BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian : Eksperimen Laboratorium
Rancangan Penelitian :
Posttest Only Control Group Design
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian 3.2.1 Lokasi Penelitian
: 1. Laboratorium Obat Tradisional Farmasi USU
2. Laboratorium Pusat Penyakit Tropis UNAIR
3.2.3 Waktu Penelitian :
9 bulan
3.3 Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi :
Bakteri Fusobacterium nucleatum
3.3.2 Sampel : Koloni Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 yang telah
diisolasi dan dibiakkan dengan media Muller Hinton Agar MHA.
3.3.3 Besar Sampel
Penentuan besar sampel dilakukan berdasarkan SOP Standard Operational Procedure yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis, Universitas Airlangga.
Jumlah pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus W.Federer 1991 :
t-1 r-1 ≥ 15
Keterangan : 5 -1 x r-1
≥ 15 t : jumlah keompok perlakuan
4 x r-1 ≥ 15
r : jumlah perlakuan ulang sampel 4r - 4
≥ 15 4r
≥ 19 r
≥ 4,75 Jumlah perlakuan ulang r yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5 kali
pengulangan.
a. Penentuan nilai Kadar Hambat Minimum KHM Bahan coba dibagi dalam delapan kelompok dan kontrol bahan coba dua
kelompok, yaitu: 1. Kelompok I
: ekstrak dengan konsentrasi 20 = 5 sampel
2. Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 10
= 5 sampel 3. Kelompok III
: ekstrak dengan konsentrasi 5 = 5 sampel
4. Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 2,5
= 5 sampel 5. Kelompok V
: ekstrak dengan konsentrasi 1,25 = 5 sampel 6. Kelompok VI
: kontrol Mc Farland = 1 sampel 7. Kelompok VII
: kontrol negatif ekstrak akar siwak tanpa suspensi F.Nucleatum
= 1 sampel Jumlah sampel = 27 sampel
Dari masing – masing konsentrasi dilakukan dilusi pengenceran untuk mendapatkan konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
b. Penentuan nilai Kadar Bunuh Minimum KBM Dari hasil penentuan nilai KHM diperoleh beberapa kelompok yang dilanjutkan
perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Miles Misra. 1. Kelompok I
: ekstrak dengan konsentrasi 20 = 5 sampel
2. Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 10
= 5 sampel 3. Kelompok III
: ekstrak dengan konsentrasi 5 = 5 sampel
4. Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 2,5
= 5 sampel 5. Kelompok V
: ekstrak dengan konsentrasi 1,25 = 5 sampel 6. Kelompok VI
: kontrol Mc Farland = 1 sampel 7. Kelompok VII
: kontrol negatif ekstrak akar siwak tanpa suspensi F.Nucleatum
= 1 sampel Jumlah sampel = 27 sampel
3.4 Variabel dan Defenisi Operasional
3.4.1 Variabel Penelitian Variabel bebas
Ekstrak etanol siwak 20, 10, 5, 2,5,
1,25 Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri Fusobacterium nucletaum
pada media MHA dengan pengukuran nilai KHM
dan KBM
Variabel terkendali
a. Jenis dan tempat produksi b. Waktu pengeringan siwak
c. Suhu pengeringan siwak d. Berat siwak sebelum dan sesudah
pengeringan e. Media pertumbuhan bakteri Muller
Hinton Agar f. Fusocacterium nucletaum ATCC 25586
g. Suhu inkubasi h. Sterilisasi alat, bahan coba dan media
i. Waktu penguapan Rotavapor j. Suhu penguapan dengan Rotavapor
k. Jumlah kertas saring saat perkolasi l. Nomor kertas saring yang digunakan
m. Konsentrasi etanol yang digunakan n. Jumlah etanol yang digunakan
o. Waktu maserasi p. Suhu maserasi
q. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator r. Waktu pengamatan
s. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke
media
Variabel tidak terkendali
a. Lingkungan kondisi tanah dan iklim tempat tumbuh siwak
b. Usia batang siwak c. Perlakuan terhadap siwak selama tumbuh
d. Waktu dan suhu saat pengiriman ekstrak
siwak sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Surabaya.
e. Suhu saat pengiriman ekstrak ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
Surabaya
3.4.2 Variabel bebas
Ekstrak siwak yang diperoleh dengan ekstraksi menggunakan pelarut etanol dengan konsentrasi 20, 10, 5, 2.5, 1.25.
3.4.3 Variabel tergantung
Pertumbuhan Fusobacterium nucleatum pada media MHA dengan pengukuran nilai KHM dan KBM.
3.4.4 Variabel terkendali
a. Jenis dan tempat produksi Salvadora persica L , Sewak Al-Muslim, tempat produksi Riyadh, Saudi Arabia
b. Waktu pengeringan siwak 14 hari c. Suhu pengeringan siwak suhu 40ºC
d. Berat siwak sebelum dan sesudah dilakukan pengeringan sebelum pengeringan 1kg, setelah pengeringan 415gr
e. Media pertumbuhan bakteri Muller Hinton Agar dan Muller Hinton Broth f. Fusobacterium nucleatum ATCC 25586
g. Suhu inkubasi yaitu 37ºC h. Sterilisasi alat, bahan coba dan media
i. Waktu penguapan dengan Rotavapor 10 jam j. Suhu penguapan dengan Rotavapor 46ºC
k. Jumlah kertas saring saat perkolasi 3 lapis l. Nomor kertas saring yang digunakan Whatman No.42
m. Konsentrasi etanol yang digunakan etanol 70 n. Jumlah etanol yang digunakan 6 liter
o. Waktu maserasi 15 menit p. Suhu maserasi 25ºC
q. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator ±20 tetes menit r. Waktu pengamatan 24 jam
s. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke media MHA = 50µl, MHB = 1 ml
3.4.5 Variabel tidak terkendali
a. Lingkungan kondisi tanah dan iklim tempat tumbuh siwak b. Usia batang siwak
c. Perlakuan terhadap siwak selama tumbuh d. Waktu dan suhu saat pengiriman ekstrak siwak sampai ke Laboratorium Pusat
Penyakit Tropis Surabaya. e. Suhu saat pengiriman ekstrak ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
Surabaya.
3.4.6 Defenisi Operasional
NO VARIABEL
DEFENISI OPERASIONAL
CARA UKUR SKALA
UKUR ALAT
UKUR Variabel Bebas
1 Ekstrak etanol
siwak 20 Ekstrak yang didapat
dengan melarutkan 200 mg ekstrak kental siwak
dalam 1 ml MHB Sesuai SOP di
Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
UNAIR Rasio
Electronic balance dan
mikropipet
2 Ekstrak etanol
siwak 10 Ekstrak yang didapat
dengan mengambil
setengah dari konsentrasi ekstrak etanol 20 dan
dilarutkan dalam 1ml MHB
Sesuai SOP di Laboratorium Pusat
Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
3 Ekstrak etanol
siwak 5 Ekstrak yang didapat
dengan mengambil setengah dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 10 dan dilarutkan dalam 1 ml
MHB Sesuai SOP di
Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
UNAIR Rasio
Mikropipet
4 Ekstrak etanol
siwak 2,5 Ekstrak yang didapat
dengan mengambil setengah dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 5 dan dilarutkan dalam 1 ml
MHB Sesuai SOP di
Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
UNAIR Rasio
Mikropipet
5 Ekstrak etanol
siwak 1,25 Ekstrak yang didapat
dengan mengambil setengah dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 2,5 dan dilarutkan dalam 1 ml
MHB Sesuai SOP di
Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
UNAIR Rasio
Mikropipet
NO VARIABEL
DEFENISI OPERASIONAL
HASIL UKUR SKALA
UKUR ALAT UKUR
Variabel Tergantung
1 KHM kadar
Hambat Minimum
Konsentrasi minimal bahan coba yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri
yang secara visual dapat diamati
Dalam satuan CFUml Colony
forming unitmililiter
Rasio Visual dengan
bantuan mikroskop
2 KBM Kadar
Bunuh Minimum
Konsentrasi minimal bahan coba yang
dapat membunuh bakteri 99,9
Dalam satuan CFUml
Colony forming
unitmililiter Rasio
Visual dengan bantuan mikroskop
Metode Drop Plate Miles Misra
3.5 Bahan dan alat penelitian 3.5.1 Bahan penelitian
a. Siwak 1 kg Sewak Al-Muslim, tempat produksi Riyadh, Saudi Arabia
b. Etanol 70 sebanyak 6 liter Kimia Farma, Indonesia c. Aquadest
d. F. nucleatum ATCC 25586 Laboratorium Mikrobiologi Penyakit Tropis Universitas Airlangga Surabaya
e. Media Mueller Hinton Agar Difco, USA f. NaCl 0,9 Kimia Farma, Indonesia
3.5.2 Alat penelitian
a. Vaccum Rotary Evaporator Stuart, 2010 b. Autoklaf Tomy, Japan
c. Blender Panasonic, Japan d. Kertas saring Whatman no.42, England
e. Inkubator CO
2
Sanyo, Japan f. Perkolator
g. Kapas Bio Panca, Indonesia
h. Pipet mikro Gilson, France i. Aluminium foil 1 gulung Total Wrap, Indonesia
j. Ose dan Spiritus k. Piring petri Pyrex, Japan
l. Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan m. Electronic balance Ohyo JP2 6000, Japan
n. Kertas perkamen 3 kajang o. Erlenmeyer Pyrex, USA
p. Timbangan Home Line, China q. Timbangan analitik Vibra, Japan
r. Vortex whirli mixer Iwaki model TM 100, Japan
3.6 Metode pengumpulan data 3.6.1 Prosedur pembuatan ekstrak siwak
a. Siwak yang digunakan adalah batang siwak sebanyak 1 kg yang dipotong - potong dan dikeringkan didalam lemari pengering yang dialaskan kertas perkamen
selama 14 hari pada suhu 40ºC sampai siwak benar-benar kering. Batang siwak yang telah dikeringkan tersebut kemudian dihitung kembali dan didapat 415 gram siwak
kering. b. Siwak yang sudah kering kemudian dimemarkan dan diblender sampai
berupa serat- serat halus. c. Pada wadah dimasukkan serat-serat siwak sebanyak 300 gram dan direndam
dengan etanol 70 sebanyak 1500 ml, kemudian ditutup dan didiamkan selama 15 menit dengan suhu 25ºC.
d. Pada bagian dasar perkolator diberi kapas dan dilapisi dengan kertas saring sebanyak 2 lembar, kemudian masa dipindahkan sedikit demi sedikit kedalam
perkolator sambil sesekali ditekan dan diatasnya dilapisi selapis kertas saring. Perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dimaserasi selama 24 jam.
e. Setelah 24 jam, cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit, etanol ditambahkan berulang-ulang secukupnya hingga terdapat
selapis cairan penyari diatas simplisia jumlah etanol yang digunakan sebanyak 6 liter, ekstrak cair yang diperoleh sebanyak 5 liter.
f. Kemudian ekstrak cair diuapkan dengan alat vacum rotavapor pada suhu
46ºC selama 5 jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari. Penguapan dengan vacum roravapor dilakukan selama 2 hari karena jumlah keseluruhan ekstrak cair yang
diperoleh adalah 5 liter, sampai diperoleh ekstrak kental ekstrak kental sebanyak 58,669 gram ekstrak kental.
g. Ekstrak kental siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup, disimpan di tempat yang sejuk.
Gambar 5. Siwak masih dalam bungkusnya
Gambar 6. Siwak setelah dibuka bungkusnya
Gambar 7. Siwak ditimbang sebanyak
1 kg
Gambar 8. Siwak dipotong kecil-kecil Gambar 9. Siwak dikeringan dalam
ruang pengeringan
3.6.2 Pengenceran bahan coba
Ekstrak siwak ditimbang memakai electonic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara melarutkannya dengan media Mueller
Hinton Broth MHB. Sediakan 5 buah tabung, pada masing-masing tabung diisikan 1 ml MHB. Pada tabung pertama dimasukkan 200 mg ekstrak kental siwak kemudian
dicampur dengan menggunakan vorteks. Dari tabung pertama diambil setengahnya lalu dimasukkan ke tabung kedua, dari tabung kedua diambil lagi setengahnya lalu
dimasukkan ke tabung ketiga begitu seterusnya sampai tabung kelima sehingga didapat konsentrasi 20, 10, 5, 2,5 dan 1,25.
Gambar 10. Siwak yang sudah kering
kemudian ditimbang Gambar 11. Siwak
dimemarkan Gambar 12. Siwak diblender sampai
berupa serat-serat halus.
Gambar 13. Simplisia dimaserasi
Gambar 14. Simplisia diperkolasi
Gambar 15. Proses penguapan dengan rotavapor dan didapat ekstrak etanol
siwak
.
3.6.3 Pembuatan media bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Muller Hinton Agar, sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest kemudian dituangkan kedalam
petri 20 mlpetri, kemudian media disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 atm pada suhu 121ºC. Kemudian selama 24 jam media
dimasukkan dalam inkobator untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak.
3.6.4 Pembiakan spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Fusobacterium nucletaum yang digunakan adalah spesimen stem cell F. nucletaum ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang telah disiapkan
pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan
larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc Farland atau sebanding dengan jumlah 1 x 10
8
CFUml.
3.6.5 Penentuan nilai KHM dan KBM a. Penentuan KHM bahan coba
Ekstrak siwak yang dipakai terdiri dari konsentrasi 20, 10, 5, 2,5 dan 1,25. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya
dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba kemudian dicampur dengan vorteks. Lalu tabung tersebut diinkubasi pada
suhu 37ºC selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektofotometer, lalu bandingkan tabung-tabung tersebut dengan
kontrol Mc Farland untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan
merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Fusobacterium nucleatum dalam media pembenihan setelah
diinkubasi 24 jam dan secara visual diamati.
b. Penentuan KBM bahan coba
Hasil pengujian penentuan nilai KHM dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 20, 10, 5, 2,5 dan 1,25 dengan metode
Drop Plate Miles Misra. Setelah itu, bahan coba dengan konsetrasi di atas dicampur dengan vorteks dan diambil 50 µl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan kedalam media
padat MHA, direplikasi 5 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37ºC selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM dengan bantuan kaca
pembesar. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri.
Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai
adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian
dibuat jumlah rata-rata dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu, karena pada penelitian konsetrasi yang dilakukan perhitungan jumlah
koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada
media padat sebanyak 50µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standard CFUml.
3.7 Pengolahan dan analisis data
Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan memakai uji statistik sebagai berikut:
1. Uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap pertumbuhan F. nucleatum
2. Uji Least Significant Difference LSD, untuk melihat perbedaan efek antibakteri antar masing-masing kelompok perlakuan.
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstraksi Siwak Salvadora persica L
Ekstrak etanol siwak berasal dari 300 gram serbuk simplisia yang dilarutkan dengan pelarut etanol 70 kemudian diuapkan dengan Vacum rotary evaporator
sehingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 58,669 gram. Ekstrak kental kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup dan disimpan didalam lemari pendingin.
1.1 Uji Efektifitas Antibakteri
Pada penelitian ini untuk melihat efek antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap Fusobacterium nucletaum dan menentukan nilai KHM konsentrasi minimal bahan coba
yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri dan KBM konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99,9 bakteri dilakukan dengan cara menghitung jumlah
koloni bakteri pada media pertumbuhan bakteri secara visual dengan bantuan mikroskop.
Gambar 9. Ekstrak kental siwak
Kategori