Validasi metode penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong (Anredera cordifolia (Ten) Steenis) dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi - USD Repository

  

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASAM URSOLAT DALAM

EKSTRAK DAUN BINAHONG ( Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) DENGAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

  SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh: Gayatri Kusuma Wardani

  NIM : 068114010

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2010

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

  Usulan Penelitian Untuk Skripsi

  

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASAM URSOLAT DALAM

EKSTRAK DAUN BINAHONG ( Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) DENGAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

  Yang diajukan oleh : Gayatri Kusuma Wardani

  068114010 telah disetujui oleh : Pembimbing I Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si. Tanggal 15 Juli 2010

MAN PERSE

      Saat saat saat dan t aku tak aku mem t keadaan aku mem t rencana aku mem saat putu aku mem

  HALAM paham ma milih untu mengecew milih untu hidupku milih untu us asa me milih untu

  (Dism

  tema

  aksud Tuha uk tetap wakan, uk tetap berantaka uk tetap elingkupik uk tetap mas Wenze

  an-teman Fa

  EMBAHAN an, percaya.. bersyukur an, berserah. ku, maju.. slaws)

  Penelitian in or Veve sahaba armasi (FST .

  r.. ..

  ni kupersem rang-orang y bapak dan e keponakan at dan sauda

  T)2006 dan mbahkan unt yang kukasi ibuku tercin nku tersaya araku terkas n almamater tuk ihi, nta ng sih rku

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPERLUAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Gayatri Kusuma Wardani Nomor Mahasiswa : 068114010

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Ursolat dalam Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikannya secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

  Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal 21 Juni 2010 Yang menyatakan Gayatri Kusuma Wardani

PERNYATAAN KEASLIAN

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 21 Juni 2010 Penulis

  Gayatri Kusuma Wardani

KATA PENGANTAR

  Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan berkat, rahmat, dan bimbingan-Nya sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Ursolat dalam Ekstrak

  

Daun Binahong ( Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) Dengan Metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi

  persyaratan dalam penyelesaian studi untuk meraih gelar Sarjana Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  Keberhasilan penelitian ini tidak lepas dari bantuan dan perhatian orang- orang di sekitar Penulis, baik secara materi maupun emosional. Untuk itu pada kesempatan ini Penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada beberapa pihak yang telah member dukungan di dalam penyelesaian skripsi ini, antara lain :

  1. Ipang Djunarko, M. Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah membantu dalam proses penyusunan skripsi ini.

  2. Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si, selaku dosen pembimbing yang dengan sabar telah membimbing, memberi dukungan, gagasan, dan kritik yang sangat berarti dalam proses penyusunan skripsi ini.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si., selaku dosen penguji yang telah memberi bantuan dan dukungan yang sangat berarti bagi Penulis.

  4. Dra. M. M. Yetty Tjandrawati, M. Si., selaku dosen penguji yang telah memberi bantuan dan dukungan yang sangat berarti bagi Penulis.

  5. Sri Hartati Yuliani, M. Si., Apt., selaku ketua proyek dan penguji yang telah memberi bantuan dan dukungan yang sangat berarti bagi Penulis.

  6. Bapak dan Ibuku, Cosmas Bambang Subiyanto dan Gayatri Gunartin, atas segala kasih sayang, doa, perhatian, perjuangan, dan dukungan dalam setiap langkah hidupku.

  7. Mas Ottok, Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kunto, Mas Sigit, Mas Wagiran, dan Pak Timbul yang telah banyak membantu terselesainya penelitian.

  8. B. Kris Mantoro, atas kehadirannya yang telah mewarnai hidupku, juga atas dukungan dan semangat yang diberikan selama ini.

  9. Robertus Satrio Wibisono, atas dukungan, kebersamaan, dan perjuangan yang menyenangkan, menyedihkan, dan mengharukan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

  10. Saudara-saudaraku di kost Pasadena, Maria Laksmi Parahita, Anastasia Aprilistyawati, Maria Evangeli, Dewi Prasetyaningrum, Widya Kusumawardani, dan Swastika Maharani atas keceriaan, kebersamaan, dan dukungan yang telah diberikan selama ini.

  11. Sahabat-sahabatku, Maria Yolanda, Veronika Yuni Candra Sari, Laurensia Utami Susanti, Rr. Kusumowardani, Adhitya Eka Prasetya, Efrinita Nur Agustian, Hertik Dwi Iswahyuni Rahayu, dsb atas kebersamaannya selama ini.

  12. Semua teman-teman angkatan 2006 dan seluruh mahasiswa Farmasi, khususnya FST 2006 atas kebersamaan selama ini. One for the FST!!

  13. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas doa dan dukungannya.

  Dengan segala kerendahan hati Penulis menyadari bahwa skripsi ini tidak sempurna, oleh karena itu Penulis akan menerima kritik, koreksi, dan saran dari berbagai pihak guna menjadikan skripsi ini lebih baik. Pada akhirnya, Penulis berharap semoga keseluruhan isi skripsi ini dapat berguna bagi banyak pihak.

  

INTISARI

  Penelitian yang dilakukan adalah untuk memvalidasi metode penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik memenuhi parameter validasi metode analisis yang meliputi akurasi, presisi, linearitas, LOD, dan LOQ jika digunakan untuk penetapan kadar asam ursolat dan untuk mengetahui apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong.

  Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental deskriptif. Analisis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan menggunakan fase diam kolom C18 dan fase gerak campuran metanol:ortophosphoric acid 1% (90:10) dengan kecepatan alir 0.6 ml/menit. Kesahihan metode diukur dengan nilai akurasi, presisi, linearitas, LOD, dan LOQ.

  Hasil dari penelitian menunjukkan bahwa metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik merupakan metode yang valid untuk menentukan kadar asam ursolat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode memiliki linearitas yang baik dengan nilai r sebesar 0.999995. Recovery dan CV untuk volume injek 2,0; 6,0; dan 10,0 µl berturut-turut adalah 104.413%, 0.05%; 105.931%, 0.01%; dan 107.909%,

• 3 0.02%. Nilai LOD dan LOQ berturut-turut adalah 3.117x10 dan 0.0104.

  Kata kunci : asam ursolat, ekstrak daun binahong, KCKT

  

ABSTRACT

  This research conducted is to validate the establisment method of ursolic acid content in the extract of binahong leaves (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) using the high performance liquid chromatography method. The purposes of this research are to know whether the reverse phase high performance liquid chromatography method accomplishes the validation parameters of the analytical method including accuration, precision, linearity, LOD, and LOQ if it is used for the establisment of ursolic acid content and to know whether the reverse phase high performance liquid chromatography method can be applied to the establisment of ursolic acid content in the extract of binahong leaves.

  This research is a non-experimental descriptif research. The analysis uses the reverse phase high performance liquid chromatography method using the C18 column stationary phase and the mobile phase of mixed methanol: ortophosphoric acid 1% (90:10) with the flow rate 0,6 ml/second. The validity of method is measured using the rate of accuration, precision, linearity, LOD, and LOQ.

  The result of this research shows that the reverse phase high performance liquid chromatography method is the valid method to determine the ursolic acid content. The result of this research shows that the method has good linearity with the rate r in the amount of 0,999995. Recovery and CV for the inject volume 2,0; 6,0; and 10,0 µl in sequence are 104,413 %, 0,05%; 105,931%, 0,01%; and 107,909%, 0,02%.

• 3 The LOD and LOQ rates in sequence are 3,117x10 and 0,0104.

  Key words: ursolic acid, extract of binahong leaves, HPLC

  DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PULIKASI ........................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ vi

PRAKATA ...................................................................................................... vii

  INTISARI ....................................................................................................... x

ABSTRACT ..................................................................................................... xi

DAFTAR ISI ................................................................................................... xii

DAFTAR TABEL .......................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvii

  BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ............................................................................................ 1 B. Rumusan Masalah ....................................................................................... 3 C. Keaslian penelitian ...................................................................................... 3 D. Manfaat penelitian ....................................................................................... 4

  a. Manfaat Praktis ....................................................................................... 4

  b. Manfaat Teoritis ..................................................................................... 4

  E. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 4

  BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA A. Binahong ..................................................................................................... 5 B. Asam Ursolat ............................................................................................... 6 C. Ekstraksi Simplisia ...................................................................................... 7

  a. Simplisia ................................................................................................ 7

  b. Ekstrak ................................................................................................... 7

  c. Ekstraksi ................................................................................................ 7

  D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ............................................................... 8

  E. Parameter Validasi Metode Analisis ........................................................... 18

  a. Parameter Metode Analisis ................................................................... 18

  b. Kategori Metode Analisis ...................................................................... 22

  c. Kesalahan Dalam Analisis ..................................................................... 23

  F. Landasan Teori ............................................................................................ 24

  G. Hipotesis ...................................................................................................... 25

  BAB III. METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian ............................................................................................ 26 B. Variabel Operasional ................................................................................... 26 C. Alat-alat Penelitian ...................................................................................... 27 D. Bahan-bahan Penelitian ............................................................................... 27 E. Tata Cara Penelitian .................................................................................... 28

  BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Penyiapan Fase Gerak Metanol:Ortophosphoric Acid 1% (90:10) ............. 34 B. Penetapan Kurva Baku ................................................................................ 37 C. Penyiapan Sampel ....................................................................................... 39 D. Analisis Kualitatif ........................................................................................ 41 E. Validitas Metode ......................................................................................... 46

  a. Akurasi .................................................................................................. 46

  b. Presisi .................................................................................................... 47

  c. Linearitas ............................................................................................... 48

  d. Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ) ................ 48

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan .................................................................................................. 50 B. Saran ............................................................................................................ 50

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 51

LAMPIRAN .................................................................................................... 55

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 92

  DAFTAR TABEL

  Tabel I. Nilai Indeks Polaritas dan Eluen Strength Pelarut ................... 11 Tabel II. Kriteria Penerimaan Akurasi Pada Konsentrasi Analit Yang

  Berbeda ..................................................................................... 19 Tabel III. Kriteria Penerimaan Presisi Pada Konsentrasi Analit Yang

  Berbeda ..................................................................................... 20 Tabel IV. Parameter Validasi Yang Dipersyaratkan Untuk Validasi

  Metode Analisis ........................................................................ 23 Tabel V. Hasil Penetapan Kurva Baku Asam Ursolat ............................. 38 Tabel VI. Hasil Perhitungan Recovery ..................................................... 47 Tabel VII. Hasil Perhitungan Kesalahan Sistemik dan Kesalahan Acak ... 47 Tabel VIII. Penimbangan Baku Asam Ursolat 90% ................................... 55 Tabel IX. Hasil Perhitungan LOD dan LOQ ............................................ 63

  DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Binahong ...................................................................................... 5 Gambar 2. Struktur Kimia Asam Ursolat .......................................................... 6 Gambar 3. Skema Alat Kromatografi Cair Kinerja

  Tinggi

  ......................... 8 Gambar 4. Difusi Eddy ............................................................................... 13 Gambar 5. Difusi Eddy ............................................................................... 13 Gambar 6. Transfer Massa Fase Diam ....................................................... 14 Gambar 7. Transfer Massa Fase Gerak ...................................................... 15 Gambar 8. Gugus Polar Asam Ursolat ....................................................... 36 Gambar 9. Gugus Non Polar Asam Ursolat ............................................... 36 Gambar 10. Interaksi Hidrogen Antara Asam Ursolat Dengan Fase Gerak

  Metanol Dalam Fase Gerak ...................................................... 37 Gambar 11. Kurva Hubungan Antara Massa Baku Asam Ursolat Dengan

  AUC .......................................................................................... 39 Gambar 12. Kromatogram Standar Asam Ursolat ....................................... 43 Gambar 13. Kromatogarm Sampel ............................................................... 44 Gambar 14. Kromatogram Spiking ............................................................... 45

  DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Seri Larutan Baku Asam Ursolat ...................................................................................... 55

  Lampiran 2. Hasil Perhitungan Recovery, Kesalahan Sistemik, dan Kesalahan Acak ........................................................................

  Lampiran 3. Perhitungan LOD dan LOQ ...................................................... 63 Lampiran 4. Penimbangan daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.)

  Steenis) ..................................................................................... 64 Lampiran 5. Penimbangan rendemen ekstrak daun binahong (Anredera

  cordifolia (Ten.) Steenis) .......................................................... 64    

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Penelitian Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) dikenal memiliki

  khasiat dalam pengobatan. Binahong disebutkan mempunyai kandungan kimia seperti asam oleanolat, asam askorbat, dan ancordin (Lazuardhi, 2009). Penelitian-penelitian sebelumnya lebih banyak membahas kandungan asam oleanolat dalam tanaman binahong dan belum membuktikan adanya kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun binahong. Asam oleanolat dan asam ursolat merupakan senyawa golongan triterpen pentasiklik, yang membedakan keduanya hanyalah posisi gugus metil pada atom karbon nomor 19 dan 20 (Olszewska, 2008). Posisi gugus metil pada asam oleanolat terletak pada atom karbon nomor 19, sedangkan pada asam ursolat, gugus metil terletak pada atom karbon nomor 20. Inilah yang menyebabkan kepolaran di antara kedua senyawa tersebut tidak jauh berbeda. Aktivitas antara kedua senyawa tersebut juga tidak jauh berbeda, seperti antiinflamasi, antioksidan, dsb.

  Menurut Wojciak dan Korsior (2007), asam oleanolat, asam ursolat, dan asam betulinat dapat dijumpai pada folium Salviae, folium Plantaginis lanceolatae, dan flos Lamii albi. Berdasarkan hal tersebut, dapat diperkirakan bahwa tanaman yang mengandung senyawa asam oleanolat dimungkinkan mengandung pula asam ursolat. Hal ini dikarenakan asam oleanolat merupakan isomer dari asam ursolat, yang berbeda posisi gugus metilnya pada atom karbon nomor 19 dan 20.

  Pada penelitian sebelumnya, asam ursolat biasa dijumpai pada tanaman ceri hitam (Prunus serotina Ehrh.), Eriobotrya japonica, Rosmarinus officinalis, dan

  

Glechoma hederaceae (Cha, 1996). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa asam

  ursolat memiliki aktivitas yang berguna dalam bidang pengobatan, seperti antiinflamasi, antitumor, antikanker, anti HIV, antioksidan, antiinvasif, antiulcer, antiarterosklerosis, hepatoprotektif, gastroprotektif, antihiperlipidemia, dsb (Liao, 2005). Bahkan saat ini sedang dikembangkan sediaan kosmetik anti aging yang menggunakan garam asam ursolat sebagai bahan aktifnya (Anonim, 2009).

  Metode kromatografi cair kinerja tinggi adalah metode yang dipilih untuk digunakan dalam analisis asam ursolat. Namun belum diketahui apakah metode ini memiliki validitas yang baik atau tidak apabila diaplikasikan pada penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong. Dari penelitian ini diharapkan dapat diperoleh metode penetapan kadar asam ursolat menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi yang memiliki akurasi, presisi, linearitas, LOD, dan LOQ yang baik.

B. Rumusan Masalah

  Berdasarkan latar belakang dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut : a. Apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik memenuhi parameter validasi metode analisis yang meliputi akurasi, presisi, linearitas,

  LOD, dan LOQ jika digunakan dalam penetapan kadar asam ursolat?

  b. Apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dapat diaplikasikan untuk menetapkan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong?

C. Keaslian Karya

  Sejauh pengetahuan penulis, penelitian dengan menggunakan tanaman binahong sudah cukup banyak dilakukan di Indonesia, antara lain :

  1. Formulasi Gel Antiluka Ekstrak Daun Binahong (Anredera baselloides (Ten.) Steenis) dengan Basis Carbopol (Setyaningretry, 2007).

  2. Optimasi Formula Span 80 dan Tween 80 dalam cold cream Obat Luka Ekstrak Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) dengan Metode Simplex Lattice Design (Paramita, 2008).

  Namun penelitian terkait kandungan asam ursolat dalam ekstrak daun binahong belum pernah dilakukan.

D. Manfaat Penelitian

  Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai berikut: a. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik valid untuk menentukan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten,) Steenis).

  b. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik untuk penetapan kadar asam ursolat.

E. Tujuan Penelitian

  1. Untuk mengetahui apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik memenuhi parameter validasi metode analisis yang meliputi akurasi, presisi, linearitas, LOD, dan LOQ jika digunakan untuk penetapan kadar asam ursolat.

  2. Untuk mengetahui apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar asam ursolat dalam ekstrak daun binahong.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Binahong Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) yang termasuk

  dalam famili Basellaceae berupa tumbuhan menjalar, berumur panjang (perenial), dan bisa mencapai panjang ± 5 m. Batangnya lunak, berbentuk silindris, saling membelit, dan berwarna merah. Daun tanaman ini bertangkai sangat pendek (subsessile), susunannya berseling, berwarna hijau, dan berbentuk jantung (cordata). Bunganya majemuk berbentuk tandan, bertangkai panjang, muncul di ketiak daun. Akarnya berbentuk rimpang, berdaging lunak. Binahong merupakan tanaman asli daerah Amerika Selatan. Tanaman ini tumbuh baik di cuaca tropis dan sub-tropis.

  

Berkembang secara generatif (biji), namun lebih sering dikembangbiakkan secara

vegetatif melalui akar rimpangnya. (Hidayati, 2009).

  

Gambar 1. Binahong (Raihan, 2009). Tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) memiliki beberapa nama lain, antara lain Boussingaultia gracilis Miers, Boussingaultia cordifolia,

  Boussingaultia baselloides (Hidayati, 2009).

  Dalam tanaman binahong terdapat beberapa kandungan kimia, seperti asam oleanolat, asam askorbat, fenol, minyak atsiri, ancordin, dsb (Lazuardhi, 2009).

B. Asam Ursolat

  CH ₃ CH ₃ O CH CH H C _{3 3} OH H CH ₃ H O H H C CH _{3 3}  

  C

30 H

  48 O

  3 Gambar 2. Struktur Kimia Asam Ursolat

  Asam ursolat merupakan golongan senyawa triterpen pentasiklik (Wojciak dan Korsior, 2007). Senyawa ini dapat ditemui pada tumbuhan apel, basil, bilberries, cranberries, elder flower, peppermint, rosemary, lavender, oregano, thyme, hawthorn, prunes, Prunus serotina Ehrh., dsb (Olszewska, 2008). Senyawa ini mempunyai berat molekul sebesar 456,68 g/mol (Anonim, 1989).

  Asam ursolat dikenal mempunyai berbagai macam khasiat, seperti antiinvasif, antiinflamasi. antiulcer, antiaterosklerosis, dan hepatoprotektif (Liao, 2005). Selain itu, asam ursolat juga mempunyai khasiat sebagai antitumor, anti-HIV, antimikroba, antifungi, gastroprotektif, dan antihiperlipidemia (Wojciak dan Korsior, 2007). Selain dalam bidang pengobatan, asam ursolat juga sering digunakan dalam kosmetik sebagai anti(photo)aging dalam bentuk garam (Anonim, 2010).

C. Ekstraksi Simplisia 1. Simplisia

  Simplisia adalah bahan alam yang digunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan apapun kecuali pengeringan. Ada 3 macam simplisia yaitu simplisia nabati, simplisia hewani, dan simplisia mineral. Simplisia nabati adalah simplisia yang berupa tanaman utuh, bagian tanaman,dan eksudat tanaman (Anonim, 1979).

  2. Ekstrak

  Ekstrak adalah sediaan kering, kental, atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya matahari langsung (Anonim, 1979). Ekstrak cair adalah sediaan dari simplisia nabati yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet (Hidayati, 2009).

  3. Ekstraksi

  Ekstraksi atau penyarian merupakan pemindahan massa zat aktif yang semula berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari tertentu sehingga terjadi pelarutan zat aktif dalam cairan penyari (Hidayati, 2009). Metode penyarian dipilih berdasarkan zat aktif yang terkandung dalam simplisia dan stabilitas zat aktif tersebut dalam cairan penyari (Anonim, 1986).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

  Kromatografi cair kinerja tinggi adalah suatu sistem kromatografi yang fase geraknya dialirkan dengan cepat dengan bantuan pompa dan hasilnya dideteksi dengan detektor (Gritter et al., 1985). Tujuan analisis dengan KCKT yaitu didapatkannya pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat (Mulja, 1995).

  

Gambar 3. Skema Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

  (Kazakevich dan Mc Nair, 1996) Berdasarkan sistem peralatannya maka KCKT termasuk kromatografi kolom karena dipakai fase diam yang ter-packing di dalam kolom, sedangkan berdasarkan proses pemisahannya KCKT digolongkan sebagai kromatografi partisi dan kromatografi adsorbsi. Prinsip kromatografi partisi didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tidak bercampur yang ada pada fase diam dan fase gerak. Fase diam (polar atau non polar) disalutkan pada penyangga dan dikemas ke dalam kolom. Jika linarut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, linarut akan tersebar

  

Cs

  antara dua fase menurut persamaan : K =

  

Cm

  K adalah koefisien distribusi dan C s dan C m adalah konsentrasi linarut berturut-turut dalam fase diam dan fase gerak (Johnson dan Stevenson, 1978).

  Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, biasanya digunakan hidrokarbon dan fase geraknya relatif bersifat polar seperti air, metanol atau asetonitril (Skoog et al., 1994).

  Kolom yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase terbalik adalah kolom dengan kemasan fase terikat, yang bersifat stabil karena fase diamnya terikat secara kimia pada penyangga, sehingga tidak mudah terbawa oleh fase gerak. Penyangga pada kemasan fase terikat biasanya terbuat dari silika yang sudah diseragamkan, berpori, dan umumnya partikel mempunyai diameter 3,5 atau 10 µm (Skoog et al., 1998).

  KCKT fase terbalik menggunakan fase diam yang berupa senyawa organik, dimana senyawa organik ini terikat secara kimia dengan gugus silanol pada permukaan silika. Hal ini yang menyebabkan permukaan silika menjadi bersifat non polar. Dalam kromatografi jenis ini, senyawa lebih polar terelusi lebih dahulu, kemudian diikuti senyawa non polar (Munson, 1991).

  Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase terbalik adalah oktadesilsilan (ODS). Selain ODS, dikenal pula silika dengan substitusi oktil (C ). Panjang pendeknya rantai karbon mempengaruhi tertambatnya senyawa pada

  8

  fase diam. Kolom dengan rantai panjang bersifat retensif, sehingga senyawa yang mempunyai sifat mirip dengan kolom akan tertambat lebih lama (Munson, 1991).

  Fase gerak merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut atau fase gerak digunakan dalam sistem KCKT, tetapi ada beberapa sifat yang perlu diperhatikan yaitu, fase gerak yang digunakan harus murni tanpa cemaran, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan cuplikan, memiliki viskositas yang rendah dan memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah jika diperlukan (Johnson and Stevenson, 1991).

  Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut atau kemampuan pelarut untuk mengelusi suatu senyawa. Kandungan utama fase gerak pada kromatografi fase terbalik adalah air. Pelarut yang dapat campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dioksan, tetrahidrofuran, dan dimetilformamida ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak (Munson, 1991).

  Polaritas fase gerak dalam KCKT sangat mempengaruhi kromatogram yang dihasilkan, sehingga perlu diperhitungkan komposisi campuran pelarut yang akan digunakan. Berdasarkan nilai P’(indeks polaritas), maka besarnya polaritas campuran pelarut dapat dihitung dengan persamaan berikut :

  P = P ’ P ’ P ’

     =   +   + .......+    _campuran  

₁

_{1 2 2 n n} ∑ Nilai P adalah polaritas campuran, P’ menyatakan indeks polaritas,

  campuran

  merupakan fraksi pelarut dalam campuran dan n adalah jenis pelarut yang digunakan (Skoog, 1985).

  Berikut ini adalah daftar pelarut berikut nilai indeks polaritas dan eluen strength dari beberapa pelarut (Skoog et al.., 1985).

  Tabel I. Nilai Indeks Polaritas dan Eluen Strength Pelarut Indeks Polaritas Eluen strength Pelarut

  (P’) (SiO )

  2 Fluoroalkana <2 -0,25 Sikloheksana 0,04 -0,2 n-Heksana 0,1 0,01 Karbon 1,6 0,18 tetraklorida 2,4 0,28 i-Propil eter 2,4 0,29 Toluen 2,8 0,38 Dietil eter 4,0 0,57 Tetrahidrofuran 4,1 0,40 Kloroform 4,3 0,88 Etanol 4,4 0,58 Etil asetat 5,1 0,95 Metanol 5,8 0,65 Acetonitril 6,9 0,64 Etilen glikol 10,2 tinggi Air

  merupakan ukuran kemampuan fase gerak menarik analit dari

  Eluen strength

  fase diam. Waktu retensi analit akan turun jika digunakan fase gerak dengan eluen

  

strength rendah, sebaliknya waktu retensi analit akan meningkat jika digunakan fase

gerak dengan eluen strength tinggi (Snyder et al.., 1997).

  Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa (Johnson dan Stevenson, 1978). Batasan yang paling sering digunakan yaitu bilangan lempeng teoritik dan faktor resolusi (Munson, 1991).

  1. Teori Lempeng (Plate Theory) Salah satu ukuran kinerja kolom adalah jumlah lempeng teoritik yang dihitung dengan persamaan:

  16 5,54 Nilai w adalah lebar alas, w 1/2 adalah lebar alas puncak pada setengah tinggi puncak, dan t R adalah waktu retensi (Sastrohamidjojo, 2001).

  Jumlah pelat teori berbanding lurus dengan panjang kolom. Karena panjang kolom bermacam-macam, maka diperlukan ukuran efisiensi kolom yang tidak bergantung pada panjang kolom. Tinggi atau jarak yang setara dengan pelat, H atau Height Equivalent to a Theoritical Plate (HETP), merupakan ukuran efisiensi kolom yang lebih disukai karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang panjangnya berlainan. H berkaitan dengan jumlah pelat teori menurut persamaan berikut:

  L H = HETP = N

  L menunjukkan panjang kolom biasanya dalam mm, dan N menunjukkan jumlah pelat teoritis (Johnson dan Stevenson, 1978).

  2. Teori Laju (Rate Theory) Pada waktu migrasi, analit mengalami transfer antara fase diam dan fase gerak berkali-kali. Waktu tinggal pada fase diam maupun fase gerak tidak teratur dan tergantung pada tersedianya energy termal dari lingkungannya yang memungkinkan transfer tersebut. Analit hanya dapat bergerak bila berada dalam fase gerak, sehingga migrasi di dalam kolom tidak teratur. Hal ini mengakibatkan laju rata-rata analit relatif terhadap fase gerak bervariasi sehingga terjadi pelebaran puncak analit. Faktor-faktor utama penyebab terjadinya pelebaran puncak yaitu:

  a. Difusi Eddy, merupakan aliran tidak teratur yang menyebabkan terjadinya pencampuran konvektif. Difusi Eddy disebabkan oleh banyak kemungkinan pada kemasan kolom yang kurang baik.

  Gambar 4. Difusi Eddy Gambar 5. Difusi Eddy Gambar 4 dan 5 menunjukkan proses terjadinya difusi Eddy. Nomor 1 menunjukkan analit yang keluar lebih dahulu karena melewati kolom dengan partikel berukuran besar dan kurang kompak. Nomor 2 menunjukkan analit keluar lebih lambat dari nomor 1 karena ukuran partikel yang lebih kecil dan lebih kompak daripada nomor 1. Nomor 3, analit keluar paling akhir, hal ini terjadi karena melewati bagian kolom dengan ukuran partikel halus dan kompak.

  b. Difusi Longitudinal, merupakan efek dari gerakan random molekul analit dalam fase gerak karena adanya perbedaan konsentrasi.

  c. Transfer massa non-ekuillibrium, merupakan efek laju ekuilibrasi analit di antara fase gerak dan fase diam yang terbatas. Hal ini terjadi karena pada umumnya aliran fase gerak terlalu cepat untuk mendapatkan ekuilibrium antara kedua fase (Noegrohati, 1994).

  Transfer massa dinyatakan dengan nilai C dan C . C merupakan

  stasionery mobile stasionery

  hasil dari ditahannya solut karena adanya fase diam. Suatu molekul bergerak lambat dalam fase diam, sementara molekul lainnya melaju melalui kolom bersama dengan fase gerak. Untuk mengatasi hal ini diperlukan fase diam yang lebih encer (tidak terlalu kental). Peristiwa ini dapat digambarkan sebagai berikut :

  Gambar 6. Transfer Massa Fase Diam (Willard et al., 1988) C mobile menggambarkan adanya peristiwa di mana solut dalam fase diam bertemu dengan fase gerak yang masih baru. Hal ini dapat digambarkan sebagai berikut :

  Gambar 7. Transfer Massa Fase Gerak (Willard et al., 1988)

  Hubungan antara ketiga faktor dapat digambarkan dengan persamaan Van

  Deemter :

. .

  A = difusi Eddy B = difusi longitudinal C = transfer massa non-ekuilibrium = rata-rata flow rate linear fase gerak H = HETP (Noegrohati,1994)

  Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari dua puncak. Daya pisah (Rs) dapat diukur dengan persamaan:

  ( )

  t − t _{R 2 R 1} 2 Δ t Rs = =

  1 / 2 )( w w ) w w ₁ + + ( _{2 1 2} Nilai t R2 dan t R1 adalah waktu retensi senyawa, diukur pada titik maksimum puncak dan Δt adalah selisih antara t R2 dan t R1 . Nilai w

  2 dan w 1 adalah lebar alas puncak dinyatakan dalam satuan waktu.

  Untuk memperbaiki resolusi dapat dinyatakan dengan parameter-parameter sebagai berikut: Berdasarkan rumus tersebut terlihat bahwa resolusi merupakan fungsi dari 3 faktor, yaitu selektivitas kolom yang tergantung pada

  α, faktor kapasitas yang tergantung pada nilai k’ dan faktor efisiensi yang tergantung pada nilai N (Noegrohati, 1994).

  Hasil pemisahan ditunjukkan pada kromatogram dan selanjutnya dapat ditentukan waktu retensi atau waktu tambat (t

  r

  ) yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa. T r adalah selang waktu yang diperlukan oleh linarut mulai pada saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor. Waktu retensi ini bersifat khas untuk senyawa tertentu. Beberapa mungkin mempunyai waktu retensi yang berdekatan, tetapi setiap senyawa hanya memiliki satu waktu retensi saja, karena setiap senyawa memiliki harga K (koefisien distribusi) yang spesifik (Mulja, 1995).

  Kualitas pemisahan KCKT dapat ditentukan dengan resolusi dan waktu pemisahan. Umumnya pemisahan dikatakan baik jika resolusi (R s ) lebih besar dari dua dan waktu pemisahannya singkat. Resolusi dapat ditentukan dengan tiga parameter yang secara langsung berhubungan dengan kondisi percobaan, yaitu faktor pemisahan, jumlah lempeng teoritis, dan rata-rata faktor retensi antara dua peak yang berdekatan (faktor kapasitas).

  Parameter faktor pemisahan dan faktor kapasitas ditentukan dengan beberapa kondisi yang mempengaruhi waktu retensi atau kesetimbangan distribusi antara sampel dengan fase diam dan sampel dengan fase gerak, yaitu :

  1. Komposisi fase diam

  2. Komposisi fase gerak

  3. Temperatur Jumlah lempeng teoritis dapat ditingkatkan dengan beberapa faktor, yaitu :

  1. Kualitas kolom yang baik (ter-packing dengan baik)

  2. Kolom yang lebih panjang

  3. Kecepatan alir yang lebih lambat

  4. Makin kecil partikel dalam kolom

  5. Viskositas fase gerak yang lebih rendah dan temperatur yang lebih tinggi

  6. Molekul sampel yang lebih kecil 7. Efek ekstra kolom yang minimum.

  Bentuk peak sama pentingnya dalam perkembangan metode KCKT. Kolom dan kondisi percobaan yang menghasilkan peak yang simetris selalu dipilih. Peak yang asimetris dapat terjadi karena antara lain jumlah sampel yang berlebihan, kesalahan pelarut untuk sampel tertentu, dan kontaminasi logam berat. Kondisi yang menyebabkan pengekoran atau peak yang asimetris harus dihindari, karena dapat menyebabkan pemisahan yang buruk dan menurunkan presisi, serta menurunkan kemampuan untuk pengukuran setiap peak secara akurat.

  Detektor yang paling sering digunakan selama perkembangan metode KCKT adalah detektor UV. Pemilihan detektor yang tepat dapat meningkatkan selektivitas dan sensitivitas serta mengurangi baseline noise (Snyder, 1997).

E. Parameter Validasi, Kategori Metode, dan Kesalahan dalam Analisis 1.

   Parameter Validasi Analisis

  Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

  Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis antara lain: a. Akurasi

  Akurasi atau kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan dengan persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita, 2004).

  Kriteria % perolehan kembali yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada matriks dapat dilihat pada tabel II :

  Tabel II. Kriteria Penerimaan Akurasi Pada Konsentrasi Analit Yang Berbeda Analit pada sampel Rata-rata yang diperoleh (%) (%)

  100 98-102 >10 98-102 >1 97-103 >0.1 95-105 0.01 90-107 0.001 90-107 0.0001 (1 ppm) 80-110 0.00001 (100 ppb) 80-110 0.000001 (10 ppb) 60-115 0.0000001 (1 ppb) 40-120

  (Harmita, 2004) Akurasi untuk kadar obat yang besar adalah 95-105%, sedangkan untuk bioanalisis rentang 80-120% masih bisa diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).

  b. Presisi Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang-ulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004).

  Presisi dinyatakan dalam koefisien variasi (KV). Suatu metode dapat dikatakan baik apabila memiliki KV < 2% (Harmita, 2004).

  Presisi terdiri dari 3 macam, yaitu (Anonim, 1995) : 1) Reproducibility , adalah keseksamaan metode bila analisis dikerjakan di laboratorium yang berbeda.

  2) Intermediate precision , adalah keseksamaan metode bila analisis dikerjakan di laboratorium yang sama pada hari yang berbeda atau analis yang berbeda atau peralatan yang berbeda. 3) Repeatibility , adalah keseksamaan metode jika analisis dilakukan oleh analis yang sama dengan peralatan yang sama pada interval waktu yang pendek.

  Tabel III. Kriteria Penerimaan Presisi Pada Konsentrasi Analit Yang Berbeda Kadar analit Koefisien variasi/KV (%) (%)

  100

  1.3 >10 2.7

  >1

  2.8 >0.1 3.7

  0.01

  5.3 (Yuwono dan Indrayanto, 2005)

  Untuk bioanalisis, nilai KV 15-20% masih dapat diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).

  c. Linearitas dan rentang Linearitas merupakan kemampuan suatu metode (pada rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit di dalam sampel. Rentang adalah jarak antara level terbawah dan teratas dari metode analisis yang telah dipakai untuk mendapatkan presisi, akurasi dan linieritas yang bisa diterima (Anonim, 2007).

  d. Spesifitas Spesifitas merupakan karakteristik terpenting dari suatu metode dan harus ditetapkan sebagai salah satu variabel yang utama. Spesifitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel potensial yang mungkin ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).

  e. Limit of Detection (LOD) LOD adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat diukur pada kondisi percobaan tertentu tetapi tidak perlu secara kuantitatif.

  Penentuan LOD pada metode instrumental dapat didasarkan pada signal to noise

  

ratio yaitu dengan cara membandingkan hasil pengukuran analit yang telah

  diketahui konsentrasinya terhadap respon blangko. Konsentrasi analit yang mampu memberikan respon 2-3 kali respon blangko inilah yang kemudian ditetapkan sebagai LOD. Penentuan LOD dapat pula didasarkan pada standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran sejumlah blangko yang kemudian dikalikan dengan faktor sebesar 2 atau 3 (Anonim, 1995).

  f. Limit of Quantitation (LOQ) LOQ adalah konsentrasi terendah dari analit dalam sampel yang masih dapat dianalisis dengan presisi dan akurasi yang baik pada kondisi percobaan tertentu dari suatu metode. LOQ merupakan parameter uji kuantitatif untuk senyawa berkadar rendah dalam sampel yang mengandung bahan-bahan lainnya seperti bahan pengotor dalam serbuk obat dan hasil degradasi dari suatu produk obat jadi. Penentuan LOQ pada metode instrumental biasanya didasarkan pada standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran sejumlah blangko yang kemudian dikalikan dengan suatu faktor sebesar 10 (Anonim, 1995). g. Sensitivitas Sensitivitas merupakan kemampuan metode untuk mengidentifikasi perbedaan yang kecil antar konsentrasi analit. Faktor yang mempengaruhi sensitivitas ini adalah kemiringan dari kurva baku dan presisi, misalkan terdapat dua metode analisis dengan tingkat presisi yang sama akan tetapi kemiringan kurva baku keduanya berbeda maka metode yang lebih sensitif adalah metode yang mempunyai kemiringan kurva baku yang lebih curam, begitu juga sebaliknya (Skoog, 1985).

  h.