Identifikasi Cendawan Endofit Asal Tanaman Obat dan Penapisan Potensinya sebagai Antibakteri
IDENTIFIKASI CENDAWAN ENDOFIT ASAL TANAMAN
OBAT DAN PENAPISAN POTENSINYA SEBAGAI
ANTIBAKTERI
GINA KUSUMA INTANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ABSTRAK
GINA KUSUMA INTANI. Identifikasi Cendawan Endofit Asal Tanaman Obat dan Penapisan
Potensinya sebagai Antibakteri. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan NAMPIAH
SUKARNO.
Cendawan endofit merupakan mikroorganisme yang hidup dalam jaringan tumbuhan tanpa
merugikan tanaman inangnya. Cendawan endofit dapat ditemukan pada berbagai tumbuhan
termasuk tanaman obat dan diketahui dapat menghasilkan berbagai senyawa bioaktif seperti
antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi tiga isolat cendawan endofit yaitu
isolat JBa8, isolat JMa3, dan isolat SLbt3 asal tanaman obat dan penapisan potensinya sebagai
penghasil senyawa antibakteri. Identifikasi cendawan dilakukan berdasarkan karakter morfologi
dan molekuler menggunakan daerah ITS rDNA. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enteropathogenic Escherichia
coli (EPEC) K1-1, dan E. coli flora normal menggunakan uji antagonisme dan metode difusi agar
menggunakan ekstrak cendawan yang diperoleh dari miselia menggunakan metanol sebagai
pelarut. Pengamatan dilakukan pada hari ke-3, ke-7, ke-10, dan ke-14 setelah inkubasi dengan
mengukur zona hambat di sekitar koloni. Ketiga isolat teridentifikasi sebagai Fusarium solani
untuk JBa8, Fusarium sp. untuk JMa3, dan Colletotrichum sp. untuk SLbt3. Sebanyak dua isolat
memiliki aktivitas antibakteri. Fusarium solani yang diisolasi dari jati belanda (Guazuma
ulmifolia) mampu menghambat pertumbuhan EPEC K1-1 dengan diameter zona hambat sebesar
12 mm. Aktivitas antibakteri Fusarium solani lebih rendah dari antibiotik cefotaxime sebagai
kontrol positif. Fusarium sp. yang diisolasi dari jahe merah (Zingiber officinale) mampu
menghambat pertumbuhan P. aeruginosa dengan diameter zona hambat sebesar 12 mm. Aktivitas
antibakteri Fusarium sp. sama dengan antibiotik cefotaxime 8 μg/mL. Sedangkan Colletotrichum
sp. yang diisolasi dari sambiloto (Andrographis paniculata) tidak memiliki aktivitas antibakteri.
Kata kunci: antibakteri, cendawan endofit, identifikasi, tanaman obat.
ABSTRACT
GINA KUSUMA INTANI. Identification of Endophytic Fungi from Medicinal Plants and
Screening Their Potency as Antibacterial Agent. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and
NAMPIAH SUKARNO.
Endophytic fungi are microorganisms living in plant tissue without causing any harm to its
host. The fungi can be found in all plants including medicinal plants. Endophytic fungi produced
variety of bioactive compounds such as antibacterial substances. This research aimed to identify 3
isolates of endophytic fungi JBa8, JMa3, and SLbt3 which were isolated from medicinal plants
and to screen their potency as source of antibacterial compounds. Identification of endophytic
fungi was performed based on morphological characteristics and DNA barcode using ITS region.
Antibacterial test was conducted against Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1, and microflora E. coli by
antagonism technique and agar diffusion method using mycelia extract with methanol solvent. The
inhibition activity of fungal extract on bacterial tested was observed on the day 3rd, 7th, 10th, and
14th after incubation by measuring clear zone around the colonies. The 3 isolates were tentatively
identified as Fusarium solani for JBa8, Fusarium sp. for JMa3, and Colletotrichum sp. for SLbt3.
Antibacterial activities were observed in F. solani and Fusarium sp. which were isolated from jati
belanda (Guazuma ulmifolia) and jahe merah (Zingiber officinale), respectively. F. solani inhibited
the growth of EPEC K1-1, whereas Fusarium sp. suppressed P. aeruginosa with clear zone
produced was 12 mm. Fusarium sp. had antibacterial activity similar with that of 8 μg/mL
cefotaxime positive control. The F. solani antibacterial activity, however, was lower than the two
positive control concentrations used. Colletotrichum sp. isolated from sambiloto (Andrographis
paniculata) did not have any antibacterial to all bacteria tested.
Key words: antibacteria, endophytic fungi, identification, medicinal plant.
3
IDENTIFIKASI CENDAWAN ENDOFIT ASAL TANAMAN
OBAT DAN PENAPISAN POTENSINYA SEBAGAI
ANTIBAKTERI
GINA KUSUMA INTANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul
Nama
NIM
: Identifikasi Cendawan Endofit Asal Tanaman Obat dan Penapisan
Potensinya sebagai Antibakteri
: Gina Kusuma Intani
: G34080105
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si
NIP. 19640517 198903 2001
Dr. Ir. Nampiah Sukarno
NIP. 19590504 198703 2001
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
NIP. 19641002 198903 1002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini sebagai syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Sains Departemen Biologi FMIPA IPB. Judul penelitian yang dilakukan
oleh penulis adalah Identifikasi Cendawan Endofit Asal Tanaman Obat dan Penapisan Potensinya
sebagai Antibakteri. Terima kasih penulis ucapkan kepada Proyek Hibah Kerjasama Internasional
DIKTI Tahun 2010 yang telah memberikan dana kepada Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan terima
kasih juga kepada Dr. Sri Budiarti yang telah memberikan isolat EPEC K1-1 dan Laboratorium
Mikrobiologi-Departemen Biologi FMIPA IPB untuk isolat bakteri uji, serta PPSHB-IPB atas
fasilitas penelitian yang diberikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan Ibu Dr. Ir.
Nampiah Sukarno selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, motivasi, dan
saran kepada penulis selama penyelesaian karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir. Raden Roro Dyah Perwitasari, M.Sc selaku dosen penguji yang telah
banyak memberikan saran dan masukan untuk perbaikan penulisan karya ilmiah ini.
Ucapan terima kasih juga ingin disampaikan kepada Ibu, Bapak, Ka Finsa Giovani, dan
Mochamad Nasodikin atas doa, perhatian, dan segala dukungan. Terima kasih penulis sampaikan
kepada Rani, Ipeh, dan Nurul teman seperjuangan dalam penelitian ini, Biorin Crew, Mba Pepi, Bu
Cinta, Pak Mulya, Pak Yanto, Ka Fajri, Mba Nurul, Ka Delih, Ka Fani, Ka Istha, Azizah, Puspa,
Nia, Inggit, Aldi, Dyah, Satriaji, teman-teman Wisma Pelangi dan teman-teman Biologi 45 yang
telah membantu selama berlangsungnya kegiatan karya ilmiah.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juni 2013
Gina Kusuma Intani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 November 1990 dari ayah H. Sagino dan ibu
Hj. Ina M. Pieter. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Penulis lulus dari SMA
Negeri 1 Pamulang pada tahun 2008 dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui
jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN). Penulis masuk dalam Program
Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi
Dasar Tingkat Persiapan Bersama IPB pada tahun ajaran 2011/2012 dan 2012/2013, mata kuliah
Genetika Molekuler pada tahun ajaran 2012/2013, dan mata kuliah Ilmu Lingkungan pada tahun
ajaran 2012/2013. Penulis aktif di beberapa organisasi, diantaranya sebagai Staf UKM UKF IPB
(Uni Konservasi Fauna IPB) sejak tahun 2008 hingga sekarang, Staf Himabio (Himpunan
Mahasiswa Biologi) pada tahun 2009-2010, menjadi Kepala Divisi Konservasi Eksitu pada
periode 2010/2011, serta menjadi panitia dan MC (Master of Ceremony) di berbagai kegiatan.
Pada tahun 2011 penulis mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa dalam bidang Pengabdian
Masyarakat dengan judul program “Pelestari Lingkungan Cilik” dan berhasil didanai DIKTI.
Pada tahun 2010, penulis melakukan Studi Lapang di Taman Wisata Alam Pangandaran
Ciamis, Jawa Barat dengan judul laporan “Bakteri Metanotrof”. Pada tahun 2011, penulis
melakukan Praktik Kerja Lapang di PT. Alam Desa Tapos dari bulan Juli sampai bulan Agustus
dengan judul laporan “Budidaya Buah Melon di PT. Alam Desa Tapos ”.
Sebagai salah satu syarat kelulusan studi di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, penulis melaksanakan penelitian yang berjudul “Identifikasi Cendawan Endofit Asal
Tanaman Obat dan Penapisan Potensinya sebagai Antibakteri” di bawah bimbingan Ibu Dr. Ir.
Utut Widyastuti, M.Si dan Ibu Dr. Ir. Nampiah Sukarno.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ....................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................................viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1
Latar Belakang ........................................................................................................................ 1
Tujuan Penelitian .................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1
Waktu dan Tempat .................................................................................................................. 1
Bahan dan Alat........................................................................................................................ 1
Metode Penelitian ................................................................................................................... 1
Identifikasi Morfologi Cendawan ............................................................................................ 1
Identifikasi Cendawan Secara Molekuler ................................................................................ 1
Produksi Miselia ................................................................................................................. 1
Isolasi DNA Genom, Amplifikasi, dan Visualisasi Amplikon .............................................. 2
Sekuensing DNA dan Analisis Sekuen ................................................................................ 2
Penapisan Potensi Senyawa Antibakteri ................................................................................... 2
Uji Antagonisme Flora Normal dan Bakteri Patogen ........................................................... 2
Ekstraksi Miselia Cendawan ............................................................................................... 2
Aktivitas Penghambatan Bakteri Patogen dengan Metode Difusi Agar ................................. 2
Analisis Data........................................................................................................................... 3
HASIL ........................................................................................................................................ 3
Identifikasi Morfologi Cendawan ............................................................................................ 3
Identifikasi Molekuler Cendawan ............................................................................................ 5
Uji Antagonisme Flora Normal................................................................................................ 6
Uji Antagonisme Bakteri Patogen ............................................................................................ 6
Aktivitas Penghambatan Ekstrak Miselia Menggunakan Metanol Terhadap Bakteri dengan
Metode Difusi Agar................................................................................................................. 6
PEMBAHASAN.......................................................................................................................... 8
SIMPULAN .............................................................................................................................. 10
SARAN ..................................................................................................................................... 10
UCAPAN TERIMA KASIH ...................................................................................................... 10
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................ 11
LAMPIRAN .............................................................................................................................. 12
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Karakteristik koloni, makroskopis dan mikroskopis cendawan endofit pada tingkat genus ........ 3
2 Hasil analisis bioinformatika menggunakan mega BLAST dari NCBI ...................................... 6
3 Hasil penapisan antara miselia cendawan dengan bakteri patogen pada hari ke-3 ...................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Koloni miselia sterilia (Isolat JBa8) pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi pada suhu
ruang. ..................................................................................................................................... 4
2 Koloni Fusarium sp. pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi pada suhu ruang ............. 4
3 Koloni Colletotrichum sp. pada media PDA, umur 14 hari setelah inkubasi pada suhu ruang ... 5
4 Hasil amplifikasi DNA pada daerah ITS menghasilkan pita berukuran ~570 bp. ...................... 5
5 (A) Kontrol metanol terhadap EPEC K1-1. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak miselia
Fusarium solani (JBa8) menggunakan metanol terhadap EPEC K1-1. (C) Kontrol antibiotik
cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap EPEC K1-1. (D) Kontrol antibiotik cefotaxime
konsentrasi 64 μg/mL terhadap EPEC K1-1. ........................................................................... 7
6 (A) Kontrol metanol terhadap P. aeruginosa. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak miselia
Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol terhadap P. aeruginosa. (C) Kontrol antibiotik
cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap P. aeruginosa. (D) Kontrol antibiotik cefotaxime
konsentrasi 64 μg/mL terhadap P. aeruginosa. ........................................................................ 7
7 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium solani (JBa8) terhadap EPEC K1-1..................... 8
8 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium sp. (JMa3) terhadap P. aeruginosa ..................... 8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JBa8 .................................................................... 13
Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JMa3 ................................................................... 15
Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan SLbt3 ................................................................... 17
Diameter zona hambat ekstrak miselia menggunakan metanol pada hari ketiga. ..................... 19
Diameter zona hambat cefotaxime dengan konsentrasi 8 μg/mL pada hari ketiga ................... 19
Diameter zona hambat cefotaxime dengan konsentrasi 64 μg/mL pada hari ketiga.................. 19
Analisis statistik perbandingan diameter zona hambat ekstrak miselia menggunakan metanol
terhadap bakteri uji dengan antibiotik cefotaxime .................................................................. 20
8 Komposisi media LBA ......................................................................................................... 22
9 Komposisi media LBB ......................................................................................................... 22
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cendawan
endofit
merupakan
mikroorganisme yang hidup dalam jaringan
organisme seperti tumbuhan, hidup pada
bagian daun, bunga, ranting ataupun akar
tumbuhan (Clay 1988); dan cendawan ini
mampu hidup dengan membentuk koloni
dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan
tanaman inangnya (Carroll 1990). Setiap
tanaman tingkat tinggi dapat mengandung
beberapa mikroba, salah satunya cendawan
endofit yang mampu menghasilkan senyawa
bioaktif atau metabolit sekunder (Tan dan Zou
2001). Metabolit sekunder yang dihasilkan
dari cendawan endofit ini dapat berupa
senyawa antibakteri, antifungi, antikanker,
antivirus, antidiabetes, dan insektisida. Oleh
sebab itu, cendawan endofit yang berpotensi
menghasilkan senyawa antibakteri dapat
dimanfaatkan sebagai agen pengendali bakteri
patogen.
Cendawan endofit dapat ditemukan
pada tanaman obat seperti jati belanda
(Guazuma ulmifolia) (Strobel et al. 2007),
jahe merah (Zingiber officinale), dan
sambiloto
(Andrographis
paniculata)
(Tejavathi et al. 2011) yang merupakan
tanaman obat potensial untuk dikembangkan
sebagai sumber herbal untuk pengobatan dan
pemeliharaan kesehatan (Deptan 2007).
Cendawan endofit asal tanaman obat
sangat besar manfaatnya sebagai sumber
penghasil antibakteri, namun belum banyak
penelitian terhadap cendawan endofit di
Indonesia. Oleh karena itu dilakukan
penelitian mengenai cendawan endofit asal
tanaman obat Indonesia. Kebanyakan
cendawan endofit sedikit menghasilkan spora
bahkan tidak menghasilkan spora sama sekali.
Hal ini yang menjadi kendala untuk proses
identifikasi spesies secara morfologi, sehingga
identifikasi secara molekuler perlu dilakukan
untuk penentuan spesies.
Identifikasi cendawan secara molekuler
menggunakan daerah ITS rDNA karena
merupakan salah satu daerah yang paling
umum digunakan untuk penanda molekuler
cendawan. Daerah ITS bersifat konservatif,
memiliki variabilitas yang sangat tinggi yang
spesifik takson, dan mempunyai jumlah
ulangan yang tinggi (Gardes dan Bruns 1993).
Tujuan Penelitian
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengidentifikasi cendawan endofit asal
tanaman obat dan penapisan potensinya
sebagai penghasil senyawa antibakteri.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan
Januari 2012 sampai dengan Desember 2012
di Laboratorium BIORIN, PPSHB-IPB.
Bahan dan Alat
Bahan
yang
digunakan
dalam
penelitian ini antara lain isolat cendawan
endofit asal jahe merah (JMa3), jati belanda
(JBa8), dan sambiloto (SLbt3) yang
merupakan koleksi PPSHB dan bagian
Mikologi IPB; isolat bakteri seperti
Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Enteropathogenic
Escherichia coli (EPEC) K1-1, dan bakteri
Escherichia coli flora normal yang merupakan
koleksi
Laboratorium
MikrobiologiDepartemen Biologi FMIPA IPB. Alat yang
digunakan adalah perangkat elektroforesis dan
mesin PCR, laminar air flow cabinet (LAFC),
rotary vacuum evaporator, dan mikroskop.
Metode Penelitian
Identifikasi Morfologi Cendawan
Identifikasi cendawan secara morfologi
dilakukan dengan mengamati beberapa
karakter morfologi dari struktur somatik dan
reproduktif baik secara makroskopis maupun
secara mikroskopis. Pengamatan makroskopis
yang dilakukan meliputi: (1) warna koloni, (2)
warna balik koloni, (3) tekstur, dan (4)
diameter koloni. Pengamatan struktur
mikroskopis
dilakukan
terhadap hifa,
konidiofor
dan
konidia.
Identifikasi
berdasarkan kunci identifikasi menurut
Barnett dan Hunter (1972), Booth (1971), dan
Weir et al. (2012)
Identifikasi Cendawan Secara Molekuler
Produksi Miselia. Isolat cendawan
terlebih dahulu diremajakan dalam media
padat potato dextrose agar (PDA) Difco lalu
ditumbuhkan dalam media cair potato
dextrose broth (PDB) dan diagitasi pada suhu
ruang selama 7 hari. Miselia dipanen dengan
cara menyaring biomassa di atas kertas saring
steril menggunakan pompa vakum. Biomassa
ini selanjutnya digunakan untuk isolasi DNA
genom.
2
Isolasi DNA Genom, Amplifikasi,
dan Visualisasi Amplikon. Isolasi DNA
genom dilakukan berdasarkan metode CTAB
menurut Sambrook et al. (1989) yang telah
dimodifikasi yaitu tanpa penambahan β
mercapto ethanol. DNA genom hasil isolasi
digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi
DNA menggunakan primer universal, yaitu
ITS1 (5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG G
3’) dan ITS4 (5’TCC TCC GCT TAT TGA
TAT GC 3’). Reaksi PCR dilakukan dengan
total reaksi 10 µl terdiri dari 1 µl DNA
genomik [100 ng/µl], 0.3 µl untuk setiap
primer [1 pmol], 1 µl dNTP 2 mM, 0.2 µl
enzim taq DNA polymerase [5U/µl], 1 µl
buffer 10x dan 6.2 µl ddH2O. Kondisi PCR
untuk ITS adalah: denaturasi pra-PCR 95oC
selama 5 menit, denaturasi 94oC selama 30
detik, penempelan primer 52oC selama 30
detik, pemanjangan DNA 72oC selama 1
menit, siklus diulangi sebanyak 35 kali,
pemanjangan pasca PCR 72oC selama 5 menit
dan proses pendinginan dilakukan pada suhu
25oC selama 10 menit. Hasil PCR
dimigrasikan pada 1% gel agarosa dan
divisualisasi di atas UV-Transluminator
dengan pewarnaan Ethidium Bromide 0.5
mg/l.
Sekuensing DNA dan Analisis
Sekuen. Sekuensing produk PCR dilakukan
oleh PT. Genetika Science Indonesia. Hasil
sekuen dianalisis menggunakan perangkat
BioEdit dan disejajarkan menggunakan
Clustal W. Sekuen yang telah disejajarkan
kemudian dibandingkan dengan data pada
GenBank menggunakan program BLAST-N
(Basic Local Alignment Search Tool
Nucleotide) dari situs NCBI (National Center
for Biotechnology Information) untuk
menentukan homologi dari isolat yang
dianalisis.
Penapisan Potensi Senyawa Antibakteri
Uji Antagonisme Flora Normal dan
Bakteri Patogen. Penapisan potensi senyawa
antibakteri pertama kali dilakukan dengan
melakukan uji antagonisme antara isolat
cendawan secara kultur dengan E. coli flora
normal. Isolat cendawan yang tidak
membunuh atau menghasilkan zona hambat
pada flora normal selanjutnya akan ditapis
kemampuannya terhadap empat bakteri
patogen, yaitu S. aureus dan B. subtilis yang
mewakili bakteri gram positif, dan P.
aeruginosa dan EPEC K1-1 yang mewakili
bakteri gram negatif melalui mekanisme uji
antagonisme. Sedangkan isolat cendawan
yang menghasilkan zona hambat pada flora
normal tidak digunakan untuk melakukan uji
aktivitas antibakteri. Isolat cendawan yang
mampu
membunuh
bakteri
patogen
selanjutnya akan dilakukan uji aktivitas
antibakteri dengan metode difusi agar
menggunakan ekstrak miselia menggunakan
metanol yang diharapkan agar metabolit
sekunder berupa senyawa aktif dari cendawan
dapat membunuh bakteri patogen.
Ekstraksi Miselia Cendawan. Isolat
cendawan endofit ditumbuhkan di dalam 100
ml media PDB dan diinkubasi pada suhu 28oC
selama dua minggu dengan agitasi pada 120
rpm. Untuk mendapatkan ekstrak kasar,
biomassa miselia cendawan dipisahkan dari
media dengan cara filtrasi menggunakan
kertas saring. Biomassa dibekukan dengan
menambah nitrogen cair lalu dihaluskan
sampai berbentuk tepung menggunakan
mortar steril; kemudian ekstraksi miselia
cendawan dilakukan dengan cara maserasi,
yaitu dengan merendam seluruh biomassa
miselia cendawan dalam pelarut metanol
murni di dalam botol, sampai terendam
seluruhnya selama ± 24 jam dan kemudian
disaring dengan kertas penyaring. Residu
kembali dimaserasi lagi dengan cara yang
sama. Proses tersebut diulangi sebanyak 3
kali. Ekstrak hasil maserasi ditampung
menjadi satu dan diuapkan untuk memisahkan
pelarutnya. Penguapan dilakukan dengan
menggunakan alat rotary vacuum evaporator
pada suhu 40°C sampai pelarut habis
menguap sehingga didapatkan ekstrak miselia
menggunakan metanol.
Aktivitas Penghambatan Bakteri
Patogen dengan Metode Difusi Agar.
Bakteri ditumbuhkan dalam 4 ml media luria
bertani broth (LBB) dan diinkubasi selama 24
jam kemudian diukur kepadatan selnya
dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 600 nm. Sebanyak 50 µl
biakan bakteri dengan kepadatan 105-108
CFU/ml dituang pada permukaan media padat
luria bertani agar (LBA). Setelah itu, kertas
cakram steril berdiameter 10 mm diletakkan
di atas permukaan media LBA dan ekstrak
miselia menggunakan metanol diteteskan ke
atas cakram sebanyak 100 µl. Kultur
diinkubasi pada suhu 37oC pada 3 hari
pertama, kemudian dipindahkan ke suhu
ruang untuk pengamatan zona hambat.
Kontrol antibiotik cefotaxime
dengan
konsentrasi 8 μg/mL dan 64 μg/mL digunakan
sebagai pembanding dalam uji aktivitas
antibakteri. Konsentrasi 8 μg/mL digunakan
untuk melihat kerentanan bakteri sedangkan
konsentrasi 64 μg/mL digunakan untuk
3
melihat keresistenan bakteri (Pierce dan
Dennis
2010).
Kemampuan
senyawa
antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona
hambat di sekitar koloni bakteri. Pengamatan
zona hambat dilakukan pada hari ke-3, ke-7,
ke-10 dan ke-14.
HASIL
Identifikasi Morfologi Cendawan
Identifikasi cendawan secara morfologi
dilakukan meliputi pengamatan makroskopis
maupun secara mikroskopis (Tabel 1).
Berdasarkan hasil identifikasi morfologi,
terdapat 2 genus cendawan dari 3 isolat
Analisis Data
cendawan yang digunakan. Dua genus
Data yang diperoleh berupa diameter
tersebut adalah Fusarium dan Colletotrichum
zona hambat dan dianalisis dengan metode
yang
masing-masing dimiliki oleh isolat JMa3
Independent-Samples T Test pada tingkat
dan
SLbt3.
Isolat JBa8 merupakan koloni
kepercayaan 95% dan taraf α = 0.05 dengan
miselia sterilia karena tidak dijumpai adanya
program SPSS 9.0.
struktur reproduktif seperti tidak terbentuknya
konidium sehingga tidak dapat teridentifikasi.
Tabel 1 Karakteristik koloni, makroskopis dan mikroskopis cendawan endofit pada tingkat genus
Kode
Nama genus
Spesies
Ciri makroskopis dan mikroskopis koloni
isolat
JBa8
Tidak
dapat Miselia sterilia
Warna koloni tampak atas putih kekuningan,
teridentifikasi
warna koloni tampak bawah kuning, tekstur
(miselia
koloni seperti kapas, pembentukan diameter
sterilia)
koloni mencapai 6 cm dalam 7 hari. Hifa
cendawan berseptat berwarna hialin dan tidak
dijumpai adanya konidia sehingga tidak dapat
diidentifikasi secara morfologi (Gambar 1).
JMa3 Fusarium
Fusarium sp.
Warna koloni tampak atas putih, warna koloni
tampak bawah kuning kecokelatan, tekstur
koloni seperti kapas, permukaan koloni
menggunung, pembentukan diameter koloni
mencapai 8 cm dalam 7 hari. Hifa berseptat,
makrokonidia berbentuk sabit berukuran 1520 μm, mikrokonidia berbentuk oval silindris
berukuran 10-15 μm dan memiliki 1 septat
(Gambar 2).
SLbt3 Colletotrichum Colletotrichum sp.
Warna koloni tampak atas putih hitam, warna
koloni tampak bawah putih kuning
kecokelatan, tekstur koloni seperti kapas,
permukaan koloni menggunung, pembentukan
diameter koloni mencapai 4.5 cm dalam 7
hari. Hifa berseptat, konidia berwarna hialin
berbentuk ovoid berukuran 25-30 μm,
apresoria berukuran 30 μm (Gambar 3).
4
Gambar 1 Koloni miselia sterilia (Isolat JBa8) pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi
pada suhu ruang. (A) Koloni tampak atas. (B) Koloni tampak bawah. (a) Hifa septat
perbesaran 1000X.
Gambar 2 Koloni Fusarium sp. pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi pada suhu ruang.
(A) Koloni tampak atas. (B) Koloni tampak bawah. (C) Mikrokonidia dengan medium
lactophenol cotton blue. (D) Makrokonidia. Skala bar C-D = 20 μm.
5
Gambar 3 Koloni Colletotrichum sp. pada media PDA, umur 14 hari setelah inkubasi pada suhu
ruang. (A) Koloni tampak atas. (B) Koloni tampak bawah. (C-D) Apresoria. (E)
Konidia. Skala bar C = 20 μm, D-E = 30 μm.
Identifikasi Molekuler Cendawan
Ketiga isolat cendawan yaitu JBa8,
JMa3, dan SLbt3 berhasil diamplifikasi
dengan menggunakan PCR. Amplifikasi DNA
dari isolat JBa8, JMa3, dan SLbt3 dengan
menggunakan primer ITS1 dan ITS4
menghasilkan amplikon berukuran ~570 bp
(Gambar 4).
Hasil analisis sekuen daerah ITS
dengan program BLAST-N (Lampiran 1-3)
menunjukkan urutan nukleotida isolat JBa8
memiliki persamaan dengan Fusarium solani
strain MTCC 9622 dengan kemiripan sebesar
99%. Isolat JMa3 memiliki persamaan dengan
Fusarium sp. Dzf1 dengan kemiripan sebesar
99% dan isolat SLbt3 memiliki kemiripan
dengan Colletotrichum sp. IP-53 dengan nilai
sebesar 96% (Tabel 2). Nilai E-value atau
nilai Error untuk ketiga isolat adalah 0.0.
~570 bp
Gambar 4
Hasil amplifikasi DNA pada daerah ITS menghasilkan pita berukuran ~570 bp.
(Keterangan M = marker 1 kb DNA ladder, Sumur 1 = JMa3, Sumur 2 = JBa8,
Sumur 3 = SLbt3).
6
Tabel 2 Hasil analisis bioinformatika menggunakan mega BLAST dari NCBI
Skor
Query
Nilai EIsolat
Homologi
No akses
maksimum coverage
value
JBa8
Fusarium solani FJ719812.1
972
99%
0.0
strain MTCC
9622
JMa3 Fusarium sp.
DQ657851.1
1050
99%
0.0
Dzf1
SLbt3 Colletotrichum
DQ780415.1
955
96%
0.0
sp. IP-53
Uji Antagonisme Flora Normal
Berdasarkan
hasil
penapisan
kemampuan
cendawan
endofit
dalam
menghambat E. coli flora normal didapat
bahwa F. solani dan Fusarium sp. tidak
menghasilkan zona hambat terhadap E. coli
flora normal. Hal ini menunjukkan bahwa
isolat tersebut dapat diuji aktivitas
antibakterinya dengan menggunakan uji
antagonis
terhadap
bakteri
patogen.
Sedangkan Colletotrichum sp. menghambat E.
coli flora normal sehingga Colletotrichum sp.
tidak dilakukan uji lanjut terhadap aktivitas
antibakteri pada tahap berikutnya.
Uji Antagonisme Bakteri Patogen
Uji antagonis F. solani dan Fusarium
sp. dilakukan terhadap 4 bakteri patogen
yaitu S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa, dan
EPEC K1-1 (Tabel 3). Dari hasil penapisan
tersebut
didapat
bahwa
F.
solani
menghasilkan zona hambat terhadap EPEC
K1-1, sedangkan Fusarium sp. menghasilkan
zona hambat terhadap B. subtilis dan P.
aeruginosa. Kedua cendawan tersebut
selanjutnya diuji kembali kemampuan
aktivitas antibakterinya terhadap 3 bakteri
patogen sesuai dengan penapisan sebelumnya.
Pengujian ini dilakukan terhadap ekstrak
miselia menggunakan metanol dengan
menggunakan metode difusi agar.
Aktivitas Penghambatan Ekstrak Miselia
Menggunakan Metanol Terhadap Bakteri
dengan Metode Difusi Agar
Hasil uji aktivitas antibakteri dengan
ekstrak miselia menggunakan metanol,
menunjukkan adanya isolat cendawan yang
terbukti mampu menghambat pertumbuhan
bakteri yang ditunjukkan dengan terbentuknya
zona bening pada hari ke-3. Fusarium solani
mampu menghambat pertumbuhan bakteri
EPEC K1-1 (Gambar 5) sedangkan Fusarium
sp. hanya mampu menghambat pertumbuhan
Identitas
maksimum
98%
100%
98%
bakteri P. aeruginosa saja (Gambar 6). Hasil
pengujian daya hambat ekstrak miselia F.
solani (JBa8) menggunakan metanol terhadap
EPEC K1-1 dan ekstrak miselia Fusarium sp.
(JMa3) menggunakan metanol terhadap P.
aeruginosa menghasilkan rata-rata diameter
zona hambat yang sama, yaitu sebesar 12 mm
(Gambar 7; Gambar 8). Kontrol antibiotik
cefotaxime pada konsentrasi 8 μg/mL dan 64
μg/mL terhadap EPEC K1-1 menghasilkan
rata-rata diameter zona hambat secara
berturut-turut sebesar 27.25 mm dan 30.00
mm, sedangkan kontrol antibiotik cefotaxime
pada konsentrasi 8 μg/mL dan 64 μg/mL
terhadap P. aeruginosa menghasilkan rata-rata
diameter zona hambat secara berturut-turut
sebesar 13.75 mm dan 19.00 mm (Lampiran
4-6). Berdasarkan hasil analisis data dengan
menggunakan Independent-Samples T Test
(Lampiran 7), kemampuan pembentukan zona
hambat oleh ekstrak miselia Fusarium sp.
(JMa3) menggunakan metanol terhadap P.
aeruginosa sama (tidak berbeda nyata) dengan
antibiotik cefotaxime 8 μg/mL, sedangkan
kemampuan pembentukan zona hambat oleh
ekstrak miselia Fusarium sp. (JMa3)
menggunakan metanol terhadap P. aeruginosa
dengan antibiotik cefotaxime 64 μg/mL dan
oleh ekstrak miselia Fusarium solani (JBa8)
menggunakan metanol terhadap EPEC K1-1
dengan antibiotik cefotaxime 8 μg/mL dan 64
μg/mL berbeda nyata. Hasil yang berbeda
nyata ini menunjukkan bahwa ekstrak miselia
menggunakan metanol tidak memiliki
kemampuan yang sama atau memiliki
kemampuan yang jauh lebih rendah
dibandingkan dengan kontrol antibiotik
cefotaxime dalam menghambat pertumbuhan
bakteri. Kontrol terhadap pelarut metanol
tidak menunjukkan adanya zona hambat atau
bernilai 0 (nol). Hal ini mengindikasikan
bahwa kontrol yang digunakan tidak
berpengaruh pada uji antibakteri.
.
7
Tabel 3 Hasil penapisan antara miselia cendawan dengan bakteri patogen pada hari ke-3
Kode isolat
JBa8
Aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen
S. aureus
B. subtilis
P. aeruginosa
EPEC K1-1
-
-
-
+
JMa3
+
+
Keterangan : - = tidak terbentuk zona hambat; + = terbentuk zona hambat
-
Gambar 5 (A) Kontrol metanol terhadap EPEC K1-1. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak miselia
Fusarium solani (JBa8) menggunakan metanol terhadap EPEC K1-1. (C) Kontrol
antibiotik cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap EPEC K1-1. (D) Kontrol
antibiotik cefotaxime konsentrasi 64 μg/mL terhadap EPEC K1-1. Pengamatan
dilakukan pada hari ke-3.
Gambar 6
(A) Kontrol metanol terhadap P. aeruginosa. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak
miselia Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol terhadap P. aeruginosa. (C)
Kontrol antibiotik cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap P. aeruginosa. (D)
Kontrol antibiotik cefotaxime konsentrasi 64 μg/mL terhadap P. aeruginosa.
Pengamatan dilakukan pada hari ke-3.
8
a
a
Ekstrak Kasar JBa8
Cefotaxime 8 µg/mL
b
Cefotaxime 64 µg/mL
Metanol
Gambar 7 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium solani (JBa8) terhadap EPEC K1-1.
Kontrol metanol tidak memiliki balok data karena bernilai 0 (nol), garis vertikal di
atas tiap balok data menunjukkan galat baku dan huruf-huruf di atas balok data
menunjukkan pembandingan nilai tengah antar perlakuan berdasarkan uji beda nyata
terkecil pada taraf nyata 0.05.
a
b
b
Ekstrak Kasar JMa3
Cefotaxime 8 µg/mL
Cefotaxime 64 µg/mL
Metanol
Gambar 8 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium sp. (JMa3) terhadap P. aeruginosa.
Kontrol metanol tidak memiliki balok data karena bernilai 0 (nol), garis vertikal di
atas tiap balok data menunjukkan galat baku dan huruf-huruf di atas balok data
menunjukkan pembandingan nilai tengah antar perlakuan berdasarkan uji beda nyata
terkecil pada taraf nyata 0.05.
PEMBAHASAN
Fusarium tergolong cendawan endofit
dengan pertumbuhan cepat dan memiliki
frekuensi kolonisasi yang tinggi pada tanaman
Acorus calamus (Mohanta et al. 2008). Isolat
JBa8 yang teramati secara mikroskopis hanya
menunjukkan hifa berseptat. Isolat ini tidak
membentuk konidium dan struktur yang khas
sehingga sulit untuk diidentifikasi berdasarkan
b
9
pada karakteristik morfologinya saja. Isolat
JMa3 berdasarkan pengamatan morfologi
merupakan Fusarium karena isolat tersebut
memiliki makrokonidia dan mikrokonidia.
Makrokonidia yang teramati pada bagian
kedua ujungnya melengkung dan berbentuk
sabit sedangkan mikrokonidia berbentuk oval
silindris dan memiliki 1 septat. Fusarium
solani merupakan agens hayati yang potensial
dalam menekan kejadian penyakit antraknosa
pada cabai (Istikorini 2008). Namun Fusarium
solani ini dapat juga menjadi cendawan
patogen yang merugikan tanaman, seperti
pada tanaman kentang, buncis, dan kacang
polong yang menyebabkan penyakit busuk
akar (Matuo dan Snyder 1973).
Isolat SLbt3 diisolasi dari organ batang
tanaman obat sambiloto. Isolat tersebut
teridentifikasi secara morfologi sebagai
Colletotrichum sp. yang ditandai dengan
konidia yang berwarna hialin dan berbentuk
ovoid. Cendawan ini merupakan bentuk
anamorf dari genus Glomerella. Miyasyiwi
(2012)
melaporkan
bahwa
genus
Colletotrichum merupakan cendawan endofit
pada tanaman pegagan (Centella asiatica).
Menurut Tan dan Zou (2001), Colletotrichum
sp. yang berendofit dengan tanaman Artemisia
annua dapat menghasilkan senyawa turunan
asam indol 6-isoprenylindole-3-carboxylic
yang dapat digunakan sebagai antibakteri dan
antifungi.
Hasil analisis sekuen daerah ITS
dengan program BLAST-N untuk identifikasi
molekuler ketiga isolat menunjukkan bahwa
isolat JBa8 yang merupakan isolat yang tidak
menghasilkan
konidia
(spora)
dapat
diidentifikasi
secara
molekuler
yaitu
Fusarium solani. Hal ini menunjukkan bahwa
pendekatan molekuler diperlukan untuk isolat
yang tidak membentuk struktur reproduktif.
Isolat JMa3 dan SLbt3 baik secara morfologi
maupun molekuler hanya dapat teridentifikasi
ke tahap genus yaitu Fusarium dan
Colletotrichum. Hal ini menunjukkan bahwa
kedua isolat tersebut memiliki peluang
sebagai spesies baru, karena pada pendekatan
molekuler homologi isolat hanya berada pada
tingkat genus saja dan belum terdeskripsikan.
Colletotrichum sp. tidak digunakan
dalam uji aktivitas antibakteri karena
membunuh E. coli flora normal pada tahap
penapisan awal. E. coli flora normal tidak
boleh dibunuh dalam penelitian ini karena
bertindak sebagai kontrol positif dan juga
karena merupakan strain komensal dalam
koloni manusia, serta diduga berperan dalam
pembentukan vitamin K yang penting untuk
pembekuan darah. Pemilihan pelarut metanol
murni dalam proses maserasi bertujuan untuk
mengekstrak senyawa aktif antibakteri dari
miselia cendawan dalam bentuk ekstrak kasar,
dimana
metanol
berfungsi
untuk
mendenaturasi sel sehingga senyawa aktif
dapat keluar dari sel. Metanol memiliki
kelebihan yaitu dapat menarik senyawa aktif
antibakteri yang bersifat polar lebih banyak
jika dibandingkan dengan pelarut lainnya.
Pada pengujian aktivitas penghambatan
bakteri dengan menggunakan ekstrak miselia
menggunakan metanol, terdapat isolat yang
diuji mampu menghambat pertumbuhan
bakteri, yaitu isolat JBa8 (F. solani) yang
mampu menghambat pertumbuhan EPEC K11, dan isolat JMa3 (Fusarium sp.) yang
mampu menghambat pertumbuhan P.
aeruginosa. Aktivitas antibakteri yang
dimilikinya terlihat dari zona bening yang
terbentuk di sekitar kertas cakram yang berisi
ekstrak miselia menggunakan metanol pada
media agar yang telah diinokulasikan bakteri
uji. F. solani diisolasi dari bagian organ akar
tanaman jati belanda. Tanaman tersebut
diketahui mengandung tanin, kafein, β
sitosterol, friedelin, kaueronic acid, flavonoid
dan saponin (Utomo 2008). Flavonoid telah
diketahui memiliki kemampuan sebagai
antibakteri. Senyawa aktif yang termasuk ke
dalam golongan flavonoid yaitu 5,7,3’,4tetrahidroksiflavon
dan
5,7-dihidroksiisoflavon. Senyawa aktif inilah yang diduga
memiliki aktivitas antibakteri. Fusarium sp.
diisolasi dari bagian akar jahe merah.
Cendawan ini mampu menghambat bakteri P.
aeruginosa. Sasidharan dan Menon (2010)
melaporkan bahwa senyawa utama pada jahe
seperti zingiberene, kemudian diikuti dengan
arcurcumene, germacrene‐D, β‐bisabolene,
dan
β‐sesquiphellandrene
mampu
menghambat aktivitas bakteri P. aeruginosa.
Isolat JBa8 dan JMa3 teridentifikasi
sebagai Fusarium secara molekuler. Mohanta
et al. (2008) melaporkan bahwa ekstrak
Fusarium sp. secara signifikan mampu
menghambat pertumbuhan bakteri gram
positif dan gram negatif, serta efektif dalam
melawan cendawan patogen. Menurut Zhang
et al. (2012), ekstrak Fusarium solani
menggunakan etil asetat yang berendofit pada
tanaman Ficus carica menghasilkan senyawa
fumitremorgin B, fumitremorgin C, asam
helovlic,
bisdethiobis(methylthio)gliotoxin,
bis-N-norgliovictin, dan gliotoxin. Senyawa
ini mampu menghasilkan aktivitas antibakteri
terhadap B. subtilis, S. aureus, E. coli dan P.
aeruginosa, serta memiliki aktivitas antifungi
10
terhadap Candida albicans, Penicillium
chrysogenum dan Aspergillus fumigatus.
Ekstrak miselia Fusarium sp. (JMa3)
menggunakan metanol hanya mampu
menghambat bakteri P. aeruginosa saja,
sedangkan pada bakteri B. subtilis tidak
mampu menghambat. Hal ini dapat terjadi
karena B. subtilis merupakan bakteri gram
positif yang memiliki struktur dinding sel
yang tebal karena kandungan peptidoglikan
yang banyak, sehingga lapisan dinding sel
bakteri tidak dapat ditembus oleh ekstrak
miselia menggunakan metanol. Sebaliknya, P.
aeruginosa merupakan bakteri gram negatif
yang memiliki struktur dinding sel yang tipis
karena kandungan peptidoglikan yang sangat
sedikit, sehingga lapisan dinding sel bakteri
dapat ditembus oleh ekstrak miselia
menggunakan metanol. Menurut Pelczar dan
Chan (1986), penghambatan aktivitas bakteri
dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara
lain gangguan pada senyawa penyusun
dinding
sel,
penghambat
keutuhan
permeabilitas dinding sel bakteri, penghambat
sintesis sel bakteri, dan penghambat sintesis
asam nukleat.
Berdasarkan uji statistik perbandingan
diameter zona hambat antara ekstrak miselia
menggunakan metanol terhadap bakteri uji
dengan antibiotik cefotaxime (Lampiran 7),
menunjukkan bahwa hanya ekstrak miselia
Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol
terhadap P. aeruginosa dengan antibiotik
cefotaxime dengan konsentrasi 8 μg/mL yang
memiliki diameter zona hambat yang tidak
berbeda
nyata
(p>0.05).
Hal
ini
mengindikasikan bahwa ekstrak miselia
Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol
dengan konsentrasi 100 μl memiliki kekuatan
hambatan yang sama dengan antibiotik
cefotaxime pada konsentrasi 8 μg/mL dalam
menghambat pertumbuhan bakteri.
Antibiotik
cefotaxime
digunakan
sebagai pembanding dalam uji aktivitas
antibakteri (kontrol positif) karena tergolong
antibiotik cephalosporins generasi ketiga,
dimana golongan antibiotik cephalosporins
generasi ketiga ini mampu menghambat
aktivitas pertumbuhan Enterobacteriaceae
seperti E. coli enteropatogenik (EPEC) dan
memiliki aktivitas yang kuat terhadap bakteri
P. aeruginosa.
Ekstrak miselia Fusarium sp. (JMa3)
menggunakan metanol mampu menghambat
P. aeruginosa dengan rata-rata diameter zona
hambat sebesar 12.00 mm sedangkan
antibiotik cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL
menghambat P. aeruginosa dengan rata-rata
diameter zona hambat sebesar 13.75 mm.
Diameter zona hambat yang dihasilkan dalam
penelitian ini tergolong kuat. Davis dan Stout
(1971) mengelompokkan antibakteri ke dalam
4 kelompok, yaitu antibakteri dengan aktivitas
rendah, sedang, kuat dan sangat kuat.
Aktivitas rendah jika diameter zona hambat
kurang dari 5 mm; aktivitas sedang jika
diameter zona hambat di antara 5-10 mm;
aktivitas kuat jika diameter zona hambat di
antara 10-20 mm; aktivitas sangat kuat jika
diameter zona hambat lebih dari 20 mm.
Efektivitas antibakteri dipengaruhi oleh
beberapa faktor, antara lain senyawa
antibakteri, suhu, waktu inkubasi, jenis,
jumlah, dan umur bakteri, serta sifat kimia
substrat seperti pH dan kadar air.
SIMPULAN
Isolat JBa8 tidak dapat teridentifikasi
secara morfologi namun secara molekuler
teridentifikasi sebagai Fusarium solani.
Secara morfologi dan molekuler, isolat JMa3
teridentifikasi ke dalam genus Fusarium
sedangkan isolat SLbt3 teridentifikasi ke
dalam genus Colletotrichum. F. solani dan
Fusarium sp. diketahui menghasilkan
senyawa antibakteri. F. solani mampu
menghambat pertumbuhan EPEC K1-1,
sedangkan isolat Fusarium sp. mampu
menghambat P. aeruginosa.
SARAN
Perlu dilakukan
purifikasi
dan
karakterisasi untuk mengetahui identitas
senyawa bioaktif yang terkandung dalam
filtrat cendawan. Selain itu juga perlu
diketahui konsentrasi dari ekstrak kasar
cendawan yang dapat menghambat bakteri uji.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih penulis ucapkan kepada
Proyek Hibah Kerjasama Internasional DIKTI
Tahun 2010 atas nama Dr. Ir. Utut Widyastuti,
M.Si yang telah membiayai penelitian ini.
Terima kasih kepada Dr. Sri Budiarti yang
telah memberikan isolat EPEC K1-1 dan
Laboratorium
Mikrobiologi-Departemen
Biologi FMIPA IPB untuk isolat bakteri uji,
serta kepada Ibu Rohani Cinta Badia Ginting
atas penyediaan isolat cendawan.
11
DAFTAR PUSTAKA
Barnett HL, Hunter BB. 1972. Illustrated
Genera of Imperfect Fungi. Ed ke-3.
Minneapolis (US): Burgess Publishing
Company.
Booth C. 1971. The Genus Fusarium. Kew
(GB):
Commonwealth
Mycological
Institute.
Carroll GC. 1990. Fungal endophytes in
vascular plant. Trans Mycol Soc Jap
31:103-116.
Clay K. 1988. Fungal endophytes of grasses: a
defensive mutualism between plants and
fungi. Ecology 69:1-16.
Davis WW, Stout TR. 1971. Disc plate
method of microbiological antibiotic
assay. Appl Microbiol 22(4):666-670.
[Deptan] Departemen Pertanian, Badan
Penelitian dan Pengembangan Pertanian.
2007. Prospek dan Arah Pengembangan
Agribisnis Tanaman Obat. Ed ke-2.
Jakarta (ID): Departemen Pertanian.
Gardes M, Bruns TD. 1993. ITS primers with
enhanced specificity for basidiomycetes application to the identification of
mycorrhizae and rusts. Mol Ecol 2:113118.
Istikorini Y. 2008. Potensi cendawan endofit
untuk mengendalikan penyakit antraknosa
pada cabai (Capsicum annuum L.)
[disertasi].
Bogor
(ID):
Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Matuo T, Snyder WC. 1973. Use of
morphology and mating populations in the
identification of formae speciales in
Fusarium solani. Phytopathology 63:562565.
Miyasyiwi S. 2012. Identifikasi cendawan
endofit asal daun pegagan (Centella
asiatica) berdasarkan morfologi dan
penanda molekuler daerah ITS (Internal
Transcribed Spacer) [skripsi]. Bogor (ID):
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Mohanta J, Tayung K, Mohapatra UB. 2008.
Antimicrobial potentials of endophytic
fungi inhabiting three Ethno-medicinal
plants Similipal Biosphere Reserve, India.
Inter
J
Microbiol
8(2):181197.doi:10.5580/80b.
Pelczar MJ Jr, Chan ECS. 1986. Dasar-dasar
Mikrobiologi. Volume ke-1. Hadioetomo
RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL,
penerjemah; Jakarta (ID): UI Pr.
Terjemahan
dari:
Elements
of
Microbiology.
Pierce-Hendry SA, Dennis J. 2010. Bacterial
culture and antibiotic susceptibility testing.
Compendium: E1-E5.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular cloning a laboratory manual
(2nd ed). USA (US): Cold Spring Harbor
Laboratory Pr.
Sasidharan I, Menon AM. 2010. Comparative
chemical composition and antimicrobial
activity fresh & dry gingers oils (Zingiber
officinale Roscoe). Int J Curr Pharm Res
2(4):40-43.
Strobel GA, Kluck K, Hess WM, Sears J, Ezra
D, Vargas PN. 2007. Muscodor albus E-6,
an endophyte of Guazuma ulmifolia
making volatile antibiotics: isolation,
characterization
and
experimental
establishment in the host plant. Microbiol
153:26132620.doi:10.1099/mic.0.2007/008912-0.
Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: a rich
source of functional metabolites. Nat Prod
Rep 18:448–459. doi:10.1039/B100918O.
Tejavathi DH, Anitha P, Murthy SM,
Nijagunaiah R. 2011. Effect of AM fungal
association
with
normal
and
micropropagated plants of Andrographis
paniculata Nees on biomass, primary and
secondary metabolites. Int Res J Plant Sci
2(12):338-348.
Utomo AW. 2008. Uji toksisitas akut ekstrak
alkohol daun jati belanda (Guazuma
ulmifolia Lamk.) pada tikus wistar
[skripsi]. Semarang (ID): Fakultas
Kedokteran, Universitas Diponegoro.
Weir BS, Johnston PR, Damm U. 2012. The
Colletotrichum gloeosporioides species
complex.
Stud
Mycol
73:115180.doi:10.3114/sim0011.
Zhang H, Ma Y, Liu R. 2012. Antimicrobial
additives
from
endophytic
fungus
Fusarium solani of Ficus carica. Appl
Mech
Mat
5:178181.doi:10.4028/www.scientific.net/AMM
.178-181.783
LAMPIRAN
13
Lampiran 1 Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JBa8
Urutan nukleotida daerah ITS 1 (forward) dan ITS 4 (reverse)
CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTG
TGAACATACCTAAACGTTGCTTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGCC
CCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAAACAAGCA
AATGAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG
CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACG
CACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCT
CAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAGCCCTCCGCGGGCACACGCCGTC
CCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGC
AACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCCAACTTCTGAACGTTGACCTCG
AATCAGGTAGATATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI
Fusarium solani strain MTCC 9622 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal
transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete
sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
GenBank: FJ719812.1
LOCUS
FJ719812
594 bp DNA linear PLN 03-AUG-2010
DEFINITION Fusarium solani strain MTCC 9622 18S ribosomal RNA gene, partial
sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene,
and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S
ribosomal RNA gene, partial sequence.
ACCESSION FJ719812
VERSION FJ719812.1 GI:224551656
KEYWORDS .
SOURCE
Fusarium solani
ORGANISM Fusarium solani
Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Pezizomycotina;
Sordariomycetes; Hypocreomycetidae; Hypocreales; Nectriaceae;
mitosporic Nectriaceae; Fusarium; Fusarium solani species complex.
REFERENCE 1 (bases 1 to 594)
AUTHORS Tayung,K., Barik,B.P. and Jha,D.K.
TITLE Antifungal activity and biocontrol potential of metabolite produced
by an endophytic Fusarium (MTCC-9622) against some postharvest
pathogens
JOURNAL Agric Technol (Thail) 6 (3), 409-419 (2010)
REFERENCE 2 (bases 1 to 594)
AUTHORS Tayung,K., Barik,B.P. and Shenoy,B.D.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (11-FEB-2009) Department of Botany and Bioinformatics,
North Orissa University, Sriram Chandra Vihar, Takatpur, Baripada,
Orissa 757003, India
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..594
/organism="Fusarium solani"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="MTCC 9622"
/isolation_source="plant"
/db_xref="taxon:169388"
/country="India"
misc_RNA
594
/note="contains 18S ribosomal RNA, internal transcribed
14
spacer 1, 5.8S ribosomal RNA, internal transcribed spacer
2, and 28S ribosomal RNA"
ORIGIN
1 tggaagtaaa agtcgtaaca aggtctccgt tggtgaacca gcggagggat cattaccgag
61 ttatacaact catcaaccct gtgaacatac ctaaaacgtt gcctcggcgg gaacagacgg
121 ccccgtaaca cgggccgccc ccgccagagg accccctaac tctgtttcta taatgtttct
181 tctgagtaaa caagcaaata aattaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctggcatc
241 gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg
301 aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagt attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca
361 ttacaaccct caggcccccg ggcctggcgt tggggatcgg cggaagcccc ctgcgggcac
421 aacgccgtcc cccaaataca gtggcggtcc cgccgcagct tccattgcgt agtagctaac
481 acctcgcaac tggagagcgg cgcggccacg ccgtaaaaca cccaacttct gaatgttgac
541 ctcgaatcag gtaggaatac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaa
//
15
Lampiran 2 Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JMa3
Urutan nukleotida daerah ITS 1 (forward) dan ITS 4 (reverse)
CCTTCCGTAGGTGAACCT
OBAT DAN PENAPISAN POTENSINYA SEBAGAI
ANTIBAKTERI
GINA KUSUMA INTANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ABSTRAK
GINA KUSUMA INTANI. Identifikasi Cendawan Endofit Asal Tanaman Obat dan Penapisan
Potensinya sebagai Antibakteri. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan NAMPIAH
SUKARNO.
Cendawan endofit merupakan mikroorganisme yang hidup dalam jaringan tumbuhan tanpa
merugikan tanaman inangnya. Cendawan endofit dapat ditemukan pada berbagai tumbuhan
termasuk tanaman obat dan diketahui dapat menghasilkan berbagai senyawa bioaktif seperti
antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi tiga isolat cendawan endofit yaitu
isolat JBa8, isolat JMa3, dan isolat SLbt3 asal tanaman obat dan penapisan potensinya sebagai
penghasil senyawa antibakteri. Identifikasi cendawan dilakukan berdasarkan karakter morfologi
dan molekuler menggunakan daerah ITS rDNA. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enteropathogenic Escherichia
coli (EPEC) K1-1, dan E. coli flora normal menggunakan uji antagonisme dan metode difusi agar
menggunakan ekstrak cendawan yang diperoleh dari miselia menggunakan metanol sebagai
pelarut. Pengamatan dilakukan pada hari ke-3, ke-7, ke-10, dan ke-14 setelah inkubasi dengan
mengukur zona hambat di sekitar koloni. Ketiga isolat teridentifikasi sebagai Fusarium solani
untuk JBa8, Fusarium sp. untuk JMa3, dan Colletotrichum sp. untuk SLbt3. Sebanyak dua isolat
memiliki aktivitas antibakteri. Fusarium solani yang diisolasi dari jati belanda (Guazuma
ulmifolia) mampu menghambat pertumbuhan EPEC K1-1 dengan diameter zona hambat sebesar
12 mm. Aktivitas antibakteri Fusarium solani lebih rendah dari antibiotik cefotaxime sebagai
kontrol positif. Fusarium sp. yang diisolasi dari jahe merah (Zingiber officinale) mampu
menghambat pertumbuhan P. aeruginosa dengan diameter zona hambat sebesar 12 mm. Aktivitas
antibakteri Fusarium sp. sama dengan antibiotik cefotaxime 8 μg/mL. Sedangkan Colletotrichum
sp. yang diisolasi dari sambiloto (Andrographis paniculata) tidak memiliki aktivitas antibakteri.
Kata kunci: antibakteri, cendawan endofit, identifikasi, tanaman obat.
ABSTRACT
GINA KUSUMA INTANI. Identification of Endophytic Fungi from Medicinal Plants and
Screening Their Potency as Antibacterial Agent. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and
NAMPIAH SUKARNO.
Endophytic fungi are microorganisms living in plant tissue without causing any harm to its
host. The fungi can be found in all plants including medicinal plants. Endophytic fungi produced
variety of bioactive compounds such as antibacterial substances. This research aimed to identify 3
isolates of endophytic fungi JBa8, JMa3, and SLbt3 which were isolated from medicinal plants
and to screen their potency as source of antibacterial compounds. Identification of endophytic
fungi was performed based on morphological characteristics and DNA barcode using ITS region.
Antibacterial test was conducted against Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1-1, and microflora E. coli by
antagonism technique and agar diffusion method using mycelia extract with methanol solvent. The
inhibition activity of fungal extract on bacterial tested was observed on the day 3rd, 7th, 10th, and
14th after incubation by measuring clear zone around the colonies. The 3 isolates were tentatively
identified as Fusarium solani for JBa8, Fusarium sp. for JMa3, and Colletotrichum sp. for SLbt3.
Antibacterial activities were observed in F. solani and Fusarium sp. which were isolated from jati
belanda (Guazuma ulmifolia) and jahe merah (Zingiber officinale), respectively. F. solani inhibited
the growth of EPEC K1-1, whereas Fusarium sp. suppressed P. aeruginosa with clear zone
produced was 12 mm. Fusarium sp. had antibacterial activity similar with that of 8 μg/mL
cefotaxime positive control. The F. solani antibacterial activity, however, was lower than the two
positive control concentrations used. Colletotrichum sp. isolated from sambiloto (Andrographis
paniculata) did not have any antibacterial to all bacteria tested.
Key words: antibacteria, endophytic fungi, identification, medicinal plant.
3
IDENTIFIKASI CENDAWAN ENDOFIT ASAL TANAMAN
OBAT DAN PENAPISAN POTENSINYA SEBAGAI
ANTIBAKTERI
GINA KUSUMA INTANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul
Nama
NIM
: Identifikasi Cendawan Endofit Asal Tanaman Obat dan Penapisan
Potensinya sebagai Antibakteri
: Gina Kusuma Intani
: G34080105
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si
NIP. 19640517 198903 2001
Dr. Ir. Nampiah Sukarno
NIP. 19590504 198703 2001
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
NIP. 19641002 198903 1002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini sebagai syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Sains Departemen Biologi FMIPA IPB. Judul penelitian yang dilakukan
oleh penulis adalah Identifikasi Cendawan Endofit Asal Tanaman Obat dan Penapisan Potensinya
sebagai Antibakteri. Terima kasih penulis ucapkan kepada Proyek Hibah Kerjasama Internasional
DIKTI Tahun 2010 yang telah memberikan dana kepada Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan terima
kasih juga kepada Dr. Sri Budiarti yang telah memberikan isolat EPEC K1-1 dan Laboratorium
Mikrobiologi-Departemen Biologi FMIPA IPB untuk isolat bakteri uji, serta PPSHB-IPB atas
fasilitas penelitian yang diberikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan Ibu Dr. Ir.
Nampiah Sukarno selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, motivasi, dan
saran kepada penulis selama penyelesaian karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Dr. Ir. Raden Roro Dyah Perwitasari, M.Sc selaku dosen penguji yang telah
banyak memberikan saran dan masukan untuk perbaikan penulisan karya ilmiah ini.
Ucapan terima kasih juga ingin disampaikan kepada Ibu, Bapak, Ka Finsa Giovani, dan
Mochamad Nasodikin atas doa, perhatian, dan segala dukungan. Terima kasih penulis sampaikan
kepada Rani, Ipeh, dan Nurul teman seperjuangan dalam penelitian ini, Biorin Crew, Mba Pepi, Bu
Cinta, Pak Mulya, Pak Yanto, Ka Fajri, Mba Nurul, Ka Delih, Ka Fani, Ka Istha, Azizah, Puspa,
Nia, Inggit, Aldi, Dyah, Satriaji, teman-teman Wisma Pelangi dan teman-teman Biologi 45 yang
telah membantu selama berlangsungnya kegiatan karya ilmiah.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juni 2013
Gina Kusuma Intani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 November 1990 dari ayah H. Sagino dan ibu
Hj. Ina M. Pieter. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Penulis lulus dari SMA
Negeri 1 Pamulang pada tahun 2008 dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui
jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN). Penulis masuk dalam Program
Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi
Dasar Tingkat Persiapan Bersama IPB pada tahun ajaran 2011/2012 dan 2012/2013, mata kuliah
Genetika Molekuler pada tahun ajaran 2012/2013, dan mata kuliah Ilmu Lingkungan pada tahun
ajaran 2012/2013. Penulis aktif di beberapa organisasi, diantaranya sebagai Staf UKM UKF IPB
(Uni Konservasi Fauna IPB) sejak tahun 2008 hingga sekarang, Staf Himabio (Himpunan
Mahasiswa Biologi) pada tahun 2009-2010, menjadi Kepala Divisi Konservasi Eksitu pada
periode 2010/2011, serta menjadi panitia dan MC (Master of Ceremony) di berbagai kegiatan.
Pada tahun 2011 penulis mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa dalam bidang Pengabdian
Masyarakat dengan judul program “Pelestari Lingkungan Cilik” dan berhasil didanai DIKTI.
Pada tahun 2010, penulis melakukan Studi Lapang di Taman Wisata Alam Pangandaran
Ciamis, Jawa Barat dengan judul laporan “Bakteri Metanotrof”. Pada tahun 2011, penulis
melakukan Praktik Kerja Lapang di PT. Alam Desa Tapos dari bulan Juli sampai bulan Agustus
dengan judul laporan “Budidaya Buah Melon di PT. Alam Desa Tapos ”.
Sebagai salah satu syarat kelulusan studi di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, penulis melaksanakan penelitian yang berjudul “Identifikasi Cendawan Endofit Asal
Tanaman Obat dan Penapisan Potensinya sebagai Antibakteri” di bawah bimbingan Ibu Dr. Ir.
Utut Widyastuti, M.Si dan Ibu Dr. Ir. Nampiah Sukarno.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ....................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................................viii
PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1
Latar Belakang ........................................................................................................................ 1
Tujuan Penelitian .................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1
Waktu dan Tempat .................................................................................................................. 1
Bahan dan Alat........................................................................................................................ 1
Metode Penelitian ................................................................................................................... 1
Identifikasi Morfologi Cendawan ............................................................................................ 1
Identifikasi Cendawan Secara Molekuler ................................................................................ 1
Produksi Miselia ................................................................................................................. 1
Isolasi DNA Genom, Amplifikasi, dan Visualisasi Amplikon .............................................. 2
Sekuensing DNA dan Analisis Sekuen ................................................................................ 2
Penapisan Potensi Senyawa Antibakteri ................................................................................... 2
Uji Antagonisme Flora Normal dan Bakteri Patogen ........................................................... 2
Ekstraksi Miselia Cendawan ............................................................................................... 2
Aktivitas Penghambatan Bakteri Patogen dengan Metode Difusi Agar ................................. 2
Analisis Data........................................................................................................................... 3
HASIL ........................................................................................................................................ 3
Identifikasi Morfologi Cendawan ............................................................................................ 3
Identifikasi Molekuler Cendawan ............................................................................................ 5
Uji Antagonisme Flora Normal................................................................................................ 6
Uji Antagonisme Bakteri Patogen ............................................................................................ 6
Aktivitas Penghambatan Ekstrak Miselia Menggunakan Metanol Terhadap Bakteri dengan
Metode Difusi Agar................................................................................................................. 6
PEMBAHASAN.......................................................................................................................... 8
SIMPULAN .............................................................................................................................. 10
SARAN ..................................................................................................................................... 10
UCAPAN TERIMA KASIH ...................................................................................................... 10
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................ 11
LAMPIRAN .............................................................................................................................. 12
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Karakteristik koloni, makroskopis dan mikroskopis cendawan endofit pada tingkat genus ........ 3
2 Hasil analisis bioinformatika menggunakan mega BLAST dari NCBI ...................................... 6
3 Hasil penapisan antara miselia cendawan dengan bakteri patogen pada hari ke-3 ...................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Koloni miselia sterilia (Isolat JBa8) pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi pada suhu
ruang. ..................................................................................................................................... 4
2 Koloni Fusarium sp. pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi pada suhu ruang ............. 4
3 Koloni Colletotrichum sp. pada media PDA, umur 14 hari setelah inkubasi pada suhu ruang ... 5
4 Hasil amplifikasi DNA pada daerah ITS menghasilkan pita berukuran ~570 bp. ...................... 5
5 (A) Kontrol metanol terhadap EPEC K1-1. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak miselia
Fusarium solani (JBa8) menggunakan metanol terhadap EPEC K1-1. (C) Kontrol antibiotik
cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap EPEC K1-1. (D) Kontrol antibiotik cefotaxime
konsentrasi 64 μg/mL terhadap EPEC K1-1. ........................................................................... 7
6 (A) Kontrol metanol terhadap P. aeruginosa. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak miselia
Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol terhadap P. aeruginosa. (C) Kontrol antibiotik
cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap P. aeruginosa. (D) Kontrol antibiotik cefotaxime
konsentrasi 64 μg/mL terhadap P. aeruginosa. ........................................................................ 7
7 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium solani (JBa8) terhadap EPEC K1-1..................... 8
8 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium sp. (JMa3) terhadap P. aeruginosa ..................... 8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JBa8 .................................................................... 13
Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JMa3 ................................................................... 15
Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan SLbt3 ................................................................... 17
Diameter zona hambat ekstrak miselia menggunakan metanol pada hari ketiga. ..................... 19
Diameter zona hambat cefotaxime dengan konsentrasi 8 μg/mL pada hari ketiga ................... 19
Diameter zona hambat cefotaxime dengan konsentrasi 64 μg/mL pada hari ketiga.................. 19
Analisis statistik perbandingan diameter zona hambat ekstrak miselia menggunakan metanol
terhadap bakteri uji dengan antibiotik cefotaxime .................................................................. 20
8 Komposisi media LBA ......................................................................................................... 22
9 Komposisi media LBB ......................................................................................................... 22
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cendawan
endofit
merupakan
mikroorganisme yang hidup dalam jaringan
organisme seperti tumbuhan, hidup pada
bagian daun, bunga, ranting ataupun akar
tumbuhan (Clay 1988); dan cendawan ini
mampu hidup dengan membentuk koloni
dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan
tanaman inangnya (Carroll 1990). Setiap
tanaman tingkat tinggi dapat mengandung
beberapa mikroba, salah satunya cendawan
endofit yang mampu menghasilkan senyawa
bioaktif atau metabolit sekunder (Tan dan Zou
2001). Metabolit sekunder yang dihasilkan
dari cendawan endofit ini dapat berupa
senyawa antibakteri, antifungi, antikanker,
antivirus, antidiabetes, dan insektisida. Oleh
sebab itu, cendawan endofit yang berpotensi
menghasilkan senyawa antibakteri dapat
dimanfaatkan sebagai agen pengendali bakteri
patogen.
Cendawan endofit dapat ditemukan
pada tanaman obat seperti jati belanda
(Guazuma ulmifolia) (Strobel et al. 2007),
jahe merah (Zingiber officinale), dan
sambiloto
(Andrographis
paniculata)
(Tejavathi et al. 2011) yang merupakan
tanaman obat potensial untuk dikembangkan
sebagai sumber herbal untuk pengobatan dan
pemeliharaan kesehatan (Deptan 2007).
Cendawan endofit asal tanaman obat
sangat besar manfaatnya sebagai sumber
penghasil antibakteri, namun belum banyak
penelitian terhadap cendawan endofit di
Indonesia. Oleh karena itu dilakukan
penelitian mengenai cendawan endofit asal
tanaman obat Indonesia. Kebanyakan
cendawan endofit sedikit menghasilkan spora
bahkan tidak menghasilkan spora sama sekali.
Hal ini yang menjadi kendala untuk proses
identifikasi spesies secara morfologi, sehingga
identifikasi secara molekuler perlu dilakukan
untuk penentuan spesies.
Identifikasi cendawan secara molekuler
menggunakan daerah ITS rDNA karena
merupakan salah satu daerah yang paling
umum digunakan untuk penanda molekuler
cendawan. Daerah ITS bersifat konservatif,
memiliki variabilitas yang sangat tinggi yang
spesifik takson, dan mempunyai jumlah
ulangan yang tinggi (Gardes dan Bruns 1993).
Tujuan Penelitian
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengidentifikasi cendawan endofit asal
tanaman obat dan penapisan potensinya
sebagai penghasil senyawa antibakteri.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan
Januari 2012 sampai dengan Desember 2012
di Laboratorium BIORIN, PPSHB-IPB.
Bahan dan Alat
Bahan
yang
digunakan
dalam
penelitian ini antara lain isolat cendawan
endofit asal jahe merah (JMa3), jati belanda
(JBa8), dan sambiloto (SLbt3) yang
merupakan koleksi PPSHB dan bagian
Mikologi IPB; isolat bakteri seperti
Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Enteropathogenic
Escherichia coli (EPEC) K1-1, dan bakteri
Escherichia coli flora normal yang merupakan
koleksi
Laboratorium
MikrobiologiDepartemen Biologi FMIPA IPB. Alat yang
digunakan adalah perangkat elektroforesis dan
mesin PCR, laminar air flow cabinet (LAFC),
rotary vacuum evaporator, dan mikroskop.
Metode Penelitian
Identifikasi Morfologi Cendawan
Identifikasi cendawan secara morfologi
dilakukan dengan mengamati beberapa
karakter morfologi dari struktur somatik dan
reproduktif baik secara makroskopis maupun
secara mikroskopis. Pengamatan makroskopis
yang dilakukan meliputi: (1) warna koloni, (2)
warna balik koloni, (3) tekstur, dan (4)
diameter koloni. Pengamatan struktur
mikroskopis
dilakukan
terhadap hifa,
konidiofor
dan
konidia.
Identifikasi
berdasarkan kunci identifikasi menurut
Barnett dan Hunter (1972), Booth (1971), dan
Weir et al. (2012)
Identifikasi Cendawan Secara Molekuler
Produksi Miselia. Isolat cendawan
terlebih dahulu diremajakan dalam media
padat potato dextrose agar (PDA) Difco lalu
ditumbuhkan dalam media cair potato
dextrose broth (PDB) dan diagitasi pada suhu
ruang selama 7 hari. Miselia dipanen dengan
cara menyaring biomassa di atas kertas saring
steril menggunakan pompa vakum. Biomassa
ini selanjutnya digunakan untuk isolasi DNA
genom.
2
Isolasi DNA Genom, Amplifikasi,
dan Visualisasi Amplikon. Isolasi DNA
genom dilakukan berdasarkan metode CTAB
menurut Sambrook et al. (1989) yang telah
dimodifikasi yaitu tanpa penambahan β
mercapto ethanol. DNA genom hasil isolasi
digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi
DNA menggunakan primer universal, yaitu
ITS1 (5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG G
3’) dan ITS4 (5’TCC TCC GCT TAT TGA
TAT GC 3’). Reaksi PCR dilakukan dengan
total reaksi 10 µl terdiri dari 1 µl DNA
genomik [100 ng/µl], 0.3 µl untuk setiap
primer [1 pmol], 1 µl dNTP 2 mM, 0.2 µl
enzim taq DNA polymerase [5U/µl], 1 µl
buffer 10x dan 6.2 µl ddH2O. Kondisi PCR
untuk ITS adalah: denaturasi pra-PCR 95oC
selama 5 menit, denaturasi 94oC selama 30
detik, penempelan primer 52oC selama 30
detik, pemanjangan DNA 72oC selama 1
menit, siklus diulangi sebanyak 35 kali,
pemanjangan pasca PCR 72oC selama 5 menit
dan proses pendinginan dilakukan pada suhu
25oC selama 10 menit. Hasil PCR
dimigrasikan pada 1% gel agarosa dan
divisualisasi di atas UV-Transluminator
dengan pewarnaan Ethidium Bromide 0.5
mg/l.
Sekuensing DNA dan Analisis
Sekuen. Sekuensing produk PCR dilakukan
oleh PT. Genetika Science Indonesia. Hasil
sekuen dianalisis menggunakan perangkat
BioEdit dan disejajarkan menggunakan
Clustal W. Sekuen yang telah disejajarkan
kemudian dibandingkan dengan data pada
GenBank menggunakan program BLAST-N
(Basic Local Alignment Search Tool
Nucleotide) dari situs NCBI (National Center
for Biotechnology Information) untuk
menentukan homologi dari isolat yang
dianalisis.
Penapisan Potensi Senyawa Antibakteri
Uji Antagonisme Flora Normal dan
Bakteri Patogen. Penapisan potensi senyawa
antibakteri pertama kali dilakukan dengan
melakukan uji antagonisme antara isolat
cendawan secara kultur dengan E. coli flora
normal. Isolat cendawan yang tidak
membunuh atau menghasilkan zona hambat
pada flora normal selanjutnya akan ditapis
kemampuannya terhadap empat bakteri
patogen, yaitu S. aureus dan B. subtilis yang
mewakili bakteri gram positif, dan P.
aeruginosa dan EPEC K1-1 yang mewakili
bakteri gram negatif melalui mekanisme uji
antagonisme. Sedangkan isolat cendawan
yang menghasilkan zona hambat pada flora
normal tidak digunakan untuk melakukan uji
aktivitas antibakteri. Isolat cendawan yang
mampu
membunuh
bakteri
patogen
selanjutnya akan dilakukan uji aktivitas
antibakteri dengan metode difusi agar
menggunakan ekstrak miselia menggunakan
metanol yang diharapkan agar metabolit
sekunder berupa senyawa aktif dari cendawan
dapat membunuh bakteri patogen.
Ekstraksi Miselia Cendawan. Isolat
cendawan endofit ditumbuhkan di dalam 100
ml media PDB dan diinkubasi pada suhu 28oC
selama dua minggu dengan agitasi pada 120
rpm. Untuk mendapatkan ekstrak kasar,
biomassa miselia cendawan dipisahkan dari
media dengan cara filtrasi menggunakan
kertas saring. Biomassa dibekukan dengan
menambah nitrogen cair lalu dihaluskan
sampai berbentuk tepung menggunakan
mortar steril; kemudian ekstraksi miselia
cendawan dilakukan dengan cara maserasi,
yaitu dengan merendam seluruh biomassa
miselia cendawan dalam pelarut metanol
murni di dalam botol, sampai terendam
seluruhnya selama ± 24 jam dan kemudian
disaring dengan kertas penyaring. Residu
kembali dimaserasi lagi dengan cara yang
sama. Proses tersebut diulangi sebanyak 3
kali. Ekstrak hasil maserasi ditampung
menjadi satu dan diuapkan untuk memisahkan
pelarutnya. Penguapan dilakukan dengan
menggunakan alat rotary vacuum evaporator
pada suhu 40°C sampai pelarut habis
menguap sehingga didapatkan ekstrak miselia
menggunakan metanol.
Aktivitas Penghambatan Bakteri
Patogen dengan Metode Difusi Agar.
Bakteri ditumbuhkan dalam 4 ml media luria
bertani broth (LBB) dan diinkubasi selama 24
jam kemudian diukur kepadatan selnya
dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 600 nm. Sebanyak 50 µl
biakan bakteri dengan kepadatan 105-108
CFU/ml dituang pada permukaan media padat
luria bertani agar (LBA). Setelah itu, kertas
cakram steril berdiameter 10 mm diletakkan
di atas permukaan media LBA dan ekstrak
miselia menggunakan metanol diteteskan ke
atas cakram sebanyak 100 µl. Kultur
diinkubasi pada suhu 37oC pada 3 hari
pertama, kemudian dipindahkan ke suhu
ruang untuk pengamatan zona hambat.
Kontrol antibiotik cefotaxime
dengan
konsentrasi 8 μg/mL dan 64 μg/mL digunakan
sebagai pembanding dalam uji aktivitas
antibakteri. Konsentrasi 8 μg/mL digunakan
untuk melihat kerentanan bakteri sedangkan
konsentrasi 64 μg/mL digunakan untuk
3
melihat keresistenan bakteri (Pierce dan
Dennis
2010).
Kemampuan
senyawa
antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona
hambat di sekitar koloni bakteri. Pengamatan
zona hambat dilakukan pada hari ke-3, ke-7,
ke-10 dan ke-14.
HASIL
Identifikasi Morfologi Cendawan
Identifikasi cendawan secara morfologi
dilakukan meliputi pengamatan makroskopis
maupun secara mikroskopis (Tabel 1).
Berdasarkan hasil identifikasi morfologi,
terdapat 2 genus cendawan dari 3 isolat
Analisis Data
cendawan yang digunakan. Dua genus
Data yang diperoleh berupa diameter
tersebut adalah Fusarium dan Colletotrichum
zona hambat dan dianalisis dengan metode
yang
masing-masing dimiliki oleh isolat JMa3
Independent-Samples T Test pada tingkat
dan
SLbt3.
Isolat JBa8 merupakan koloni
kepercayaan 95% dan taraf α = 0.05 dengan
miselia sterilia karena tidak dijumpai adanya
program SPSS 9.0.
struktur reproduktif seperti tidak terbentuknya
konidium sehingga tidak dapat teridentifikasi.
Tabel 1 Karakteristik koloni, makroskopis dan mikroskopis cendawan endofit pada tingkat genus
Kode
Nama genus
Spesies
Ciri makroskopis dan mikroskopis koloni
isolat
JBa8
Tidak
dapat Miselia sterilia
Warna koloni tampak atas putih kekuningan,
teridentifikasi
warna koloni tampak bawah kuning, tekstur
(miselia
koloni seperti kapas, pembentukan diameter
sterilia)
koloni mencapai 6 cm dalam 7 hari. Hifa
cendawan berseptat berwarna hialin dan tidak
dijumpai adanya konidia sehingga tidak dapat
diidentifikasi secara morfologi (Gambar 1).
JMa3 Fusarium
Fusarium sp.
Warna koloni tampak atas putih, warna koloni
tampak bawah kuning kecokelatan, tekstur
koloni seperti kapas, permukaan koloni
menggunung, pembentukan diameter koloni
mencapai 8 cm dalam 7 hari. Hifa berseptat,
makrokonidia berbentuk sabit berukuran 1520 μm, mikrokonidia berbentuk oval silindris
berukuran 10-15 μm dan memiliki 1 septat
(Gambar 2).
SLbt3 Colletotrichum Colletotrichum sp.
Warna koloni tampak atas putih hitam, warna
koloni tampak bawah putih kuning
kecokelatan, tekstur koloni seperti kapas,
permukaan koloni menggunung, pembentukan
diameter koloni mencapai 4.5 cm dalam 7
hari. Hifa berseptat, konidia berwarna hialin
berbentuk ovoid berukuran 25-30 μm,
apresoria berukuran 30 μm (Gambar 3).
4
Gambar 1 Koloni miselia sterilia (Isolat JBa8) pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi
pada suhu ruang. (A) Koloni tampak atas. (B) Koloni tampak bawah. (a) Hifa septat
perbesaran 1000X.
Gambar 2 Koloni Fusarium sp. pada media PDA, umur 7 hari setelah inkubasi pada suhu ruang.
(A) Koloni tampak atas. (B) Koloni tampak bawah. (C) Mikrokonidia dengan medium
lactophenol cotton blue. (D) Makrokonidia. Skala bar C-D = 20 μm.
5
Gambar 3 Koloni Colletotrichum sp. pada media PDA, umur 14 hari setelah inkubasi pada suhu
ruang. (A) Koloni tampak atas. (B) Koloni tampak bawah. (C-D) Apresoria. (E)
Konidia. Skala bar C = 20 μm, D-E = 30 μm.
Identifikasi Molekuler Cendawan
Ketiga isolat cendawan yaitu JBa8,
JMa3, dan SLbt3 berhasil diamplifikasi
dengan menggunakan PCR. Amplifikasi DNA
dari isolat JBa8, JMa3, dan SLbt3 dengan
menggunakan primer ITS1 dan ITS4
menghasilkan amplikon berukuran ~570 bp
(Gambar 4).
Hasil analisis sekuen daerah ITS
dengan program BLAST-N (Lampiran 1-3)
menunjukkan urutan nukleotida isolat JBa8
memiliki persamaan dengan Fusarium solani
strain MTCC 9622 dengan kemiripan sebesar
99%. Isolat JMa3 memiliki persamaan dengan
Fusarium sp. Dzf1 dengan kemiripan sebesar
99% dan isolat SLbt3 memiliki kemiripan
dengan Colletotrichum sp. IP-53 dengan nilai
sebesar 96% (Tabel 2). Nilai E-value atau
nilai Error untuk ketiga isolat adalah 0.0.
~570 bp
Gambar 4
Hasil amplifikasi DNA pada daerah ITS menghasilkan pita berukuran ~570 bp.
(Keterangan M = marker 1 kb DNA ladder, Sumur 1 = JMa3, Sumur 2 = JBa8,
Sumur 3 = SLbt3).
6
Tabel 2 Hasil analisis bioinformatika menggunakan mega BLAST dari NCBI
Skor
Query
Nilai EIsolat
Homologi
No akses
maksimum coverage
value
JBa8
Fusarium solani FJ719812.1
972
99%
0.0
strain MTCC
9622
JMa3 Fusarium sp.
DQ657851.1
1050
99%
0.0
Dzf1
SLbt3 Colletotrichum
DQ780415.1
955
96%
0.0
sp. IP-53
Uji Antagonisme Flora Normal
Berdasarkan
hasil
penapisan
kemampuan
cendawan
endofit
dalam
menghambat E. coli flora normal didapat
bahwa F. solani dan Fusarium sp. tidak
menghasilkan zona hambat terhadap E. coli
flora normal. Hal ini menunjukkan bahwa
isolat tersebut dapat diuji aktivitas
antibakterinya dengan menggunakan uji
antagonis
terhadap
bakteri
patogen.
Sedangkan Colletotrichum sp. menghambat E.
coli flora normal sehingga Colletotrichum sp.
tidak dilakukan uji lanjut terhadap aktivitas
antibakteri pada tahap berikutnya.
Uji Antagonisme Bakteri Patogen
Uji antagonis F. solani dan Fusarium
sp. dilakukan terhadap 4 bakteri patogen
yaitu S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa, dan
EPEC K1-1 (Tabel 3). Dari hasil penapisan
tersebut
didapat
bahwa
F.
solani
menghasilkan zona hambat terhadap EPEC
K1-1, sedangkan Fusarium sp. menghasilkan
zona hambat terhadap B. subtilis dan P.
aeruginosa. Kedua cendawan tersebut
selanjutnya diuji kembali kemampuan
aktivitas antibakterinya terhadap 3 bakteri
patogen sesuai dengan penapisan sebelumnya.
Pengujian ini dilakukan terhadap ekstrak
miselia menggunakan metanol dengan
menggunakan metode difusi agar.
Aktivitas Penghambatan Ekstrak Miselia
Menggunakan Metanol Terhadap Bakteri
dengan Metode Difusi Agar
Hasil uji aktivitas antibakteri dengan
ekstrak miselia menggunakan metanol,
menunjukkan adanya isolat cendawan yang
terbukti mampu menghambat pertumbuhan
bakteri yang ditunjukkan dengan terbentuknya
zona bening pada hari ke-3. Fusarium solani
mampu menghambat pertumbuhan bakteri
EPEC K1-1 (Gambar 5) sedangkan Fusarium
sp. hanya mampu menghambat pertumbuhan
Identitas
maksimum
98%
100%
98%
bakteri P. aeruginosa saja (Gambar 6). Hasil
pengujian daya hambat ekstrak miselia F.
solani (JBa8) menggunakan metanol terhadap
EPEC K1-1 dan ekstrak miselia Fusarium sp.
(JMa3) menggunakan metanol terhadap P.
aeruginosa menghasilkan rata-rata diameter
zona hambat yang sama, yaitu sebesar 12 mm
(Gambar 7; Gambar 8). Kontrol antibiotik
cefotaxime pada konsentrasi 8 μg/mL dan 64
μg/mL terhadap EPEC K1-1 menghasilkan
rata-rata diameter zona hambat secara
berturut-turut sebesar 27.25 mm dan 30.00
mm, sedangkan kontrol antibiotik cefotaxime
pada konsentrasi 8 μg/mL dan 64 μg/mL
terhadap P. aeruginosa menghasilkan rata-rata
diameter zona hambat secara berturut-turut
sebesar 13.75 mm dan 19.00 mm (Lampiran
4-6). Berdasarkan hasil analisis data dengan
menggunakan Independent-Samples T Test
(Lampiran 7), kemampuan pembentukan zona
hambat oleh ekstrak miselia Fusarium sp.
(JMa3) menggunakan metanol terhadap P.
aeruginosa sama (tidak berbeda nyata) dengan
antibiotik cefotaxime 8 μg/mL, sedangkan
kemampuan pembentukan zona hambat oleh
ekstrak miselia Fusarium sp. (JMa3)
menggunakan metanol terhadap P. aeruginosa
dengan antibiotik cefotaxime 64 μg/mL dan
oleh ekstrak miselia Fusarium solani (JBa8)
menggunakan metanol terhadap EPEC K1-1
dengan antibiotik cefotaxime 8 μg/mL dan 64
μg/mL berbeda nyata. Hasil yang berbeda
nyata ini menunjukkan bahwa ekstrak miselia
menggunakan metanol tidak memiliki
kemampuan yang sama atau memiliki
kemampuan yang jauh lebih rendah
dibandingkan dengan kontrol antibiotik
cefotaxime dalam menghambat pertumbuhan
bakteri. Kontrol terhadap pelarut metanol
tidak menunjukkan adanya zona hambat atau
bernilai 0 (nol). Hal ini mengindikasikan
bahwa kontrol yang digunakan tidak
berpengaruh pada uji antibakteri.
.
7
Tabel 3 Hasil penapisan antara miselia cendawan dengan bakteri patogen pada hari ke-3
Kode isolat
JBa8
Aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen
S. aureus
B. subtilis
P. aeruginosa
EPEC K1-1
-
-
-
+
JMa3
+
+
Keterangan : - = tidak terbentuk zona hambat; + = terbentuk zona hambat
-
Gambar 5 (A) Kontrol metanol terhadap EPEC K1-1. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak miselia
Fusarium solani (JBa8) menggunakan metanol terhadap EPEC K1-1. (C) Kontrol
antibiotik cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap EPEC K1-1. (D) Kontrol
antibiotik cefotaxime konsentrasi 64 μg/mL terhadap EPEC K1-1. Pengamatan
dilakukan pada hari ke-3.
Gambar 6
(A) Kontrol metanol terhadap P. aeruginosa. (B) Uji aktivitas antibakteri ekstrak
miselia Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol terhadap P. aeruginosa. (C)
Kontrol antibiotik cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL terhadap P. aeruginosa. (D)
Kontrol antibiotik cefotaxime konsentrasi 64 μg/mL terhadap P. aeruginosa.
Pengamatan dilakukan pada hari ke-3.
8
a
a
Ekstrak Kasar JBa8
Cefotaxime 8 µg/mL
b
Cefotaxime 64 µg/mL
Metanol
Gambar 7 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium solani (JBa8) terhadap EPEC K1-1.
Kontrol metanol tidak memiliki balok data karena bernilai 0 (nol), garis vertikal di
atas tiap balok data menunjukkan galat baku dan huruf-huruf di atas balok data
menunjukkan pembandingan nilai tengah antar perlakuan berdasarkan uji beda nyata
terkecil pada taraf nyata 0.05.
a
b
b
Ekstrak Kasar JMa3
Cefotaxime 8 µg/mL
Cefotaxime 64 µg/mL
Metanol
Gambar 8 Aktivitas antibakteri ekstrak kasar Fusarium sp. (JMa3) terhadap P. aeruginosa.
Kontrol metanol tidak memiliki balok data karena bernilai 0 (nol), garis vertikal di
atas tiap balok data menunjukkan galat baku dan huruf-huruf di atas balok data
menunjukkan pembandingan nilai tengah antar perlakuan berdasarkan uji beda nyata
terkecil pada taraf nyata 0.05.
PEMBAHASAN
Fusarium tergolong cendawan endofit
dengan pertumbuhan cepat dan memiliki
frekuensi kolonisasi yang tinggi pada tanaman
Acorus calamus (Mohanta et al. 2008). Isolat
JBa8 yang teramati secara mikroskopis hanya
menunjukkan hifa berseptat. Isolat ini tidak
membentuk konidium dan struktur yang khas
sehingga sulit untuk diidentifikasi berdasarkan
b
9
pada karakteristik morfologinya saja. Isolat
JMa3 berdasarkan pengamatan morfologi
merupakan Fusarium karena isolat tersebut
memiliki makrokonidia dan mikrokonidia.
Makrokonidia yang teramati pada bagian
kedua ujungnya melengkung dan berbentuk
sabit sedangkan mikrokonidia berbentuk oval
silindris dan memiliki 1 septat. Fusarium
solani merupakan agens hayati yang potensial
dalam menekan kejadian penyakit antraknosa
pada cabai (Istikorini 2008). Namun Fusarium
solani ini dapat juga menjadi cendawan
patogen yang merugikan tanaman, seperti
pada tanaman kentang, buncis, dan kacang
polong yang menyebabkan penyakit busuk
akar (Matuo dan Snyder 1973).
Isolat SLbt3 diisolasi dari organ batang
tanaman obat sambiloto. Isolat tersebut
teridentifikasi secara morfologi sebagai
Colletotrichum sp. yang ditandai dengan
konidia yang berwarna hialin dan berbentuk
ovoid. Cendawan ini merupakan bentuk
anamorf dari genus Glomerella. Miyasyiwi
(2012)
melaporkan
bahwa
genus
Colletotrichum merupakan cendawan endofit
pada tanaman pegagan (Centella asiatica).
Menurut Tan dan Zou (2001), Colletotrichum
sp. yang berendofit dengan tanaman Artemisia
annua dapat menghasilkan senyawa turunan
asam indol 6-isoprenylindole-3-carboxylic
yang dapat digunakan sebagai antibakteri dan
antifungi.
Hasil analisis sekuen daerah ITS
dengan program BLAST-N untuk identifikasi
molekuler ketiga isolat menunjukkan bahwa
isolat JBa8 yang merupakan isolat yang tidak
menghasilkan
konidia
(spora)
dapat
diidentifikasi
secara
molekuler
yaitu
Fusarium solani. Hal ini menunjukkan bahwa
pendekatan molekuler diperlukan untuk isolat
yang tidak membentuk struktur reproduktif.
Isolat JMa3 dan SLbt3 baik secara morfologi
maupun molekuler hanya dapat teridentifikasi
ke tahap genus yaitu Fusarium dan
Colletotrichum. Hal ini menunjukkan bahwa
kedua isolat tersebut memiliki peluang
sebagai spesies baru, karena pada pendekatan
molekuler homologi isolat hanya berada pada
tingkat genus saja dan belum terdeskripsikan.
Colletotrichum sp. tidak digunakan
dalam uji aktivitas antibakteri karena
membunuh E. coli flora normal pada tahap
penapisan awal. E. coli flora normal tidak
boleh dibunuh dalam penelitian ini karena
bertindak sebagai kontrol positif dan juga
karena merupakan strain komensal dalam
koloni manusia, serta diduga berperan dalam
pembentukan vitamin K yang penting untuk
pembekuan darah. Pemilihan pelarut metanol
murni dalam proses maserasi bertujuan untuk
mengekstrak senyawa aktif antibakteri dari
miselia cendawan dalam bentuk ekstrak kasar,
dimana
metanol
berfungsi
untuk
mendenaturasi sel sehingga senyawa aktif
dapat keluar dari sel. Metanol memiliki
kelebihan yaitu dapat menarik senyawa aktif
antibakteri yang bersifat polar lebih banyak
jika dibandingkan dengan pelarut lainnya.
Pada pengujian aktivitas penghambatan
bakteri dengan menggunakan ekstrak miselia
menggunakan metanol, terdapat isolat yang
diuji mampu menghambat pertumbuhan
bakteri, yaitu isolat JBa8 (F. solani) yang
mampu menghambat pertumbuhan EPEC K11, dan isolat JMa3 (Fusarium sp.) yang
mampu menghambat pertumbuhan P.
aeruginosa. Aktivitas antibakteri yang
dimilikinya terlihat dari zona bening yang
terbentuk di sekitar kertas cakram yang berisi
ekstrak miselia menggunakan metanol pada
media agar yang telah diinokulasikan bakteri
uji. F. solani diisolasi dari bagian organ akar
tanaman jati belanda. Tanaman tersebut
diketahui mengandung tanin, kafein, β
sitosterol, friedelin, kaueronic acid, flavonoid
dan saponin (Utomo 2008). Flavonoid telah
diketahui memiliki kemampuan sebagai
antibakteri. Senyawa aktif yang termasuk ke
dalam golongan flavonoid yaitu 5,7,3’,4tetrahidroksiflavon
dan
5,7-dihidroksiisoflavon. Senyawa aktif inilah yang diduga
memiliki aktivitas antibakteri. Fusarium sp.
diisolasi dari bagian akar jahe merah.
Cendawan ini mampu menghambat bakteri P.
aeruginosa. Sasidharan dan Menon (2010)
melaporkan bahwa senyawa utama pada jahe
seperti zingiberene, kemudian diikuti dengan
arcurcumene, germacrene‐D, β‐bisabolene,
dan
β‐sesquiphellandrene
mampu
menghambat aktivitas bakteri P. aeruginosa.
Isolat JBa8 dan JMa3 teridentifikasi
sebagai Fusarium secara molekuler. Mohanta
et al. (2008) melaporkan bahwa ekstrak
Fusarium sp. secara signifikan mampu
menghambat pertumbuhan bakteri gram
positif dan gram negatif, serta efektif dalam
melawan cendawan patogen. Menurut Zhang
et al. (2012), ekstrak Fusarium solani
menggunakan etil asetat yang berendofit pada
tanaman Ficus carica menghasilkan senyawa
fumitremorgin B, fumitremorgin C, asam
helovlic,
bisdethiobis(methylthio)gliotoxin,
bis-N-norgliovictin, dan gliotoxin. Senyawa
ini mampu menghasilkan aktivitas antibakteri
terhadap B. subtilis, S. aureus, E. coli dan P.
aeruginosa, serta memiliki aktivitas antifungi
10
terhadap Candida albicans, Penicillium
chrysogenum dan Aspergillus fumigatus.
Ekstrak miselia Fusarium sp. (JMa3)
menggunakan metanol hanya mampu
menghambat bakteri P. aeruginosa saja,
sedangkan pada bakteri B. subtilis tidak
mampu menghambat. Hal ini dapat terjadi
karena B. subtilis merupakan bakteri gram
positif yang memiliki struktur dinding sel
yang tebal karena kandungan peptidoglikan
yang banyak, sehingga lapisan dinding sel
bakteri tidak dapat ditembus oleh ekstrak
miselia menggunakan metanol. Sebaliknya, P.
aeruginosa merupakan bakteri gram negatif
yang memiliki struktur dinding sel yang tipis
karena kandungan peptidoglikan yang sangat
sedikit, sehingga lapisan dinding sel bakteri
dapat ditembus oleh ekstrak miselia
menggunakan metanol. Menurut Pelczar dan
Chan (1986), penghambatan aktivitas bakteri
dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara
lain gangguan pada senyawa penyusun
dinding
sel,
penghambat
keutuhan
permeabilitas dinding sel bakteri, penghambat
sintesis sel bakteri, dan penghambat sintesis
asam nukleat.
Berdasarkan uji statistik perbandingan
diameter zona hambat antara ekstrak miselia
menggunakan metanol terhadap bakteri uji
dengan antibiotik cefotaxime (Lampiran 7),
menunjukkan bahwa hanya ekstrak miselia
Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol
terhadap P. aeruginosa dengan antibiotik
cefotaxime dengan konsentrasi 8 μg/mL yang
memiliki diameter zona hambat yang tidak
berbeda
nyata
(p>0.05).
Hal
ini
mengindikasikan bahwa ekstrak miselia
Fusarium sp. (JMa3) menggunakan metanol
dengan konsentrasi 100 μl memiliki kekuatan
hambatan yang sama dengan antibiotik
cefotaxime pada konsentrasi 8 μg/mL dalam
menghambat pertumbuhan bakteri.
Antibiotik
cefotaxime
digunakan
sebagai pembanding dalam uji aktivitas
antibakteri (kontrol positif) karena tergolong
antibiotik cephalosporins generasi ketiga,
dimana golongan antibiotik cephalosporins
generasi ketiga ini mampu menghambat
aktivitas pertumbuhan Enterobacteriaceae
seperti E. coli enteropatogenik (EPEC) dan
memiliki aktivitas yang kuat terhadap bakteri
P. aeruginosa.
Ekstrak miselia Fusarium sp. (JMa3)
menggunakan metanol mampu menghambat
P. aeruginosa dengan rata-rata diameter zona
hambat sebesar 12.00 mm sedangkan
antibiotik cefotaxime konsentrasi 8 μg/mL
menghambat P. aeruginosa dengan rata-rata
diameter zona hambat sebesar 13.75 mm.
Diameter zona hambat yang dihasilkan dalam
penelitian ini tergolong kuat. Davis dan Stout
(1971) mengelompokkan antibakteri ke dalam
4 kelompok, yaitu antibakteri dengan aktivitas
rendah, sedang, kuat dan sangat kuat.
Aktivitas rendah jika diameter zona hambat
kurang dari 5 mm; aktivitas sedang jika
diameter zona hambat di antara 5-10 mm;
aktivitas kuat jika diameter zona hambat di
antara 10-20 mm; aktivitas sangat kuat jika
diameter zona hambat lebih dari 20 mm.
Efektivitas antibakteri dipengaruhi oleh
beberapa faktor, antara lain senyawa
antibakteri, suhu, waktu inkubasi, jenis,
jumlah, dan umur bakteri, serta sifat kimia
substrat seperti pH dan kadar air.
SIMPULAN
Isolat JBa8 tidak dapat teridentifikasi
secara morfologi namun secara molekuler
teridentifikasi sebagai Fusarium solani.
Secara morfologi dan molekuler, isolat JMa3
teridentifikasi ke dalam genus Fusarium
sedangkan isolat SLbt3 teridentifikasi ke
dalam genus Colletotrichum. F. solani dan
Fusarium sp. diketahui menghasilkan
senyawa antibakteri. F. solani mampu
menghambat pertumbuhan EPEC K1-1,
sedangkan isolat Fusarium sp. mampu
menghambat P. aeruginosa.
SARAN
Perlu dilakukan
purifikasi
dan
karakterisasi untuk mengetahui identitas
senyawa bioaktif yang terkandung dalam
filtrat cendawan. Selain itu juga perlu
diketahui konsentrasi dari ekstrak kasar
cendawan yang dapat menghambat bakteri uji.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih penulis ucapkan kepada
Proyek Hibah Kerjasama Internasional DIKTI
Tahun 2010 atas nama Dr. Ir. Utut Widyastuti,
M.Si yang telah membiayai penelitian ini.
Terima kasih kepada Dr. Sri Budiarti yang
telah memberikan isolat EPEC K1-1 dan
Laboratorium
Mikrobiologi-Departemen
Biologi FMIPA IPB untuk isolat bakteri uji,
serta kepada Ibu Rohani Cinta Badia Ginting
atas penyediaan isolat cendawan.
11
DAFTAR PUSTAKA
Barnett HL, Hunter BB. 1972. Illustrated
Genera of Imperfect Fungi. Ed ke-3.
Minneapolis (US): Burgess Publishing
Company.
Booth C. 1971. The Genus Fusarium. Kew
(GB):
Commonwealth
Mycological
Institute.
Carroll GC. 1990. Fungal endophytes in
vascular plant. Trans Mycol Soc Jap
31:103-116.
Clay K. 1988. Fungal endophytes of grasses: a
defensive mutualism between plants and
fungi. Ecology 69:1-16.
Davis WW, Stout TR. 1971. Disc plate
method of microbiological antibiotic
assay. Appl Microbiol 22(4):666-670.
[Deptan] Departemen Pertanian, Badan
Penelitian dan Pengembangan Pertanian.
2007. Prospek dan Arah Pengembangan
Agribisnis Tanaman Obat. Ed ke-2.
Jakarta (ID): Departemen Pertanian.
Gardes M, Bruns TD. 1993. ITS primers with
enhanced specificity for basidiomycetes application to the identification of
mycorrhizae and rusts. Mol Ecol 2:113118.
Istikorini Y. 2008. Potensi cendawan endofit
untuk mengendalikan penyakit antraknosa
pada cabai (Capsicum annuum L.)
[disertasi].
Bogor
(ID):
Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Matuo T, Snyder WC. 1973. Use of
morphology and mating populations in the
identification of formae speciales in
Fusarium solani. Phytopathology 63:562565.
Miyasyiwi S. 2012. Identifikasi cendawan
endofit asal daun pegagan (Centella
asiatica) berdasarkan morfologi dan
penanda molekuler daerah ITS (Internal
Transcribed Spacer) [skripsi]. Bogor (ID):
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Mohanta J, Tayung K, Mohapatra UB. 2008.
Antimicrobial potentials of endophytic
fungi inhabiting three Ethno-medicinal
plants Similipal Biosphere Reserve, India.
Inter
J
Microbiol
8(2):181197.doi:10.5580/80b.
Pelczar MJ Jr, Chan ECS. 1986. Dasar-dasar
Mikrobiologi. Volume ke-1. Hadioetomo
RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL,
penerjemah; Jakarta (ID): UI Pr.
Terjemahan
dari:
Elements
of
Microbiology.
Pierce-Hendry SA, Dennis J. 2010. Bacterial
culture and antibiotic susceptibility testing.
Compendium: E1-E5.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular cloning a laboratory manual
(2nd ed). USA (US): Cold Spring Harbor
Laboratory Pr.
Sasidharan I, Menon AM. 2010. Comparative
chemical composition and antimicrobial
activity fresh & dry gingers oils (Zingiber
officinale Roscoe). Int J Curr Pharm Res
2(4):40-43.
Strobel GA, Kluck K, Hess WM, Sears J, Ezra
D, Vargas PN. 2007. Muscodor albus E-6,
an endophyte of Guazuma ulmifolia
making volatile antibiotics: isolation,
characterization
and
experimental
establishment in the host plant. Microbiol
153:26132620.doi:10.1099/mic.0.2007/008912-0.
Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: a rich
source of functional metabolites. Nat Prod
Rep 18:448–459. doi:10.1039/B100918O.
Tejavathi DH, Anitha P, Murthy SM,
Nijagunaiah R. 2011. Effect of AM fungal
association
with
normal
and
micropropagated plants of Andrographis
paniculata Nees on biomass, primary and
secondary metabolites. Int Res J Plant Sci
2(12):338-348.
Utomo AW. 2008. Uji toksisitas akut ekstrak
alkohol daun jati belanda (Guazuma
ulmifolia Lamk.) pada tikus wistar
[skripsi]. Semarang (ID): Fakultas
Kedokteran, Universitas Diponegoro.
Weir BS, Johnston PR, Damm U. 2012. The
Colletotrichum gloeosporioides species
complex.
Stud
Mycol
73:115180.doi:10.3114/sim0011.
Zhang H, Ma Y, Liu R. 2012. Antimicrobial
additives
from
endophytic
fungus
Fusarium solani of Ficus carica. Appl
Mech
Mat
5:178181.doi:10.4028/www.scientific.net/AMM
.178-181.783
LAMPIRAN
13
Lampiran 1 Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JBa8
Urutan nukleotida daerah ITS 1 (forward) dan ITS 4 (reverse)
CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTG
TGAACATACCTAAACGTTGCTTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGCC
CCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAAACAAGCA
AATGAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG
CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACG
CACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCT
CAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAGCCCTCCGCGGGCACACGCCGTC
CCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGC
AACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCCAACTTCTGAACGTTGACCTCG
AATCAGGTAGATATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI
Fusarium solani strain MTCC 9622 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal
transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete
sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
GenBank: FJ719812.1
LOCUS
FJ719812
594 bp DNA linear PLN 03-AUG-2010
DEFINITION Fusarium solani strain MTCC 9622 18S ribosomal RNA gene, partial
sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene,
and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S
ribosomal RNA gene, partial sequence.
ACCESSION FJ719812
VERSION FJ719812.1 GI:224551656
KEYWORDS .
SOURCE
Fusarium solani
ORGANISM Fusarium solani
Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Pezizomycotina;
Sordariomycetes; Hypocreomycetidae; Hypocreales; Nectriaceae;
mitosporic Nectriaceae; Fusarium; Fusarium solani species complex.
REFERENCE 1 (bases 1 to 594)
AUTHORS Tayung,K., Barik,B.P. and Jha,D.K.
TITLE Antifungal activity and biocontrol potential of metabolite produced
by an endophytic Fusarium (MTCC-9622) against some postharvest
pathogens
JOURNAL Agric Technol (Thail) 6 (3), 409-419 (2010)
REFERENCE 2 (bases 1 to 594)
AUTHORS Tayung,K., Barik,B.P. and Shenoy,B.D.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (11-FEB-2009) Department of Botany and Bioinformatics,
North Orissa University, Sriram Chandra Vihar, Takatpur, Baripada,
Orissa 757003, India
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..594
/organism="Fusarium solani"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="MTCC 9622"
/isolation_source="plant"
/db_xref="taxon:169388"
/country="India"
misc_RNA
594
/note="contains 18S ribosomal RNA, internal transcribed
14
spacer 1, 5.8S ribosomal RNA, internal transcribed spacer
2, and 28S ribosomal RNA"
ORIGIN
1 tggaagtaaa agtcgtaaca aggtctccgt tggtgaacca gcggagggat cattaccgag
61 ttatacaact catcaaccct gtgaacatac ctaaaacgtt gcctcggcgg gaacagacgg
121 ccccgtaaca cgggccgccc ccgccagagg accccctaac tctgtttcta taatgtttct
181 tctgagtaaa caagcaaata aattaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctggcatc
241 gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg
301 aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagt attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca
361 ttacaaccct caggcccccg ggcctggcgt tggggatcgg cggaagcccc ctgcgggcac
421 aacgccgtcc cccaaataca gtggcggtcc cgccgcagct tccattgcgt agtagctaac
481 acctcgcaac tggagagcgg cgcggccacg ccgtaaaaca cccaacttct gaatgttgac
541 ctcgaatcag gtaggaatac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaa
//
15
Lampiran 2 Hasil runutan DNA daerah ITS cendawan JMa3
Urutan nukleotida daerah ITS 1 (forward) dan ITS 4 (reverse)
CCTTCCGTAGGTGAACCT