bebas
mampu mengkonversi laktosa susu UHT berlemak paling tinggi pada jam ke 12
secara berurutan 85.45% dan 87.43% (Gambar 17). Sel amobil dan bebas dari L.
plantarum B134 memecah laktosa susu UHT skim tertinggi berdasarkan
persentase laktosa yang terhidrolisis paling tinggi pada jam ke 9 dengan nilai
secara berurutan 91.26% dan 95.82% (Gambar 18).
β-Galaktosidase amobil dan β-galaktosidase bebas mengubah laktosa susu
UHT berlemak mampu menghasilkan glukosa tertinggi secara berurutan pada jam
ke 15 dan 9. Laktosa susu UHT berlemak yang terhidrolisis pada jam ke 15 untuk
β-galaktosidase amobil sebesar 80.55% dan jam ke 9 untuk β-galaktosidase bebas
sebesar 95.87% (Gambar 19). Konversi laktosa susu UHT skim tertinggi yang
dilakukan oleh β-galaktosidase amobil pada jam ke 6 dan β-galaktosidase bebas
pada jam ke 9. Laktosa yang terhidrolisis β-galaktosidase amobil pada jam ke 6
sebesar 93.06%, sedangkan β-galaktosidase bebas pada jam ke 9 sebesar 97.43%
(Gambar 20).
Laktosa terhidrolisis( %)
100
80
60
40
Sel Bebas
Sel Amobil
20
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam ke-
Gambar 17 Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan sel selama 24
jam.
15
120
Laktosa terhidrolisis (%)
100
80
60
Sel Bebas
40
Sel Amobil
20
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam ke-
Laktosa terhidrolisis (%)
Gambar 18 Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan sel L. plantarum
B134 selama 24 jam.
100
80
60
40
β-gal amobil
20
β-gal bebas
0
0
3
6
9
12
15
Jam ke-
18
21
24
Gambar 19 Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam.
Laktosa terhidrolisis (%)
100
80
60
40
β-gal amobil
β-gal bebas
20
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam ke-
Gambar 20 Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam.
16
Keterulangan Pemakaian Sel L. plantarum B134 Amobil dan
β-Galaktosidase Amobil
Sel L. plantarum B134 amobil dan β-galaktosidase amobil dapat dipakai
secara berulang. Sel L. plantarum B134 amobil dapat dipakai sebanyak 4 kali
pada susu UHT berlemak dan skim untuk menurunkan kadar laktosa. Kadar
laktosa UHT berlemak yang tidak terhidrolis oleh sel L. plantarum B134 amobil
pada setiap ulangan secara berurutan adalah 3.78%, 6.02%, 6.42%, dan 11.97%
(Gambar 21). Kadar laktosa UHT skim yang tidak terhidrolisis oleh sel L.
plantarum B134 amobil pada setiap ulangan secara berurutan adalah 16.63%,
6.18%, 8.46%, dan 8.14% (Gambar 21).
β-Galaktosidase amobil dapat dipakai 3 kali untuk menurunkan kadar
laktosa UHT berlemak dan 6 kali untuk menurunkan kadar laktosa UHT skim.
Kadar laktosa UHT berlemak yang tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase
amobil pada setiap ulangan secara berurutan sebesar 6.81%, 12.19%, dan 44.55%
(Gambar 22). Kadar laktosa UHT skim yang tidak dapat dihidrolisis oleh βgalaktosidase amobil pada setiap ulangan secara berurutan sebesar 6.24%, 7.367%,
7.89%, 14.53%, 16.28%, dan 47.79% (Gambar 22).
Laktosa yang tidak terhidrolisis
(%)
100
80
60
UHT Berlemak
40
UHT Skim
16.63
20
6.02 6.18
3.78
11.97
8.14
6.428.46
0
2 Siklus (kali) 3
1
4
Gambar 21 Keterulangan pemakaian sel L. plantarum B134 amobil.
Laktosa yang tidak terhidrolisis
(%)
100
UHT belemak
80
UHT Skim
60
47.79
44.55
40
20
6.81
6.24
12.19
7.37
1
2
7.89
14.53
16.28
0
3
4
5
6
Siklus (Kali)
Gambar 22 Keterulangan pemakaian β-galaktosidase amobil
17
Penyimpanan β-Galaktosidase Amobil
Aktivitas relatif β-galaktosidase (%)
β-Galaktosidase amobil disimpan pada suhu 4ºC selama 35 hari. Setiap 5
hari sekali, aktivitas β-galaktosidase diukur berdasarkan banyaknya produk oNP
yang terbentuk. Aktivitas relatif β-galaktosidase bebas pada dari ke 0, 5, 10, 15,
20, 25, 30, dan 35 sebesar 100%, 82.76%, 56.59, 66.93%, 63.63%, 41.58%,
25.23%, 29.13% (Gambar 23). Aktivitas relatif β-galaktosidase amobil pada hari
ke 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 sebesar 100%, 80.38%, 67.27%, 66.40%,
73.63%, 53.56%, 34.87%, dan 43.41% (Gambar 23).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100 100
82.76 83.29
81.36
87.15
69.45
66.93
Enzim amobil
63.63 66.18
Enzim bebas
58.86
56.59
41.58
45.83
25.23
0
5
10
15
20
25
30
29.13
35
Hari ke-
Gambar 23 Penyimpanan β-galaktosidase selama 35 hari
4 PEMBAHASAN
Produksi Sel L. plantarum B134 dan β-Galaktosidase
L. plantarum merupakan bakteri asam laktat yang ditumbuhkan dalam
media MRS (de Man, Rogosa, dan Sharpe). Masa kultivasi dapat dilakukan
hingga jam ke 49 pada suhu 37oC. Setelah jam ke 24, L. plantarum memasuki fase
stationer (Smentankova 2012). L. plantarum isolat B134 menghasilkan βgalaktosidase tertinggi saat 2% inokulum ditumbuhkan dalam media MRS yang
mengandung 2% laktosa dan pH media 5. Waktu inkubasi yang dibutuhkan untuk
menghasilkan aktivitas β-galaktosidase tertinggi pada L. plantarum adalah 24 jam
pada suhu 37ºC (Hartono 2013; Sulistiani 2013). Setelah sel dipanen, βgalaktosidase diperoleh dengan memecah sel menggunakan sonikator. Pemecahan
tersebut bertujuan untuk menghancurkan dinding sel bakteri menggunakan
gelombang suara tertentu. Selanjutnya β-galaktosidase dimurnikan secara
semipurifikasi hingga tahap dialisis. β-Galaktosidase hasil dialisis digunakan
untuk diamobilisasi dengan natrium alginat karena aktivitas β-galaktosidase dari L.
plantarum B134 setelah proses dialisis telah mengalami peningkatan aktivitas
spesifik sebesar 45.828 U/mg dibandingkan dengan β-galaktosidase kasar. Sel L.
plantarum B134 yang diamobilisasi dipanen pada jam ke 18. Pertumbuhan sel L.
plantarum B134 mencapai fase logaritma pada jam ke 18 (Hartono 2013).
18
Amobilisasi Sel L. plantarum B134 dan β-Galaktosidase
Amobilisasi sel dan enzim menggunakan metode penjebakan
menggunakan matriks alginat sudah umum digunakan. Butiran gel yang
dihasilkan merupakan titik kritis yang harus diperhatikan selama proses
amobilisasi. Bentuk dan ukuran butiran gel yang dihasilkan akan mempengaruhi
aktivitas sel maupun enzim yang dijebak. Butiran gel yang berukuran kecil akan
menurunkan risiko keluarnya massa sel dan enzim. Selain itu, substrat dan
senyawa lain yang mendukung dapat masuk kedalam butiran gel dengan mudah.
Bentuk gel yang baik sangat penting dalam proses pengerasan gel karena akan
menghindari bentuk sel yang tidak sempurna (Keshaw et al. 2005). Gambar 24
menunjukkan butiran gel dari enzim dan sel amobil dalam penelitian ini.
(a)
(b)
Gambar 24 Butiran gel (a) β-galaktosidase amobil (b) sel Lactobacillus plantarum
B134 amobil.
Kombinasi konsentrasi natrium alginat, kalsium klorida, sel, dan enzim
merupakan hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sel dan enzim amobil.
Matriks alginat terbentuk karena kation Ca2+ dalam kalsium klorida bereaksi
dengan anion monovalen karboksilat pada natrium alginat (Najafpour et al. 2004).
Konsentrasi natrium alginat yang digunakan akan mempengaruhi difusi substrat
kedalam butiran gel. Semakin tinggi konsentrasi natrium alginat yang digunakan
akan menyebabkan ikatan silang yang terbentuk akan semakin banyak. Hal ini
juga menyebabkan butiran gel yang dibentuk dari natrium alginat dengan
konsentrasi tinggi menghasilkan warna gel yang lebih terang (Das dan Senapati
2008). Penurunan aktivitas β-galaktosidase dapat terjadi saat konsentrasi natrium
alginat terlalu tinggi. Hal ini terjadi karena penurunan porositas butiran gel yang
menyebabkan substrat sulit untuk berdifusi kedalam gel (Talekar dan Chavar
2012).
Faktor lain yang mempengaruhi adalah konsentrasi kalsium klorida.
Butiran gel yang stabil dapat menahan sel maupun enzim secara maksimal tetapi
tidak menghambat kerja enzim. Kalsium klorida akan menstabilkan bentuk
butiran gel tersebut. Konsentrasi kalsium klorida yang terlalu tinggi akan
menyebabkan penurunan aktivitas enzim. Hal ini disebabkan adanya perubahan
pH kalsium klorida yang mempengaruhi kerja enzim (Talekar d
DENGAN NATRIUM ALGINAT DAN POTENSI HIDROLISISNYA PADA
SUSU UHT SKIM DAN BERLEMAK
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Amobilisasi Sel Lactobacillus
plantarum B134 dan β-Galaktosidase dengan Natrium Alginat dan Potensi
Hidrolisisnya pada Susu Skim dan Susu Berlemak UHT adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
Perguruan Tinggi mana pun. Tema dan penelitian ini merupakan bagian dari proyek
penelitian yang didanai oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI (Proyek PKPP 2012 dan
DIPA 2013). Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya ini milik Institut
Petanian Bogor. Namun, data yang berada dalam tesis ini milik Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia.
Bogor, September 2014
Lusiana Kresnawati Hartono
NIM G851130446
RINGKASAN
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum
B134 dan β-Galaktosidase dengan Natrium Alginat dan Potensi Hidrolisisnya pada Susu
UHT Skim dan Berlemak. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TATIK
KHUSNIATI.
Susu merupakan salah satu produk pangan yang memiliki nilai gizi yang baik.
Sayangnya, konsumsi susu Indonesia hanya 11.09 per liter per kapita per tahun.
Minimnya konsumsi susu dapat disebabkan karena intoleransi laktosa yaitu
ketimakmampuan tubuh untuk mencerna laktosa karena tidak memiliki β-galaktosidase.
Solusi alternatifnya adalah mengolah susu sampai kadar laktosanya menjadi rendah
menggunakan β-galaktosidase dari mikroorganisme. L. plantarum B134 merupakan
bakteri asam laktat dari Indonesia yang memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi.
Penggunaan β-galaktosidase lebih efisien apabila dilakukan teknik penjebakan
(amobilisasi) sehingga dapat digunakan berulang dan dapat menurunkan biaya produksi.
Natrium alginat merupakan matriks penjebak yang murah dan aman untuk
mengamobilisasi enzim dan sel.
Penelitian ini bertujuan untuk menghidrolisis laktosa susu UHT berlemak dan
skim dengan menggunakan sel L. plantarum B134 amobil dan β-galaktosidase amobil.
Tahapan penelitian ini meliputi (1) optimasi amobilisasi sel L.plantarum B134 dan βgalaktosidase dengan natrium alginat, (2) pengaruh pH dan suhu pada sel L.plantarum
B134 dan β-galaktosidase amobil, (3) stabilitas pH dan suhu β-galaktosidase amobil,
(4) hidrolisis laktosa pada susu UHT berlemak dan skim, (5) keterulangan pemakaian
beads sel L. plantarum B134 amobil dan β-galaktosidase amobil, dan (6) penyimpanan
β-galaktosidase amobil.
Sel L. plantarum B134 amobil mencapai optimum pada 1% natrium alginat, 0.1
M CaCl2, dan 12% b/v sel. Aktivitas β-galaktosidase mencapai optimum pada pH 6.5
dan suhu 45ºC selama 5 menit. Efisiensi amobilisasi sel L. plantarum B134 amobil
adalah 28.95%. Laktosa susu UHT berlemak terhidrolisis sebesar 85.45% selama 12 jam
sedangkan pada susu UHT skim sebesar 91.26% selama 9 jam. Sel L. plantarum B134
amobil dapat digunakan untuk kedua tipe susu UHT sebanyak 4 kali.
β-Galaktosidase amobil mencapai optimum pada 1% natrium alginat, 0.1 M
CaCl2, dan 26 U β-galaktosidase. Aktivitas β-galaktosidase amobil mencapai optimum
pada pH 5.5, suhu 35ᵒC selama 15 menit. Efisiensi amobilisasi β-galaktosidase amobil
adalah 96.69%. Stabiltas pH tercapai pada pH 5 dan stabilitas suhu pada 30ºC. Nilai Km
dan Vmaks β-galaktosidase masing-masing sebesar 30.487 mM dan 1.742 μmol/menit.
β-Galaktosidase amobil mereduksi 80.55% laktosa UHT belemak selama 15 jam dan
93.06% laktosa UHT skim selama 6 jam. β-Galaktosidase amobil dapat digunakan 3
kali untuk hidrolisis laktosa susu UHT berlemak dan 6 kali untuk susu UHT skim.
Setelah penyipanan 35 hari pada suhu 4ºC, β-galaktosidase masih memiliki aktivitas
relatif β-galaktosidase sebesar 52.01%.
Kata kunci: amobil, β-galaktosidase, Lactobacillus plantarum B134, natrium alginat,
UHT.
SUMMARY
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Immobilization of Lactobacillus plantarum
B134 Cell and β-Galactosidase using Sodium Alginate and Its Hydrolysis Potency in
UHT Skim and Whole Milk. Supervised by I MADE ARTIKA and TATIK
KHUSNIATI.
Milk is a food product with a high level of nutrition. Milk consumption in
Indonesia is only 11.09 per capita per liter per year. Lactose intolerance is being the
factor. Lactose intolerant individuals can not hydrolyse lactose byself because lack of βgalactosidase. As a solution, lactose in milk can be reduced using microorganism βgalactosidase. L. plantarum B134 is local lactic acid bacterial strain from Indonesia
which has high activity of β-galactosidase. The use of β-galactosidase is more efficient
when conducted with trapping techniques (immobilization) so that it can be used over
and over and can lower the cost of production. Sodium alginate matrix trapper is a
cheap and safe for immobilization of enzymes and cells.
The aim of this research was to immobilize cells and β-galactosidase for
reducuction of lactose in UHT whole and skim milk. Stages of this research were (1)
optimization of immobilized L. plantarum B134 cells and β-galactosidase using sodium
alginate, (2) effect of pH and temperature on immobilized L. plantarum B134 cells and
β-galactosidase, (3) stability of pH and temperature on immobilized β-galactosidase, (4)
lactose hydrolysis in UHT whole and skim milk, (5) reusability of immobilized L.
plantarum B134 cells and β-galactosidase, (6) immobilized β-galactosidase stored.
The optimum immobilization of L. plantarum B134 cells was in 1% sodium
alginate, 0.1 M CaCl2, and 12% w/v suspension cells. The optimum immobilization of
β-galactosidase was in 1% sodium alginate, 0.1 M CaCl2, and 26 U v/v enzymes. The
optimum activity of β-galactosidase in immobilized cells was reached in pH 6.5;
temperature 45ºC; incubation time 5 minutes, while the immobilized β-galactosidase
was in pH 5.5; temperature 35ºC; incubation time 15 minutes. Immobilized efficiency
was 28.95% for immobilized cells and 96.69% for immobilized enzyme. Immobilized
β-galactosidase was stable at pH 30ºC and temperature 30ºC. Km and Vmax value of
immobilized β-galactosidase were 30.487 mM and 1.742 μmol/minute, respectively.
The higest percentage of UHT whole milk hydrolyzed by immobilized cells was
reached for 12 hours with value 85.45, while that by immobilized enzyme was 15 hours
with value 80.55%. The higest of UHT skim milk hydrolyzed by immobilized cells was
reached for 9 hours with value 91.26% while that by immobilized enzyme was 6 hours
with value 93.06%. Immobilized cells can be re-used 4 times in both of milk.
Immobilized enzymes can be re-used 3 times in UHT whole milk and 6 times in UHT
skim milk. Immobilized β-galactosidase could be stored at 4ºC for 35 days with the
retained activity was 52.01%.
Key words: β-galactosidase, immobilization, Lactobacillus plantarum B134, sodium
alginates.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu
masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AMOBILISASI SEL Lactobacillus plantarum B134 DAN β-GALAKTOSIDASE
DENGAN NATRIUM ALGINAT DAN POTENSI HIDROLISISNYA PADA
SUSU UHT SKIM DAN BERLEMAK
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Syamsul Falah, S. Hut, M. Sc.
Judul Tesis : Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum B134 dan β-Galaktosidase
dengan Natrium Alginat dan Potensi Hidrolisisnya pada Susu UHT Skim
dan Berlemak
Nama
: Lusiana Kresnawati Hartono
NIM
: G851130446
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir I Made Artika, M.App. Sc
Ketua
Dr Ir Tatik Khusniati, M.App. Sc
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian: 29 Agustus 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah swt atas segala nikmat dan
karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Penelitian ini merupakan
bagian dari penelitian di Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
yang dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Mikroba, Bidang Mikrobiologi dari bulan
Oktober 2013 hingga Februari 2014. Tesis ini berjudul Amobilisasi Sel Lactobacillus
plantarum B134 dan β-Galaktosidase dengan Natrium Alginat dan Potensi
Hidrolisisnya pada Susu Skim dan Susu Berlemak UHT.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
sebagai pembimbing utama dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc sebagai pembimbing
kedua serta sebagai peneliti utama dalam penelitian ini atas arahan penyusunan tesis ini.
Penulis juga mengucapkan kepada keluarga dan teman-teman yang selalu mendukung
penulis.
Penyusunan tesis ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Oleh karena itu,
penulis sangat mengharapkan adanya saran dan kritik yang bermanfaat dalam
pelaksanaan penelitian ini.
Bogor, September 2014
Lusiana Kresnawati Hartono
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
1
1
2
3
3
3
METODE
Bahan
Alat
Prosedur
3
3
3
4
HASIL
Keadaan Amobilisasi Sel L. plantarum B134
Keadaan Amobilisasi β-Galaktosidase dari L. plantarum B134
Pengukuran dan Stabilitas β-Galaktosidase Amobil
Kinetika β-Galaktosidase Amobil
Hidrolisis Laktosa Susu Berlemak dan Skim UHT
Keterulangan Pemakaian Sel L. plantarum B134 Amobil dan
β-Galaktosidase Amobil
Penyimpanan β-Galaktosidase Amobil
8
8
10
11
13
14
16
17
PEMBAHASAN
Produksi Sel L. plantarum B134 dan β-Galaktosidase
Pengaruh pH dan Suhu terhadap β-Galaktosidase setelah Proses Amobil
Stabilitas β-Galaktosidase Amobil
Kinetika β-Galaktosidase Amobil
Hidrolisis Laktosa Susu UHT Skim dan Berlemak
Keterulangan Pemakaian Beads Sel L. plantarum B134 Amobil dan
β-Galaktosidase Amobil
Penyimpanan β-Galaktosidase Amobil
17
17
19
21
22
22
SIMPULAN
25
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
35
24
25
DAFTAR GAMBAR
1. Produk oNP yang dihasilkan pada variasi CaCl2
2. Produk yang dihasilkan pada variasi natrium alginat
3. Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai konsentrasi sel
L. plantarum B134
4. Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai pH
5. Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai suhu
6. Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada variasi waktu
pengukuran β-galaktosidase
7. Produk oNP pada berbagai konsentrasi CaCl2 dalam optimasi
amobilisasi β-galaktodisase
8. Produk oNP pada berbagai konsentrasi natrium alginat dalam
optimasi amobilisasi β-galaktodisase
9. Produk oNP pada berbagai konsentrasi β-galaktosidase dalam
optimasi amobilisasi β-galaktodisase
10. Aktivitas β-galaktosidase dalam β-galaktosidase amobil pada
berbagai pH
11. Aktivitas β-galaktosidase dalam β-galaktosidase amobil pada
berbagai suhu
12. Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada berbagai variasi
waktu
13. Stabilitas pH β-galaktosidase amobil
14. Stabilitas suhu β-galaktosidase amobil
15. Kurva Michaelis Menten β-galaktosidase amobil
16. Kurva Line-Weaver Burk β-galaktosidase amobil
17. Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan sel selama 24
jam
18. Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan sel L. plantarum
B134 selama 24 jam
19. Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam
20. Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam
21. Keterulangan pemakaian sel L. plantarum B134 amobil
22. Keterulangan pemakaian β-galaktosidase amobil
23. Peyimpangan β-galaktosidase selama 35 hari
24. Butiran gel
25. Reaksi hidrolisis laktosa
26. Reaksi hidrolisis oNPGal oleh β-galaktosidase
8
9
9
10
10
11
11
12
12
13
13
14
14
15
15
16
17
17
18
18
19
19
20
21
22
22
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Diagram alur penelitian
Perhitungan aktivitas β-galaktosidase
Kurva standar oNP
Kurva standar protein
Optimasi keadaan amobilisasi
Pengaruh pH, suhu, dan waktu inkubasi
Stabilitas pH dan suhu dari β-galaktosidase amobil
Hidrolisis laktosa susu UHT berlemak dan skim
Penyimpanan β-galaktosidase pada suhu 4ᵒC selama 35 hari
Parameter kinetik β-galaktosidase amobil
Riwayat hidup
36
37
38
39
40
41
42
43
44
44
45
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Susu merupakan sumber protein hewani yang mengandung komponen gizi
yang lengkap serta kompleks. Para ahli gizi menyarankan konsumsi susu dan
produknya setiap hari sesuai dengan piramida makanan. Indonesia menjadi negara
terendah di Asia Tenggara dalam konsumsi susu. Wakil Menteri Pertanian
mengatakan bahwa konsumsi susu di Indonesia hanya 11.09 kg per kapita
pertahun, sedangkan Malaysia dan Filipina konsumsinya mencapai 22.1 liter per
kapita per tahun, Thailand 33.7 liter per kapita per tahun, Vietnam 12.1 liter per
kapita per tahun, dan India mencapai 42.08 liter per kapita per tahun (Biro Umum
dan Humas Deptan 2012). Salah satu golongan masyarakat yang tidak
mengonsumsi susu adalah penderita intoleransi laktosa.
Kejadian intoleransi laktosa banyak terjadi pada orang Asia, Afrika, Timur
Tengah, beberapa negara Mediterania, dan juga ras Aborigin Australia
dibandingkan ras Kaukasia. Laktase merupakan enzim yang berperan dalam
pemecahan laktosa yang terdapat dalam mukosa usus halus. Enzim ini akan
memecah laktosa menjadi monosakarida berupa glukosa dan galaktosa yang
mudah diserap oleh tubuh. Keterbatasan laktase akan mengganggu pencernaan
laktosa. Laktosa dalam susu dipecah oleh bakteri dalam usus halus. Proses
fermentasi dapat menyebabkan kembung dan rasa sakit pada perut. Sebagian
laktosa yang tidak dicerna tetap berada dalan saluran pencernaan yang
menyebabkan tidak terjadinya penyerapan air dari feses sehingga akan terjadi
diare (BPOM 2008).
Orang yang kekurangan laktase akan mengalami intoleransi laktosa.
Gejala seseorang mengalami intoleransi laktosa seperti sakit perut, perut kembung,
dan diare. Penyebab terjadinya intoleransi laktosa sebagian besar karena faktor
genetik, yaitu jumlah laktase yang dimiliki lebih sedikit daripada orang normal.
Faktor lain penyebab intoleransi laktosa antara lain gastroenteritis, infeksi parasit,
dan defisiensi besi. Gastroenteritis dapat memicu penguraian enzim laktase yang
dapat berlangsung hingga beberapa minggu. Infeksi parasit dapat menyebabkan
pengurangan jumlah laktase sementara waktu (BPOM 2008).
Susu merupakan salah satu produk pangan yang memiliki kandungan gizi
yang baik. Namun. kandungan laktosa dalam susu sapi segar sekitar 4%
(Sumarjiana 2011). Hal ini menyebabkan penderita intoleransi laktosa tidak dapat
mengonsumsi susu. Salah satu alternatifnya adalah menggunakan β-galaktosidase
(laktase) untuk menghidrolisis laktosa tanpa menurunkan nilai gizi dalam susu.
Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan salah satu golongan bakteri yang dapat
menghasilkan β-galaktosidase. Lactobacillus sp. merupakan salah satu BAL yang
sering digunakan dalam produk makanan dan minuman fermentasi sehingga
keamanannya sudah terjamin (Sumathy et al. 2012). Lactobacillus bulgaricus
mampu menurunkan kandungan laktosa hingga 50-60% (Wierzbicki dan
Kosikowski 1973). β-Galaktosdase yang dipurifikasi parsial dari Lactobacillus
plantarum strain B123 indigenous mampu menurunkan laktosa dalam susu UHT
2
berlemak hingga 60% dan pada susu UHT rendah lemak hingga 81.1% (Mariyani
2013).
Enzim ini dapat dipakai berulang bila menggunakan teknik amobilisasi.
Amobilisasi enzim sering dilakukan karena kualitas produk yang dihasilkan baik
dan enzim dapat dipakai secara berulang (Illanes et al. 2008). Penelitian yang
dilakukan oleh Tanrisven dan Dogan (2002), Pessela et al. (2003, 2004, 2007)
Mariotti et al. (2008), Numano dan Sungur (2004), Goel et al. (2006), Grosova et
al. (2009), Yuningtyas (2011), Klein et al.(2013) menunjukkan bahwa βgalaktosidase amobil dapat menurunkan kadar laktosa dalam susu hingga 70%.
Amobolisasi juga dapat dilakukan pada sel mikroba penghasil β-galaktosidase.
Penurunan kadar laktosa dalam susu skim mencapai 87.8% setelah ditambahkan
sel amobil Kluyveromyces marxianus (Panesar 2007). Sel amobil dari
Kluyveromyces marxianus dapat menurunkan kadar laktosa dalam whey hingga
81.2% (Singh dan Singh 2012).
Alginat tersusun atas heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan
L-guluronat (Najafpour et al. 2004). Alginat merupakan salah satu bahan
penjerap dalam amobilisasi enzim yang sering digunakan. Kelebihan dari alginat
adalah aman, efisien, murah, dan kekuatan gelnya baik sehingga mampu
mempertahankan aktivitas dan stabilitas enzim (Goksungur dan Zorlu 2001).
Yuningtyas (2011) dan Prihantini (2013) menggunakan alginat untuk
mengamobilisasi β-galaktosidase dari bakteri indigen asal Indonesia. Penelitian
Yuningtyas (2011) menunjukkan bahwa aktivitas hidrolisis relatif susu UHT
menggunakan β-galaktosidase amobil mencapai 28.09% dan sel Enterobacter
cloacae amobil mencapai 22.01%. Aktivitas relatif hidrolisis susu UHT dari sel
BAL indigenos D210 sebesar 76.72% dan β-galaktosidase amobil sebesar 62.68%
(Prihantini 2013).
Lactobacillus plantarum B134 merupakan salah satu BAL asal Indonesia
yang diisolasi dari makanan tradisional asal Bogor oleh Sulistiani (Komunikasi
Pribadi 2013). Karakter β-galaktosidase dari bakteri tersebut juga telah diteliti
(Hartono 2013). Hasil penelitian tersebut mendasari penelitian ini untuk melihat
potensi β-galaktosidase dan sel amobil dari Lactobacillus plantarum stain B134
terhadap penurunan kadar laktosa pada susu UHT skim dan berlemak serta
stabilitas penyimpanan β-galaktosidase amobil. Hasil penelitian ini diharapkan
dapat menjadi landasan untuk pengembangan suatu produk susu UHT rendah
laktosa di Indonesia yang saat ini belum ada.
Perumusan Masalah
Potensi dari β-galaktosidase pada Lactobacillus sp. yang berasal dari
Indonesia belum banyak diungkap. Penapisan awal mengenai aktivitas βgalaktosidase pada beberapa
isolat Lactobacillus sp., koleksi Bidang
Mikrobiologi, Puslit Biologi LIPI, telah dilakukan Lactobacillus plantarum B134
merupakan salah satunya. β-Galaktosidase dari L. plantarum strain B1334 telah
dimurnikan secara parsial dan diungkap karakternya oleh Hartono (2013). Namun,
amobilisasi β-galaktosidase dan sel dari L. plantarum B134 menggunakan Naalginat belum dilakukan. Salah satu aplikasi β-galaktosidase dalam produk pangan
sebagai agen penghidrolisis laktosa susu UHT. Karakter β-galaktosidase amobil
dan penyimpanannya juga belum diketahui.
3
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengamobilisasi β-galaktosidase dan sel dari
L. plantarum B134 yang dapat menghidrolisis laktosa yang terkandung dalam
susu UHT.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai karakter βgalaktosidase dan sel dari L. plantarum dan teknik amobilisasinya sehingga dapat
bermanfaat dalam pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi bidang industri
pengolahan makanan khususnya mengenai potensi hidrolisis laktosa susu UHT
oleh β-galaktosidase.
Hipotesis
Sel bakteri dan β-galaktosidase yang berasal dari L. plantarum B134 dapat
diamobilisasi menggunakan natrium alginat dan dapat dipakai berulang. Karakter
β-galaktosidase amobil (pH dan suhu) dapat terdeteksi. Selain itu, sel dan βgalaktosidase amobil mampu menghidrolisis laktosa dalam susu skim dan susu
berlemak UHT.
2 METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan bakteri L.
plantarum B134 yang merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong,
buffer tris-HCl 0.1 M, buffer fosfat 0.05 M, buffer tris-HCl 0.01 M, susu UHT
(skim dan berlemak), β-galaktosidase, commasie brilian blue 0.1%, o-Nitrofenilβ-D-Galaktosida (oNPGal), Na2CO3 1 M, o-Nitrofenol (ONP), bovine serum
albumin (BSA), Na-alginat pa, CaCl2, dan ammonium sulfat pa.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikropipet,, laminar air
flow cabinet, tabung Eppendorf, neraca analitik, vortex, penangas air Memmert,
stopwatch, pH meter HM-25G TOADKK, kuvet spektrofotometer UV-Vis 1700
shimadzu, inkubator Isuzu, sonikator Eyela, tabung dialisis (Novagen), dan
magnetic stirrer.
4
Prosedur
Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997)
Inokulum L. plantarum B134 diambil sebanyak 2% dengan kerapatan
optik 0.7 yang diinokulasikan dalam 2400 mL media produksi steril dan
diinkubasi pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi selama 18 jam, sel dipanen
sedangkan untuk enzim dipanen setelah inkubasi 24 jam. Sel dipanen dengan
mensetrifus media selama 15 menit dengan kecepatan 9.500 rpm pada suhu 4ºC.
Pelet yang diperoleh merupakan sel bakteri dan disimpan pada suhu 4ºC, Enzim
dipanen dengan mensentrifus media 15 menit dengan kecepatan 9.500 rpm pada
suhu 4ºC. Pelet yang dihasilkan dicuci dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5 lalu
disentrifus kembali. Pencucian pellet dilakukan sebanyak dua kali. Pelet yang
diperoleh setelah pencucian yang kedua ditimbang dan ditambahkan buffer fosfat
0.05 M pH 6.5 dengan perbandingan 1:5 (pellet:buffer). Kemudian pemecahan sel
dilakukan dengan sonikator 50 hHz selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan
yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim β-galaktosidase.
Pengendapan dengan Ammonium Sulfat (Scopes 1987)
Ekstrak kasar β-galaktosidase sebanyak 20 mL diendapkan dalam
ammonium sulfat. Penambahan ammonium sulfat dilakukan secara bertahap.
Konsentrasi ammonium sulfat yang digunakan yaitu 0-40% dan 40-50%. Larutan
kemudian diaduk dengan magnetic stirrer secara perlahan selama 1 jam. Larutan
disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Pelet
yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam 1 mL buffer fosfat 0.05 M pH 6.5.
Kejenuhan ammonium sulfat yang optimum akan ditunjukkan oleh aktivitas yang
tinggi.
533 (�2 −�1 )
Jumlah ammonium sulfat (gram/liter) =
100−0.352
Keterangan:
S1
: Konsentrasi awal ammonium sulfat
S2
: Konsentrasi akhir ammonium sulfat
NB: Nilai 533 menunjukkan bahwa dibutuhkan 533 gram ammonium sulfat per
liter untuk membuat larutan jenuh 100%.
Dialisis. Tabung dialisis diisi β-galaktosidase hasil pengendapan amonium
sulfat. Tabung kemudian direndam dalam 2 liter buffer PO4 0.01 M pH 6.5 yang
diletakkan diatas stirer dan disimpan dalam Cool Room bersuhu 4ºC selama 15
jam.
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Pengukuran Kurva Standar. Standar protein yang digunakan adalah
bovine serum albumin (BSA) pada berbagai konsentrasi dari 0.005-1.00 mg/mL
yang dilarutkan dalam NaCl 0.15 M. Sebanyak 20 µl BSA ditambahkan dalam 1
mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban
larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
Pengukuran Sampel. Sebanyak 20 µl β-galaktosidase ditambahkan dalam
1 mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit.
Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
5
Pembuatan Blanko. Sebanyak 40 µl NaCl 0.15 M ditambahkan dalam 2
mL lautan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban
larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
Uji Aktivitas β-Galaktosidase (modifikasi Liu et al. 2009)
Pengukuran Sampel. Uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara
sebanyak 1 mL buffer tris-HCl 0.1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke
dalam tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Kemudian
ditambahkan 200 µl o-nitrofenil-β-D-galaktosida (oNPGal) 2 mg/ml dan
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Pada menit ke-5 ditambahkan 1 mL
Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis dengan mengukur
absorban pada λ=420 nm.
Pengukuran Kurva Standar. Berbagai konsentrasi oNP dari 0-2.5 mM
yang dilarutkan dalam buffer tris-HCl 0.01 M pH 7. Sebanyak 1 mL buffer trisHCl 0.1 M pH 7 dan 100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi
kemudian ditambahkan 200 µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu
37ºC selama 5 menit. Selanjutnya campuran ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M.
Larutan di vortex dan intensitas warna kuning yang terbentuk diukur
absorbansinya pada λ=420 nm. Hasil pembacaan aktivitas β-galaktosidase
dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1
µmol oNP dari substrat oNPGal per menit pada kondisi percobaan.
Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum (Becerra et al. Modifikasi 2001)
Hasil panen sel Lactobacillus plantarum B134 ditambahkan ke dalam
natrium alginat (konsentrasi optimum). Butiran sel dibuat dengan meneteskan
suspensi sel ke dalam natrium alginat dengan syringe kedalam 50 ml larutan
CaCl2 (konsentrasi optimum) sambil diaduk dengan pengaduk bermagnet dengan
kecepatan 100 rpm. Butiran sel yang telah terbentuk diinkubasi selama 1 jam
dalam larutan CaCl2 pada suhu 4ºC hingga gel mengeras. Butiran sel kemudian
disaring dengan kertas saring dan dipindahkan dalam labu erlenmeyer untuk
dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali.
Amobilisasi β-Galaktosidase (Haider dan Husain modifikasi 2007)
Hasil dialisis β-galaktosidase ditambahkan ke dalam natrium alginat
(konsentrasi optimum). Butiran gel dibuat dengan meneteskan suspensi dengan
syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 (konsentrasi optimum) kemudian diaduk
dengan pengaduk bermagnet. Setelah butiran gel terbentuk, butiran gel
ditambahkan dalam larutan CaCl2 kemudian diinkubasi selama 1 jam. Setelah 1
jam, butiran gel disaring menggunakan kertas saring dan dipindahkan dalam labu
erlenmeyer, kemudian dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali. Hasil butiran gel
diaplikasikan dalam susu UHT untuk menurunkan kadar laktosa dalam susu UHT
tersebut.
Optimasi Amobilisasi Sel Lactobacillus plantarum B134 (Becerra et al.
Modifikasi 2001)
Natrium alginat yang digunakan bervariasi yaitu 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,
dan 6%. Larutan CaCl2 yang digunakan bervariasi yaitu 0.1 M, 0.3 M, dan 0.5 M.
Selain itu, bobot sel yang digunakan juga bervariasi yaitu 10%, 20%, dan 40%
6
(b/v). Setelah butiran gel yang bervariasi telah diperoleh, gel tersebut diuji
aktivitasnya. Konsentrasi alginat dan bobot sel yang menghasilkan produk paling
tinggi akan digunakan sebagai komposisi untuk amobilisasi sel Lactobacillus
plantarum B134.
Optimasi Amobilisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus plantarum B134
(Becerra et al. Modifikasi 2001)
Natrium alginat yang digunakan bervariasi yaitu 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,
dan 6%. Larutan CaCl2 yang digunakan bervariasi yaitu 0.1 M, 0.3 M, dan 0.5 M.
Selain itu, unit enzim yang digunakan juga bervariasi yaitu 6.5 U, 13 U, dan 26 U.
Setelah butiran gel yang bervariasi telah diperoleh, gel tersebut diuji aktivitasnya.
Konsentrasi alginat dan unit enzim yang menghasilkan produk paling tinggi akan
digunakan sebagai komposisi untuk amobilisasi β-galaktosidase dari
Lactobacillus plantarum B134.
Karakterisasi β-Galaktosidase
Pengaruh pH terhadap Aktivitas dan Stabilitas β-Galaktosidase
amobil. Optimasi pH dilakukan dengan menggunakan buffer tris-HCl pada
variasi pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0. Pengujian aktivitas dilakukan pada
suhu 37ºC selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas βgalaktosidase amobil menunjukkan pH optimum β-galaktosidase. Stabilitas enzim
amobil terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim pada larutan
buffer pada berbagai pH (5-8 dengan selang 0.5) selama 1 jam. Setelah inkubasi
selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan dalam penangas es selama 10
menit. Aktivitas enzim yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase
pada pH optimum. Nilai aktivitas enzim amobil tersisa dinyatakan dalam
persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim
amobil tanpa perlakuan).
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas dan Stabilitas β-Galaktosidase
Amobil. Uji aktivitas enzim amobil dengan variasi suhu 25, 30, 35, 40, 45, 50,
dan 55 ºC dilakukan untuk penentuan suhu optimum. Pengujian aktivitas
dilakukan berdasarkan pH optimum selama 5 menit. Aktivitas tertinggi
berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase menunjukkan suhu optimum enzim βgalaktosidase. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan
larutan enzim pada berbagai suhu (25-55oC dengan selang 5oC) selama 1 jam
dalam buffer dengan pH hasil stabilitas. Setelah inkubasi selesai larutan enzim
dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas enzim amobil yang
tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase pada pH dan suhu optimum.
Nilai aktivitas enzim amobil tersisa dinyatakan dalam persentase dari aktivitas
setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan).
Penentuan Kinetika Enzim Amobil. Analisis KM dan Vmaks dilakukan
pada enzim amobil. Sebanyak 1000 µl tris-HCl 0.1 pada pH optimum, 100 µl
enzim, dan 200 µl substrat oNPGal yang diujikan pada konsentrasi 0.01, 0.05, 0.1,
0.5, 1, 2, 4, dan 5 mg/ml diinkubasi selama 5-30 menit. Setiap 5 menit, sebanyak
1000 µl Na2CO3 1 M ditambahkan agar reaksi berhenti kemudian larutan
dianalisis menggunakan spektrofotometer UV Vis pada λ=420 nm. Grafik dibuat
dengan memplotkan hubungan antara waktu (sumbu X) dan kadar oNP yang
terbentuk (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal dimana nilai
7
kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya
grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk menentukan nilai KM dan Vmaks. Grafik
Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v
sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan pembentukan
produk persatuan waktu.
Aplikasi β-Galaktosidase pada Susu UHT (Haider dan Husein modifikasi
2007, Kishore dan Katasya 2012)
Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT. Sel bebas, enzim bebas, sel amobil,
dan enzim amobil ditambahkan dalam 5 mL susu UHT. Konsentrasi sel dan enzim
yang ditambahkan sesuai dengan hasil optimasi amobilisasi. Sampel diinkubasi
suhu optimum selama 24 jam. Setiap 3 jam sekali, pengambilan sampel dilakukan
sebanyak 250 µl. Analisis pengukuran kadar laktosa menggunakan kit enzimatik
analisis glukosa GOD-POD (glukosa oksidase-peroksidase).
Keterulangan Pemakaian Sel Amobil dan Enzim Amobil. Sebanyak 5
mL susu UHT ditambahkan sel dan enzim amobil. Sampel diinkubasi pada suhu
dan waktu optimum untuk menghidrolisis laktosa susu UHT. Sel dan enzim
amobil digunakan kembali untuk menghidrolisis laktosa susu UHT. Analisa
pengukuran kadar laktosa menggunakan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD
(glukosa oksidase-peroksidase).
Analisis Penurunan dengan GOD-POD. Sebanyak 10 µl enzim
ditambahkan reagen GOD-POD kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu
37ºC. Larutan kemudian dianalisis dengan spektrofotometri UV-VIS pada λ
sebesar 500 nm. Hasil absorbansi kemudian dibandingkan dengan standar glukosa
100 mg/dl. Jumlah laktosa yang mengalami hidrolisis akan setara dengan jumlah
glukosa yang terbentuk pada percobaan.
������� ���� ��������� ����� ���������
% laktosa yang tidak terhidrolisis = �������
���� ��������� ������ ℎ ���������
× 100
Stabilitas Penyimanan Beads β-Galaktosidase
Beads β-galaktosidase disimpan dalam suhu 4ºC selama 35 hari. Setiap 5
hari sekali, aktivitas beads β-galaktosidase diuji aktivitasnya.
Analisis Statistika
Amobilisasi sel L.plantarum B134 dan β-galaktosidase menggunakan
rancangan acak lengkap dengan ulangan 3 kali. Variabel yang digunakan dalam
menentukan amobilisisasi yaitu: konsentrasi CaCl2 (0.1 M, 0.3 M, dan 0.5 M),
natrium alginat (0.5%, 1%, 2%, and 3% b/v), sel L. plantarum B134 (4%, 8%,
12% b/v), β-galaktosidase (6.5 U, 13 U, dan 26 U), pH (5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5,
dan 8.0), suhu (25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, dan 55oC), stabilitas pH (5.0,
5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0), dan stabilitas suhu (25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC,
50oC, dan 55oC). Model linier (Matjik dan Sumertajaya 2002) yang digunakan
adalah:
�ij = � + �� + �� + ���
Keterangan:
Yij = pengamatan ke j pada unit percobaan ke i
8
µ
��
��
���
= pengaruh rataan umum
= pengaruh variabel amobilisasi pada jam ke-i
= pengaruh ulangan ke-j
= pengaruh galat variable amobilisasi pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
Data yang diperoleh akan dianalisis dengan Analysis of Variance
(ANOVA) pada selang kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data
menggunakan SPSS 16.0. Jika hasil uji berbeda nyata makan akan dilanjutkan
dengan uji Duncan.
3 HASIL
Amobilisasi Sel L. plantarum B134
Produk oNP (μmol)
Konsentrasi natrium alginat, CaCl2, dan sel sangat penting agar beads sel
dapat terbentuk sempurna. Konsentrasi CaCl2 yang digunakan adalah 0.1 M, 0.3
M, dan 0.5 M. Gambar 1 menunjukkan produk oNP tertinggi tercapai pada
konsentrasi CaCl2 0.1 M sebesar yaitu 0.899 μmol. Natrium alginat divariasikan
dengan konsentrasi 0.5%, 1%, 2%, dan 3%. Produk oNP tertinggi tercapai pada
saat konsentrasi natrium alginat 1% sebesar 2.5 μmol (Gambar 2). Massa sel juga
divariasikan untuk mengisi beads sel dengan konsentrasi 4% b/v, 8% b/v, dan
12% b/v. Produk oNP tertinggi dihasilkan pada massa sel 12% b/v yaitu sebesar
1.227 μmol (Gambar 3).
1.000
0.899a
0.755b
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000c
0.000
0.1
0.3
0.5
[CaCl2] (M)
Produk oNP (μmol)
Gambar 1 Produk oNP yang dihasilkan pada variasi CaCl2 pada amobilisasi L.
plantarum B134. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
pada uji Duncan 5%.
2.500b
3.000
2.000
1.405a
0.914c
1.000
0.491d
0.000
0.5
1
2
3
Natrium Alginat (%)
Gambar 2 Produk yang dihasilkan pada variasi natrium alginat pada amobilisasi L.
plantarum B134. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
pada ada uji Duncan 5%.
Produk oNP (μmol)
9
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
1.227c
0.476b
0.142a
4
8
12
Konsentrasi sel (% b/v)
Gambar 3 Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai konsentrasi sel
L. plantarum B134. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda
nyata pada uji Duncan 5%.
Pengukuran β-Galaktosidase pada Sel L. plantarum B134 Amobil
Aktivitas β-galaktosidase dalam sel L. plantarum B134 amobil
dipengaruhi oleh pH, suhu, dan waktu inkubasi dalam pengukurannya. Nilai pH
divariasikan antara 5 hingga 8 dengan selang 0.5. Aktivitas β-galaktosidase diukur
dengan terbentuknya produk oNP pada selang pH tersebut. Aktivitas βgalaktosidase mencapai optimum pada pH 6.5 dengan produk oNP yang
dihasilkan yaitu sebesar 1.512 μmol (Gambar 4). Variasi suhu yang digunakan
untuk pengukuran aktivitas β-galaktosidase yaitu 25oC, 30oC, 35 oC, 40 oC, 45 oC,
50 oC, dan 55 oC. Aktivitas β-galaktosidase mencapai optimum pada suhu 45 oC
dengan produk oNP yang dihasilkan yaitu sebesar 1.979 μmol (Gambar 5). Waktu
inkubasi β-galaktosidase divariasikan antara 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 menit.
Produk oNP yang dihasilkan meningkat sebanding dengan lamanya waktu
inkubasi yang dilakukan. Nilai absorbansinya secara berurutan adalah sebagai
berikut 0.465 A, 0.647 A, 0.672 A, 0.744 A, 0.776 A, dan 0.859 A (Gambar 6).
Waktu inkubasi yang dipilih untuk pengukuran β-galaktosidase adalah 5 menit.
Efesiensi amobilisasi sel L. plantarum B134 yang diujikan pada keadaan optimum
aktivitas β-galaktosidase adalah 28.95%.
Produk oNP (μmol)
2.000
1.512d
1.500
1.089a
1.270b
1.197e
1.172c
1.000
0.329f
0.500
0.040g
0.000
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
pH
Gambar 4 Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai pH. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Produk oNP (μmol
oNP)
10
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
1.979e
1.577c
0.979f
0.770d
0.163a
0.727g
0.390b
25
30
35
40
45
50
55
Suhu (oC)
Gambar 5 Produk oNP yang dihasilkan pada berbagai suhu. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
1
8
0.8
6
0.6
4
0.4
Produk oNP (µmol
ONP)
2
0
Absorban
si (A)
Produk oNP (μmol
oNP)
10
0.2
0
0
5
10
15
20
Waktu (menit)
25
30
Gambar 6 Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada variasi waktu
pengukuran β-galaktosidase
Amobilisasi β-Galaktosidase dari L. plantarum B134
Produk oNP (μmol
oNP)
Amobilisasi β-galaktosidase yang baik perlu ditentukan komposisi
konsentrasi natrium alginat, CaCl2, dan enzim yang tepat. Konsentrasi CaCl2
divariasikan 0.1 M, 0.3 M, dan 0.5M. Produk oNP tertinggi diperoleh pada
konsentrasi CaCl2 0.1 M sebesar 0.813 μmol (Gambar 7). Natrium alginat yang
digunakan adalah 0.5%, 1%, 2%, dan 3%. Saat konsentrasi natrium alginat 1%,
oNP tertinggi yang dihasilkan yaitu 1.494 μmol (Gambar 8). Konsenstrasi enzim
divariasikan antara 6.5 unit, 13 unit, dan 26 unit. Gambar 9 menunjukkan bahwa
26 unit β-galaktosidase masih dapat ditampung oleh beads alginat dan
menghasilkan produk oNP tertinggi sebesar 4.996 μmol.
1.000
0.813a
0.691b
0.608b
0.500
0.000
0.1
0.3
0.5
[CaCl2] (M)
Gambar 7 Produk oNP pada berbagai konsentrasi CaCl2 dalam amobilisasi βgalaktodisase. Huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
pada uji Duncan 5%.
11
Produk oNP (μmol)
1.800
1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
1.494b
0.770a
0.743a
0.5
1
0.666a
2
3
Konsentrasi Natrium Alginat (%)
Gambar 8 Produk oNP pada berbagai konsentrasi natrium alginat dalam
amobilisasi β-galaktodisase. Huruf yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Produk oNP (μmol)
6.000
4.996b
5.000
4.000
3.000
2.736a
3.116a
2.000
1.000
0.000
6.5
13.0
26.0
[β-Galaktosidase] (unit)
Gambar 9 Produk oNP pada berbagai konsentrasi β-galaktosidase dalam
amobilisasi β-galaktodisase. Huruf yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Pengukuran dan Stabilitas β-Galaktosidase Amobil
Keadaan pengukuran β-galaktosidase yang diperhatikan adalah pH, suhu,
dan waktu inkubasi. Nilai pH buffer tris-HCl yang digunakan dalam pengukuran
β-galaktosidase divariasikan antara 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, dan 8. Gambar 10
menunjukkan aktivitas β-galaktosidase mencapai optimum pada pH 5.5 yaitu
sebesar 4.403 U/mL. Suhu untuk pengukuran β-galaktosidase divariasikan antara
25, 30, 35, 40, 45, dan 50ºC. Suhu pengukuran 35ºC menghasilkan aktivitas βgalaktosidase optimum yaitu sebesar 2.345 U/mL (Gambar 11). Waktu inkubasi
yang digunakan juga diuji pada 5, 10, 15, dan 20, 25, dan 30 menit. Absorbansi
oNP secara berurutan adalah 0.027 A, 0.096 A, 0.162 A, 0.108 A, 0.133, dan
0.196 A. Produk oNP yang terbentuk pada waktu pengukuran diatas secara
berurutan adalah 1.427 μmol, 2.921 μmol, 4.638 μmol, 8.255 μmol, 9.666 μmol,
dan 12.242 μmol (Gambar 12). Efisiensi amobilisasi β-galaktosidase sebesar
96.69%
Aktivitas
β-Galaktosidase (U/mL)
12
4.403b
5.0
4.0
3.0
3.385c
2.731d
2.573a
2.0
1.0
0.384e
0.259f
0.121g
7.0
7.5
8.0
0.0
5.0
5.5
6.0
6.5
pH
Aktivitas
β-Galaktosidase (U/ml)
Gambar 10 Aktivitas β-galaktosidase amobil pada berbagai pH. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.345c
1.920d
0.904a
1.270e
1.021b
0.000f
25
30
35
40
45
50
Suhu (oC)
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
Produk oNP (μmol)
1.2
1
0.8
0.6
0.4
Produk oNP…
Absorban (A)
0.2
0
0
5
10
15
20
Waktu (menit)
25
Absorban
(A)
Gambar 11 Aktivitas β-galaktosidase amobil pada berbagai suhu. Huruf yang
sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
30
Gambar 12 Absorbansi dan produk oNP yang dihasilkan pada berbagai variasi
waktu.
Penyimpanan β-galaktosidase ditentukan oleh kestabilan terhadap pH dan
suhu. Kestabilan β-galaktosidase terhadap perlakuan penyimpanan pH selama 1
jam divariasikan menggunakan buffer tris-HCl pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, dan 8.
Aktivitas β-galaktosidase pada variasi penyimpanan pH dibandingkan dengan
aktivitas β-galaktosidase pada pH dan suhu optimum. Aktivitas β-galaktosidase
tersisa dari berbagai variasi pH secara berurutan adalah 54.38%, 47.18%, 46.82%,
42.42%, 34.68%, 19.51%, dan 0.86% (Gambar 13). Kestabilan β-galaktosidase
diujikan pada variasi suhu 25, 30, 35, 40, 45, dan 50ºC. Aktivitas β-galaktosidase
13
Aktivitas
β-galaktosidase tersisa (%)
terisisa setelah perlakuan secara berurutan adalah 77.51%, 79.69%, 60.16%,
56.59%, 25.82%, dan 0% (Gambar 14).
100
80
54.38a
60
47.18b
45.82c
42.42d
34.68e
40
19.51f
20
0.86g
0
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
pH
Aktivitas
β-galaktosidase tersisa (%)
Gambar 13 Stabilitas pH β-galaktosidase amobil. Huruf yang sama menunjukkan
tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
100
78.15a
80
79.63a
59.95b
60
56.90c
40
26.24d
20
0.00e
0
25
30
35
40
45
50
Suhu (˚C)
Gambar 14 Stabilitas suhu β-galaktosidase amobil. Huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan 5%.
Kinetika β-Galaktosidase Amobil
V (µmol/menit)
Parameter kinetik β-galaktosidase amobil ditentukan menggunakan kurva
Michaelis-Menten dan Lineweaver-Burk. Kurva Michaelis-Menten menunjukkan
hubungan antara konsentrasi oNPGal dngan kecepatan β-galaktosidase amobil
(Gambar 15). Kurva Lineweaver-Burk digunakan untuk menentukan nilai Km dan
Vmaks (Gambar 16). Persamaan Lineweaver-Burk yaitu y=17.50x-1.742 dengan
R2 sebesar 0.976. Nilai Km dan Vmaks ditentukan dari persamaan tersebut
sebesar 30.487 mM dan 1.742 μmol/menit.
2
1.5
1
0.5
0
0.000
5.000
10.000
15.000
20.000
[S] (mM)
Gambar 15 Kurva Michaelis Menten β-galaktosidase amobil
14
12
10
y = 17.50x - 0.574
R² = 0.976
1/V
8
6
4
2
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
1/S
Gambar 16 Kurva Lineweaver-Burk β-galaktosidase amobil
Hidrolisis Laktosa Susu Berlemak dan Skim UHT
Laktosa susu UHT dari tipe UHT berlemak dan UHT skim dihidrolisis
menggunakan sel L. plantarum B134 dan β-galaktosidase semipurifikasi dengan
sistem batch. Sel L. plantarum B134 amobil dan sel L. plantarum B134 bebas
mampu mengkonversi laktosa susu UHT berlemak paling tinggi pada jam ke 12
secara berurutan 85.45% dan 87.43% (Gambar 17). Sel amobil dan bebas dari L.
plantarum B134 memecah laktosa susu UHT skim tertinggi berdasarkan
persentase laktosa yang terhidrolisis paling tinggi pada jam ke 9 dengan nilai
secara berurutan 91.26% dan 95.82% (Gambar 18).
β-Galaktosidase amobil dan β-galaktosidase bebas mengubah laktosa susu
UHT berlemak mampu menghasilkan glukosa tertinggi secara berurutan pada jam
ke 15 dan 9. Laktosa susu UHT berlemak yang terhidrolisis pada jam ke 15 untuk
β-galaktosidase amobil sebesar 80.55% dan jam ke 9 untuk β-galaktosidase bebas
sebesar 95.87% (Gambar 19). Konversi laktosa susu UHT skim tertinggi yang
dilakukan oleh β-galaktosidase amobil pada jam ke 6 dan β-galaktosidase bebas
pada jam ke 9. Laktosa yang terhidrolisis β-galaktosidase amobil pada jam ke 6
sebesar 93.06%, sedangkan β-galaktosidase bebas pada jam ke 9 sebesar 97.43%
(Gambar 20).
Laktosa terhidrolisis( %)
100
80
60
40
Sel Bebas
Sel Amobil
20
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam ke-
Gambar 17 Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan sel selama 24
jam.
15
120
Laktosa terhidrolisis (%)
100
80
60
Sel Bebas
40
Sel Amobil
20
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam ke-
Laktosa terhidrolisis (%)
Gambar 18 Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan sel L. plantarum
B134 selama 24 jam.
100
80
60
40
β-gal amobil
20
β-gal bebas
0
0
3
6
9
12
15
Jam ke-
18
21
24
Gambar 19 Hidrolisis laktosa susu berlemak UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam.
Laktosa terhidrolisis (%)
100
80
60
40
β-gal amobil
β-gal bebas
20
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam ke-
Gambar 20 Hidrolisis laktosa susu skim UHT menggunakan β-galaktosidase
selama 24 jam.
16
Keterulangan Pemakaian Sel L. plantarum B134 Amobil dan
β-Galaktosidase Amobil
Sel L. plantarum B134 amobil dan β-galaktosidase amobil dapat dipakai
secara berulang. Sel L. plantarum B134 amobil dapat dipakai sebanyak 4 kali
pada susu UHT berlemak dan skim untuk menurunkan kadar laktosa. Kadar
laktosa UHT berlemak yang tidak terhidrolis oleh sel L. plantarum B134 amobil
pada setiap ulangan secara berurutan adalah 3.78%, 6.02%, 6.42%, dan 11.97%
(Gambar 21). Kadar laktosa UHT skim yang tidak terhidrolisis oleh sel L.
plantarum B134 amobil pada setiap ulangan secara berurutan adalah 16.63%,
6.18%, 8.46%, dan 8.14% (Gambar 21).
β-Galaktosidase amobil dapat dipakai 3 kali untuk menurunkan kadar
laktosa UHT berlemak dan 6 kali untuk menurunkan kadar laktosa UHT skim.
Kadar laktosa UHT berlemak yang tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase
amobil pada setiap ulangan secara berurutan sebesar 6.81%, 12.19%, dan 44.55%
(Gambar 22). Kadar laktosa UHT skim yang tidak dapat dihidrolisis oleh βgalaktosidase amobil pada setiap ulangan secara berurutan sebesar 6.24%, 7.367%,
7.89%, 14.53%, 16.28%, dan 47.79% (Gambar 22).
Laktosa yang tidak terhidrolisis
(%)
100
80
60
UHT Berlemak
40
UHT Skim
16.63
20
6.02 6.18
3.78
11.97
8.14
6.428.46
0
2 Siklus (kali) 3
1
4
Gambar 21 Keterulangan pemakaian sel L. plantarum B134 amobil.
Laktosa yang tidak terhidrolisis
(%)
100
UHT belemak
80
UHT Skim
60
47.79
44.55
40
20
6.81
6.24
12.19
7.37
1
2
7.89
14.53
16.28
0
3
4
5
6
Siklus (Kali)
Gambar 22 Keterulangan pemakaian β-galaktosidase amobil
17
Penyimpanan β-Galaktosidase Amobil
Aktivitas relatif β-galaktosidase (%)
β-Galaktosidase amobil disimpan pada suhu 4ºC selama 35 hari. Setiap 5
hari sekali, aktivitas β-galaktosidase diukur berdasarkan banyaknya produk oNP
yang terbentuk. Aktivitas relatif β-galaktosidase bebas pada dari ke 0, 5, 10, 15,
20, 25, 30, dan 35 sebesar 100%, 82.76%, 56.59, 66.93%, 63.63%, 41.58%,
25.23%, 29.13% (Gambar 23). Aktivitas relatif β-galaktosidase amobil pada hari
ke 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 sebesar 100%, 80.38%, 67.27%, 66.40%,
73.63%, 53.56%, 34.87%, dan 43.41% (Gambar 23).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100 100
82.76 83.29
81.36
87.15
69.45
66.93
Enzim amobil
63.63 66.18
Enzim bebas
58.86
56.59
41.58
45.83
25.23
0
5
10
15
20
25
30
29.13
35
Hari ke-
Gambar 23 Penyimpanan β-galaktosidase selama 35 hari
4 PEMBAHASAN
Produksi Sel L. plantarum B134 dan β-Galaktosidase
L. plantarum merupakan bakteri asam laktat yang ditumbuhkan dalam
media MRS (de Man, Rogosa, dan Sharpe). Masa kultivasi dapat dilakukan
hingga jam ke 49 pada suhu 37oC. Setelah jam ke 24, L. plantarum memasuki fase
stationer (Smentankova 2012). L. plantarum isolat B134 menghasilkan βgalaktosidase tertinggi saat 2% inokulum ditumbuhkan dalam media MRS yang
mengandung 2% laktosa dan pH media 5. Waktu inkubasi yang dibutuhkan untuk
menghasilkan aktivitas β-galaktosidase tertinggi pada L. plantarum adalah 24 jam
pada suhu 37ºC (Hartono 2013; Sulistiani 2013). Setelah sel dipanen, βgalaktosidase diperoleh dengan memecah sel menggunakan sonikator. Pemecahan
tersebut bertujuan untuk menghancurkan dinding sel bakteri menggunakan
gelombang suara tertentu. Selanjutnya β-galaktosidase dimurnikan secara
semipurifikasi hingga tahap dialisis. β-Galaktosidase hasil dialisis digunakan
untuk diamobilisasi dengan natrium alginat karena aktivitas β-galaktosidase dari L.
plantarum B134 setelah proses dialisis telah mengalami peningkatan aktivitas
spesifik sebesar 45.828 U/mg dibandingkan dengan β-galaktosidase kasar. Sel L.
plantarum B134 yang diamobilisasi dipanen pada jam ke 18. Pertumbuhan sel L.
plantarum B134 mencapai fase logaritma pada jam ke 18 (Hartono 2013).
18
Amobilisasi Sel L. plantarum B134 dan β-Galaktosidase
Amobilisasi sel dan enzim menggunakan metode penjebakan
menggunakan matriks alginat sudah umum digunakan. Butiran gel yang
dihasilkan merupakan titik kritis yang harus diperhatikan selama proses
amobilisasi. Bentuk dan ukuran butiran gel yang dihasilkan akan mempengaruhi
aktivitas sel maupun enzim yang dijebak. Butiran gel yang berukuran kecil akan
menurunkan risiko keluarnya massa sel dan enzim. Selain itu, substrat dan
senyawa lain yang mendukung dapat masuk kedalam butiran gel dengan mudah.
Bentuk gel yang baik sangat penting dalam proses pengerasan gel karena akan
menghindari bentuk sel yang tidak sempurna (Keshaw et al. 2005). Gambar 24
menunjukkan butiran gel dari enzim dan sel amobil dalam penelitian ini.
(a)
(b)
Gambar 24 Butiran gel (a) β-galaktosidase amobil (b) sel Lactobacillus plantarum
B134 amobil.
Kombinasi konsentrasi natrium alginat, kalsium klorida, sel, dan enzim
merupakan hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sel dan enzim amobil.
Matriks alginat terbentuk karena kation Ca2+ dalam kalsium klorida bereaksi
dengan anion monovalen karboksilat pada natrium alginat (Najafpour et al. 2004).
Konsentrasi natrium alginat yang digunakan akan mempengaruhi difusi substrat
kedalam butiran gel. Semakin tinggi konsentrasi natrium alginat yang digunakan
akan menyebabkan ikatan silang yang terbentuk akan semakin banyak. Hal ini
juga menyebabkan butiran gel yang dibentuk dari natrium alginat dengan
konsentrasi tinggi menghasilkan warna gel yang lebih terang (Das dan Senapati
2008). Penurunan aktivitas β-galaktosidase dapat terjadi saat konsentrasi natrium
alginat terlalu tinggi. Hal ini terjadi karena penurunan porositas butiran gel yang
menyebabkan substrat sulit untuk berdifusi kedalam gel (Talekar dan Chavar
2012).
Faktor lain yang mempengaruhi adalah konsentrasi kalsium klorida.
Butiran gel yang stabil dapat menahan sel maupun enzim secara maksimal tetapi
tidak menghambat kerja enzim. Kalsium klorida akan menstabilkan bentuk
butiran gel tersebut. Konsentrasi kalsium klorida yang terlalu tinggi akan
menyebabkan penurunan aktivitas enzim. Hal ini disebabkan adanya perubahan
pH kalsium klorida yang mempengaruhi kerja enzim (Talekar d