Validasi metode peneantuan kadar apigenin dalam ekstrak seledri dengan kromatografi cair kinerja tinggi
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak
Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM
DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI.
Apigenin merupakan senyawa aktif yang berasal dari seledri (Apium graveolens)
dan telah digunakan secara luas untuk pengobatan penyakit asam urat. Validasi metode
penentuan kadar apigenin yang dilakukan pada penelitian adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005). Analisis kadar
apigenin dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis KCKT dapat digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan
maka metode tersebut divalidasi. Parameter-parameter validasi yang diuji meliputi
linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Semua parameter yang
ditetapkan memenuhi kriteria penerimaan yang telah ditetapkan oleh Association of
Official Analytical Chemist. Linearitas pada konsentrasi 3,8; 5,7; dan 7,6 mg/l memiliki
koefisien korelasi berkisar antara 0,9900 dan 0,9998. Limit deteksi metode ini adalah
sebesar 2,7222 mg/l dan limit kuantifikasi sebesar 8,2500 mg/l. Ketelitian dilakukan pada
hari yang sama sebanyak lima kali ulangan menunjukkan ketelitian yang cukup baik
dengan simpangan baku relatif sebesar 3,85%. Ketepatan ditentukan dengan metode
penambahan standar dengan nilai persen perolehan kembali berkisar antara 95,00 dan
118,77%. Rerata kadar apigenin yang diperoleh adalah sebesar 0,0052% (b/b).
ABSTRACT
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validation Method for Determination of Apigenin in Extract
Celery with High Performance Liquid Chromatography. Under the direction of
LATIFAH KOSIM DARUSMAN and MOHAMAD RAFI.
Apigenin is an active substance derived from celery (Apium graveolens) and
widely used for the treatment of gout. Determination method of apigenin which have
been validated was introduced by Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005).
Apigenin analysis was done by high performance liquid chromatography (HPLC). To
make sure that HPLC analysis method can be used for the intended purpose then the
method was validated. Parameters determined on method validation were linearity, limit
of detection, limit of quantification, precision, and accuracy. All parameters were in
accordance with the acceptance criteria of Association of Official Analytical Chemist.
The linearity in the concentration of 3,8; 5,7; and 7,6 mg/l had correlation coefficent of
0,9900–0,9998. limit of detection in this method was 2,7222 mg/l and limit of
quantification was 8,2500 mg/l. Interday precision in five restating showed good
precision with relative standard deviation of 3,85%. Accuracy was determined by
standard addition method with recovery percentage of 95,00–118,77%. Average
concentration of apigenin is 0,0052% (w/w).
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Skripsi : Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri
dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Nama
: Rahma Juwita Zamri
NIM
: G44203012
Disetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS
NIP 13053668
Mohamad Rafi, S.Si
NIP 132321454
Diketahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806
Tanggal lulus:
PRAKATA
Bismillahirrohamanirrohim.
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas
limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi
ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2007 sampai
Maret 2008. Tema yang diambil adalah validasi metode, dengan judul Validasi Metode
Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu selama
kegiatan penelitian dan penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Pusat Studi Biofarmaka
atas bantuan sebagian dana penelitian, alm Dra.Tuti Setiawati Sudjana, MS yang sempat
menjadi pembimbing I, Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS selaku pembimbing I, M.
Rafi, S.Si selaku pembimbing II, Rudi Heryanto, S.Si, M.Si atas literatur dan saran yang
telah diberikan. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak Eman dan
seluruh staf kimia analitik, M. Agung Zaim, S.Si beserta seluruh staf pusat studi
biofarmaka yang telah membantu selama penelitian, Budi Arifin, S.Si, dan teman-teman
kimia angkatan 40 yang senantiasa memberikan semangat dan tempat untuk berdiskusi
khususnya Niken, Wina, Farah, Noerhayati, Erika, Ratna, dan Lita. Terima kasih juga
disampaikan kepada Aby, Umi, Idris, Hasby, Amel, Ruly, Mas Irawan, dan Mbak Muji
atas segala doa, kasih sayang, dan dorongan semangat yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, April 2008
Rahma Juwita Zamri
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 05 Maret 1985 dari ayah KH Aby
Muhammad Zamri dan ibu Jusmaniar. Penulis merupakan putri pertama dari lima
bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMUN 1 Cikarang Utara dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah
Kimia TPB pada tahun ajaran 2006/2007, 2007/2008, Kimia Analitik pada tahun ajaran
2006/2007, Kimia Lingkungan pada tahun 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 pada
tahun ajaran 2006/2007, Kimia Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Spektroskopi I
D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Makanan D3 pada tahun ajaran 2007/2008, dan
Anorganik Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008. Penulis pernah aktif di kegiatan
organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai salah satu staf Departemen Kimia Pangan,
Ikatan Mahasiswa Kimia, dan sebagai salah satu staf Departemen Kajian dan Jurnalistik
Islam DKM Al-Ghifari pada tahun 2006. Penulis mengikuti Program Kreativitas
Mahasiswa Bidang Penelitian (PKMP) dan dibiayai oleh Dikti dengan judul Daya
Antioksidan Ekstrak Tumbuhan Meniran (Phyllanthus niruri Linn), Daun Sendok
(Plantago major Linn) dan Som Jawa (Talinum paniculatum (jack) Gaertn) dengan
Metode Tiosianat dan DPPH pada tahun 2005. Penulis menyelesaikan praktik lapangan di
bagian Non-Soap Detergent PT Unilever Indonesia, Tbk pada tahun 2006 dengan judul
Penentuan Bulk Density Powder Detergen dan Pengaruhnya Terhadap Proses
Pengemasan.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Seledri (Apium graveolens L.) .........................................................................
Flavonoid ........................................................................................................
Apigenin .........................................................................................................
Validasi ...........................................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi ..................................................................................................
Limit Kuantifikasi ...........................................................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................................
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................
Metode Penelitian ............................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Pendahuluan ..............................................................................................
Ekstraksi Apigenin ..........................................................................................
Analisis dengan KLT .......................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi ...............................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
6
6
7
7
8
9
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .........................................................................................................
Saran ...............................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
9
LAMPIRAN ............................................................................................................. 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Data rendemen ekstrak seledri ................................................................................
6
2 Hasil analisis dengan KLT ......................................................................................
7
3 Persamaan regresi linear dan koefisien korelasi kurva standar ................................
7
4 Parameter statistika kurva standar rerata (n=3) ........................................................
8
5 Penentuan kadar apigenin .......................................................................................
8
6 Rerata persen perolehan kembali ............................................................................
9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur umum senyawa flavonoid .........................................................................
1
2 Struktur apigenin ....................................................................................................
2
3 Kromatogram hasil KLT standar apigenin dengan ekstrak ......................................
7
4 Kurva standar rerata ...............................................................................................
7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelitian ............................................................................................. 12
2 Hasil analisis kadar air seledri .............................................................................. 13
3 Data rendemen hasil ekstraksi seledri .................................................................... 14
4 Nilai Rf dan warna bercak hasil KLT ..................................................................... 15
5 Linearitas ulangan 1 .............................................................................................. 16
6 Linearitas ulangan 2 .............................................................................................. 18
7 Linearitas ulangan 3 .............................................................................................. 20
8 Parameter statistika kurva standar rerata ............................................................... 22
9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi ........................................................ 24
10 Penentuan ketelitian ............................................................................................. 25
11 Penentuan persen perolehan kembali .................................................................... 28
PENDAHULUAN
Seledri merupakan salah satu tanaman
obat yang berperan dalam mengatasi penyakit
rematik dan asam urat. Komponen metabolit
sekunder yang berhasil diisolasi dari seledri di
antaranya glikosida, apiin, apiol, dan
flavonoid yang bermanfaat sebagai obat
peluruh keringat, penurun demam, rematik
sukar tidur, dan darah tinggi. Selain itu pada
seledri juga ditemukan apigenin, manit,
inositol, asparigina, glutamina, kolina, dan
linamarosa (Soedibyo 1998).
Apigenin merupakan salah satu senyawa
yang terdapat dalam seledri dan dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999). Metode yang digunakan untuk
penentuan kadar apigenin adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. (2005).
Analisis kadar apigenin pada penelitian ini
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) karena metode tersebut memiliki
sensitivitas yang tinggi dan memerlukan
jumlah contoh yang sedikit (beberapa µl).
Hasil analisis yang akurat dan absah akan
diperoleh apabila metode yang digunakan
telah divalidasi terlebih dahulu.
Validasi adalah sebuah evaluasi mengenai
ketepatan dan ketelitian dari suatu prosedur
analisis yang layak digunakan untuk
menyelesaikan masalah. Validasi menjamin
bahwa prosedur yang sama mendapatkan hasil
yang dapat dibandingkan. Nisbah analisis ini
dapat
digunakan
untuk
mengevaluasi
ketelitian dan ketepatan. Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis dapat digunakan dan
menjamin mutu produk yang dihasilkan sesuai
persyaratan, maka metode tersebut harus
divalidasi. Parameter yang diuji dalam
penelitian ini meliputi linearitas, limit deteksi,
limit kuantifikasi, ketelitian, dan ketepatan.
Penelitian ini bertujuan mengetahui keabsahan
data yang dihasilkan dari metode Frankee et
al. (2005).
TINJAUAN PUSTAKA
bergerigi dan panjang 10–25 cm. Dalam
keadaan kering daun seledri menggulung,
berwarna hijau kecoklatan, berbau aroma
kuat, rasa manis sedikit pahit (Djumidi et al.
1998).
Menurut Soedibyo (1998), kandungan
kimia seledri adalah apiin, apigenin, manit,
inositol, asparagina, glutamina, kolina, dan
linamarosa. Kandungan seledri daun tiap 100
g ialah 89 g air, 2,20 g protein, 0,60 g lemak,
4,60 g karbohidrat, 1,40 g serat, 1,70 g abu,
2685 IU vitamin A, 0,08 mg vitamin B1, 0,12
mg vitamin B2, 0,60 mg niasin, 49 mg
vitamin C, 326 mg Ca, 51 mg P, 15,30 mg Fe,
151 mg Na, 318 mg K (Susiarti 2000).
Tanaman seledri juga dimanfaatkan untuk
pengobatan tradisional, misalnya untuk obat
tekanan darah tinggi, diuretik, emenagog
(memperlancar haid), dengeu (demam disertai
lini pada sendi-sendi dan otot), dan rematik.
Tanaman ini juga dapat digunakan untuk
melangsingkan tubuh. Di pedesaan Jawa
Barat, daun seledri dimanfaatkan untuk
menyuburkan rambut, selain lidah buaya dan
daun dadap (Susiarti 2000).
Flavonoid
Flavonoid merupakan golongan terbesar
senyawa fenolik di samping fenol sederhana,
fenilpropanoid, dan kuinonfenolik (Harborne
1986). Sebanyak 2% dari seluruh karbon yang
difotosintesis oleh tanaman diubah menjadi
flavonoid atau senyawa yang berhubungan
erat dengannya (Markham 1988). Dalam
tumbuhan, aglikon flavonoid terdapat dalam
berbagai
bentuk
struktur.
Semuanya
mengandung 15 atom C dalam inti dasarnya
yang tersusun dalam konfigurasi C 6-C3-C6,
yaitu dua cincin aromatik dihubungkan oleh 3
karbon yang dapat atau tidak dapat
membentuk cincin ketiga. Cincin diberi nama
A, B, dan C, atom karbon dinomori menurut
sistem penomoran yang menggunakan angka
untuk cincin A dan C serta angka beraksen
untuk cincin B. Struktur umum flavonoid
dapat dilihat pada Gambar 1.
Seledri (Apium graveolens)
Apium graveolens adalah daun seledri dari
famili Apiaceae atau Umbelliflorae. Ciri
makroskopis simplisia daun seledri berupa
daun tunggal atau majemuk semu, tangkai
silindris beralur, panjang tangkai 5–15 cm.
Daun seledri berbentuk segi tiga, dengan
ujung runcing, pangkal berlekuk, tepi
B
A
C
Gambar 1 Struktur umum senyawa
flavonoid (Markham 1988).
Flavonoid
umumnya
secara
alami
terbentuk di bawah pengaruh bioflavonoid
(vitamin D) yang selalu ada dalam tanaman
dan memiliki efek yang bermanfaat terhadap
lebih dari 50 penyakit (Heldt 1997). Flavonoid
akan berubah warnanya jika ditambah basa
atau amonia sehingga mudah dideteksi pada
kromatogram atau pada larutan (Harborne
1986).
Flavonoid, tanin, lignan, dan lignin
merupakan turunan fenilalanina dan pada
beberapa tanaman ada yang berasal dari
tirosina. Fenilalanina dan tirosina terbentuk
dari jalur sikimat. Karena senyawa fenolik
berasal dari dua asam amino yang memiliki
cincin fenil dengan C3 sebagai rantai samping,
mereka dinamai fenilpropanoid. Flavonoid
yang meliputi flavon, isoflavon, dan
antosianidin,
sebagaimana
struktur
fenilpropana, mengandung sebuah cincin
kedua yang terbentuk dari tiga molekul asetil
koenzim A (Heldt 1997). Flavon merupakan
prekursor untuk beberapa flavonoid
Apigenin
Apigenin merupakan komponen flavonoid
utama dari seledri yang termasuk ke dalam
golongan flavon (Harborne 1986). Gambar 2
menunjukkan struktur kimia apigenin. Rumus
molekulnya adalah C15H10O5 dengan bobot
molekul 270,23 g/mol. Nama Intenational
Union of Pure and Applied Chemistry dari
apigenin
adalah
5,7-dihidroksi-2-(4hidroksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on.
Titik
leleh apigenin 345–350 C. Apigenin
memiliki banyak kegunaan, salah satunya
dalam bidang farmasi. Senyawa ini dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999).
Gambar 2 Struktur apigenin
(Markham 1988).
Penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Hertog et al. (1992) mengemukakan
bahwa kadar apigenin pada seledri yang
direfluks dengan metanol 50% adalah 1787
mg/kg bobot kering seledri. Kemudian,
Crozier et al. (1997) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri bervariasi
bergantung dari jenis seledri yang dianalisis,
kadar apigenin dalam seledri bervariasi antara
17 dan 191 µg/g bobot segar seledri. Barubaru ini, Laura (2007) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri berkisar antara 2
dan 17 ppm bergantung pada masa tanam
seledri.
Validasi
Validasi
menurut
Harmita
(2004)
merupakan suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu berdasarkan percobaan
laboratorium untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan
untuk penggunaannya. Validasi menurut SK
Menkes RI No. 43/Menkes/SK/II/1988
tentang cara pembuatan obat yang baik
(CPOB)
merupakan
suatu
tindakan
pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa
tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem,
perlengkapan,
atau
mekanisme
yang
digunakan dalam produksi dan pengawasan
akan senantiasa mencapai hasil yang
diinginkan (Depkes RI 2001). Association of
South East Asian Nation Good Manufacturing
Practice (ASEAN GMP) menyatakan bahwa
validasi adalah kegiatan membuktikan dengan
pasti bahwa material, proses, prosedur,
aktivitas, sistem, peralatan, atau mekanisme
yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil
yang diharapkan pada standar yang konsisten
(ASEAN 1996).
Validasi metode menurut Association of
Official Analytical Chemist (AOAC)
(2002) adalah suatu proses yang menetapkan
bahwa karakteristik suatu metode yang
ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk
aplikasi analisis yang diharapkan dengan cara
studi laboratorium. Validasi menurut Levin
(2002) dibagi menjadi empat kelas, yaitu kelas
A, B, C, dan D. Kelas A digunakan untuk
identifikasi suatu senyawa. Kelas B digunakan
untuk mendeteksi dan menentukan adanya
pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa
secara kuantitatif dan kelas D untuk mencari
ciri suatu senyawa.
Linearitas
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu
metode analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi
analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi
tertentu (AOAC 2002). Linearitas suatu
metode analisis adalah ukuran yang
menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak
Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM
DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI.
Apigenin merupakan senyawa aktif yang berasal dari seledri (Apium graveolens)
dan telah digunakan secara luas untuk pengobatan penyakit asam urat. Validasi metode
penentuan kadar apigenin yang dilakukan pada penelitian adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005). Analisis kadar
apigenin dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis KCKT dapat digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan
maka metode tersebut divalidasi. Parameter-parameter validasi yang diuji meliputi
linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Semua parameter yang
ditetapkan memenuhi kriteria penerimaan yang telah ditetapkan oleh Association of
Official Analytical Chemist. Linearitas pada konsentrasi 3,8; 5,7; dan 7,6 mg/l memiliki
koefisien korelasi berkisar antara 0,9900 dan 0,9998. Limit deteksi metode ini adalah
sebesar 2,7222 mg/l dan limit kuantifikasi sebesar 8,2500 mg/l. Ketelitian dilakukan pada
hari yang sama sebanyak lima kali ulangan menunjukkan ketelitian yang cukup baik
dengan simpangan baku relatif sebesar 3,85%. Ketepatan ditentukan dengan metode
penambahan standar dengan nilai persen perolehan kembali berkisar antara 95,00 dan
118,77%. Rerata kadar apigenin yang diperoleh adalah sebesar 0,0052% (b/b).
ABSTRACT
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validation Method for Determination of Apigenin in Extract
Celery with High Performance Liquid Chromatography. Under the direction of
LATIFAH KOSIM DARUSMAN and MOHAMAD RAFI.
Apigenin is an active substance derived from celery (Apium graveolens) and
widely used for the treatment of gout. Determination method of apigenin which have
been validated was introduced by Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005).
Apigenin analysis was done by high performance liquid chromatography (HPLC). To
make sure that HPLC analysis method can be used for the intended purpose then the
method was validated. Parameters determined on method validation were linearity, limit
of detection, limit of quantification, precision, and accuracy. All parameters were in
accordance with the acceptance criteria of Association of Official Analytical Chemist.
The linearity in the concentration of 3,8; 5,7; and 7,6 mg/l had correlation coefficent of
0,9900–0,9998. limit of detection in this method was 2,7222 mg/l and limit of
quantification was 8,2500 mg/l. Interday precision in five restating showed good
precision with relative standard deviation of 3,85%. Accuracy was determined by
standard addition method with recovery percentage of 95,00–118,77%. Average
concentration of apigenin is 0,0052% (w/w).
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Skripsi : Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri
dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Nama
: Rahma Juwita Zamri
NIM
: G44203012
Disetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS
NIP 13053668
Mohamad Rafi, S.Si
NIP 132321454
Diketahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806
Tanggal lulus:
PRAKATA
Bismillahirrohamanirrohim.
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas
limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi
ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2007 sampai
Maret 2008. Tema yang diambil adalah validasi metode, dengan judul Validasi Metode
Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu selama
kegiatan penelitian dan penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Pusat Studi Biofarmaka
atas bantuan sebagian dana penelitian, alm Dra.Tuti Setiawati Sudjana, MS yang sempat
menjadi pembimbing I, Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS selaku pembimbing I, M.
Rafi, S.Si selaku pembimbing II, Rudi Heryanto, S.Si, M.Si atas literatur dan saran yang
telah diberikan. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak Eman dan
seluruh staf kimia analitik, M. Agung Zaim, S.Si beserta seluruh staf pusat studi
biofarmaka yang telah membantu selama penelitian, Budi Arifin, S.Si, dan teman-teman
kimia angkatan 40 yang senantiasa memberikan semangat dan tempat untuk berdiskusi
khususnya Niken, Wina, Farah, Noerhayati, Erika, Ratna, dan Lita. Terima kasih juga
disampaikan kepada Aby, Umi, Idris, Hasby, Amel, Ruly, Mas Irawan, dan Mbak Muji
atas segala doa, kasih sayang, dan dorongan semangat yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, April 2008
Rahma Juwita Zamri
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 05 Maret 1985 dari ayah KH Aby
Muhammad Zamri dan ibu Jusmaniar. Penulis merupakan putri pertama dari lima
bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMUN 1 Cikarang Utara dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah
Kimia TPB pada tahun ajaran 2006/2007, 2007/2008, Kimia Analitik pada tahun ajaran
2006/2007, Kimia Lingkungan pada tahun 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 pada
tahun ajaran 2006/2007, Kimia Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Spektroskopi I
D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Makanan D3 pada tahun ajaran 2007/2008, dan
Anorganik Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008. Penulis pernah aktif di kegiatan
organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai salah satu staf Departemen Kimia Pangan,
Ikatan Mahasiswa Kimia, dan sebagai salah satu staf Departemen Kajian dan Jurnalistik
Islam DKM Al-Ghifari pada tahun 2006. Penulis mengikuti Program Kreativitas
Mahasiswa Bidang Penelitian (PKMP) dan dibiayai oleh Dikti dengan judul Daya
Antioksidan Ekstrak Tumbuhan Meniran (Phyllanthus niruri Linn), Daun Sendok
(Plantago major Linn) dan Som Jawa (Talinum paniculatum (jack) Gaertn) dengan
Metode Tiosianat dan DPPH pada tahun 2005. Penulis menyelesaikan praktik lapangan di
bagian Non-Soap Detergent PT Unilever Indonesia, Tbk pada tahun 2006 dengan judul
Penentuan Bulk Density Powder Detergen dan Pengaruhnya Terhadap Proses
Pengemasan.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Seledri (Apium graveolens L.) .........................................................................
Flavonoid ........................................................................................................
Apigenin .........................................................................................................
Validasi ...........................................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi ..................................................................................................
Limit Kuantifikasi ...........................................................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................................
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................
Metode Penelitian ............................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Pendahuluan ..............................................................................................
Ekstraksi Apigenin ..........................................................................................
Analisis dengan KLT .......................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi ...............................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
6
6
7
7
8
9
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .........................................................................................................
Saran ...............................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
9
LAMPIRAN ............................................................................................................. 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Data rendemen ekstrak seledri ................................................................................
6
2 Hasil analisis dengan KLT ......................................................................................
7
3 Persamaan regresi linear dan koefisien korelasi kurva standar ................................
7
4 Parameter statistika kurva standar rerata (n=3) ........................................................
8
5 Penentuan kadar apigenin .......................................................................................
8
6 Rerata persen perolehan kembali ............................................................................
9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur umum senyawa flavonoid .........................................................................
1
2 Struktur apigenin ....................................................................................................
2
3 Kromatogram hasil KLT standar apigenin dengan ekstrak ......................................
7
4 Kurva standar rerata ...............................................................................................
7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelitian ............................................................................................. 12
2 Hasil analisis kadar air seledri .............................................................................. 13
3 Data rendemen hasil ekstraksi seledri .................................................................... 14
4 Nilai Rf dan warna bercak hasil KLT ..................................................................... 15
5 Linearitas ulangan 1 .............................................................................................. 16
6 Linearitas ulangan 2 .............................................................................................. 18
7 Linearitas ulangan 3 .............................................................................................. 20
8 Parameter statistika kurva standar rerata ............................................................... 22
9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi ........................................................ 24
10 Penentuan ketelitian ............................................................................................. 25
11 Penentuan persen perolehan kembali .................................................................... 28
PENDAHULUAN
Seledri merupakan salah satu tanaman
obat yang berperan dalam mengatasi penyakit
rematik dan asam urat. Komponen metabolit
sekunder yang berhasil diisolasi dari seledri di
antaranya glikosida, apiin, apiol, dan
flavonoid yang bermanfaat sebagai obat
peluruh keringat, penurun demam, rematik
sukar tidur, dan darah tinggi. Selain itu pada
seledri juga ditemukan apigenin, manit,
inositol, asparigina, glutamina, kolina, dan
linamarosa (Soedibyo 1998).
Apigenin merupakan salah satu senyawa
yang terdapat dalam seledri dan dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999). Metode yang digunakan untuk
penentuan kadar apigenin adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. (2005).
Analisis kadar apigenin pada penelitian ini
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) karena metode tersebut memiliki
sensitivitas yang tinggi dan memerlukan
jumlah contoh yang sedikit (beberapa µl).
Hasil analisis yang akurat dan absah akan
diperoleh apabila metode yang digunakan
telah divalidasi terlebih dahulu.
Validasi adalah sebuah evaluasi mengenai
ketepatan dan ketelitian dari suatu prosedur
analisis yang layak digunakan untuk
menyelesaikan masalah. Validasi menjamin
bahwa prosedur yang sama mendapatkan hasil
yang dapat dibandingkan. Nisbah analisis ini
dapat
digunakan
untuk
mengevaluasi
ketelitian dan ketepatan. Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis dapat digunakan dan
menjamin mutu produk yang dihasilkan sesuai
persyaratan, maka metode tersebut harus
divalidasi. Parameter yang diuji dalam
penelitian ini meliputi linearitas, limit deteksi,
limit kuantifikasi, ketelitian, dan ketepatan.
Penelitian ini bertujuan mengetahui keabsahan
data yang dihasilkan dari metode Frankee et
al. (2005).
TINJAUAN PUSTAKA
bergerigi dan panjang 10–25 cm. Dalam
keadaan kering daun seledri menggulung,
berwarna hijau kecoklatan, berbau aroma
kuat, rasa manis sedikit pahit (Djumidi et al.
1998).
Menurut Soedibyo (1998), kandungan
kimia seledri adalah apiin, apigenin, manit,
inositol, asparagina, glutamina, kolina, dan
linamarosa. Kandungan seledri daun tiap 100
g ialah 89 g air, 2,20 g protein, 0,60 g lemak,
4,60 g karbohidrat, 1,40 g serat, 1,70 g abu,
2685 IU vitamin A, 0,08 mg vitamin B1, 0,12
mg vitamin B2, 0,60 mg niasin, 49 mg
vitamin C, 326 mg Ca, 51 mg P, 15,30 mg Fe,
151 mg Na, 318 mg K (Susiarti 2000).
Tanaman seledri juga dimanfaatkan untuk
pengobatan tradisional, misalnya untuk obat
tekanan darah tinggi, diuretik, emenagog
(memperlancar haid), dengeu (demam disertai
lini pada sendi-sendi dan otot), dan rematik.
Tanaman ini juga dapat digunakan untuk
melangsingkan tubuh. Di pedesaan Jawa
Barat, daun seledri dimanfaatkan untuk
menyuburkan rambut, selain lidah buaya dan
daun dadap (Susiarti 2000).
Flavonoid
Flavonoid merupakan golongan terbesar
senyawa fenolik di samping fenol sederhana,
fenilpropanoid, dan kuinonfenolik (Harborne
1986). Sebanyak 2% dari seluruh karbon yang
difotosintesis oleh tanaman diubah menjadi
flavonoid atau senyawa yang berhubungan
erat dengannya (Markham 1988). Dalam
tumbuhan, aglikon flavonoid terdapat dalam
berbagai
bentuk
struktur.
Semuanya
mengandung 15 atom C dalam inti dasarnya
yang tersusun dalam konfigurasi C 6-C3-C6,
yaitu dua cincin aromatik dihubungkan oleh 3
karbon yang dapat atau tidak dapat
membentuk cincin ketiga. Cincin diberi nama
A, B, dan C, atom karbon dinomori menurut
sistem penomoran yang menggunakan angka
untuk cincin A dan C serta angka beraksen
untuk cincin B. Struktur umum flavonoid
dapat dilihat pada Gambar 1.
Seledri (Apium graveolens)
Apium graveolens adalah daun seledri dari
famili Apiaceae atau Umbelliflorae. Ciri
makroskopis simplisia daun seledri berupa
daun tunggal atau majemuk semu, tangkai
silindris beralur, panjang tangkai 5–15 cm.
Daun seledri berbentuk segi tiga, dengan
ujung runcing, pangkal berlekuk, tepi
B
A
C
Gambar 1 Struktur umum senyawa
flavonoid (Markham 1988).
Flavonoid
umumnya
secara
alami
terbentuk di bawah pengaruh bioflavonoid
(vitamin D) yang selalu ada dalam tanaman
dan memiliki efek yang bermanfaat terhadap
lebih dari 50 penyakit (Heldt 1997). Flavonoid
akan berubah warnanya jika ditambah basa
atau amonia sehingga mudah dideteksi pada
kromatogram atau pada larutan (Harborne
1986).
Flavonoid, tanin, lignan, dan lignin
merupakan turunan fenilalanina dan pada
beberapa tanaman ada yang berasal dari
tirosina. Fenilalanina dan tirosina terbentuk
dari jalur sikimat. Karena senyawa fenolik
berasal dari dua asam amino yang memiliki
cincin fenil dengan C3 sebagai rantai samping,
mereka dinamai fenilpropanoid. Flavonoid
yang meliputi flavon, isoflavon, dan
antosianidin,
sebagaimana
struktur
fenilpropana, mengandung sebuah cincin
kedua yang terbentuk dari tiga molekul asetil
koenzim A (Heldt 1997). Flavon merupakan
prekursor untuk beberapa flavonoid
Apigenin
Apigenin merupakan komponen flavonoid
utama dari seledri yang termasuk ke dalam
golongan flavon (Harborne 1986). Gambar 2
menunjukkan struktur kimia apigenin. Rumus
molekulnya adalah C15H10O5 dengan bobot
molekul 270,23 g/mol. Nama Intenational
Union of Pure and Applied Chemistry dari
apigenin
adalah
5,7-dihidroksi-2-(4hidroksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on.
Titik
leleh apigenin 345–350 C. Apigenin
memiliki banyak kegunaan, salah satunya
dalam bidang farmasi. Senyawa ini dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999).
Gambar 2 Struktur apigenin
(Markham 1988).
Penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Hertog et al. (1992) mengemukakan
bahwa kadar apigenin pada seledri yang
direfluks dengan metanol 50% adalah 1787
mg/kg bobot kering seledri. Kemudian,
Crozier et al. (1997) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri bervariasi
bergantung dari jenis seledri yang dianalisis,
kadar apigenin dalam seledri bervariasi antara
17 dan 191 µg/g bobot segar seledri. Barubaru ini, Laura (2007) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri berkisar antara 2
dan 17 ppm bergantung pada masa tanam
seledri.
Validasi
Validasi
menurut
Harmita
(2004)
merupakan suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu berdasarkan percobaan
laboratorium untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan
untuk penggunaannya. Validasi menurut SK
Menkes RI No. 43/Menkes/SK/II/1988
tentang cara pembuatan obat yang baik
(CPOB)
merupakan
suatu
tindakan
pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa
tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem,
perlengkapan,
atau
mekanisme
yang
digunakan dalam produksi dan pengawasan
akan senantiasa mencapai hasil yang
diinginkan (Depkes RI 2001). Association of
South East Asian Nation Good Manufacturing
Practice (ASEAN GMP) menyatakan bahwa
validasi adalah kegiatan membuktikan dengan
pasti bahwa material, proses, prosedur,
aktivitas, sistem, peralatan, atau mekanisme
yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil
yang diharapkan pada standar yang konsisten
(ASEAN 1996).
Validasi metode menurut Association of
Official Analytical Chemist (AOAC)
(2002) adalah suatu proses yang menetapkan
bahwa karakteristik suatu metode yang
ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk
aplikasi analisis yang diharapkan dengan cara
studi laboratorium. Validasi menurut Levin
(2002) dibagi menjadi empat kelas, yaitu kelas
A, B, C, dan D. Kelas A digunakan untuk
identifikasi suatu senyawa. Kelas B digunakan
untuk mendeteksi dan menentukan adanya
pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa
secara kuantitatif dan kelas D untuk mencari
ciri suatu senyawa.
Linearitas
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu
metode analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi
analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi
tertentu (AOAC 2002). Linearitas suatu
metode analisis adalah ukuran yang
menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi
antara kadar analit dan respons detektor,
dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r)
(Depkes 2001). Respons detektor yang
digunakan adalah luas area puncak untuk
instrumen KCKT. Koefisien korelasi didapat
dengan menghitung regresi dari persamaan
linearnya, sedangkan perpotongan dengan
sumbu y menyatakan ukuran biasnya. Selang
linearitas adalah selang antara konsentrasi
tertinggi dan terendah dari analit yang dapat
ditetapkan menggunakan suatu metode
dengan tingkat, ketelitian, kecermatan, dan
koefisien korelasi yang telah dilakukan. Nilai
r yang dihasilkan lebih besar atau sama
dengan 0.9900 (AOAC 2002). Secara
matematis, nilai r dapat dihitung dengan
menggunakan rumus
r =
x
x x y y
i
x yi y
2
2
i
1/ 2
i
dengan
r = koefisien korelasi
xi = konsentrasi analit setiap ulangan
x = konsentrasi analit rerata
yi = luas area puncak setiap ulangan
y = luas area puncak rerata
Limit Deteksi
Limit deteksi (LD) menurut AOAC (2002)
adalah konsentrasi analit terendah di dalam
suatu contoh yang dapat dideteksi tetapi tidak
harus terkuantitasi pada kondisi percobaan
yang ditetapkan. Umumnya nisbah respons
antara analit:derau adalah 3:1. LD dihitung
dari rerata kemiringan garis dan simpangan
baku intersep kurva standar yang diperoleh.
Limit Kuantifikasi
Limit kuantifikasi adalah konsentrasi
analit terendah yang terdapat dalam contoh
yang dapat diukur secara tepat dan teliti
(AOAC 2002). LK dapat dihitung sebagai
konsentrasi analit yang memiliki respons
analit:derau sebesar 10:1 (Green 1996; ICH
1995). LK dihitung dari rerata kemiringan
garis dan simpangan baku intersep kurva
standar yang diperoleh.
Ketelitian
Ketelitian dapat dinyatakan dengan tiga
cara,
yaitu
kedapatulangan, ketelitian
intermediet, dan ketertiruan. Ketelitian
menurut AOAC (2002) adalah kesamaan hasil
dari tiap individu ketika metode tersebut
diterapkan berulang kali pada berbagai
pencuplikan suatu contoh homogen. Ketelitian
diukur dengan menghitung simpangan baku
relatif (SBR) dari lima kali pengukuran ulang.
Menurut AOAC syarat penerimaan parameter
validasi ini, sebagai berikut: sangat teliti
(%SBR 1), teliti (%SBR 1-2), sedang
(%SBR 2-5), dan tidak teliti (%SBR 5)
Ketepatan
Ketepatan
suatu
prosedur
analisis
didefinisikan sebagai kedekatan hasil yang
diterima (baik sebagai nilai teoretis maupun
dengan nilai rujukan yang diterima) dengan
nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran
(ICH 1995 diacu dalam Chan 2004).
Ketepatan menurut AOAC (2002) adalah
kedekatan nilai hasil percobaan yang
diperoleh dari suatu metode terhadap nilai
sebenarnya. Ketepatan diukur dengan
menghitung
perolehan
kembali
(PK)
menggunakan metode penambahan standar.
Nilai PK bergantung pada matriks contoh,
prosedur proses contoh, dan konsentrasi
analit. Batas penerimaan PK menurut AOAC
adalah 80–120%.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT)
KCKT adalah suatu teknik analisis
kromatografi dengan menggunakan tekanan
tinggi yang berguna untuk pemisahan ion atau
molekul terlarut dalam suatu larutan. Teknik
ini berkembang untuk mengatasi kelemahankelemahan pemisahan pada kromatografi gas,
seperti senyawa yang relatif tidak tahan panas
dan senyawa yang tidak volatil.
KCKT berdasarkan kepolaran kolomnya
dibagi menjadi dua, yaitu fase normal dan
terbalik.
Kromatografi
fase
normal
menggunakan fase diam lebih polar daripada
fase gerak, sedangkan pada kromatografi fase
terbalik, fase gerak lebih polar daripada fase
diam. Proses pemisahan campuran komponen
terjadi di dalam kolom, yaitu berdasarkan
perbedaan
distribusi
masing-masing
komponen pada fase diam dan fase gerak. Zatzat yang berinteraksi kuat dengan fase diam
akan tertahan lebih lama dalam kolom,
sedangkan yang berinteraksi lemah akan
keluar dengan cepat dari kolom (Christian
1986).
KCKT terdiri atas beberapa bagian, yaitu
sistem eluen, sistem tekanan, injeksi contoh,
kolom, dan sistem deteksi. Sistem eluen pada
KCKT dapat menggunakan berbagai macam
pelarut, biasanya air dan pelarut organik.
Eluen yang digunakan dapat berupa pelarut
tunggal atau campuran dari dua atau lebih
pelarut. Keadaan ini menyebabkan ada dua
jenis sistem elusi, yaitu isokratik dan gradien.
Pada sistem isokratik eluen tidak mengalami
perubahan konsentrasi, jika sebaliknya disebut
sistem elusi gradien. Sistem tekanan pada
KCKT menggunakan pompa bertekanan
tinggi. Pompa harus tahan terhadap semua
jenis pelarut, dapat mencapai tekanan sampai
6000 psi, dapat mengantarkan aliran terukur
0.01–1.0 atau 0.1–20 ml/menit.
Injeksi contoh pada KCKT menggunakan
syringe dengan volume 5–50 l. Kolom pada
KCKT ada dua jenis, yaitu kolom pelindung
dan kolom pemisahan. Kolom pelindung
digunakan untuk menahan zat-zat pengotor
yang dapat menyumbat kolom pemisahan
sehingga memperpanjang masa pakainya.
Kolom pelindung atau prakolom sering
dipasang antara katup pemasukan dan kolom
utama. Kolom pelindung ini sering
mengandung kemasan yang serupa dengan
kemasan yang dipakai dalam kolom utama,
tetapi butirannya yang lebih keras dan lebih
besar (20–40 m), (Gritter et al. 1991).
Kolom ini memiliki panjang 10–30 cm
dengan diameter 3–10 mm dan diisi dengan
fase diam. Sistem deteksi pada KCKT
menggunakan beberapa macam detektor.
Detektor ultraviolet (UV) dapat berfungsi jika
pelarut mengandung kromofor UV (benzena
atau toluena) atau jika zat terlarut mempunyai
gugus fungsi –C=C–, –C=O–, –N=O–, dan
–N=N–. Sel detektor yang bersih sangat
menentukan pada pendeteksian yang teliti
(Meloan 1999).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
seledri, standar apigenin untuk KLT dengan
kemurnian 95%, Mg, HCl 37%, etanol 95%,
amil alkohol, metanol : air (5:4), HCl 1,2 M,
hidroksitoluena terbutilasi (BHT), asam asetat
10%, asetonitril, akuabides, dan akuades.
Alat-alat
yang
digunakan
adalah
seperangkat alat refluks, radas penguap putar,
alat-alat kaca, neraca analitik Sartorius,
eksikator, oven, bejana pengembang Camag,
pipa kapiler, sonikator Branson 1510,
perangkat KCKT Hitachi dengan detektor
UV-Vis L-2420, dan saringan 0,45 m.
Metode Penelitian
Penyiapan Bahan Baku
Seledri diperoleh dari Kecamatan Milir,
Kabupaten Bandungan, provinsi Jawa Tengah
dalam bentuk kering. Seledri yang sudah
kering kemudian dihaluskan. Bagan alir
penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1
Penetapan Kadar Air (Depkes 1995)
Cawan porselen dikeringkan pada suhu
105 C selama 30 menit, lalu ditempatkan di
dalam eksikator dan ditimbang. Seledri yang
telah dihaluskan ditimbang sekitar 5 g dan
dimasukkan ke dalam cawan tersebut. Contoh
beserta cawannya dikeringkan pada suhu 105
C selama 3 jam, dimasukkan ke dalam
eksikator,
dan
ditimbang
kembali.
Pengeringan dan penimbangan dilakukan
berulang kali sampai diperoleh bobot tetap
dengan selisih kurang lebih 0,0001 g.
Pekerjaan dilakukan sebanyak tiga kali
ulangan.
Kadar air =
ab
a
dengan
a = bobot contoh sebelum dikeringkan (g)
b = bobot contohl setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Apigenin (Frankee et al. 2005)
Ekstraksi sekaligus hidrolisis flavon
dilakukan dengan menambahkan
225 ml
metanol:air (5:4) ke dalam 5 g seledri dengan
0,05 g BHT sebagai antioksidan dan 25 ml
HCl 1,2 M. Campuran disonikasi selama satu
menit, sebelum direfluks selama 2 jam.
Ekstrak lalu disaring dan dipekatkan dengan
radas penguap putar.
Uji Flavonoid (Harborne 1986)
Sebanyak 1 gram ekstrak dimasukkan ke
dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100
ml air panas dan dididihkan selama 5 menit.
Setelah itu larutan disaring dan filtratnya
digunakan untuk pengujian. Sebanyak 10 ml
filtrat ditambahkan 0,50 g serbuk Mg, 2 ml
alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan
etanol 95%), dan 2 ml amil alkohol.
Terbentuknya warna merah, kuning, dan
jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan
keberadaan flavonoid.
Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Ekstrak dan standar apigenin ditotolkan
pada lempeng silika gel GF254 sebagai fase
diam. Fase gerak yang digunakan adalah
kloroform:metanol (9,5:0,5). Lempeng silika
gel dimasukkan ke dalam bejana pengembang
yang berisi fase gerak yang telah dijenuhkan.
Setelah
selesai,
lempeng
tersebut
dikeringudarakan dan dilakukan pengamatan
bercak dengan menggunakan lampu UV pada
panjang gelombang 365 nm
Analisis dengan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (Frankee et al. 2005)
Kadar apigenin dianalisis menggunakan
KCKT. Kolom yang digunakan adalah kolom
fase terbalik C18 yang berisi silika dengan
detektor ultraviolet (UV). Elusi dengan laju
alir sebesar 0,60 ml/menit. Digunakan
campuran eluen asam asetat 10% (A) dan
metanol/asetonitril/air (0,8:1:1; v/v/v) (B).
Elusi diikuti dengan gradien linear dengan
konsentrasi B dalam A (v/v) dari 0% sampai
50% selama 20 menit, dari 50% kembali ke
40% dalam 0,1 menit, lalu dipertahankan pada
40% selama 10 menit. Kemudian dilanjutkan
dari 40% ke 95% selama 15 menit, dari 95%
ke 10% dalam 3 menit dengan kesetimbangan
selama 10 menit sebelum injeksi yang
berikutnya. Kadar apigenin diukur pada 333
nm.
Validasi Metode Penentuan Apigenin
Pembuatan Larutan Standar dan Contoh
Sebanyak 10 mg serbuk apigenin
dimasukkan ke dalam gelas piala dan
ditambahkan 30 ml metanol pa, kemudian
dipanaskan pada suhu 50 o C sambil diaduk
dengan pengaduk magnetik sampai serbuk
benar-benar larut. Larutan ini dimasukkan ke
dalam labu takar 100 ml dan
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak
Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM
DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI.
Apigenin merupakan senyawa aktif yang berasal dari seledri (Apium graveolens)
dan telah digunakan secara luas untuk pengobatan penyakit asam urat. Validasi metode
penentuan kadar apigenin yang dilakukan pada penelitian adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005). Analisis kadar
apigenin dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis KCKT dapat digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan
maka metode tersebut divalidasi. Parameter-parameter validasi yang diuji meliputi
linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Semua parameter yang
ditetapkan memenuhi kriteria penerimaan yang telah ditetapkan oleh Association of
Official Analytical Chemist. Linearitas pada konsentrasi 3,8; 5,7; dan 7,6 mg/l memiliki
koefisien korelasi berkisar antara 0,9900 dan 0,9998. Limit deteksi metode ini adalah
sebesar 2,7222 mg/l dan limit kuantifikasi sebesar 8,2500 mg/l. Ketelitian dilakukan pada
hari yang sama sebanyak lima kali ulangan menunjukkan ketelitian yang cukup baik
dengan simpangan baku relatif sebesar 3,85%. Ketepatan ditentukan dengan metode
penambahan standar dengan nilai persen perolehan kembali berkisar antara 95,00 dan
118,77%. Rerata kadar apigenin yang diperoleh adalah sebesar 0,0052% (b/b).
ABSTRACT
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validation Method for Determination of Apigenin in Extract
Celery with High Performance Liquid Chromatography. Under the direction of
LATIFAH KOSIM DARUSMAN and MOHAMAD RAFI.
Apigenin is an active substance derived from celery (Apium graveolens) and
widely used for the treatment of gout. Determination method of apigenin which have
been validated was introduced by Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005).
Apigenin analysis was done by high performance liquid chromatography (HPLC). To
make sure that HPLC analysis method can be used for the intended purpose then the
method was validated. Parameters determined on method validation were linearity, limit
of detection, limit of quantification, precision, and accuracy. All parameters were in
accordance with the acceptance criteria of Association of Official Analytical Chemist.
The linearity in the concentration of 3,8; 5,7; and 7,6 mg/l had correlation coefficent of
0,9900–0,9998. limit of detection in this method was 2,7222 mg/l and limit of
quantification was 8,2500 mg/l. Interday precision in five restating showed good
precision with relative standard deviation of 3,85%. Accuracy was determined by
standard addition method with recovery percentage of 95,00–118,77%. Average
concentration of apigenin is 0,0052% (w/w).
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Skripsi : Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri
dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Nama
: Rahma Juwita Zamri
NIM
: G44203012
Disetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS
NIP 13053668
Mohamad Rafi, S.Si
NIP 132321454
Diketahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806
Tanggal lulus:
PRAKATA
Bismillahirrohamanirrohim.
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas
limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi
ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2007 sampai
Maret 2008. Tema yang diambil adalah validasi metode, dengan judul Validasi Metode
Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu selama
kegiatan penelitian dan penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Pusat Studi Biofarmaka
atas bantuan sebagian dana penelitian, alm Dra.Tuti Setiawati Sudjana, MS yang sempat
menjadi pembimbing I, Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS selaku pembimbing I, M.
Rafi, S.Si selaku pembimbing II, Rudi Heryanto, S.Si, M.Si atas literatur dan saran yang
telah diberikan. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak Eman dan
seluruh staf kimia analitik, M. Agung Zaim, S.Si beserta seluruh staf pusat studi
biofarmaka yang telah membantu selama penelitian, Budi Arifin, S.Si, dan teman-teman
kimia angkatan 40 yang senantiasa memberikan semangat dan tempat untuk berdiskusi
khususnya Niken, Wina, Farah, Noerhayati, Erika, Ratna, dan Lita. Terima kasih juga
disampaikan kepada Aby, Umi, Idris, Hasby, Amel, Ruly, Mas Irawan, dan Mbak Muji
atas segala doa, kasih sayang, dan dorongan semangat yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, April 2008
Rahma Juwita Zamri
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 05 Maret 1985 dari ayah KH Aby
Muhammad Zamri dan ibu Jusmaniar. Penulis merupakan putri pertama dari lima
bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMUN 1 Cikarang Utara dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah
Kimia TPB pada tahun ajaran 2006/2007, 2007/2008, Kimia Analitik pada tahun ajaran
2006/2007, Kimia Lingkungan pada tahun 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 pada
tahun ajaran 2006/2007, Kimia Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Spektroskopi I
D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Makanan D3 pada tahun ajaran 2007/2008, dan
Anorganik Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008. Penulis pernah aktif di kegiatan
organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai salah satu staf Departemen Kimia Pangan,
Ikatan Mahasiswa Kimia, dan sebagai salah satu staf Departemen Kajian dan Jurnalistik
Islam DKM Al-Ghifari pada tahun 2006. Penulis mengikuti Program Kreativitas
Mahasiswa Bidang Penelitian (PKMP) dan dibiayai oleh Dikti dengan judul Daya
Antioksidan Ekstrak Tumbuhan Meniran (Phyllanthus niruri Linn), Daun Sendok
(Plantago major Linn) dan Som Jawa (Talinum paniculatum (jack) Gaertn) dengan
Metode Tiosianat dan DPPH pada tahun 2005. Penulis menyelesaikan praktik lapangan di
bagian Non-Soap Detergent PT Unilever Indonesia, Tbk pada tahun 2006 dengan judul
Penentuan Bulk Density Powder Detergen dan Pengaruhnya Terhadap Proses
Pengemasan.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Seledri (Apium graveolens L.) .........................................................................
Flavonoid ........................................................................................................
Apigenin .........................................................................................................
Validasi ...........................................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi ..................................................................................................
Limit Kuantifikasi ...........................................................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................................
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................
Metode Penelitian ............................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Pendahuluan ..............................................................................................
Ekstraksi Apigenin ..........................................................................................
Analisis dengan KLT .......................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi ...............................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
6
6
7
7
8
9
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .........................................................................................................
Saran ...............................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
9
LAMPIRAN ............................................................................................................. 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Data rendemen ekstrak seledri ................................................................................
6
2 Hasil analisis dengan KLT ......................................................................................
7
3 Persamaan regresi linear dan koefisien korelasi kurva standar ................................
7
4 Parameter statistika kurva standar rerata (n=3) ........................................................
8
5 Penentuan kadar apigenin .......................................................................................
8
6 Rerata persen perolehan kembali ............................................................................
9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur umum senyawa flavonoid .........................................................................
1
2 Struktur apigenin ....................................................................................................
2
3 Kromatogram hasil KLT standar apigenin dengan ekstrak ......................................
7
4 Kurva standar rerata ...............................................................................................
7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelitian ............................................................................................. 12
2 Hasil analisis kadar air seledri .............................................................................. 13
3 Data rendemen hasil ekstraksi seledri .................................................................... 14
4 Nilai Rf dan warna bercak hasil KLT ..................................................................... 15
5 Linearitas ulangan 1 .............................................................................................. 16
6 Linearitas ulangan 2 .............................................................................................. 18
7 Linearitas ulangan 3 .............................................................................................. 20
8 Parameter statistika kurva standar rerata ............................................................... 22
9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi ........................................................ 24
10 Penentuan ketelitian ............................................................................................. 25
11 Penentuan persen perolehan kembali .................................................................... 28
PENDAHULUAN
Seledri merupakan salah satu tanaman
obat yang berperan dalam mengatasi penyakit
rematik dan asam urat. Komponen metabolit
sekunder yang berhasil diisolasi dari seledri di
antaranya glikosida, apiin, apiol, dan
flavonoid yang bermanfaat sebagai obat
peluruh keringat, penurun demam, rematik
sukar tidur, dan darah tinggi. Selain itu pada
seledri juga ditemukan apigenin, manit,
inositol, asparigina, glutamina, kolina, dan
linamarosa (Soedibyo 1998).
Apigenin merupakan salah satu senyawa
yang terdapat dalam seledri dan dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999). Metode yang digunakan untuk
penentuan kadar apigenin adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. (2005).
Analisis kadar apigenin pada penelitian ini
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) karena metode tersebut memiliki
sensitivitas yang tinggi dan memerlukan
jumlah contoh yang sedikit (beberapa µl).
Hasil analisis yang akurat dan absah akan
diperoleh apabila metode yang digunakan
telah divalidasi terlebih dahulu.
Validasi adalah sebuah evaluasi mengenai
ketepatan dan ketelitian dari suatu prosedur
analisis yang layak digunakan untuk
menyelesaikan masalah. Validasi menjamin
bahwa prosedur yang sama mendapatkan hasil
yang dapat dibandingkan. Nisbah analisis ini
dapat
digunakan
untuk
mengevaluasi
ketelitian dan ketepatan. Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis dapat digunakan dan
menjamin mutu produk yang dihasilkan sesuai
persyaratan, maka metode tersebut harus
divalidasi. Parameter yang diuji dalam
penelitian ini meliputi linearitas, limit deteksi,
limit kuantifikasi, ketelitian, dan ketepatan.
Penelitian ini bertujuan mengetahui keabsahan
data yang dihasilkan dari metode Frankee et
al. (2005).
TINJAUAN PUSTAKA
bergerigi dan panjang 10–25 cm. Dalam
keadaan kering daun seledri menggulung,
berwarna hijau kecoklatan, berbau aroma
kuat, rasa manis sedikit pahit (Djumidi et al.
1998).
Menurut Soedibyo (1998), kandungan
kimia seledri adalah apiin, apigenin, manit,
inositol, asparagina, glutamina, kolina, dan
linamarosa. Kandungan seledri daun tiap 100
g ialah 89 g air, 2,20 g protein, 0,60 g lemak,
4,60 g karbohidrat, 1,40 g serat, 1,70 g abu,
2685 IU vitamin A, 0,08 mg vitamin B1, 0,12
mg vitamin B2, 0,60 mg niasin, 49 mg
vitamin C, 326 mg Ca, 51 mg P, 15,30 mg Fe,
151 mg Na, 318 mg K (Susiarti 2000).
Tanaman seledri juga dimanfaatkan untuk
pengobatan tradisional, misalnya untuk obat
tekanan darah tinggi, diuretik, emenagog
(memperlancar haid), dengeu (demam disertai
lini pada sendi-sendi dan otot), dan rematik.
Tanaman ini juga dapat digunakan untuk
melangsingkan tubuh. Di pedesaan Jawa
Barat, daun seledri dimanfaatkan untuk
menyuburkan rambut, selain lidah buaya dan
daun dadap (Susiarti 2000).
Flavonoid
Flavonoid merupakan golongan terbesar
senyawa fenolik di samping fenol sederhana,
fenilpropanoid, dan kuinonfenolik (Harborne
1986). Sebanyak 2% dari seluruh karbon yang
difotosintesis oleh tanaman diubah menjadi
flavonoid atau senyawa yang berhubungan
erat dengannya (Markham 1988). Dalam
tumbuhan, aglikon flavonoid terdapat dalam
berbagai
bentuk
struktur.
Semuanya
mengandung 15 atom C dalam inti dasarnya
yang tersusun dalam konfigurasi C 6-C3-C6,
yaitu dua cincin aromatik dihubungkan oleh 3
karbon yang dapat atau tidak dapat
membentuk cincin ketiga. Cincin diberi nama
A, B, dan C, atom karbon dinomori menurut
sistem penomoran yang menggunakan angka
untuk cincin A dan C serta angka beraksen
untuk cincin B. Struktur umum flavonoid
dapat dilihat pada Gambar 1.
Seledri (Apium graveolens)
Apium graveolens adalah daun seledri dari
famili Apiaceae atau Umbelliflorae. Ciri
makroskopis simplisia daun seledri berupa
daun tunggal atau majemuk semu, tangkai
silindris beralur, panjang tangkai 5–15 cm.
Daun seledri berbentuk segi tiga, dengan
ujung runcing, pangkal berlekuk, tepi
B
A
C
Gambar 1 Struktur umum senyawa
flavonoid (Markham 1988).
Flavonoid
umumnya
secara
alami
terbentuk di bawah pengaruh bioflavonoid
(vitamin D) yang selalu ada dalam tanaman
dan memiliki efek yang bermanfaat terhadap
lebih dari 50 penyakit (Heldt 1997). Flavonoid
akan berubah warnanya jika ditambah basa
atau amonia sehingga mudah dideteksi pada
kromatogram atau pada larutan (Harborne
1986).
Flavonoid, tanin, lignan, dan lignin
merupakan turunan fenilalanina dan pada
beberapa tanaman ada yang berasal dari
tirosina. Fenilalanina dan tirosina terbentuk
dari jalur sikimat. Karena senyawa fenolik
berasal dari dua asam amino yang memiliki
cincin fenil dengan C3 sebagai rantai samping,
mereka dinamai fenilpropanoid. Flavonoid
yang meliputi flavon, isoflavon, dan
antosianidin,
sebagaimana
struktur
fenilpropana, mengandung sebuah cincin
kedua yang terbentuk dari tiga molekul asetil
koenzim A (Heldt 1997). Flavon merupakan
prekursor untuk beberapa flavonoid
Apigenin
Apigenin merupakan komponen flavonoid
utama dari seledri yang termasuk ke dalam
golongan flavon (Harborne 1986). Gambar 2
menunjukkan struktur kimia apigenin. Rumus
molekulnya adalah C15H10O5 dengan bobot
molekul 270,23 g/mol. Nama Intenational
Union of Pure and Applied Chemistry dari
apigenin
adalah
5,7-dihidroksi-2-(4hidroksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on.
Titik
leleh apigenin 345–350 C. Apigenin
memiliki banyak kegunaan, salah satunya
dalam bidang farmasi. Senyawa ini dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999).
Gambar 2 Struktur apigenin
(Markham 1988).
Penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Hertog et al. (1992) mengemukakan
bahwa kadar apigenin pada seledri yang
direfluks dengan metanol 50% adalah 1787
mg/kg bobot kering seledri. Kemudian,
Crozier et al. (1997) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri bervariasi
bergantung dari jenis seledri yang dianalisis,
kadar apigenin dalam seledri bervariasi antara
17 dan 191 µg/g bobot segar seledri. Barubaru ini, Laura (2007) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri berkisar antara 2
dan 17 ppm bergantung pada masa tanam
seledri.
Validasi
Validasi
menurut
Harmita
(2004)
merupakan suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu berdasarkan percobaan
laboratorium untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan
untuk penggunaannya. Validasi menurut SK
Menkes RI No. 43/Menkes/SK/II/1988
tentang cara pembuatan obat yang baik
(CPOB)
merupakan
suatu
tindakan
pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa
tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem,
perlengkapan,
atau
mekanisme
yang
digunakan dalam produksi dan pengawasan
akan senantiasa mencapai hasil yang
diinginkan (Depkes RI 2001). Association of
South East Asian Nation Good Manufacturing
Practice (ASEAN GMP) menyatakan bahwa
validasi adalah kegiatan membuktikan dengan
pasti bahwa material, proses, prosedur,
aktivitas, sistem, peralatan, atau mekanisme
yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil
yang diharapkan pada standar yang konsisten
(ASEAN 1996).
Validasi metode menurut Association of
Official Analytical Chemist (AOAC)
(2002) adalah suatu proses yang menetapkan
bahwa karakteristik suatu metode yang
ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk
aplikasi analisis yang diharapkan dengan cara
studi laboratorium. Validasi menurut Levin
(2002) dibagi menjadi empat kelas, yaitu kelas
A, B, C, dan D. Kelas A digunakan untuk
identifikasi suatu senyawa. Kelas B digunakan
untuk mendeteksi dan menentukan adanya
pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa
secara kuantitatif dan kelas D untuk mencari
ciri suatu senyawa.
Linearitas
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu
metode analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi
analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi
tertentu (AOAC 2002). Linearitas suatu
metode analisis adalah ukuran yang
menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak
Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM
DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI.
Apigenin merupakan senyawa aktif yang berasal dari seledri (Apium graveolens)
dan telah digunakan secara luas untuk pengobatan penyakit asam urat. Validasi metode
penentuan kadar apigenin yang dilakukan pada penelitian adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005). Analisis kadar
apigenin dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis KCKT dapat digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan
maka metode tersebut divalidasi. Parameter-parameter validasi yang diuji meliputi
linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Semua parameter yang
ditetapkan memenuhi kriteria penerimaan yang telah ditetapkan oleh Association of
Official Analytical Chemist. Linearitas pada konsentrasi 3,8; 5,7; dan 7,6 mg/l memiliki
koefisien korelasi berkisar antara 0,9900 dan 0,9998. Limit deteksi metode ini adalah
sebesar 2,7222 mg/l dan limit kuantifikasi sebesar 8,2500 mg/l. Ketelitian dilakukan pada
hari yang sama sebanyak lima kali ulangan menunjukkan ketelitian yang cukup baik
dengan simpangan baku relatif sebesar 3,85%. Ketepatan ditentukan dengan metode
penambahan standar dengan nilai persen perolehan kembali berkisar antara 95,00 dan
118,77%. Rerata kadar apigenin yang diperoleh adalah sebesar 0,0052% (b/b).
ABSTRACT
RAHMA JUWITA ZAMRI. Validation Method for Determination of Apigenin in Extract
Celery with High Performance Liquid Chromatography. Under the direction of
LATIFAH KOSIM DARUSMAN and MOHAMAD RAFI.
Apigenin is an active substance derived from celery (Apium graveolens) and
widely used for the treatment of gout. Determination method of apigenin which have
been validated was introduced by Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005).
Apigenin analysis was done by high performance liquid chromatography (HPLC). To
make sure that HPLC analysis method can be used for the intended purpose then the
method was validated. Parameters determined on method validation were linearity, limit
of detection, limit of quantification, precision, and accuracy. All parameters were in
accordance with the acceptance criteria of Association of Official Analytical Chemist.
The linearity in the concentration of 3,8; 5,7; and 7,6 mg/l had correlation coefficent of
0,9900–0,9998. limit of detection in this method was 2,7222 mg/l and limit of
quantification was 8,2500 mg/l. Interday precision in five restating showed good
precision with relative standard deviation of 3,85%. Accuracy was determined by
standard addition method with recovery percentage of 95,00–118,77%. Average
concentration of apigenin is 0,0052% (w/w).
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul Skripsi : Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri
dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Nama
: Rahma Juwita Zamri
NIM
: G44203012
Disetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS
NIP 13053668
Mohamad Rafi, S.Si
NIP 132321454
Diketahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806
Tanggal lulus:
PRAKATA
Bismillahirrohamanirrohim.
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas
limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi
ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2007 sampai
Maret 2008. Tema yang diambil adalah validasi metode, dengan judul Validasi Metode
Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu selama
kegiatan penelitian dan penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Pusat Studi Biofarmaka
atas bantuan sebagian dana penelitian, alm Dra.Tuti Setiawati Sudjana, MS yang sempat
menjadi pembimbing I, Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS selaku pembimbing I, M.
Rafi, S.Si selaku pembimbing II, Rudi Heryanto, S.Si, M.Si atas literatur dan saran yang
telah diberikan. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak Eman dan
seluruh staf kimia analitik, M. Agung Zaim, S.Si beserta seluruh staf pusat studi
biofarmaka yang telah membantu selama penelitian, Budi Arifin, S.Si, dan teman-teman
kimia angkatan 40 yang senantiasa memberikan semangat dan tempat untuk berdiskusi
khususnya Niken, Wina, Farah, Noerhayati, Erika, Ratna, dan Lita. Terima kasih juga
disampaikan kepada Aby, Umi, Idris, Hasby, Amel, Ruly, Mas Irawan, dan Mbak Muji
atas segala doa, kasih sayang, dan dorongan semangat yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, April 2008
Rahma Juwita Zamri
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 05 Maret 1985 dari ayah KH Aby
Muhammad Zamri dan ibu Jusmaniar. Penulis merupakan putri pertama dari lima
bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMUN 1 Cikarang Utara dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah
Kimia TPB pada tahun ajaran 2006/2007, 2007/2008, Kimia Analitik pada tahun ajaran
2006/2007, Kimia Lingkungan pada tahun 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 pada
tahun ajaran 2006/2007, Kimia Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Spektroskopi I
D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Makanan D3 pada tahun ajaran 2007/2008, dan
Anorganik Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008. Penulis pernah aktif di kegiatan
organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai salah satu staf Departemen Kimia Pangan,
Ikatan Mahasiswa Kimia, dan sebagai salah satu staf Departemen Kajian dan Jurnalistik
Islam DKM Al-Ghifari pada tahun 2006. Penulis mengikuti Program Kreativitas
Mahasiswa Bidang Penelitian (PKMP) dan dibiayai oleh Dikti dengan judul Daya
Antioksidan Ekstrak Tumbuhan Meniran (Phyllanthus niruri Linn), Daun Sendok
(Plantago major Linn) dan Som Jawa (Talinum paniculatum (jack) Gaertn) dengan
Metode Tiosianat dan DPPH pada tahun 2005. Penulis menyelesaikan praktik lapangan di
bagian Non-Soap Detergent PT Unilever Indonesia, Tbk pada tahun 2006 dengan judul
Penentuan Bulk Density Powder Detergen dan Pengaruhnya Terhadap Proses
Pengemasan.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Seledri (Apium graveolens L.) .........................................................................
Flavonoid ........................................................................................................
Apigenin .........................................................................................................
Validasi ...........................................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi ..................................................................................................
Limit Kuantifikasi ...........................................................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................................
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat.................................................................................................
Metode Penelitian ............................................................................................
4
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Pendahuluan ..............................................................................................
Ekstraksi Apigenin ..........................................................................................
Analisis dengan KLT .......................................................................................
Linearitas ........................................................................................................
Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi ...............................................................
Ketelitian ........................................................................................................
Ketepatan ........................................................................................................
6
6
7
7
8
9
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .........................................................................................................
Saran ...............................................................................................................
9
9
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
9
LAMPIRAN ............................................................................................................. 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Data rendemen ekstrak seledri ................................................................................
6
2 Hasil analisis dengan KLT ......................................................................................
7
3 Persamaan regresi linear dan koefisien korelasi kurva standar ................................
7
4 Parameter statistika kurva standar rerata (n=3) ........................................................
8
5 Penentuan kadar apigenin .......................................................................................
8
6 Rerata persen perolehan kembali ............................................................................
9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur umum senyawa flavonoid .........................................................................
1
2 Struktur apigenin ....................................................................................................
2
3 Kromatogram hasil KLT standar apigenin dengan ekstrak ......................................
7
4 Kurva standar rerata ...............................................................................................
7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelitian ............................................................................................. 12
2 Hasil analisis kadar air seledri .............................................................................. 13
3 Data rendemen hasil ekstraksi seledri .................................................................... 14
4 Nilai Rf dan warna bercak hasil KLT ..................................................................... 15
5 Linearitas ulangan 1 .............................................................................................. 16
6 Linearitas ulangan 2 .............................................................................................. 18
7 Linearitas ulangan 3 .............................................................................................. 20
8 Parameter statistika kurva standar rerata ............................................................... 22
9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi ........................................................ 24
10 Penentuan ketelitian ............................................................................................. 25
11 Penentuan persen perolehan kembali .................................................................... 28
PENDAHULUAN
Seledri merupakan salah satu tanaman
obat yang berperan dalam mengatasi penyakit
rematik dan asam urat. Komponen metabolit
sekunder yang berhasil diisolasi dari seledri di
antaranya glikosida, apiin, apiol, dan
flavonoid yang bermanfaat sebagai obat
peluruh keringat, penurun demam, rematik
sukar tidur, dan darah tinggi. Selain itu pada
seledri juga ditemukan apigenin, manit,
inositol, asparigina, glutamina, kolina, dan
linamarosa (Soedibyo 1998).
Apigenin merupakan salah satu senyawa
yang terdapat dalam seledri dan dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999). Metode yang digunakan untuk
penentuan kadar apigenin adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. (2005).
Analisis kadar apigenin pada penelitian ini
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) karena metode tersebut memiliki
sensitivitas yang tinggi dan memerlukan
jumlah contoh yang sedikit (beberapa µl).
Hasil analisis yang akurat dan absah akan
diperoleh apabila metode yang digunakan
telah divalidasi terlebih dahulu.
Validasi adalah sebuah evaluasi mengenai
ketepatan dan ketelitian dari suatu prosedur
analisis yang layak digunakan untuk
menyelesaikan masalah. Validasi menjamin
bahwa prosedur yang sama mendapatkan hasil
yang dapat dibandingkan. Nisbah analisis ini
dapat
digunakan
untuk
mengevaluasi
ketelitian dan ketepatan. Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis dapat digunakan dan
menjamin mutu produk yang dihasilkan sesuai
persyaratan, maka metode tersebut harus
divalidasi. Parameter yang diuji dalam
penelitian ini meliputi linearitas, limit deteksi,
limit kuantifikasi, ketelitian, dan ketepatan.
Penelitian ini bertujuan mengetahui keabsahan
data yang dihasilkan dari metode Frankee et
al. (2005).
TINJAUAN PUSTAKA
bergerigi dan panjang 10–25 cm. Dalam
keadaan kering daun seledri menggulung,
berwarna hijau kecoklatan, berbau aroma
kuat, rasa manis sedikit pahit (Djumidi et al.
1998).
Menurut Soedibyo (1998), kandungan
kimia seledri adalah apiin, apigenin, manit,
inositol, asparagina, glutamina, kolina, dan
linamarosa. Kandungan seledri daun tiap 100
g ialah 89 g air, 2,20 g protein, 0,60 g lemak,
4,60 g karbohidrat, 1,40 g serat, 1,70 g abu,
2685 IU vitamin A, 0,08 mg vitamin B1, 0,12
mg vitamin B2, 0,60 mg niasin, 49 mg
vitamin C, 326 mg Ca, 51 mg P, 15,30 mg Fe,
151 mg Na, 318 mg K (Susiarti 2000).
Tanaman seledri juga dimanfaatkan untuk
pengobatan tradisional, misalnya untuk obat
tekanan darah tinggi, diuretik, emenagog
(memperlancar haid), dengeu (demam disertai
lini pada sendi-sendi dan otot), dan rematik.
Tanaman ini juga dapat digunakan untuk
melangsingkan tubuh. Di pedesaan Jawa
Barat, daun seledri dimanfaatkan untuk
menyuburkan rambut, selain lidah buaya dan
daun dadap (Susiarti 2000).
Flavonoid
Flavonoid merupakan golongan terbesar
senyawa fenolik di samping fenol sederhana,
fenilpropanoid, dan kuinonfenolik (Harborne
1986). Sebanyak 2% dari seluruh karbon yang
difotosintesis oleh tanaman diubah menjadi
flavonoid atau senyawa yang berhubungan
erat dengannya (Markham 1988). Dalam
tumbuhan, aglikon flavonoid terdapat dalam
berbagai
bentuk
struktur.
Semuanya
mengandung 15 atom C dalam inti dasarnya
yang tersusun dalam konfigurasi C 6-C3-C6,
yaitu dua cincin aromatik dihubungkan oleh 3
karbon yang dapat atau tidak dapat
membentuk cincin ketiga. Cincin diberi nama
A, B, dan C, atom karbon dinomori menurut
sistem penomoran yang menggunakan angka
untuk cincin A dan C serta angka beraksen
untuk cincin B. Struktur umum flavonoid
dapat dilihat pada Gambar 1.
Seledri (Apium graveolens)
Apium graveolens adalah daun seledri dari
famili Apiaceae atau Umbelliflorae. Ciri
makroskopis simplisia daun seledri berupa
daun tunggal atau majemuk semu, tangkai
silindris beralur, panjang tangkai 5–15 cm.
Daun seledri berbentuk segi tiga, dengan
ujung runcing, pangkal berlekuk, tepi
B
A
C
Gambar 1 Struktur umum senyawa
flavonoid (Markham 1988).
Flavonoid
umumnya
secara
alami
terbentuk di bawah pengaruh bioflavonoid
(vitamin D) yang selalu ada dalam tanaman
dan memiliki efek yang bermanfaat terhadap
lebih dari 50 penyakit (Heldt 1997). Flavonoid
akan berubah warnanya jika ditambah basa
atau amonia sehingga mudah dideteksi pada
kromatogram atau pada larutan (Harborne
1986).
Flavonoid, tanin, lignan, dan lignin
merupakan turunan fenilalanina dan pada
beberapa tanaman ada yang berasal dari
tirosina. Fenilalanina dan tirosina terbentuk
dari jalur sikimat. Karena senyawa fenolik
berasal dari dua asam amino yang memiliki
cincin fenil dengan C3 sebagai rantai samping,
mereka dinamai fenilpropanoid. Flavonoid
yang meliputi flavon, isoflavon, dan
antosianidin,
sebagaimana
struktur
fenilpropana, mengandung sebuah cincin
kedua yang terbentuk dari tiga molekul asetil
koenzim A (Heldt 1997). Flavon merupakan
prekursor untuk beberapa flavonoid
Apigenin
Apigenin merupakan komponen flavonoid
utama dari seledri yang termasuk ke dalam
golongan flavon (Harborne 1986). Gambar 2
menunjukkan struktur kimia apigenin. Rumus
molekulnya adalah C15H10O5 dengan bobot
molekul 270,23 g/mol. Nama Intenational
Union of Pure and Applied Chemistry dari
apigenin
adalah
5,7-dihidroksi-2-(4hidroksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on.
Titik
leleh apigenin 345–350 C. Apigenin
memiliki banyak kegunaan, salah satunya
dalam bidang farmasi. Senyawa ini dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999).
Gambar 2 Struktur apigenin
(Markham 1988).
Penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Hertog et al. (1992) mengemukakan
bahwa kadar apigenin pada seledri yang
direfluks dengan metanol 50% adalah 1787
mg/kg bobot kering seledri. Kemudian,
Crozier et al. (1997) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri bervariasi
bergantung dari jenis seledri yang dianalisis,
kadar apigenin dalam seledri bervariasi antara
17 dan 191 µg/g bobot segar seledri. Barubaru ini, Laura (2007) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri berkisar antara 2
dan 17 ppm bergantung pada masa tanam
seledri.
Validasi
Validasi
menurut
Harmita
(2004)
merupakan suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu berdasarkan percobaan
laboratorium untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan
untuk penggunaannya. Validasi menurut SK
Menkes RI No. 43/Menkes/SK/II/1988
tentang cara pembuatan obat yang baik
(CPOB)
merupakan
suatu
tindakan
pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa
tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem,
perlengkapan,
atau
mekanisme
yang
digunakan dalam produksi dan pengawasan
akan senantiasa mencapai hasil yang
diinginkan (Depkes RI 2001). Association of
South East Asian Nation Good Manufacturing
Practice (ASEAN GMP) menyatakan bahwa
validasi adalah kegiatan membuktikan dengan
pasti bahwa material, proses, prosedur,
aktivitas, sistem, peralatan, atau mekanisme
yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil
yang diharapkan pada standar yang konsisten
(ASEAN 1996).
Validasi metode menurut Association of
Official Analytical Chemist (AOAC)
(2002) adalah suatu proses yang menetapkan
bahwa karakteristik suatu metode yang
ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk
aplikasi analisis yang diharapkan dengan cara
studi laboratorium. Validasi menurut Levin
(2002) dibagi menjadi empat kelas, yaitu kelas
A, B, C, dan D. Kelas A digunakan untuk
identifikasi suatu senyawa. Kelas B digunakan
untuk mendeteksi dan menentukan adanya
pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa
secara kuantitatif dan kelas D untuk mencari
ciri suatu senyawa.
Linearitas
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu
metode analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi
analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi
tertentu (AOAC 2002). Linearitas suatu
metode analisis adalah ukuran yang
menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi
antara kadar analit dan respons detektor,
dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r)
(Depkes 2001). Respons detektor yang
digunakan adalah luas area puncak untuk
instrumen KCKT. Koefisien korelasi didapat
dengan menghitung regresi dari persamaan
linearnya, sedangkan perpotongan dengan
sumbu y menyatakan ukuran biasnya. Selang
linearitas adalah selang antara konsentrasi
tertinggi dan terendah dari analit yang dapat
ditetapkan menggunakan suatu metode
dengan tingkat, ketelitian, kecermatan, dan
koefisien korelasi yang telah dilakukan. Nilai
r yang dihasilkan lebih besar atau sama
dengan 0.9900 (AOAC 2002). Secara
matematis, nilai r dapat dihitung dengan
menggunakan rumus
r =
x
x x y y
i
x yi y
2
2
i
1/ 2
i
dengan
r = koefisien korelasi
xi = konsentrasi analit setiap ulangan
x = konsentrasi analit rerata
yi = luas area puncak setiap ulangan
y = luas area puncak rerata
Limit Deteksi
Limit deteksi (LD) menurut AOAC (2002)
adalah konsentrasi analit terendah di dalam
suatu contoh yang dapat dideteksi tetapi tidak
harus terkuantitasi pada kondisi percobaan
yang ditetapkan. Umumnya nisbah respons
antara analit:derau adalah 3:1. LD dihitung
dari rerata kemiringan garis dan simpangan
baku intersep kurva standar yang diperoleh.
Limit Kuantifikasi
Limit kuantifikasi adalah konsentrasi
analit terendah yang terdapat dalam contoh
yang dapat diukur secara tepat dan teliti
(AOAC 2002). LK dapat dihitung sebagai
konsentrasi analit yang memiliki respons
analit:derau sebesar 10:1 (Green 1996; ICH
1995). LK dihitung dari rerata kemiringan
garis dan simpangan baku intersep kurva
standar yang diperoleh.
Ketelitian
Ketelitian dapat dinyatakan dengan tiga
cara,
yaitu
kedapatulangan, ketelitian
intermediet, dan ketertiruan. Ketelitian
menurut AOAC (2002) adalah kesamaan hasil
dari tiap individu ketika metode tersebut
diterapkan berulang kali pada berbagai
pencuplikan suatu contoh homogen. Ketelitian
diukur dengan menghitung simpangan baku
relatif (SBR) dari lima kali pengukuran ulang.
Menurut AOAC syarat penerimaan parameter
validasi ini, sebagai berikut: sangat teliti
(%SBR 1), teliti (%SBR 1-2), sedang
(%SBR 2-5), dan tidak teliti (%SBR 5)
Ketepatan
Ketepatan
suatu
prosedur
analisis
didefinisikan sebagai kedekatan hasil yang
diterima (baik sebagai nilai teoretis maupun
dengan nilai rujukan yang diterima) dengan
nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran
(ICH 1995 diacu dalam Chan 2004).
Ketepatan menurut AOAC (2002) adalah
kedekatan nilai hasil percobaan yang
diperoleh dari suatu metode terhadap nilai
sebenarnya. Ketepatan diukur dengan
menghitung
perolehan
kembali
(PK)
menggunakan metode penambahan standar.
Nilai PK bergantung pada matriks contoh,
prosedur proses contoh, dan konsentrasi
analit. Batas penerimaan PK menurut AOAC
adalah 80–120%.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT)
KCKT adalah suatu teknik analisis
kromatografi dengan menggunakan tekanan
tinggi yang berguna untuk pemisahan ion atau
molekul terlarut dalam suatu larutan. Teknik
ini berkembang untuk mengatasi kelemahankelemahan pemisahan pada kromatografi gas,
seperti senyawa yang relatif tidak tahan panas
dan senyawa yang tidak volatil.
KCKT berdasarkan kepolaran kolomnya
dibagi menjadi dua, yaitu fase normal dan
terbalik.
Kromatografi
fase
normal
menggunakan fase diam lebih polar daripada
fase gerak, sedangkan pada kromatografi fase
terbalik, fase gerak lebih polar daripada fase
diam. Proses pemisahan campuran komponen
terjadi di dalam kolom, yaitu berdasarkan
perbedaan
distribusi
masing-masing
komponen pada fase diam dan fase gerak. Zatzat yang berinteraksi kuat dengan fase diam
akan tertahan lebih lama dalam kolom,
sedangkan yang berinteraksi lemah akan
keluar dengan cepat dari kolom (Christian
1986).
KCKT terdiri atas beberapa bagian, yaitu
sistem eluen, sistem tekanan, injeksi contoh,
kolom, dan sistem deteksi. Sistem eluen pada
KCKT dapat menggunakan berbagai macam
pelarut, biasanya air dan pelarut organik.
Eluen yang digunakan dapat berupa pelarut
tunggal atau campuran dari dua atau lebih
pelarut. Keadaan ini menyebabkan ada dua
jenis sistem elusi, yaitu isokratik dan gradien.
Pada sistem isokratik eluen tidak mengalami
perubahan konsentrasi, jika sebaliknya disebut
sistem elusi gradien. Sistem tekanan pada
KCKT menggunakan pompa bertekanan
tinggi. Pompa harus tahan terhadap semua
jenis pelarut, dapat mencapai tekanan sampai
6000 psi, dapat mengantarkan aliran terukur
0.01–1.0 atau 0.1–20 ml/menit.
Injeksi contoh pada KCKT menggunakan
syringe dengan volume 5–50 l. Kolom pada
KCKT ada dua jenis, yaitu kolom pelindung
dan kolom pemisahan. Kolom pelindung
digunakan untuk menahan zat-zat pengotor
yang dapat menyumbat kolom pemisahan
sehingga memperpanjang masa pakainya.
Kolom pelindung atau prakolom sering
dipasang antara katup pemasukan dan kolom
utama. Kolom pelindung ini sering
mengandung kemasan yang serupa dengan
kemasan yang dipakai dalam kolom utama,
tetapi butirannya yang lebih keras dan lebih
besar (20–40 m), (Gritter et al. 1991).
Kolom ini memiliki panjang 10–30 cm
dengan diameter 3–10 mm dan diisi dengan
fase diam. Sistem deteksi pada KCKT
menggunakan beberapa macam detektor.
Detektor ultraviolet (UV) dapat berfungsi jika
pelarut mengandung kromofor UV (benzena
atau toluena) atau jika zat terlarut mempunyai
gugus fungsi –C=C–, –C=O–, –N=O–, dan
–N=N–. Sel detektor yang bersih sangat
menentukan pada pendeteksian yang teliti
(Meloan 1999).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
seledri, standar apigenin untuk KLT dengan
kemurnian 95%, Mg, HCl 37%, etanol 95%,
amil alkohol, metanol : air (5:4), HCl 1,2 M,
hidroksitoluena terbutilasi (BHT), asam asetat
10%, asetonitril, akuabides, dan akuades.
Alat-alat
yang
digunakan
adalah
seperangkat alat refluks, radas penguap putar,
alat-alat kaca, neraca analitik Sartorius,
eksikator, oven, bejana pengembang Camag,
pipa kapiler, sonikator Branson 1510,
perangkat KCKT Hitachi dengan detektor
UV-Vis L-2420, dan saringan 0,45 m.
Metode Penelitian
Penyiapan Bahan Baku
Seledri diperoleh dari Kecamatan Milir,
Kabupaten Bandungan, provinsi Jawa Tengah
dalam bentuk kering. Seledri yang sudah
kering kemudian dihaluskan. Bagan alir
penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1
Penetapan Kadar Air (Depkes 1995)
Cawan porselen dikeringkan pada suhu
105 C selama 30 menit, lalu ditempatkan di
dalam eksikator dan ditimbang. Seledri yang
telah dihaluskan ditimbang sekitar 5 g dan
dimasukkan ke dalam cawan tersebut. Contoh
beserta cawannya dikeringkan pada suhu 105
C selama 3 jam, dimasukkan ke dalam
eksikator,
dan
ditimbang
kembali.
Pengeringan dan penimbangan dilakukan
berulang kali sampai diperoleh bobot tetap
dengan selisih kurang lebih 0,0001 g.
Pekerjaan dilakukan sebanyak tiga kali
ulangan.
Kadar air =
ab
a
dengan
a = bobot contoh sebelum dikeringkan (g)
b = bobot contohl setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Apigenin (Frankee et al. 2005)
Ekstraksi sekaligus hidrolisis flavon
dilakukan dengan menambahkan
225 ml
metanol:air (5:4) ke dalam 5 g seledri dengan
0,05 g BHT sebagai antioksidan dan 25 ml
HCl 1,2 M. Campuran disonikasi selama satu
menit, sebelum direfluks selama 2 jam.
Ekstrak lalu disaring dan dipekatkan dengan
radas penguap putar.
Uji Flavonoid (Harborne 1986)
Sebanyak 1 gram ekstrak dimasukkan ke
dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100
ml air panas dan dididihkan selama 5 menit.
Setelah itu larutan disaring dan filtratnya
digunakan untuk pengujian. Sebanyak 10 ml
filtrat ditambahkan 0,50 g serbuk Mg, 2 ml
alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan
etanol 95%), dan 2 ml amil alkohol.
Terbentuknya warna merah, kuning, dan
jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan
keberadaan flavonoid.
Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Ekstrak dan standar apigenin ditotolkan
pada lempeng silika gel GF254 sebagai fase
diam. Fase gerak yang digunakan adalah
kloroform:metanol (9,5:0,5). Lempeng silika
gel dimasukkan ke dalam bejana pengembang
yang berisi fase gerak yang telah dijenuhkan.
Setelah
selesai,
lempeng
tersebut
dikeringudarakan dan dilakukan pengamatan
bercak dengan menggunakan lampu UV pada
panjang gelombang 365 nm
Analisis dengan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (Frankee et al. 2005)
Kadar apigenin dianalisis menggunakan
KCKT. Kolom yang digunakan adalah kolom
fase terbalik C18 yang berisi silika dengan
detektor ultraviolet (UV). Elusi dengan laju
alir sebesar 0,60 ml/menit. Digunakan
campuran eluen asam asetat 10% (A) dan
metanol/asetonitril/air (0,8:1:1; v/v/v) (B).
Elusi diikuti dengan gradien linear dengan
konsentrasi B dalam A (v/v) dari 0% sampai
50% selama 20 menit, dari 50% kembali ke
40% dalam 0,1 menit, lalu dipertahankan pada
40% selama 10 menit. Kemudian dilanjutkan
dari 40% ke 95% selama 15 menit, dari 95%
ke 10% dalam 3 menit dengan kesetimbangan
selama 10 menit sebelum injeksi yang
berikutnya. Kadar apigenin diukur pada 333
nm.
Validasi Metode Penentuan Apigenin
Pembuatan Larutan Standar dan Contoh
Sebanyak 10 mg serbuk apigenin
dimasukkan ke dalam gelas piala dan
ditambahkan 30 ml metanol pa, kemudian
dipanaskan pada suhu 50 o C sambil diaduk
dengan pengaduk magnetik sampai serbuk
benar-benar larut. Larutan ini dimasukkan ke
dalam labu takar 100 ml dan