Dari data yang diperoleh, dipilih yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi, Pada hari uji, sampel yang memenuhi kriteria seperti yang telah ditentukan, diperiksa
ekspresi mRNA Mammaglobin dengan menggunakan mesin PCR. Semua data dikumpulkan, dikelompokkan dan dilakukan analisa statistik
menggunakan menggunakan software SPSS dengan uji Chi Square dan bila tidak terpenuhi, akan dilakukan uji Fisher sebagai alternatif. Kemaknaan yang dinilai
adalah bila p0,05. Dinilai apakah ekspresi mRNA Mammaglobin mampu membedakan kelompok metastase dan non-metastase.
3.10. Pelaksanaan Penelitian
Dari data histopatologi dan hasil imaging X foto rontgen, USG maupun CT Scan, MRI dan lainnya, yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi diperoleh
sebanyak 29 subjek , dibagi menjadi dua kelompok : yaitu yang metastase sebanyak
13 orang dan yang non metastase sebanyak 16 orang. 3.10.1.
Prosedur pemeriksaan Ekspresi mRNA Mammaglobin : 3.10.1.1. Isolasi RNA
Menggunakan reagent Instagene Matrix dari BioRad, dengan protokol sebagai berikut :
Alat dan Bahan yang perlu disiapkan :
UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
Alat Bahan
Sentrifugasi Nuclease free water
Vortex Microtube 1,5 mL
Mikropipet ukuran berbagai ukuran Tips berbagai ukuran
Cara Kerja :
Step Pertama
Disiapkan tabung Microtube 1,5 mL Dimasukkan 100 uL darah kemudian tambahkan 350 uL Lysis Solution dari Norgen
Lalu diVortex selama 15 detik untuk melarutkan darah Selanjutnya ditambahkan 200 uL Etanol 96 ke dalam Lisat
Lisat yang telah tercampur lalu diVortex kembali selama 10 detik.
Step kedua
Dari tabung Microtube diatas, diambil 600 uL Lisat dan dimasukkan ke dalam tabung Columm
Kemudian disentrifugasi selama 1 menit agar semua cairan Lisat melewati saringan pada tabung Columm
Dilakukan pemeriksaan ulangan untuk melihat bila masih ada cairan Lisat tersisa, sentrifugasi kembali sampai cairan lewat semua, kemudian buang cairan yang
tertampung dari tabung kolektor.
UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
Step ke tiga
Dimasukkan 400 uL Wash Solution ke dalam tabung Columm di step 2 Lalu sentrifugasi selama 1 menit dan cairan dalam tabung kolektor dibuang.
Ditambahkan 400 uL Wash Solution sekali lagi dan sentrifugasi selama 1 menit Lalu semua cairan yang tersisa dalam tabung kolektor dibuang dan disentrifugasi
selama 2 menit lagi sampai tabung Columm benar benar kering.
Step ke empat
Tabung Columm selanjutnya ditempatkan pada tabung Elution Kemudian ditambahkan 50 uL Elution Solution ke tabung Columm tadi.
Lalu sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 2000 Rpm, dengan kecepatan 13.000 Rpm selama 1 menit.
Sentrifugasi dilakukan berulang sampai Elution Solution lewat semua yang tampak
sebagai cairan di dasar tabung sebagai RNA. RNA
siap di pakai, boleh disimpan pada suhu – 20 C
3.10.1.2. Pembuatan cDNA total dengan RT-PCR Menggunakan reagent iScript cDNA synthase dari BioRad. Adapun protokol
pengerjaan sebagai berikut : a. Semua komponen untuk reaksi cDNA dimasukkan pada tabung mikro steril
tube PCR seperti tabel 1
UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
Tabel 1. Komposisi sintesis cDNA
Komponen Percontoh sampel
RNA total 20 ng 10 uL
iScript reaction mix 4 uL
iScript reverse transcriptaseenzyme 1 uL
Nuclease-free water 5 uL
Volume total
20 uL
b. Kemudian tube PCR tersebut dimasukkan ke dalam mesin PCR dan mengikuti profil PCR sebagai berikut : 25
C selama 5 menit, dilanjutkan pada suhu 42 C
selama 30 menit dan 85 C selama 5 menit.
Catatan : jika sudah dilakukan isolasi RNA, maka harus dilanjutkan hingga cDNA synthesis.
3.10.1.3. Isolasi Gen spesifik dari cDNA total:
Menggunakan reagents IQ Supermix dari BioRad. Adapun protokol pengerjaan sebagai berikut ini :
Tabel 2, Alat dan Bahan yang perlu disiapkan : Alat
Bahan PCR
Nuclease free water Mikropipet ukuran 1-10 uL
PCR tube Mikropipet ukuran 10 -100 uL
Tips berbagai ukuran Mikropipet ukuran 100-1000 uL
primer
UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
Cara Kerja : a. Semua komponen pada tabel 3 untuk reaksi cDNA spesifik dicampur dalam tabung
mikro steril tube PCR b. Primer yang dipergunakan adalah :
Primer forward 5’-CAG CGG CTT CCT TGA TCC TTG-3’ Primer Reverse 5’-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3’Grunewald., 2000
Tabel 3. Komposisi Reaksi PCR spesifik
Komponen reaksi Konsentrasi Awal
Konsentrasi Akhir Volume
Nuclease free water 14,8
PCR Buffer 10x
1 x 2
dNTP mix 10 µM
0,5 µM 0,4
MgCl2 2 x
1 x 0,6
Primer F 10uM Primer R 10 uM
cDNAPlasmid template iTag DNA Polymerase
10 uM 10 uM
5 UuL 0,25 uM
0,25 uM
1 Unit 0,5
0,5 1
0,2
Volume total 20 µL
Tube PCR tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin PCR Adapun Profil PCR yang sebelumnya sudah dilakukan optimasi adalah:
1. 95,0 C selama 3 menit 2. 95,0 C selama 10 detik
3. Gradient 57,0 C selama 30 detik 4. 72,0 C selama 30 detik
5. Kembali ke step 2 sebanyak 35 X 6. 72,0 C selama 7 menit
UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
3.10.1.4. Elektroforesis
Sampel DNA hasil amplifikasi diambil sebanyak 5 μl dan dicampurkan masing-
masing dengan 2 μl loading buffer. Campuran ini selanjutnya dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarose. Untuk mengamati kehadiran larik band DNA, dilakukan
pewarnaan menggunakan GelRed dari Biotium. Pada elektroforesis ini, digunakan Certified PCR Low Melt Agarose dari BioRad.
Hal ini dikarenakan agarose ini memiliki kemampuan pemisahan yang tinggi dan menghasilkan resolusi yang sangat baik dari fragmen dengan ukuran rendah 1000
bp. Hasil elektroforesis dibandingkan dengan ukuran ladder sehingga diperoleh
ukuran kasar dari gen yang sudah diperoleh. Adanya kehadiran larik band dari cDNA spesifik dan memiliki ukuran yang sesuai dengan gen yang diinginkan
menunjukan adanya kehadiran gen tersebut.
UNIVERSITAS SUMATRA UTARA
BAB IV
HASIL PENELITIAN
