atau kotoran yang masih tertinggal pada simplisia kering sortasi kering, kemudian dihaluskan dengan mortar dan lalu disimpan
dalam wadah bersih. Dihasilkan serbuk biji jengkol simplisia dan selanjutnya dilakukan ekstraksi. Pembuatan ekstrak etanol biji
jengkol dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi adalah penarikan simplisia dengan cara merendam simplisia tersebut dalam
cairan penyari. Serbuk simplisia direndam dalam 2 liter etanol 96 selama 24 jam, selanjutnya disaring hingga didapatkan filtrat. Filtrat
tersebut kemudian dievaporasi menggunakan Rotary evaporator hingga dihasilkan ekstrak kental. Ekstrak kental tersebut selanjutnya
diencerkan menggunakan aquades sesuai dengan dosis yang dibutuhkan, yaitu 1200 mgkgBB, 2400 mgkgBB, dan 4800
mgkgBB Gaol, 2014.
3.5.2. Prosedur Perlakuan
Prosedur perlakuan, pembuatan dan pembacaan preparat disajikan dalam Gambar 6 dan dijelaskan sebagai berikut:
1. Selama 7 hari tikus dibiarkan adaptasi dengan kandang
aklimatisasi dan diukur berat badannya menggunakan neraca analitik sebelum diberi perlakuan. Selama masa adaptasi dan
masa perlakuan, tikus diberi makan pelet ayam serta minum air ad libitum.
2. Tikus sebanyak 20 ekor dikelompokkan dalam 4 kelompok.
Kelompok 1 sebagai kelompok kontrol negatif, dimana hanya
diberi akuades per oral. Kelompok 2,3, dan 4 sebagai kelompok perlakuan. Dimana kelompok 2 diberikan ekstrak etanol 96 biji
jengkol 1200 mgkgbb per oral sekali sehari, kelompok 3 diberikan ekstrak etanol 96 biji jengkol 2400 mgkgbb per oral
sekali sehari, kelompok 4 diberikan ekstrak etanol 96 biji jengkol 4800 mgkgbb per oral sekali sehari.
3. Tikus dipuasakan selama 8-12 jam, kemudian ukur mencekoki
tikus kelompok 2, 3 dan 4 dengan ekstrak etanol biji jengkol sebanyak 3 cc, dengan dosis masing-masing 1200, 2400 dan 4800
mgkgBB selama 14 hari, satu kali setiap hari. 4.
Pada hari ke-15, tikus dari tiap kelompok dianastesi dengan Ketamine˗xylazine 75˗100 mgkgBB + 5˗10 mgkgBB secara
intraperitoneal IP lalu tikus di euthanasia berdasarkan Institutional Animal Care and Use Committee IACUC
menggunakan metode cervical dislocation dengan cara ibu jari dan jari telunjuk ditempatkan dikedua sisi leher di dasar kranium.
Sementara tangan lain memegang pada pangkal ekor dan dengan cepat ditarik sehingga menyebabkan pemisahan antara tengkorak
dan otak dari sumsum tulang belakang.. 5.
Setelah tikus mati, dilakukan laparotomi, pankreas tikus diambil untuk sediaan mikroskopis. Pembuatan sediaan mikroskopis
dengan metode paraffin dan pewarnaan HE. 6.
Sampel pankreas difiksasi dengan formalin 10 7.
Teknik pembuatan preparat histopatologi
3.5.3. Prosedur Pembuatan Preparat
1. Fixation
Spesimen berupa potongan organ pankreas yang telah dipotong secara representatif kemudian segera difiksasi dengan formalin
10 selama 3 jam Kemudian, cuci di bawah air mengalir sebanyak 3−5 kali
2. Trimming
Organ pankreas dibuat kecil ±3 mm. Kemudian, dimasukkan ke embedding cassette.
3. Dehydration
Embedding cassette dikeringkan dari air dengan menggunakan kertas tisu. Perendaman organ pankreas dimulai berturut-turut
dengan alkohol 70 , 96 , absolut I, II, III masing-masing selama satu jam
4. Clearing
Alkohol dibersihkan dengan menggunakan xylol I, II, III masing- masing selama 30 menit.
5. Impregnasi
Paraffin I dan II digunakan masing-masing selama satu jam dalam inkubator dengan suhu 65,1
⁰C. 6.
Embedding Tuang paraffin dalam pan, pindahkan satu per satu embedding
cassette ke dasar pan. Lepaskan paraffin yang berisi pankreas dari pan dengan memasukkan ke dalam suhu 4-6
⁰C beberapa saat.
Potong paraffin
sesuai dengan
letak jaringan
dengan menggunakan scalpel. Letakkan pada balok kayu, ratakan
pinggirnya dan buat ujungnya sedikit meruncing. Blok paraffin siap dipotong dengan mikrotom.
7. Cutting
Sebelum blok paraffin dipotong, dinginkan terlebih dahulu. Lakukan potongan kasar lanjutkan potongan h
alus sebesar 4˗5 mikron. Pilih lembaran potongan yang paling baik, apungkan
pada air dan hilangkan kerutannya dengan cara tekan salah satu sisi lembaran jaringan tersebut dengan ujung jarum dan sisi yang
lain ditarik menggunakan kuas runcing. Pindahkan lembaran jaringan ke dalam water bath selama beberapa detik sampai
mengembang sempurna. Dengan gerakan menyendok, ambil lembaran jaringan tersebut dengan slide bersih dan tempatkan di
tengah atau pada sepertiga atas atau bawah, cegah jangan sampai ada gelembung udara di bawah jaringan. Slide yang berisi
jaringan ditempatkan pada inkubator suhu 37
o
C selama 24 jam sampai jaringan melekat sempurna.
8. Staining
Pilih slide terbaik selanjutnya secara berurutan memasukkan ke dalam zat kimia dibawah ini dengan waktu sebagai berikut.
Pertama, dilakukan deparafinisasi dalam xylol I selama 5 menit, xylol II selama 5 menit, ethanol absolut selama 1 jam. Kedua,
dilakukan hidrasi dalam alkohol 96 selama 2 menit, alkohol
70 selama 2 menit, air selama 10 menit. Ketiga, dibuat pulasan inti dengan menggunakan Harris Hematoksilin selama 15 menit,
dibilas dengan air mengalir, diwarnai kembali dengan eosin selama maksimal 1 menit. Keempat, didehidrasi dengan
menggunakan alkohol 70, 96, absolut masing-masing selama 2 menit. Kelima, dijernihkan dengan xylol I dan II masing-masing
selama 2 menit. 9.
Mounting Letakkan slide diatas kertas tissue pada tempat datar. Kemudian,
ditetesi dengan bahan mounting yaitu entelan dan ditutup dengan cover glass, cegah adanya gelembung udara.
10. Baca slide dengan mikroskop
Slide diperiksa dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400 x.
3.6. Diagram Alur Penelitian
