Gen Suppressor Tumor - p53

p53 mencegah terjadinya replikasi DNA yang rusak pada sel sel normal dan mendorong terjadinya apoptosis terhadap sel yang rusak tersebut Kresno, 2002. Terganggunya fungsi gen tumor suppressor ini menyebabkan terganggunya proses restriction point sel dan tidak berjalannya fungsi apoptosis. Hal inilah yang mendasari pertumbuhan tumor yang makin lama makin besar dan menyebar kebagian organ tubuh disekitarnya. Proses pengendalian untuk menekan pertumbuhan kanker secara umum dilakukan dengan beberapa cara antara lain: pencegahan terhadap agen penyebab kanker, peningkatkan pertahanan terhadap kanker, perubahan gaya hidup dan pengendalian dengan bahan kimia Murray, 1998. Salah satu tujuan terapi kanker adalah mengembalikan fungsi gen yang terganggu, sehingga dapat kembali menginduksi terjadinya apoptosis . Pengendalian menggunakan bahan kimia atau dikenal dengan kemoterapi, merupakan pendekatan yang sering dipakai. Efek samping dari terapi dapat dihindari dengan target obat yang spesifik. Target terapi yaitu pada protein yang berperan dalam mengontrol pertumbuhan sel melalui proses apoptosis, salah satu metode yang dilakukan yaitu dengan membandingkan perbedaan kontrol pertumbuhan pada sel kanker dengan sel normal sehingga dapat diketahui mekanisme pengembalian fungsi sel kanker seperti sel normal Wang et al .,2003.

2. Gen Suppressor Tumor - p53

Gen Supresor Tumor, berfungsi untuk menghambat atau ―mengambil kerusakan‖ pada pertumbuhan sel dan siklus pembelahan. Mutasi pada gen supresor tumor menyebabkan sel mengabaikan satu atau lebih komponen jaringan sinyal penghambat, memindahkan kerusakan dari siklus sel dan menyebabkan angka yang tinggi dari pertumbuhan yang tidak terkontrol –kanker. Gen supresor tumor Rb yang menyandi protein pRb penting untuk mengontrol siklus sel master brake pada titik pemeriksaan G1-S, sedangkan gen TP53 yang mengkode untuk protein p53 adalah emergency brake di titik pemeriksaan G1-S namun biasanya tidak dalam perjalanan replikasi normal. Tapi bila terjadi kerusakan DNA, p53 akan memengaruhi transkripsi untuk menghentikan siklus sel. Jika kerusakan terlalu berat, maka p53 merangsang apoptosis Price, 2006. Proses apoptosis dapat terjadi melalui beberapa jalur. Salah satu jalur yang mempunyai kaitan erat dengan kanker adalah malalui induksi apoptosis oleh protein p53. Protein p53 merespon kerusakan DNA atau stres sel yang meliputi: aktivitas onkogen gen pendorong terbentuknya tumor, hypoksia kekurangan oksigen dalam sel, erosi telomerase pemendekan DNA, akibat nonaktifnya enzim telomerase dan stres sel yang lain Stokloza dan Golab, 2005. Aktivitas transkripsi dari p53 bergantung pada pembentukan tetramer dari protein tersebut yang berinteraksi dengan DNA dengan urutan yang spesifik sequence-specific . Tiap subunit p53 terdiri dari 4 domain yang berbeda fungsinya. Residu 1--44, merupakan ujung N yang sedikit terlipat sebagai domain pengaktif transkripsi. Domain inti merupakan bagian yang berinteraksi dengan DNA dan berawal dari residu 102 sampai residu 292. Residu 320--356 bertanggung jawab atas pembentukan tetramer, sedangkan residu 356--393 merupakan domain regulator Zhao et al. , 2001. Gambar 2. Urutan spesifik sequence-specific protein p53. Domain inti central core merupakan bagian yang berhubungan langsung dengan DNA. Pada sebagian kanker manusia mengalami mutasi di bagian ini Bai dan Zhu, 2006. Kurang lebih 55 sel tumor pada manusia kehilangan fungsi p53 akibat mutasi Joerger et al., 2005. Hilangnya fungsi p53 menyebabkan kerusakan DNA atau cacat sel yang lain yang tidak diikuti dengan penghentian penggandaan dan atau proses apoptosis meskipun terjadi kenaikan konsentrasi p53 Bykov et al ., 2002a. Mutasi yang terjadi sebagian besar terdapat pada domain inti yang berinteraksi dengan DNA sehngga merusak kemampuan protein ini untuk berinteraksi dengan DNA targetnya dan mencegah aktivitas transkripsinya. Mutasi yang terjadi pada p53 secara umum ada enam titik atau hot-spots mutasi yang sering terkait dengan kanker manusia yaitu R175H, G245S, R248Q, R249S, R273H, dan R282W Hainaut dan Hollstein, 2000. Mutasi ini dapat dibedakan menjadi 2 kelas, yaitu kontak termutasi, terjadi pada residu yang kontak langsung dengan DNA misalnya R248W, R273H dan konformasi termutasi, terjadi pada residu yang menjaga stabilitas struktur dari domain inti misalnya R175H, R249S, R282G Peng et al. , 2003. Gambar 3. Interaksi p53 dengan DNA. Asam amino Arg 273 berinteraksi langsung pada groove mayor DNA sementara itu Arg 248 berinteraksi pada groove minor DNA. Interaksi ini secara struktural distabilkan oleh 4 residu utama yakni Arg 175, Gly 245, Arg 249 dan Arg 282. Visualisasi menggunakan perangkat lunak chimera Pettersen et al ., 2004 dengan kode protein p53 1TSR.pdb. Pengaruh secara struktural mutasi pada hot spots :  Hot spots 175, asam amino arginin termutasi menjadi histidin akibat yang ditimbulkan yaitu rusaknya ikatan hidrogen antara loop2 dan loop3 sehingga menyebabkan ketidakstabilan ikatan antara p53 dengan DNA.  Hot spots 273, asam amino arginin digantikan oleh histidin atau sistein dampak yang ditimbulkan yaitu kegagalan p53 untuk berinteraksi dengan DNA pada groove mayor.  Hot spots 248, asam amino arginin termutasi menjadi glutamin atau triptofan akibat yang ditimbulkan yaitu terjadi kerusakan ikatan antara p53 dengan DNA pada bagian groove minor.  Hot spots 245, asam amino glisin digantikan oleh serin, terjadi perubahan konformasi pada loop3 akibatnya terjadi ketidakstabilan ikatan antara p53 dengan DNA terutama ikatan pada bagian groove minor.  Hot spots 249, asam amino arginin digantikan oleh serin akibatnya terjadi perubahan konformasi pada loop3 sehingga terjadi ketidakstabilan ikatan antara p53 dengan DNA terutama ikatan pada groove minor.  Hot spots 282, asam amino arginin termutasi menjadi triptofan akibatnya terjadi destabilisasi ikatan helix 2 dan DNA pada groove mayor dan merusak kontak dengan b-hairpin. Joerger et al ., 2006. Mutasi p53 kebanyakan ditemukan dalam tumor keras ganas yakni terdapat dalam kanker paru-paru, usus, otak dan kanker pankreas. Kanker yang mengandung p53 termutasi cenderung resisten terhadap kemoterapi yang telah umum dilakukan dibandingkan dengan yang mengandung wild-type p53 Bykov, et al. , 2002a. Di samping itu terapi kanker bervariasi bergantung pada tipe kanker tersebut. Dalam kaitannya dengan pengendalian kanker melalui induksi apoptosis jalur p53, diketahui bahwa limfoma menunjukkan respon paling kuat, pada mamari dan intestinal diperoleh respon menengah, sedangkan untuk kanker paru- paru, kulit dan hati, tidak ditemukan terapi yang terkait dengan induksi apoptosis Kemp et al ., 2001. 3. PRIMA-1 p53 Reactivation and Induction of Massive Apoptosis Pengembalian fungsi p53 yang termutasi akan memicu terjadinya proses apotosis secara massal. Proses pengembalian fungsi p53 melalui pengembalian konfomer domain inti dari p53 termutasi dengan molekul kecil telah dilakukan. Bukti-bukti menunjukkan bahwa fungsi p53 dapat dikembalikan dengan mengatur konfomasi mutan p53 sehingga menyerupai p53 wild type . Senyawa yang digunakan salah satunya adalah PRIMA – 1 . PRIMA-1 memiliki sifat fisik yaitu berupa kristal putih dengan titik leleh sebesar 142 –144° C, rumus molekul C 9 H 15 NO, dan berat molekul 185,2 gmol. PRIMA-1 secara selektif menghambat pertumbuhan sel tumor dengan memicu apoptosis dalam pola yang bergantung pada transkripsi melalui manipulsi konformasional mutan p53 untuk memperbaiki ikatan DNA sekuen spesifik. Struktur PRIMA-1 disajikan pada Gambar 4. Gambar 4. Struktur PRIMA-1 Bykov et al ., 2002. Optimasi geometri PRIMA-1 bertujuan untuk memperoleh konformasi PRIMA-1 dengan energi internal terendah. Penghitungan dilakukan dengan mekanika kuantum metode ab initio dengan level teori HF dan basis set 6-31G. Tujuan dipakainya metode ab initio yakni proses penghitungan sangat teliti dengan mempertimbangkan atom sampai pada konfigurasi elektronnya. Atom C Atom N Atom O Atom H Gambar 5. Perbandingan struktur PRIMA-1 sebelum optimasi dengan yang teroptimasi. Panah menunjukkan perbedaan struktur yang nyata pada PRIMA-1 bagian fleksibel. Pada Gambar 5 di atas tampak terjadi perubahan konfigurasi antara PRIMA-1 sebelum optimasi dengan yang setelah teroptimasi. Struktur awal sebelum optimasi merupakan struktur perkiraan yang disesuikan dengan gambar dua dimensi dari senyawa ini. Dengan optimasi geometri kemungkinan konformasi yang stabil dan energi internal terendah dapat tercapai. Secara umum struktur PRIMA-1 terdapat dua bagian, yakni bagian kaku rigid dan bagian fleksibel yang dapat berotasi. Akibatnya terdapat beberapa kemungkinan konformasi PRIMA-1 . Proses optimasi geometri didapatkan konformasi struktur dengan energi yang minimal Warsino, 2008

4. Pemetaan interaksi pada p53 termutasi kode pdb 2BIM jenis mutasi