Daya atibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) terhadap Fusobacterium nucleatum sebagai bahan medikamen saluran akar secara in vitro.

DAYA ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL BUAH MAHKOTA

DEWA (PHALERIA MACROCARPA [SCHEFF.] BOERL.)

TERHADAP FUSOBACTERIUM NUCLEATUM

SEBAGAI BAHAN MEDIKAMEN SALURAN

AKAR SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi tugas dan melengkapi syarat guna memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Gigi

Oleh:

CAROLINA MONICA KERE NIM : 070600072

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

DEPARTEMEN ILMU KONSERVASI GIGI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

Fakultas Kedokteran Gigi

Departemen Ilmu Konservasi Gigi

Tahun 2011

Carolina Monica Kere

Daya atibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) terhadap Fusobacterium nucleatum sebagai bahan medikamen saluran akar secara in vitro.

xii + 60

Fusobacterium nucleatum merupakan salah satu bakteri yang paling banyak ditemukan pada infeksi saluran akar dengan persentase insidens sebesar 48%, dan sering ditemui pada kasus flare up endodonti. Prosedur preparasi saluran akar hanya dapat membuang 75% mikroorganisme, karena itu diperlukan bahan medikamen saluran akar untuk mengeliminasi bakteri dalam saluran akar yang terinfeksi. Kalsium hidroksida adalah salah satu pilihan bahan medikamen terbaik yang paling sering digunakan. Tetapi kalsium hidroksida diteliti memiliki beberapa kelemahan, sehingga perlu dikembangkan bahan medikamen alternatif. Saat ini banyak penelitian dilakukan untuk mencari bahan alternatif yang berasal bahan alami. Buah mahkota dewa merupakan salah satu alternatif yang dapat dipilih sebagai bahan medikamen saluran akar karena terdapat kandungan senyawa yang berkhasiat sebagai bahan antibakteri, yaitu saponin, tanin, polifenol, dan alkaloid.

Penelitian dimulai dengan melakukan ekstraksi buah mahkota dewa menggunakan pelarut etanol 96%. Buah mahkota dewa segar sebanyak 1000 gram

diolah hingga menghasilkan 100 gram simplisia. Simplisia dimaserasi dan dimasukkan ke dalam perkulator untuk diperkolasi dengan pelarut etanol 96% sebanyak 5 liter sehingga diperoleh 4 liter perkolat cair. Perkolat diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental buah mahkota dewa. Untuk mengetahui daya antibakteri buah mahkota dewa dalam menghambat pertumbuhan bakteri F.nucleatum dilakukan dengan menentukan nilai KHM dan KBM pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,125%, 3,125%, dan 1,65%.

Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanol buah mahkota dewa memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Fusobacterium nucleatum dengan nilai KHM dan KBM 3,125 %.

LEMBAR PENGESAHAN

SKRIPSI INI TELAH DISETUJUI UNTUK DISEMINARKAN PADA TANGGAL 5 AGUSTUS 2011

OLEH : Pembimbing I

Prof.Trimurni Abidin, drg., M.Kes., Sp.KG (K) NIP : 19500828 197902 2 001

Pembimbing II

Darwis Aswal, drg. NIP : 19560516 198303 1 003

Mengetahui

Ketua Departemen Ilmu Konservasi Gigi Fakultas Kedokteran Gigi

Universitas Sumatera Utara

Cut Nurliza, drg., M.Kes NIP : 19560105 198203 2 002

PERNYATAAN PERSETUJUAN Skripsi berjudul

DAYA ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL BUAH MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) TERHADAP Fusobacterium nucleatum SEBAGAI BAHAN MEDIKAMEN SALURAN AKAR SECARA In Vitro

Yang dipersiapkan dan disusun oleh : CAROLINA MONICA KERE

NIM : 070600072

Telah dipertahankan didepan tim penguji pada tanggal 5 Agustus 2011

dan dinyatakan telah memenuhi syarat untuk diterima Susunan Tim Penguji Skripsi

Ketua Penguji

Prof.Trimurni Abidin, drg., M.Kes, Sp.KG(K) NIP : 19500828 197902 2 001

Anggota tim penguji lain

Darwis Aswal,drg. Bakri Soeyono, drg. Cut Nurliza, drg., M.Kes NIP : 19560516 198303 1 003 NIP : 19450702 197802 1 001 NIP : 19560105 198203 2 002

Medan, 4 Agustus 2011 Fakultas Kedokteran Gigi Departemen Ilmu Konservasi Gigi

Ketua,

Cut Nurliza, drg., M.Kes NIP : 19560105 198203 2 002

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat dan kasihNya yang senantiasa menyertai dan memberikan kekuatan kepada penulis sehingga skripsi ini telah selesai disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana Kedokteran Gigi.

Dalam pelaksanaan penelitian dan penulisan skripsi ini, penulis telah banyak mendapat bimbingan, pengarahan, saran-saran dan bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, dengan penuh ketulusan dan kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Prof. H. Nazruddin, drg., C.Ort., Ph.D., Sp.Ort selaku Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

2. Cut Nurliza, drg., M.Kes selaku Ketua Departemen Ilmu Konservasi Gigi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

3. Prof. Trimurni Abidin, drg., M.Kes, Sp.KG (K) selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktu dan pikiran baik dalam pendidikan dan penulisan skripsi ini sehingga dapat diselesaikan dengan baik.

4. Darwis Aswal, drg. selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktu dan pikiran dalam penulisan skripsi ini.

5. Wilda Hafni Lubis, drg., M.Si selaku dosen pembimbing akademik yang senantiasa memberikan semangat dan masukan selama penulis menjalani pendidikan di Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

6. Seluruh staff pengajar dan pegawai di Departemen Ilmu Konservasi Gigi Universitas Sumatera Utara.

7. Awalludin, M.Si., Apt selaku kepala Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah banyak memberikan masukan dan bantuan dalam kegiatan ekstraksi.

8. Wahyu Hidayahtiningsih, S.Si., M.Kes selaku peneliti pada Laboratorium Tropical Disease Centre Universitas Airlangga yang telah banyak membantu peneliti terutama dalam kegiatan penelitian di laboratorium.

9. Senior saya, Kak Lusiana Beatrice,SKG dan Bang Muktar Hutasoit,SKG terima kasih atas dukungan doa dan semangat bagi penulis.

10. Teman-teman terkasih, Kak Irma, Kak Sabrina, Rindu, Dayuni, Lenaria dan Soli, juga bagi sahabat-sahabat terbaik, Bella, Tri Sari, Haspeni, Isfayanti, teman angkatan 2007 Ristoria, Ester, Natalia, Steven Wijaya, Ulipe, dan teman-teman lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu serta adik Fadil Pradana atas dukungan, bantuan dan kebersamaan selama menjalani pendidikan di Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

11. Seluruh staf pengajar dan pegawai di Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

Ucapan terima kasih yang khusus penulis berikan kepada orangtua terkasih, Ayahanda Reinhart Antonius Kere dan Ibunda Mathilda Agatha Tamaela atas segala doa, perhatian, kasih sayang, semangat, nasehat serta dukungan baik moril maupun materil.

Penulis juga mengucapkan rasa saying dan terima kasih kepada saudara penulis Reinly Alfa Kere, S.Kom, Vini Maureen Kere, dan Lionel Septian Kere yang selalu mendukung penulis dan menjadi sumber semangat bagi penulis.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada keluarga yang turut andil dalam memberikan bantuan baik moril maupun materil atas penyelesaian pendidikan dan skripsi ini. Juga kepada teman-teman dalam penelitian di Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, terima kasih untuk kebersamaan dan keakraban yang terjalin dengan baik selama penelitian.

Akhirnya penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah memberi bantuan kepada penulis dan memohon maaf apabila ada kesalahan selama penyusunan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan memberikan sumbangan pikiran yang berguna bagi fakultas, pengembangan ilmu dan masyarakat.

Medan, 5 Agustus 2011

Penulis,

(Carolina Monica Kere)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL... i

HALAMAN PENGESAHAN JUDUL... ii

HALAMAN PERSETUJUAN... iii

KATA PENGANTAR... iv

DAFTAR ISI... vii

DAFTAR TABEL………... ix

DAFTAR GAMBAR... x

DAFTAR LAMPIRAN………... xii

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar belakang... 1

1.2 Perumusan masalah... 4

1.3 Tujuan penelitian... 5

1.4 Manfaat Penelitian... 5

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Bahan Medikamen Saluran Akar... 7

2.2 Fusobacterium nucleatum sebagai salah satu bakteri yang terdapat pada infeksi saluran akar... 10

2.3 Tanaman Mahkota Dewa... 15

2.4 Nilai Farmakologis Mahkota Dewa... 17

BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1 Kerangka Konsep... 21

3.2 Hipotesis Penelitian... 23

BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian... 24

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian... 24

4.3 Sampel dan Besar Sampel... 24

4.5 Defenisi Operasional... 28 4.6 Bahan dan Alat Penelitian... 29 4.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data... 30 BAB 5 HASIL PENELITIAN

5.1 Ekstraksi Buah Mahkota Dewa... 36 5.2 Uji Efektivitas Antibakteri... 37 BAB 6 PEMBAHASAN... 41 BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan... 48 7.2 Saran... 48

DAFTAR RUJUKAN... 49

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Bakteri yang diisolasi dari saluran akar gigi dengan lesi apikal... 12 2. Perhitungan jumlah bakteri untuk bahan coba ekstrak etanol

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Koloni Fusobacterium nucleatum dengan scanning

electron micrograph... 11

2. Agregasi F.nucleatum dan P.gingivalis dengan scanning electron micrograph... 14

3. Buah Mahkota Dewa... 16

4. Tanaman mahkota dewa yang berasal dari Kel.Karangsari Kec. Medan Polonia... 31

5. Buah mahkota dewa 1000 gram, diiris dan dikeringkan dalam lemari pengering... 31

6. Simplisia kering yang dihaluskan... 31

7. Pengayakan simplisia menjadi serbuk 100 gram... 32

8. Penambahan etanol hingga didapat maserat cair 4 liter... 32

9. Penguapan maserat pada vaccum rotary evaporator... 32

10. Ekstrak kental buah mahkota dewa dengan pelarut etanol... 32

11. Ekstrak kental buah mahkota dewa (konentrasi100%) dengan pelarut etanol... 36

12. Suspensi bakteri Fusobacterium nucleatum sebelum berkontak dengan bahan coba... 37

13. Suspensi bakteri Fusobacterium nucleatum setelah berkontak dengan bahan coba pada berbagai konsentrasi... 38

14. Koloni Mac Farland 0,5………... 39

15. Hasil peletakan tetsan konsentrasi 3,125% ekstrak etanol buah mahkota dewa setelah diinkubasi 24 jam………... 39

16. Koloni yang terbentuk pada media MHA dengan konsentrasi ekstrak buah mahkota dewa 1,56%, pada (A) replikasi 1, (B) replikasi 2, (C) replikasi 3, (D) replikasi 4, (E) replikasi 5,

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Skema Alur Pikir... 52 2. Skema Alur Penelitian... 55 3. Data Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri pada Pengukuran

MBC Buah Mahkota Dewa……….. 58

Fakultas Kedokteran Gigi

Departemen Ilmu Konservasi Gigi

Tahun 2011

Carolina Monica Kere

Daya atibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) terhadap Fusobacterium nucleatum sebagai bahan medikamen saluran akar secara in vitro.

xii + 60

Fusobacterium nucleatum merupakan salah satu bakteri yang paling banyak ditemukan pada infeksi saluran akar dengan persentase insidens sebesar 48%, dan sering ditemui pada kasus flare up endodonti. Prosedur preparasi saluran akar hanya dapat membuang 75% mikroorganisme, karena itu diperlukan bahan medikamen saluran akar untuk mengeliminasi bakteri dalam saluran akar yang terinfeksi. Kalsium hidroksida adalah salah satu pilihan bahan medikamen terbaik yang paling sering digunakan. Tetapi kalsium hidroksida diteliti memiliki beberapa kelemahan, sehingga perlu dikembangkan bahan medikamen alternatif. Saat ini banyak penelitian dilakukan untuk mencari bahan alternatif yang berasal bahan alami. Buah mahkota dewa merupakan salah satu alternatif yang dapat dipilih sebagai bahan medikamen saluran akar karena terdapat kandungan senyawa yang berkhasiat sebagai bahan antibakteri, yaitu saponin, tanin, polifenol, dan alkaloid.

Penelitian dimulai dengan melakukan ekstraksi buah mahkota dewa menggunakan pelarut etanol 96%. Buah mahkota dewa segar sebanyak 1000 gram

diolah hingga menghasilkan 100 gram simplisia. Simplisia dimaserasi dan dimasukkan ke dalam perkulator untuk diperkolasi dengan pelarut etanol 96% sebanyak 5 liter sehingga diperoleh 4 liter perkolat cair. Perkolat diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental buah mahkota dewa. Untuk mengetahui daya antibakteri buah mahkota dewa dalam menghambat pertumbuhan bakteri F.nucleatum dilakukan dengan menentukan nilai KHM dan KBM pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,125%, 3,125%, dan 1,65%.

Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanol buah mahkota dewa memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Fusobacterium nucleatum dengan nilai KHM dan KBM 3,125 %.

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Penyakit pulpa dan jaringan sekitar akar gigi secara langsung maupun tidak langsung ada hubungannya dengan mikroorganisme. Bakteri yang paling banyak diisolasi dari saluran akar yang terinfeksi dengan pulpa terbuka adalah obligat anaerob.1 Menurut Sundqvist (1992), Fusobacterium nucleatum merupakan salah satu bakteri yang paling banyak ditemukan pada infeksi saluran akar dengan persentase insidens sebesar 48%.2

Fusobacterium nucleatum adalah bakteri anaerob gram negatif, dan mengadakan perlekatan melalui interaksi spesifik antara lipopolisakarida yang dihasilkannya yang mampu larut dalam saliva. Lipopolisakarida memiliki kemampuan untuk mengadakan perlekatan pada struktur hidroksiapatit, serum, dan sementum. Hal ini menunjukkan bahwa lipopolisakarida dari F.nucleatum memegang peranan penting dalam proses perlekatannya, bukan hanya pada epitel, tetapi juga pada struktur gigi.3

Fusobacterium nucleatum sering ditemukan pada kasus flare up endodonti, dan keberadaan bakteri ini dapat menyebabkan rasa sakit yang parah disertai dengan pembengkakkan.4 Kombinasi dari F.nucleatum, Prevotella sp., dan Porphyromonas sp. merupakan faktor resiko terjadinya flare up endodonti, hal ini disebabkan karena adanya sinergi antara bakteri tersebut, sehingga meningkatkan intensitas terjadinya reaksi inflamasi pada jaringan periapeks.5 Selain itu F.nucleatum bersama dengan

P.Gingivalis memegang peranan penting pada lesi endo-perio melalui agregasi kedua bakteri tersebut.6

Perawatan kasus endodonti membutuhkan penggunaan bahan medikamen yang mampu mengeliminasi endotoksin bakteri yang telah melekat pada struktur gigi yang tidak tereliminasi sempurna saat proses instrumentasi saluran akar.3 Penggunaan bahan medikamen saluran akar selama perawatan endodonti harus dapat mensterilisasi dan mengurangi jumlah mikroorganisme patogen dalam saluran akar. Berbagai bahan medikamen yang sering digunakan antara lain kalsium hidroksida (Ca(OH)2), antibiotik, non-phenolic biocides, penolic biocides, dan bahan iodin. Medikamen saluran akar digunakan dengan tujuan mengeliminasi bakteri yang tidak dapat dihancurkan dengan proses chemo-mechanical seperti instrumentasi dan irigasi.7,8

Bahan medikamen yang umum digunakan saat ini adalah kalsium hidroksida (Ca(OH)2). Bahan ini digunakan sebagai medikamen antar kunjungan terapi endodonti dan memiliki sifat antibakteri yang sangat baik. Sjorgen et al, (1991) menyatakan bahwa sifat antibakteri kalsium hidroksida disebabkan oleh penguraian ion-ion Ca2+ dan OH-.9 Keuntungan lain yang diperoleh dari penggunaan kalsium hidroksida adalah efeknya yang tahan lebih lama jika dibandingkan dengan bahan medikamen lainnya.10 Namun, menurut Tam et al, (1989) kalsium hidroksida juga memiliki beberapa kelemahan, di antaranya kekuatan kompresif yang rendah sehingga dapat berpengaruh pada kestabilan kalsium hidroksida terhadap cairan di dalam saluran akar yang akhirnya dapat melarutkan bahan medikamen saluran akar. Selain itu, Haapasalo et al dan Porteiner et al melaporkan bahwa dentin dapat

menginaktifkan aktivitas antibakteri kalsium hidroksida karena adanya kemampuan buffer dentin yang menghambat kerja kalsium hidroksida.11 Penelitian oleh Peters et al, (2002) menunjukkan jumlah saluran akar yang positif mengandung bakteri meningkat setelah perawatan saluran akar dengan kalsium hidroksida.10 Disebutkan juga semakin lama Ca(OH)2 digunakan sebagai medikamen pada gigi dewasa muda, semakin meningkatkan resiko terjadinya fraktur akar. Kalsium hidroksida mampu menyebabkan resopsi interna yang meningkatkan resiko fraktur akar pada gigi dewasa muda.12 Oleh karena itu, sangat diharapkan berkembangnya aplikasi bahan medikamen yang berasal dari alam dan kompatibel terhadap jaringan, namun tetap memiliki kemampuan yang sama dengan bahan non-biologi.

Bahan alami yang mungkin dapat dikembangkan sebagai alternatif medikamen saluran akar adalah tanaman mahkota dewa (Phaleria macrocarpa

[Scheff.] Boerl.). Pemanfaatan tanaman mahkota dewa ini secara tradisional adalah sebagai tanaman yang sejak lama dikenal dapat memiliki khasiat untuk mengobati luka, diabetes, lever, flu, alergi, sesak nafas, desentri, penyakit kulit, diabetes, jantung, ginjal, dan kanker.13,14 Efek terapeutik buah mahkota dewa erat hubungannya dengan senyawa kimia yang terkandung di dalamnya. Telah diketahui bahwa biji mahkota dewa bersifat toksik sedangkan daging buahnya tidak. Potensi penghambatan daging buah mahkota dewa lebih besar jika dibandingkan dengan akar, kulit batang, maupun daunnya.15 Komposisi aktif buah mahkota dewa adalah tanin, flavonoid, saponin dan alkaloid.13,14,15

Dalam bidang kedokteran gigi, penelitian mengenai zona hambat infusum daun mahkota dewa pada pertumbuhan Streptococcus mutans memperlihatkan bahwa

semakin tinggi konsentrasi infusum daun mahkota dewa, maka semakin besar zona inhibisinya.16 Penelitian infusum daun mahkota dewa terhadap Staphylococcus aureus menunjukkan kemampuan antibakteri diperoleh dengan nilai KHM 3,125% dan KBM 6,25%.16 Penelitian mengenai daya antibakteri ekstrak buah mahkota dewa dalam menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis, disimpulkan bahwa ekstrak buah mahkota dewa memiliki kemampuan daya antibakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis dengan nilai KHM dan KBM 12,5%.17

Dari uraian tersebut, timbul pemikiran untuk meneliti daya antibakteri daging buah mahkota dewa terhadap bakteri F.nucleatum. Pengujian aktivitas antibakteri pada penelitian ini menggunakan metode dilusi untuk mencari nilai KHM dan KBM yang merepresentasikan daya antibakteri buah mahkota dewa terhadap F.nucleatum. Kultur bakteri diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam karena pada suhu dan waktu tersebut F.nucleatum dapat bertumbuh dengan optimal.

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan uraian pada latar belakang, timbul permasalahan sebagai berikut: 1. Apakah ekstrak etanol buah mahkota dewa dapat menghambat pertumbuhan

Fusobacterium nucleatum jika akan digunakan sebagai bahan alternatif medikamen saluran akar?

2. Berapa konsentrasi minimal ekstrak etanol buah mahkota dewa yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Fusobacterium nucleatum ?

1.3 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah:

1. Untuk mengetahui daya hambat ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap

Fusobacterium nucleatum jika akan digunakan sebagai bahan alternatif medikamen saluran akar.

2. Untuk mengetahui konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Fusobacterium nucleatum.

1.4 Manfaat Penelitian

Dengan adanya penelitian ini, diharapkan:

1. Potensi pendayagunaan tanaman mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) yang ada di Indonesia dapat dikembangkan sebagai bahan alternatif medikamen saluran akar.

2. Meningkatkan pemanfaatan bahan alami yang bersifat biokompatibel terhadap jaringan periapikal sebagai bahan material kedokteran gigi.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

Tindakan pembersihan dan pembentukan saluran akar adalah salah satu tahap terpenting. Cleaning adalah tindakan pengambilan dan pembersihan seluruh jaringan pulpa serta jaringan nekrotik yang dapat memberi kesempatan tumbuhnya kuman.

Shaping yaitu tindakan pembentukan saluran akar untuk persiapan pengisian. Selain itu, pemakaian instrumen serta medikamen saluran akar juga harus diperhatikan. Penggunaan bahan medikamen dalam perawatan endodonti merupakan salah satu langkah yang penting.7

Suatu bahan medikamen saluran akar yang ideal diharapkan mampu megeliminasi bakteri dalam saluran akar yang tidak tereliminasi pada prosedur eliminasi, mampu mengurangi rasa sakit maupun inflamasi periradikular, mampu mengeliminasi eksudat apikal, serta mencegah resopsi akar dan infeksi ulang.7

Secara historis, bahan medikamen yang digunakan selama ini yakni bahan yang berbasis fenol, seperti formocresol, camphorated monoparachlorophenol (CMCP), metacresyl acetate, eugenol dan thymol. Formocresol merupakan kombinasi formaline dan tricresol dengan perbandingan 1:1. Formocresol serta bahan yang berbasis fenol lainnya memiliki daya hambat terhadap bakteri namun efeknya hanya beberapa waktu saja.18

Medikamen ini (terutama golongan fenol) tidak lagi direkomendasikan karena bersifat antigenik dan sitotoksik, sehingga menyebabkan nekrosis dan peradangan.

bermanfaat sama sekali jika digunakan sebagai medikamen antar kunjungan.18,19 Setelah instrumentasi pada pulpa yang nekrosis, direkomendasikan memakai kalsium hidroksida. Efek antimikrobanya antar-kunjungan lebih kuat dibandingkan dengan material yang telah disebutkan di atas.9,10

2.1Bahan Medikamen Saluran Akar

Fungsi antimikroba dari medikasi intrakanal antar kunjungan adalah hal yang sangat penting. Mikroorganisme yang masih tertinggal akan berkembang biak. Sesungguhnya, pernah dianggap bahwa keberhasilan perawatan, baik untuk jangka pendek maupun jangka panjang, bergantung pada medikamen yang diletakkan dalam saluran akar pada waktu antar kunjungan. 8,9

Adanya bakteri tidak hanya menyebabkan lesi periapikal, tetapi juga turut dalam mekanisme pertahanan lesi tersebut. Tindakan medikasi intrakanal merupakan tahap perawatan endodonti yang penting sebab jika diabaikan dapat menyebabkan kegagalan perawatan.19,20

Jadi medikamen saluran akar ditujukan untuk (1) memperoleh aktivitas antimikroba di pulpa dan periapeks, (2) menetralkan sisa-sisa debris di saluran akar dan menjadikannya inert, (3) mengontrol dan mencegah nyeri pasca perawatan.8

Bahan medikamen saluran akar yang telah dipakai selama ini antara lain: a. Bahan berbasis fenol

Terbagi atas parachlorophenol, champhorated monoparachlorophenol

bertahan lama, menimbulkan bau tidak sedap, toksik terhadap jaringan dan melemahkan sifat bahan tumpatan.18

b. Kombinasi antibiotik-steroid

Memiliki efek bakterisida yang kuat terhadap bakteri. Mengandung

kortikosteroid yang berguna mengurangi peradangan dan antibiotik untuk menghambat pertumbuhan bakteri saluran akar. Tetapi keberadaan kedua kandungan tersebut perlu diperhatikan mengingat efek samping yang ditimbulkan dari kandungan kortikosteroid akan menurunkan kemampuan regenerasi sel dan jaringan serta menghambat pembentukan fibroblast dan antibodi. Kandungan antibiotikanya juga berakibat kurang baik untuk pemakaian jangka panjang.18

c. Formokresol

Merupakan kombinasi formaline dan tricresol dalam perbandingan 1:2 atau 1:1. Formokresol merupakan bahan medikamen yang tidak spesifik dan sangat efektif terhadap mikroorganisme aerob dan anaerob yang ditemukan dalam saluran akar. Tetapi formokresol disebutkan juga menghasilkan iritasi derajat tinggi dan menyebabkan nekrosis yang bertahan selama 2-3 bulan, sehingga bersifat toksik.18

d. Kalsium hidroksida

Kalsium hidroksida (Ca(OH)2) telah digunakan sejak 1920 sebagai bahan medikamen saluran akar. Kalsium hidroksida saat ini merupakan medikamen saluran akar yang paling sering digunakan.9,10

Kalsium hidroksida terbukti sebagai bahan biokompatibel, pH bahan kalsium hidroksida berkisar antara 12,5-12,8. Kalsium hidroksida memiliki kelarutan yang rendah terhadap air, serta tidak dapat larut dalam alkohol. Karena sifat yang

dimilikinya, kalsium hidroksida dinilai efektif dalam melawan mikroba anaaerob yang berada pada pulpa gigi yang nekrosis. Keuntungan lain adalah bahan kalsium hidroksida memiliki keefektifan dalam waktu yang cukup lama jika dibandingkan dengan bahan medikamen lainnya, dan pada beberapa kasus perawatan saluran akar bahan ini dapat bertahan selama beberapa bulan dalam saluran akar .9,10

Mekanisme antimikroba Ca(OH)2 terjadi dengan pemisahan ion calcium dan

hydroxyl ke dalam reaksi enzimatik pada bakteri dan jaringan, menginhibisi replikasi DNA serta bertindak sebagai barrier dalam mencegah masuknya bakteri dalam sistem saluran akar. Ion hydroxyl akan mempengaruhi kelangsungan hidup bakteri anaerob. Difusi ion hydroxyl (OH-) menyebabkan lingkungan alkaline sehingga tidak kondusif bagi pertahanan bakteri dalam saluran akar. Ion calcium memberi efek terapeutik yang dimediasi melalui ionchannel.9

Walaupun demikian, dari beberapa penelitian, didapati bahwa Ca(OH)2 juga memiliki beberapa kelemahan. Menurut Tam et al, (1989) kalsium hidroksida juga memiliki beberapa kelemahan, di antaranya kekuatan kompresif yang rendah sehingga dapat berpengaruh pada kestabilan kalsium hidroksida terhadap cairan di dalam saluran akar yang akhirnya dapat melarutkan bahan medikamen saluran akar. Selain itu, Haapasalo et al dan Porteiner et al melaporkan bahwa dentin dapat menginaktifkan aktivitas antibakteri kalsium hidroksida, hal ini berkaitan dengan kemampuan buffer dentin yang menghambat kerja kalsium hidroksida. Kemampuan buffer dentin menghambat terjadinya kondisi alkaline yang dibutuhkan untuk membunuh bakteri, juga menghambat penetrasi ion hydroxyl ke jaringan pulpa.10 Begitu juga penelitian Peters et al, (2002) menunjukkan jumlah saluran akar yang

positif mengandung bakteri meningkat setelah perawatan saluran akar dengan kalsium hidroksida.10 Disebutkan juga semakin lama Ca(OH)2 digunakan sebagai medikamen pada gigi dewasa muda, semakin meningkatkan resiko terjadinya fraktur akar. Kalsium hidroksida menyebabkan resopsi interna sehingga gigi mudah fraktur.12

Gomes et al, 2002 beranggapan bahwa walaupun kalsium hidroksida direkomendasikan sebagai bahan medikasi intrakanal pada perawatan periodontitis apikalis, bukan berarti bahwa pemakaian kalsium hidroksia dapat digunakan secara universal, karena kalsium hidroksida tidak menunjukkan kemampuan yang sama terhadap seluruh bakteri.21

Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa penemuan-penemuan bahan perawatan saluran akar selama ini menggunakan bahan sintetis yang memiliki efek antibakteri yang tinggi, tetapi mempunyai efek samping terhadap jaringan gigi. Oleh karena itu, perlu dikembangkan bahan alami bersifat biokompatibel terhadap saluran akar.

2.2 Fusobacterium nucleatum sebagai salah satu bakteri yang terdapat

pada infeksi saluran akar

Penelitian telah membuktikan bahwa Fusobacterium nucleatum, adalah flora normal rongga mulut dan merupakan salah satu bakteri penyebab infeksi saluran akar yang simpomatik.1,3

Menurut taksonominya, Fusobacterium nucleatum diklasifikasikan berdasarkan:

Kingdom : Bacteria Filum : Fusobacteria Famili : Bacteriodaceae Genus : Fusobacterium

Spesies: Fusobacterium nucleatum.3

F.nucleatum adalah bakteri obligat anaerob gram negatif yang tidak berspora dan non motil. Selnya berbentuk batang, dengan bagian ujung yang tajam dan panjang yang bervariasi. F.nucleatum memerlukan media yang baik untuk tumbuh dan biasanya tumbuh subur pada media yang mengandung trypticase, peptone dan ekstrak ragi.F.nucleatum menggunakan asam amino untuk menghasilkan energi serta menggunakan glukosa untuk reaksi biosintesis molekul interseluler.3

Gambar 1. Koloni Fusobacterium nucleatum dengan scanning electron micrograph.7

Penelitian Jacinto RC et al (2003) dari 48 saluran akar gigi diisolasi bakteri obligat anaerob sebesar 74,77%. Bakteri yang mendominasi hasil penelitiannya

adalah Fusobacterium necrophorum (15 kasus), Anaerococcis prevotii (14 kasus),

Peptostreptococcus (13 kasus), Streptococcus sanguis (11 kasus) dan Fusobacterium nucleatum (11 kasus).

Tabel 1. Bakteri yang diisolasi dari saluran akar gigi dengan lesi apikal.2

Bakteri Persentase Indeks

Fusobacterium nucelatum Streptococcus sp. Bacteroides sp. Prevotella intermedia Peptostreptococcus micros Eubacterium alactolyticum Peptostreptococcus anaerobicus Lactobasillus sp. Eubacterium lentum Fusobacterium sp. Campylobacter sp. Peptostreptococcus sp. Actinomyces sp. Eubacterium timidum Capnocytophaga ochracea Eubacterium brachy Selemonas sputigena Veinlonella parvulla Porphyromonas endodontalis Provotella buccae Provotella oralis Propionibacterium propionicum Prevotella denticola Prevotella loeschii Eubacterium notadum 48 40 35 34 34 34 31 32 31 29 25 15 15 11 11 9 9 9 9 9 8 8 6 6 6

Pada tabel 1 terlihat berbagai spesies yang diisolasi dari saluran akar gigi dengan lesi periapeks. Fusobacterium nucleatum menempati urutan pertama sebagai isolat dominan, dengan persentase insidens 48%.

Fusobacterium nucleatum adalah bakteri yang umum diisolasi pada plak gigi.

Fusobacterium nucleatum juga sering dihubungkan dengan infeksi periodontal, dapat juga menginfeksi kepala dan leher, dada, paru-paru, hati, dan perut.3

Membran luar bakteri ini mempunyai karakteristik bakteri gram negatif. Sel bakteri dilindungi oleh membran luar dan dalam yang dipisahkan oleh ruang periplasmik yang mengandung lapisan peptidoglikan. Pada umumnya, membran dalam bakteri gram negatif merupakan dua lapisan fosfolipid yang simetris dimana perbandingan fosfolipid dan protein sama besar. Membran luar berfungsi sebagai penyaring molekul dan merupakan membran asimetrik yang terdiri dari lapisan fosfolipid, lipopolisakarida, lipoprotein dan protein.3

Kompleks lipopolisakarida secara umum dikaitkan sebagai zat endotoksin yang dapat menyebabkan biological effects yaitu aktivasi komplemen, sitotoksisitas, dan resopsi tulang. Lipopolisakarida memegang peranan penting dalam proses perlekatannya dan mampu larut dalam saliva. Lipopolisakarida yang diproduksi oleh

F.nucleatum memungkinkan bakteri ini melekat pada struktur hidroksiapatit, serum dan sementum. Hal ini menunjukkan bahwa lipopolisakarida dari F.nucleatum

memegang peranan penting dalam proses perlekatannya, bukan hanya pada epitel, tetapi juga permukaan gigi.3

Polisakarida yang dihasilkan F.nucleatum merupakan potent agent yang dapat menyebabkan pembentukan antibodi host walau hanya dalam konsentrasi yang sangat

rendah. Bakteri gram negatif anaerob sering sekali diisolasi dari gigi dengan infeksi saluran akar, oleh karena itu endotoksin bakteri mungkin menyebabkan iritasi jaringan periapikal dan berperan penting dalam patogenesis lesi inflamasi dan pulpa.3

Sebagian besar bakteri spesies F.nucleatum menghasilkan asam butirat dan mengubah treonin menjadi asam propionat. Butirat, propionat dan ion amonium merupakan produk hasil metabolisme F.nucleatum yang dapat menghambat proliferasi sel fibroblas pada gingiva. Kejadian ini memberikan jalan bagi

F.nucleatum untuk melakukan penetrasi ke epitel gingiva. Asam butirat yang dihasilkan juga dapat mengiritasi jaringan.3

Pada keadaan defisiensi nutrisi, F.nucleatum mampu memecah kandungan glukosa dari struktur interseluler dan memanfaatkannya sebagai sumber energi. Hal ini akan mendorong bakteri lain berpindah pada sekitar permukaan sel F.nucleatum

dan selanjutnya berikatan dengan dinding sel F.nucleatum. Secara in vivo ditemukan hubungan antara F.nucleatum dengan P.gingivalis oleh karena hubungan interaksinya akan menghasilkan enzim proteolitik dan agregasi kedua bakteri ini menghasilkan efek sinergisme, yang terjadi pada kasus infeksi endo-perio.3,6

Gambar 2. Agregasi F.nucleatum (bentuk batang) dan P.gingivalis (bentuk kokus) dengan scanning electron micrograph 5.

2.3 Tanaman Mahkota Dewa

Bahan alami (khususnya tumbuh-tumbuhan) merupakan keanekaragaman hayati yang masih sangat sedikit menjadi subjek penelitian ilmiah di Indonesia, padahal Indonesia merupakan negara yang memiliki kekayaan keanekaragaman hayati terbesar di dunia dengan lebih kurang 30.000 jenis tumbuh-tumbuhan berikut biota lautnya. Dari sekian besar jumlah tersebut, baru sekitar 940 spesies yang diketahui bersifat terapeutik melalui penelitian ilmiah dan hanya sekitar 180 spesies di antaranya yang telah dimanfaatkan dalam temuan obat tradisional oleh industri obat tradisional Indonesia.15

Tanaman mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) merupakan tamanan obat yang sudah dikenal dan saat ini semakin diminati masyarakat. Asal tanaman mahkota dewa masih belum diketahui. Menilik nama botaninya Phaleria papuana, banyak orang yang memperkirakan tanaman ini populasi aslinya dari tanah Papua, Irian Jaya. Dan dewasa ini, pengobatan dengan memanfaatkan mahkota dewa semakin dirasakan khasiatnya oleh masyarakat umum dengan petunjuk beberapa pengobatan herbal.26,27

Mahkota dewa tumbuh subur di tanah yang gembur dan subur pada ketinggian 10-1.200 m dpl. Perdu menahun ini tumbuh tegak dengan tinggi 1-2,5 m. Batangnya bulat, permukaannya kasar, warnanya cokelat, berkayu dan bergetah, percabangan simpodial. Daunnya tunggal, letaknya berhadapan, bertangkai pendek, bentuknya lanset atau jorong, ujung dan pangkal runcing, dengan tepi rata, pertulangan menyirip, permukaan licin, berwarna hijau tua,ukuran panjang 7-10 cm, lebar 2-5 cm. Bunganya keluar sepanjang tahun, letaknya tersebar di batang atau ketiak daun,

bentuk tabung, berukuran kecil, berwarna putih, dan harum. Buahnya berbentuk bulat, dengan diameter 3-5 cm, permukaan licin, beralur, ketika muda warnanya hijau dan merah setelah masak. Daging buah berwarna putih, berserat, dan berair. Biji buahnya bulat, keras, berwarna cokelat. Berakar tunggang dan berwarna kuning kecokelatan.26,27

Gambar 3. Buah Mahkota Dewa 26

Berdasarkan taksonominya, tanaman mahkota dewa dapat diklasifikasikan sebagai berikut:

Divisi : Spermatopyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae

Bangsa : Thymelaeaceae

Suku : Thymelaeceae Marga : Phaleria

Spesies : Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. atau Phaleria papuana

Di daerah Sumatera, mahkota dewa biasanya dikenal dengan nama simalakama, sedangkan di daerah Jawa dikenal dengan nama makutadewa. Tanaman ini disebut juga makuto rojo, makutu ratu, obat dewa, obat pusaka, crown of God.27,28

Pemanfaatan tanaman mahkota dewa ini secara tradisional adalah sebagai tanaman obat yang sejak lama dikenal dapat memiliki khasiat untuk mengobati luka, diabetes, lever, flu, alergi, sesak nafas, desentri, penyakit kulit, diabetes, jantung, ginjal, dan kanker.13,14 Berdasarkan hal tersebut, dilakukan rangkaian penelitian farmakologi terhadap ekstrak kulit biji dan daging buah tanaman mahkota dewa yang mencakup penelitian uji toksisitas, uji antikanker, dan uji aktifitas antioksidan pada tanaman.26 Penelitian Lisdawati (2002) menunjukkan bahwa daging buah dan cangkang biji mengandung beberapa senyawa, antara lain: alkaloid, flavonoid, senyawa polifenol dan tanin.15,28

Acuan pustaka yang ada telah menyebutkan bahwa tanaman marga Phaleria

umumnya memiliki aktifitas antimikroba. Aktifitas ini berkaitan dengan toksisitas tanaman yang cukup tinggi sebagai salah satu bentuk dan mekanisme pertahanan diri. Penelitian yang telah dilakukan hingga saat ini menyatakan bahwa toksisitas tanaman berkaitan erat dengan kandungan senyawa kimia yang terkandung di dalamnya.15

2.4. Nilai Farmakologis Buah Mahkota Dewa

Efek terapeutik buah mahkota dewa erat hubungannya dengan senyawa kimia yang terkandung di dalamnya. Dari penelitian sebelumnya, diketahui bahwa biji mahkota dewa bersifat toksik sedangkan daging buahnya tidak. Daging buah mahkota

dewa memiliki potensi penghambatan yang lebih besar jika dibandingkan dengan daun, kulit batang, ranting, dan akar tanaman mahkota dewa.15

Komponen aktif buah mahkota dewa adalah tanin, flavonoid, saponin dan alkaloid.15,28 Ekstrak daging mahkota dewa berkhasiat sebagai antihistamin dan antialergi.28

Saponin dikenal juga sebagai deterjen alam, larut dalam air, tapi tidak larut dalam eter dan merupakan larutan berbuih yang diklasifikasikan oleh struktur aglykon kompleks ke dalam triterpenoid dan steroid saponin. Kedua senyawa ini mempunyai efek antiinflamasi, analgesik, dan sitotoksik. Senyawa saponin juga bersifat sebagai antimikroba, antibakteri dan antivirus. Selain itu, saponin juga mampu meningkatkan sistem kekebalan tubuh, dengan cara meningkatkan produksi sitokin seperti interleukin dan interferon.28,29 Efek saponin yang lain adalah mampu mengurangi kadar gula darah, serta mengurangi penggumpalan darah.

Saponin memiliki molekul amfipatik (mengandung bagian hidrofilik dan hidrofobik) yang dapat melarutkan protein membran. Ujung hidrofobik saponin akan berikatan pada regio hidofobik protein membran sel dengan menggeser sebagian besar unsur lipid yang terikat. Ujung hidrofilik saponin merupakan ujung yang bebas akan membawa protein ke dalam larutan sebagai kompleks saponin-protein, mengganggu perkembangan protozoa dengan ikatan tersebut pada permukaan membran sel protozoa menyebabkan membran pecah, sel lisis dan mati. 28

Alkaloid, merupakan senyawa organik yang berfungsi sebagai detoksifikasi, menetralisir racun di dalam tubuh. Mekanisme kerja antimikroba dari alkaloid dihubungkan dengan kemampuan alkaloid untuk berikatan dengan DNA sel, sehingga

mengganggu fungsi sel diikuti dengan pecahnya sel dan diakhiri dengan kematian sel.15

Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam yang potensial sebagai antioksidan dan mempunyai bioaktivitas sebagai obat.30 Berfungsi melancarkan peredaran darah ke seluruh tubuh dan mencegah terjadinya penyumbatan pada pembuluh darah, mengurangi kandungan kolesterol serta mengurangi penimbunan lemak pada dinding pembuluh darah, member efek antiinflamasi (antiradang), berfungsi sebagai antioksidan, membantu mengurangi rasa sakit jika terjadi pendarahan atau pembengkakan.30 Kandungan polifenol berfungsi sebagai antihistamin. Kandungan tanin berfungsi sebagai antibakteri.13

Berbagai penelitian juga telah dilakukan di Indonesia mengenai efek antibakteri, antara lain penelitian uji zona hambat infusum daun mahkota dewa pada pertumbuhan Streptoccocus mutans. Hasil penelitian ini menyatakan semakin tinggi konsentrasi infusum daun mahkota dewa, semakin besar pula zona inhibisinya dan daya hambat terbesar dari ketiga perlakuan tersebut adalah infusum mahkota dewa dengan konsentrasi 50%.14 Peneltian mengenai daya antibakteri ekstrak daun mahkota dewa dalam menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis, menyimpulkan bahwa ekstrak daun mahkota dewa memiliki kemampuan daya antibakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis.15 Penelitian lainnya adalah mengenai daya antibakteri ekstrak buah mahkota dewa sebagai pada konsentrasi yang berbeda terhadap Enterococcus faecalis sebagai bahan alternatif medikamen saluran akar. Penelitian ini menyimpulkan bahwa ekstrak buah mahkota dewa memiliki efek

antibakteri terhadap bakteri Enterococcus faecalis dilihat dari konsentrasi KHM dan KBM bahan tersebut yaitu pada konsentrasi 12,5%.16

BAB 3

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep

Perawatan Saluran Akar

Medikamen Saluran Akar Bakteri Fusobacterium nucleatum

Ekstrak buah Mahkota Dewa

Polifenol Saponin

Sel F.nucleatum mati

Dinding sel dirusak → protein diendapkan → sintesis DNA terganggu → Sel lysis Tanin Alkaloid

Daya Antibakteri

Parameter antibakteri dilihat dengan mengendalikan konsentrasi sampel (100%,50%, 25%, 12,5%, 6,25%) Perusakan senyawa

protein & inhibisi enzim penting

Bekerja sebagai deterjen yang menyerang lapisan batas sel. Berikatan dengan DNA sel Mengikat & mengendapkan protein ?  Suhu  Waktu  KHM  KBM

Ekstrak buah mahkota dewa mengandung polifenol, saponin, alkaloid, dan tanin yang masing-masing mempunyai mekanisme yang berlainan dalam membunuh bakteri. Saponin yang berperan sebagai surfaktan/deterjen alam (merupakan bahan aktif permukaan) akan menyerang lapisan batas sel bakteri melalui pembentukan ikatan gugus polar saponin dengan lipoprotein membran sel dan gugus non polar saponin dengan lemak membran sel. Sehingga terjadi gangguan semipermeabilitas membran sel yang akan mengakibatkan terjadinya gangguan fungsi sel diikuti dengan pecahnya sel dan diakhiri dengan kematian sel bakteri.

Mekanisme kerja alkaloid dihubungkan dengan kemampuan alkaloid untuk berikatan dengan DNA sel, sehingga mengganggu fungsi sel diikuti dengan pecahnya sel dan diakhiri dengan kematian sel.

Senyawa polifenol mempunyai kemampuan untuk merusak senyawa protein bakteri dan menginhibisi enzim penting pada bakteri, sehingga menyebabkan terjadinya gangguan semipermeabilitas membran sel yang diikuti dengan kematian sel. Senyawa tanin berperan dalam mengikat dan mengendapkan protein bakteri.

Penelitian sebelumnya mengenai daya antibakteri ekstrak buah mahkota dewa pada konsentrasi yang berbeda terhadap Enterococcus faecalis sebagai bahan alternatif medikamen saluran akar menyimpulkan ekstrak buah mahkota dewa memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Enterococcus faecalis dilihat dari konsentrasi KHM dan KBM bahan tersebut yaitu pada konsentrasi 12,5%.15

3.2 Hipotesis Penelitian

Dari skema kerangka konsep, lahir hipotesis penelitian bahwa ekstrak buah mahkota dewa memiliki daya antibakteri terhadap bakteri Fusobacterium nucleatum. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak etanol buah mahkota dewa, akan semakin besar daya antibakterinya terhadap Fusobacterium nucleatum.

BAB 4

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian : Postest Only Control Group Design

Jenis Penelitian : Eksperimental Laboratorium

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

4.2.1 Tempat Penelitian : 1.Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU

2.Laboratorium Pusat Penyakit Tropis UNAIR

4.2.2 Waktu Penelitian : Februari 2011 – Maret 2011

4.3 Sampel dan Besar Sampel Penelitian

4.3.1 Sampel Penelitian : Koloni F.nucleatum ATCC 25586 yang telah

diisolasi dan dibiakkan dalam media Mueller Hinton Agar (MHA).

4.3.2 Besar Sampel Penelitian :

Adapun penentuan besar sampel dilakukan berdasarkan standart Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Universitas Airlangga:

a. Penentuan nilai KHM

 Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100% = 6 sampel

 Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50% = 6 sampel

 Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25% = 6 sampel

 Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5% = 6 sampel

 Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25% = 6 sampel

 Kelompok VII : kontrol negatif (ekstrak buah

mahkota dewa tanpa suspensi F.nucleatum) = 1 sampel Jumlah sampel = 32 sampel

Dari masing-masing konsentrasi dilakukan dilusi (pengenceran) untuk mendapatkan konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. b. Penentuan nilai KBM

Dari hasil penentuan nilai KHM diperoleh beberapa kelompok yang dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Mills Mesra.

 Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100% = 6 sampel

 Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50% = 6 sampel

 Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25% = 6 sampel

 Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5% = 6 sampel

 Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25% = 6 sampel

 Kelompok VI : kontrol Mac Farland = 1 sampel

 Kelompok VII : kontrol negatif (ekstrak buah

mahkota dewa tanpa suspensi F.nucleatum) = 1 sampel Jumlah sampel = 32 sampel

4.4 Variabel Penelitian

Variabel Bebas :

Ekstrak buah mahkota dewa dengan pelarut etanol dengan konsentrasi 100%,50%, 25%, 12,5%, 6,25%

Variabel Tergantung: Pertumbuhan bakteri

F.nucleatum pada media MHA

dengan pengukuran nilai KHM dan KBM

Variabel Terkendali:

 Asal tumbuh buah mahkota dewa (Kelurahan Karangsari, Kecamatan Medan Polonia, Medan)

 Keseragaman kondisi buah yang dipetik

 Vaccum Rotary Evaporator dengan tekanan <1 ATM dan temperatur

≤60°C

 Individu asal F.nucleatum diisolasi.

 Suspensi Fusobacterium nucleatum ATCC 25586

 Jumlah suspensi bakteri yang diteteskan tiap replikasi (1 ml)

 Media pertumbuhan MHA (Mueller Hinton Agar)

 Suhu yang digunakan untuk

menumbuhkan F.nucleatum (37°C)

 Waktu yang digunakan untuk mengamati pertumbuhan atau pembiakan F.nucleatum yaitu 24 jam

 Jumlah bahan percobaan yang diteteskan ke media padat (50μl)

Variabel Tak Terkendali:

 Pola pemeliharaan tanaman mahkota dewa

 Kondisi tanah tempat tanaman mahkota dewa ditanam

 Lama penyimpanan buah mahkota dewa

 Lama penyimpanan, lama pengiriman, suhu saat

pengiriman bahan coba (ekstrak etanol buah mahkota dewa) ke laboratorium

Variabel Bebas

 Ekstrak buah mahkota dewa dengan pelarut etanol dengan konsentrasi 100%,50%, 25%, 12,5%, 6,25%

Variabel Tergantung

 Pertumbuhan bakteri F.nucleatum pada media MHA dengan pengukuran nilai KHM dan KBM

Variabel Terkendali

 Asal tumbuh buah mahkota dewa (Kelurahan Karangsari, Kecamatan Medan Polonia, Medan)

 Keseragaman kondisi buah yang dipetik

 Vaccum Rotary Evaporator dengan tekanan <1 ATM dan temperatur ≤60°C

 Individu asal F.nucleatum diisolasi

 Suspensi Fusobacterium nucleatum ATCC 25586

 Jumlah suspensi bakteri yang diteteskan tiap replikasi (1 ml)

 Media pertumbuhan MHA (Mueller Hinton Agar)

 Suhu yang digunakan untuk menumbuhkan F.nucleatum (37°C)

 Waktu yang digunakan untuk mengamati pertumbuhan atau pembiakan F.nucleatum yaitu 24 jam

 Jumlah bahan percobaan yang diteteskan ke media padat (50μl) Variabel Tak Terkendali

 Pola pemeliharaan tanaman mahkota dewa

 Kondisi tanah tempat tanaman mahkota dewa ditanam

 Lama penyimpanan, lama pengiriman, suhu saat pengiriman bahan coba (ekstrak etanol buah mahkota dewa) ke laboratorium.

4.5 Defenisi Operasional

 Buah mahkota dewa adalah buah mahkota dewa yang tumbuh di Kelurahan Karangsari, Kecamatan Medan Polonia, Medan.

 Ekstrak buah mahkota dewa pelarut etanol adalah ekstrak yang diperoleh dengan melakukan ekstraksi buah mahkota dewa yang telah diperkolasi dengan pelarut etanol 96% sehingga diperoleh ekstrak kental buah mahkota dewa.

 Koloni F.nucleatum adalah bakteri F.nucleatum yang berasal dari stem cell

F.nucleatum ATCC 25586 dan kemudian dikultur pada media MHA dalam suasana anaerob.

 KHM (Konsentrasi Hambat Minimal) adalah konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri pada media perbenihan dengan menggunakan metode dilusi.

 KBM (Konsentrasi Bakterisidal Minimal) adalah konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99,9% atau 100% bakteri setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra.

4.6 Bahan dan Alat Penelitian

4.6.1 Bahan Penelitian

 Buah mahkota dewa sebanyak 1000 gram (Medan Polonia, Indonesia)

 Pelarut Etanol 96% sebanyak 5 liter (Kimia Farma,Indonesia)

 Suspensi F.nucleatum ATCC 25586 (UNAIR, Indonesia)

 Media Mueller Hinton Agar (Difco, USA)

4.6.2 Alat Penelitian

 Vaccum Rotary Evaporator (Heidolph VV 2000, Germany)

 Alumunium foil 1 gulungan

 Erlenmeyer (Pyrex, USA)

 Deslitator

 Lemari penyimpan petri

 Blender (Panasonic, Japan)

 Kertas saring (Whatman no.42, England)

 Autoklaf (Tomy, Japan)

 Electronic Balance (Ohyo JP2 6000, Japan)

 Vortex/whirli mixer (Iwaki model TM 100, Japan)

 Pipet mikro dan tips(Gilson, France)

 Kaca Pembesar (Ootsuka ENV-CL, Japan)

4.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data

4.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Buah Mahkota Dewa

Buah yang dipakai adalah buah yang segar, berwarna merah seluruhnya. Bahan baku berupa buah mahkota dewa sebanyak 1000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, diiris halus, dan dibuang bijinya. Selanjutntya daging buah mahkota dewa dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari.

Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96%. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam, simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkulator yang ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkulator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkulator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes/menit. Sampel pada tabung perkulator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan <1 ATM dengan temperatur ≤ 60°C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental buah mahkota dewa.

Gambar 4.Tanaman buah mahkota dewa yang berasal dari kelurahan Karangsari,

Kecamatan Medan Polonia

Gambar 5. Buah mahkota dewa 1000 gram, diiris dan dikeringkan dalam lemari pengering

Gambar 7. Pengayakan simplisia menjadi serbuk

Gambar 8. Penambahan etanol hingga didapat maserat cair 4 liter

Gambar 9. Penguapan maserat pada Gambar 10. Ekstrak etanol buah VacumRotary Evaporator mahkota dewa

4.7.2 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media MHA sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri (20 ml/petri), lalu dipanaskan diatas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 151°C. Setelah disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin.

Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.

4.7.3 Pembiakan Spesimen

Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO2. Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah spesimen

F.nucleatum ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9% sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 108 CFU/ml.

4.7.4 Penentuan KHM bahan coba

Bahan coba ekstrak buah mahkota dewa yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100%,50%, 25%, 12,5%, 6,25%. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 50μl lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai

konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO2 dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tesebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan F.nucleatum dalam media perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.

4.7.5 Penentuan KBM bahan coba

Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100%,50%, 25%, 12,5%, 6,25% dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat (Mueller Hinton Agar) direplikasi 6 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37°C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni,

bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit) / ml cairan (suspensi).

Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar (CFU/ml).

BAB 5

HASIL PENELITIAN

5.1 Ekstraksi Buah Mahkota Dewa

Ekstrak etanol buah mahkota dewa yang diperoleh berasal dari 1000 gram buah mahkota dewa yang kemudian dihaluskan menjadi bentuk simplisia. Simplisia tersebut kemudian diperkolasi dengan menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak 5 liter yang sudah di redestilisasi. Didapat maserat cair sebanyak 4 liter dari proses tersebut. Kemudian maserat cair diuapkan dalam alat vacuum rotary evaporator, sehingga dihasilkan ekstrak kental buah mahkota dewa.

Gambar 11. Ekstrak etanol buah mahkota dewa (konsentrasi 100%)

5.2 Uji Efektivitas Antibakteri

Pengujian daya antibakteri dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba (100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%). Penetapan konsentrasi berdasarkan pada standard Laboratorium Tropical Disease, UNAIR dengan metode pengenceran ganda (dilusi). Perubahan yang terjadi ditandai dengan hasil biakan mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol (Mac Farland yang diinkubasi 24 jam). Selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah koloni bakteri menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra yang bertujuan untuk membuktikan bahwa tingkat kekeruhan pada setiap konsentrasi menunjukkan kemampuan bahan coba membunuh bakteri sebesar 99% - 100%, yang disebut dengan KBM (Konsentrasi Bakterisidal Minimal).

Gambar 12. Suspensi bakteri Fusobacterium nucleatum sebelum berkontak dengan bahan coba.

Gambar 13. Suspensi bakteri Fusobacterium nucleatum setelah berkontak dengan bahan coba pada berbagai konsentrasi.

Setelah diamati kekeruhan, penentuan KHM sulit dilakukan. Terlihat semua suspensi dalam tabung yang telah berkontak dengan bahan coba berwarna. Penelitian dilanjutkan dengan perhitungan KBM menggunakan metode drop plate mills mesra

pada suasana anaerob dengan inkubasi 37° C selama 24 jam. Terlihat bahwa pada setiap konsentrasi di atas (100%, 50%, 25%,12,5% dan 6,25%) masih memberikan efek antibakteri dimana tidak dijumpai pertumbuhan bakteri. Karena itu penelitian dilanjutkan dengan penambahan dua konsentrasi di bawah konsentrasi yang ditetapkan semula, yaitu konsentrasi 3,125% dan konsentrasi 1,56% untuk mengetahui nilai KBM bahan coba. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi 3,125% tidak dijumpai pertumbuhan bakteri atau senilai 0 CFU/ml. Sedangkan pada konsentrasi 1,56%, dijumpai adanya pertumbuhan bakteri, yaitu 141,20 CFU/ml. pada replikasi 1. Sehingga konsentrasi 3,125% ditetapkan sebagai KBM.

Gambar 14. Koloni Mac Farland 0,5 Gambar 15. Hasil peletakan tetesan konsentrasi 3,125% ekstrak etanol buah mahkota dewa setelah diinkubasi 24 jam.

A B C

D E F

Gamabar 16. Menunjukkan koloni yang terbentuk pada media MHA dengan konsentrasi ekstrak buah mahkota dewa dengan pelarut etanol 1,56%, dengan (A) replikasi 1, (B) replikasi 2, (C) replikasi 3, (D) replikasi 4, (E) replikasi 5, (F) replikasi 6.

Tabel 2. Perhitungan jumlah bakteri untuk bahan coba ekstrak etanol buah mahkota

dewa.

Bahan Uji Ekstrak Etanol Buah Mahkota Dewa

Replikasi 1 2 3 4 5 6

Konsentrasi 100%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml Konsentrasi

50%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml Konsentrasi

25%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml Konsentrasi

12,5%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml Konsentrasi

6,25%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml Konsentrasi

3,125%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml Konsentrasi 1,56% 141,20 CFU/ml 166,20 CFU/ml 172,20 CFU/ml 125,20 CFU/ml 120,20 CFU/ml 116,20 CFU/ml Keterangan: 0 CFU/ml = steril, tidak dijumpai pertumbuhan bakteri

Setiap CFU/ml telah dikali 20 (faktor pengali)

Tabel 2 menunjukkan jumlah koloni bakteri yang terbentuk setelah bakteri berkontak dengan ekstrak buah mahkota dewa pada berbagai konsentrasi, dimana masing-masing konsentrasi mengalami enam kali replikasi.

Data hasil penelitan ini tidak dilakukan uji statistik karena nilai perhitungan koloni bakteri pada KHM dan KBM adalah 0 CFU/ml yang artinya tidak didapati adanya pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan atau bakteri yang berkontak dengan bahan coba 100% mengalami kematian.

BAB 6 PEMBAHASAN

Uji aktivitas antibakteri secara in vitro bertujuan untuk mengetahui bahan uji antibakteri yang masih dapat digunakan untuk mengatasi masalah infeksi oleh mikroorganisme. Uji aktivitas antibakteri pada dasarnya dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu metode difusi cakram dan metode dilusi. Pada metode difusi cakram, penilaian aktivitas antibakteri dilihat dari pengukuran zona inhibisi yang dipengaruhi kelarutan dan difusi bahan yang diuji sehingga kurang efektif dalam menginhibisi miroorganisme. Sedangkan metode dilusi oleh Fereira et al., 2002 telah dilakukan untuk mengamati aktivitas antibakteri , karena bahan coba langsung berkontak dengan mikroorganisme dan langsung diperoleh nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimal) dengan mengamati perubahan kekeruhan suspensi setelah diinkubasi 37°C selama 24 jam dan KBM (Konsentrasi Bakterisidal Minimal) dari bahan coba dengan perhitungan jumlah bakteri pada petri dish sehingga hasil penelitian akan lebih representatif. Atas dasar inilah maka peneliti memilih metode dilusi untuk menguji daya antibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap Fusobacterium nucleatum.

Dalam penelitian ini, ektraksi buah mahkota dewa dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol. Pelarut etanol adalah pelarut yang dapat melarutkan seluruh bahan aktif yang terkandung dalam suatu bahan alami, baik bahan aktif yang bersifat polar, semipolar maupun non polar. Selain itu, pelarut etanol diketahui lebih aman (tidak bersifat toksik) jika dibandingkan dengan pelarut metanol. Etanol yang

digunakan adalah etanol 96%, dan bukan 70%. Pemilihan konsentrasi ini didasarkan untuk menghindari adanya efek antibakteri yang didapat dari bahan etanol, sebab dalam hal ini etanol 70% memiliki daya antibakteri, sedangkan konsentrasi 96% adalah konsentrasi etanol yang ideal untuk digunakan sebagai bahan pelarut.

Buah mahkota dewa yang dipakai adalah buah mahkota dewa yang masih segar, bertujuan untuk menghindari rusaknya kandungan zat akibat proses enzimatis. Buah mahkota dewa yang digunakan sebanyak 1000 gram karena diperkirakan akan dapat menghasilkan ekstrak kental buah mahkota dewa dengan konsentrasi 100% yang cukup untuk melakukan pengujian antibakteri terhadap F.nucleatum. Buah mahkota dewa terlebih dahulu diiris kecil dengan tujuan untuk mempercepat proses maserasi. Bagian tanaman yang diiris adalah buah mahkota dewa, tanpa bijinya karena biji tanaman mahkota dewa diketahui mengandung toksik. Sampel mahkota dewa yang diiris kecil akan memperbanyak permukaan serta memperpendek jarak antar sel sehingga bahan coba dapat berkontak langsung dan lebih banyak dengan pelarut etanol sehingga pelarut etanol akan dapat dengan sempurna berdifusi ke dalam molekul-molekul senyawa buah mahkota dewa. Untuk menghindari terjadinya pembusukan, buah yang telah diiris harus dikeringkan terlebih dahulu di dalam lemari pengering.

Dalam hal ini, kandungan berupa senyawa aktif buah mahkota dewa tahan terhadap pengeringan. Irisan kering buah mahkota dewa kemudian dihaluskan hingga menjadi serbuk yang disebut simplisia lalu dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol. Metode ekstraksi yang dipilih adalah maserasi, alasannya karena pelaksanaanya sederhana serta untuk mengurangi kemungkinan terjadinya penguraian

zat aktif yang terkandung dalam buah mahkota dewa oleh pengaruh suhu, karena dalam maserasi tidak ada proses pemanasan. Tujuan maserasi adalah untuk memberi kesempatan pada simplisia untuk berdifusi ke dalam pelarut. Kemudian diperkolasi hingga diperoleh 4 liter maserat cair, yang akan dilakukan penguapan menggunakan

Vaccum Rotary Evaporator yang bekerja dengan cara menurunkan tekanan udara dari tekanan udara luar menjadi <1 ATM, sehingga tekanan uap pelarut serta titik didih pelarut menurun. Penurunan tekanan akan berbanding lurus dengan penurunan temperatur sehingga menghindari terjadinya penguraian kandungan kimia maserat cair yang diekstraksi.

Senyawa aktif mahkota dewa yang berkhasiat sebagai antibakteri adalah saponin, alkaloid dan tanin. Adanya efek antibakteri dari senyawa aktif ekstrak buah mahkota dewa (saponin) sebagai deterjen yang memiliki molekul ampifatik (mengandung bagian hidrofilik dan hidrofobik) yang dapat melarutkan protein membran. Ujung hidrofobik saponin berikatan pada region hidrofobik protein membran sel dengan menggeser sebagian besar unsur lipid yang terikat. Ujung hidrofilik saponin merupakan ujung yang bebas akan membawa protein ke dalam larutan sebagai kompleks deterjen-protein sehingga sel bakteri menjadi lisis.

Saponin akan membentuk busa yang stabil dalam larutan air, serta mengandung makna kadar racun yang tinggi. Dalam penelitian ini, pada saat sampel buah mahkota dewa dicuci hanya sedikit dihasilkan busa. Hal ini membuktikan adanya kandungan saponin dengan konsentrasi yang rendah pada buah mahkota dewa, dan hal ini berarti juga bahwa buah mahkota dewa toksisitasnya rendah.

Senyawa lain seperti alkaloid, tanin dan flavonoid turut bekerja sebagai antibakteri. Senyawa alkaloid mampu berikatan dengan DNA sel, sehingga mengganggu fungsi sel diikuti dengan pecahnya sel dan diakhiri dengan kematian sel. Tanin dan flavonoid keduanya sebagai polifenol, dan merupakan bagian dari senyawa fenolik kompleks tanaman. Senyawa polifenol mempunyai kemampuan untuk merusak senyawa protein bakteri dan menginhibisi enzim penting pada bakteri, sehingga menyebabkan terjadinya gangguan semipermeabilitas membran sel yang diikuti dengan kematian sel. Senyawa tanin berperan dalam mengikat dan mengendapkan protein bakteri. Seluruh senyawa dari ekstrak etanol buah mahkota dewa yang berfungsi sebagai antibakteri adalah termasuk senyawa yang tahan terhadap suhu pengeringan.

Metode dilusi dilakukan pada penelitian ini, dimana pengenceran dilakukan sebesar setengah dari konsentrasi awal, yaitu konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5% 6,25%. Setiap konsentrasi dilakukan replikasi 6 sampel sehingga didapat jumlah sampel yang digunakan baik pada penentuan KHM dan KBM masing-masing adalah 32 sampel. Jumlah sampel tersebut telah memenuhi standar penelitian yaitu minimal 25 sampel. Penentuan konsentrasi tersebut disesuaikan berdasarkan standard konsentrasi pengujian antibakteri yang ada di laboratorium Tropical Disease, UNAIR.

Setelah dilakukan pengujian nilai KHM dan KBM dalam berbagai konsentrasi tersebut, tidak dijumpai adanya pertumbuhan bakteri (steril atau 0 CFU/ml), yang bermakna bahwa pada seluruh konsentrasi tersebut, semuanya memberikan daya antibakteri, dan belum didapati nilai KHM dan KBM dari bahan tersebut sehingga

dilakukan pengenceran lagi di bawah konsentrasi 6,25% yaitu konsentrasi 3,125% dan 1,56%. Pada konsentrasi 3,125% dan 1,56% juga dilakukan replikasi sebanyak 6 kali baik pada penentuan KHM maupun KBM bahan coba. Sehingga jumlah akhir sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sebanyak 44 sampel baik untuk penentuan KHM maupun KBM.

Efek antibakteri dari ekstrak etanol mahkota dewa dengan konsentrasi 100 % (sangat kental) terhadap F.nucleatum akan secara langsung membunuh bakteri karena tingginya konsentrasi antibakteri yang terkandung di dalamnya. Demikian juga yang terjadi pada konsentrasi 50%, 25%,12,5%,6,125%, dan 3,125% tidak ditemui pertumbuhan bakteri (media steril) dengan jumlah koloni senilai 0 CFU/ml. Sedangkan pada konsentrasi 1,56% yang telah dilakukan pengenceran akan semakin mengurangi daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri dilihat dari terbentuknya koloni bakteri 141,20 CFU/ml. pada replikasi 1.

Hasil penelitian menunjukkan, bahwa bahan coba yaitu ekstrak buah mahkota dewa memiliki efek antibakteri terhadap F.nucleatum dengan pengukuran nilai KHM dan KBM bahan coba. Efek antibakteri bahan coba dilihat dari besar nilai KHM dan KBM bahan coba terhadap pertumbuhan bakteri, dengan jumlah bakteri yang sama untuk setiap perlakuan yaitu 108 CFU/ml. Nilai minimal ditunjukkan pada bahan coba dengan konsentrasi 3,125% yaitu 0 CFU/ml. Ekstrak etanol mahkota dewa dengan konsentrasi 3,125% adalah konsentrasi minimal yang dibuktikan dengan diperolehnya nilai KBM 0 CFU/ml pada media pembenihan. Hal ini mungkin terjadi karena saat ekstrak berkontak dengan sel dapat berdifusi pada membran sel

F.nucleatum dan menghasilkan efek antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri F.nucleatum.

Jika dibandingkan penelitian daya antibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap bakteri F.nucleatum dengan Enterococcus faecalis maka terdapat perbedaan KHM dan KBM antara keduanya, dimana untuk bakteri Enterococcus faecalis KHM dan KBM yang lebih besar, yaitu 12,5%.

Perbedaan KHM dan KBM ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap

F.nucleatum dan E.faecalis disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel kedua bakteri tersebut. F.nucleatum merupakan bakteri gram negatif, sedangkan E.faecalis

adalah bakteri gram positif. Dinding sel bakteri gram negatif maupun gram positif mengandung peptidoglikan. Peptidoglikan merupakan bahan padat yang dibentuk oleh karbohidrat seperti pada tulang belakang. Pada bakteri gram negatif, peptidoglikannya hanya merupakan lapisan tipis yang berada di dalam rongga periplasmik antara lapisan dalam dan lapisan luar yang disusun atas senyawa fosfolipid yang tebal. Sedangkan dinding sel bakteri gram positif dominan disusun oleh senyawa peptidoglikan melalui ikatan peptida, antar lapisan dinding sel dihubungkan oleh asam teichoic, sehingga tercipta sebuah lapisan yang sangat padat yang memberikan perlindungan tambahan pada bakteri. Karena itu, E.faecalis

membutuhkan konsentrasi KHM dan KBM yang lebih tinggi daripada F.nucleatum, sebab dinding sel bakteri E.faecalis tersusun lebih padat daripada F.nucleatum.33

Ada kemungkinan adanya konsentrasi lain diantara 1,56% -3,125% yang dapat membunuh F.nucleatum, sehingga perlu dilakukan pengujian antibakteri dengan metode lain. Selain itu, ekstrak etanol mahkota dewa yang memiliki saponin dengan

kandungan yang rendah berarti memiliki makna toksisitas yang rendah dapat menjadi pertimbangan pengembangan ekstrak tersebut sebagai salah satu bahan alternatif untuk digunakan sebagai medikamen saluran akar. Pada akhir penelitian tidak dilakukan uji statistik terhadap hasil yang didapat, karena nilai yang didapat pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,56% telah memiliki perbedaan yang jelas antar konsentrasi.

BAB 7

KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan

Ekstrak etanol buah mahkota dewa memiliki daya antibakteri sehingga mampu menghambat pertumbuhan Fusobacterium nucleatum. Efek antibakteri dinilai dari nilai KHM dan KBM. Penilaian KHM sulit ditentukan secara visual karena bahan ekstrak etanol berwarna, yang mempengaruhi interpretasi. Sehingga dinilai dari jumlah koloni yang terbentuk, didapat hasil KBM pada konsentrasi 3,125% dengan jumlah 0 CFU/ml.

7.2 Saran

1. Hendaknya dilakukan perbandingan antibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap Ca(OH)2 sebagai bahan medikamen yang paling sering digunakan.

2. Perlu dilakukan uji toksisitas pada ekstrak etanol buah mahkota dewa untuk mengetahui pengaruhnya terhadap pertumbuhan sel.

3. Agar dilakukan penelitian lebih lanjut untuk penelitian in vivo dalam penentuan konsentrasi KHM dan KBM ekstrak etanol buah mahkota dewa yang aman jika dipakai sebagai bahan medikamen saluran akar.

4. Diharapkan semakin banyak dilakukan penelitan dari bahan-bahan alami sehingga dapat mengembangkan potensi pendayagunaan tanaman obat berkhasiat yang ada di Indonesia.

DAFTAR RUJUKAN

1. Squiera JF, IN Rocas. Endodontic Microbiology In: Endodontics Principles And Practice 4th ed. Michigan:Saunders, 2008 : 38-46.

2. Baumgartner JC, JW Hutter. Endodontic Microbiology and Treatment of Infections In: Cohen S, RC Burns Pathways of the Pulp 8th ed. St.Louis: CV. Mosby Co, 2002 : 501- 519.

3. Bolstad AI, HB Jensen, V Bakken. Taxonomy, Biology and Periodontal Aspects of Fusobacterium nucleatum. Clinical Microbiology Review, Jan 1996 : 55-71. 4. Villanueva CP. Fusobacterium nucleatum in Endodontic Flare Up. Elsevier J

2002 : 93(2),179-83.

5. Ingle JI, Backland LK. Endodontics 5th ed. Philadelphia : Lea & Febringer. 2002 : 69.

6. Handal T, DA Caugant, I Olsen, P Sunde. Bacterial Diversity in Persistent Periapical Lesions on Root Filled Teeth. J Oral Microbiol, 2009 : 1.

7. Grossman L. Endodontic Practice 9th ed. Philadelphia : Lea & Febringer. 1978 : 230-231.

8. Johnson WT, WC Noblett. Cleaning and Shaping In: Endodontics Principles and Practice 4th ed. Michigan:Saunders, 2008 : 258-81.

9. Squiera JF, HP Lopez. Mechanism of Antimicrobial Activity of Calcium Hydroxide : a Critical Review. Int Endod J 1999 : 32,361-9.

10. C Sathorn, Parashos P, Messer H. Calcium Hydroxide has Limited Effectiveness in Eliminating Bacteria from Human Root Canal. Int Endodont J 2007 : 40, 2-10.

11. Haapasalo HK, et al. Inactivation of Local Root Canal Medicaments by Dentine:an in vitro study. Int Endod J 2000: 33,126-31.

12. Andersen JO, Ban Farik, Erik CM. Long-term Calcium Hydroxide as a Root Canal Dressing May Increase Risk of Root Fracture. Dental Traumatology J 2002 : 18,134-7.

13. Rohyami Y. Penentuan Kandungan Flavonoid dari Ekstrak Metanol Daging Buah Mahkota Dewa. Jurnal Logika 2008 : 5,1-16.

14. Suryani L, Selly Stepriyani. Daya Antibakteri Infusum Daun Mahkota Dewa terhadap Staphylococcus aureus dan Eschericia coli. Jurnal Mutiara Medika 2007 : 7,23-8.

15. Lisdawati V. Berdasar Uji Penapsisan Farmakologi Pada Buah Mahkota Dewa. Bagian Farmakologi dan Toksikologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada, 2002.

16. Yunanto K. Uji Zona Hambat Infusum Daun Mahkota Dewa Pada Pertumbuhan Streptococcus mutans. SKRIPSI Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember 2008.

17. Aswal D, L Beatrice. Efek Antibakteri Ekstrak Buah Mahkota Dewa Terhadap Enterococcus faecalis Sebagai Bahan Medikamen Saluran Akar Secara In Vitro. J Dent 2010 : 15(1),32-6.

18. Hauman CHJ, RM Love. Concepts of Biocompatibility Testing. JofER 2009. 19. Walton RE. Interappointment Flare Ups: Incidence, Related Factors,

Prevention and Management. Endodontic Topics 2002 : 3,67-76.

20. P Ajitha et al. Time Dependent Inhibitory Effect of Dentin on Various Calcium Hydroxide Medicaments. J Endod 2003 : 15.

21. Gomes BPFA et al. In Vitro Evaluation of the Antimicrobial Activity of Five Root Canal Sealers. Braz Dent J 2004 : 15(1).

22. Jacinto RC et al. Microbiology Analysis of Infected Root Canal from

Symptomatic and Asymptomatic Teeth with Periapical Periodontitis and the Antimicrobial Susceptibility of Some Isolated Anaerobic Bacteria. Oral Microbial Immunol 2003 : 18,285-92.

23. Jawetz, Melnick Adelberg. Mikrobiologi Kedokteran. Penerjemah dan Editor : Bagian Mikrobiologi FK UNAIR. Ed 1. Jakarta : Salemba Medika,2001: 288-91.

24. Jacinto RC et al. Quantification of Endotoxins in Necrotic Root Canals from Symptomatic and Asymptomatic Teeth. J Med Microbiol 2002 : 148,467-72. 25. Soeksmanto A, Yatri H, Partomuan S. Kandungan Antioksidan pada Beberapa

26. Majalah Flona. Manfaat Mahkota Dewa. Edisi 27 (2). Mei, 2005 : 13-14,23. 27. Majalah Trubus. Phaleria Macrocarpa, Herbal Fruit. Edisi 34 : 11-14. 28. O Soetan K et al. Evaluation of the Antimicrobial Activity of Saponins Extract

of Shorgum Bicolor L.Moench. AJB 2006 : 5(23),2405-7.

29. Chusnie TP, Andrew JL. Antimicrobial Activity of Flavonoids. Int J of Antimicrobial Agents 2005 : 26,343-56.

30. Akroum S et al. Antibacterial, Antioxidant and Acute Toxicity Test on Flavonoids Extracted from Some Medicinal Plants. IJGP 2010, 165-9. 31. T Okuda. Systematics and Health Effects of Chemically Distinct Tannins in

Medicinal Plants. Phytochemistry 2005 : 66,2012-31.

32. Berrin O, Kartal Murat, Orhan Illkay. Cytotoxicity, Antiviral and Antimicrobial Activities of Alkaloids, Flavonoids, and Phenolic Acids. Pharmaceutical

Biology J 2011 : 49,396-402.

33. Courvaline P. Transfer of Antibiotic Resistance Genes between Gram Positive and Gram Negative Bacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1994 : 38(7),1447-51.

LAMPIRAN 1. Skema Alur Pikir

 Keberadaan bakteri mempunyai nilai yang penting dalam patogenesis pulpa dan periapeks. Eliminasi mikroorganisme dari saluran akar yang terinfeksi merupakan fokus utama pada perawatan saluran akar.

 Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mengetahui jenis mikroorganisme yang berperan dalam patogenesis pulpa dan periapeks. Hasil penelitian menunjukkan bakteri obligat anaerob merupakan bakteri dominan sebagai penyebab infeksi saluran akar terutama asimptomatik.

 Menurut Sundqvist (1994), Fusobacterium nucleatum merupakan salah satu bakteri yang paling banyak ditemukan pada infeksi saluran akar dengan persentase insidens sebesar 48%.

 Merupakan salah satu bakteri yang dapat menimbulkan tanda dan gejala klinis, walaupun tidak cukup korelasi mutlaknya. Meskipun demikian, keberadaan

Fusobacterium nucleatum akan meningkatkan proses infeksi dari strein bakteri pigmen hitam.

 Ca(OH)2 telah digunakan sejak tahun 1920 dan saat ini merupakan bahan medikamen yang paling sering digunakan, serta terbukti sebagai bahan biokmpatibel dan efektif pada gigi dengan periodontitis apikalis serta memiliki daya antibakteri.

 Buah mahkota dewa bentuknya bulat, diameter bervariasi, biasanya berkisar 3-5 cm, permukaan licin, beralur, ketika muda warnanya hijau dan ketika masak, warnanya merah. Daging buah berwarna putih, berserat dan berair.

 Buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl) telah lama digunakan sebagai obat alternatif kesehatan. Telah dilakukan penelitian mengenai zona hambat infusum daun mahkota dewa pada pertumbuhan Streptococcus mutans. (Kiki Yunanto,2007). Hasil penelitian tersebut adalah semakin tinggi konsentrasi infusum daun mahkota dewa, maka semakkin besar zona inhibisinya dan daya hambat terbesar pada ketiga perlakuan(konsentrasi infusum 50%, 25%, dan 12,5%) adalah infusum daun mahkota dewa 50%.

 Hasil penelitian menyatakan bahwa daging buah mahkota dewa tidak bersifat toksik (Lucie Widowati,2003).

 Hasil penelitian menyatakan bahwa daging buah mahkota dewa memiliki senyawa aktif yang berkhasiat sebagai bahan antibakteri, yaitu polifenol, saponin, alkaloid, dan tanin. (Luciana Beatrice,2010).

 Karena adanya kandungan empat senyawa aktif yang berkhasiat sebagai antibakteri, timbul pemikiran untuk meneliti peranannya ekstrak etanol buah mahkota dewa dalam proses eliminasi bakteri di saluran akar, dalam hal ini hendak dilakukan penelitian terhadap bakteri Fusobacterium nucleatum.

 Saponin yang terkandung dalam buah mahkota dewa diketahui berperan sebagai detergen / surfaktan, juga memiliki sifat lain, yaitu sebagai anti-bakteri dan anti-virus, mampu meningkatkan sistem kekebalan tubuh, meningkatkan vitalitas, mengurangi kadar gula dalam darah, mengurangi penggumpalan darah.

 Polifenol dan Tanin merupakan senyawa fenolik kompleks yang berfungsi mengikat dan mengendapkan protein, serta diduga memiliki bekerja sebagai anti bakteri. Alkaloid mampu berikatan dengan DNA sel sehingga menyebabkan fungsi sel terganggu.

Seperti halnya ekstrak buah mahkota dewa yang dapat dipergunakan sebagai salah satu alternatif bahan medikamen saluran akar serta ekstrak etanol buah mahkota dewa yang dapat menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis, maka timbul pemikiran untuk melakukan penelitian yang menguji daya anti-bakteri buah mahkota dewa sebagai bahan medikamen saluran akar terhadap bakteri Fusobacterium nucleatum.

Yang menjadi permasalah adalah:

Apakah ekstrak buah mahkota dewa memiliki daya anti-bakteri dengan mengetahui konsentrasi minimal terhadap pertumbuhan bakteri Fusobacterium nucleatum.

Tujuan penelitian:

Untuk mengetahui konsentrasi minimum ekstrak etanol buah mahkota dewa dalam menghambat pertumbuhan bakteri Fusobacterium nucleatum.

DAYA ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL BUAH MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa [Scheff] Boerl) TERHADAP Fusobacterium nucleatum SEBAGAI BAHAN ALTERNATIF MEDIKAMEN SALURAN AKAR SECARA IN VITRO

LAMPIRAN 2. Skema Alur Penelitian

2.1 Pembuatan ekstrak buah mahkota dewa

Sediaan buah mahkota dewa yang segar dan matang.

Bahan baku dicuci bersih, ditimbang lalu diiris halus dan dikeringkan selama 10 hari di lemari pengering.

Sampel diblender menjadi serbuk, lalu dimaserasi dengan pelarut etanol 96% selama 3 jam kemudian diperkolasi. Ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selaman 24 jam.

Semua maserat yang didapat,digabung dan disaring, lalu diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada tekanan < 1 ATM dengan temperatur ≤ 60°C.

Ekstrak kental berwarna coklat dengan konsentrasi 100 %.

Setelah 24 jam, cairan (maserat) ditampung. Ulangi prosedur tersebut sampai maserat yang dihasilkan berwarna jernih.

2.2 Pembuatan media pertumbuhan

2.3 Pembiakan spesimen

Mueller Hinton Agar 12 gram + aquadest 240 ml

Diperoleh sesuai kekeruhan Mac Farland

(Kekeruhan 0,5 Mac Farland / 1.108 CFU/ml.) Dituangkan ke dalam petri.

Jika akan digunakan,dipanaskan kembali hingga Disterilkan dengan autoklaf selama 3 jam. Dipanaskan hingga mendidih.

1 – 2 ose koloni disuspensikan dengan larutan NaCl 0,9%.

Dibiakkan pada media pertumbuhan.

2.4 Skema Ujibakteri

Hasil Metode Drop Plate Mills Mesra.

Menghitung jumlah koloni bakteri pada kelompok perlakuan yang mulai tampak jernih.

Penentuan nilai MIC dari kelompok perlakuan yang mulai tampak jernih.

Membandingkan kekeruhan dengan kontrol (Mac Farland yang diinkubasi 24 jam.)

Dimasukkan dalam inkubator CO2 dengan suhu 37°C selama 24 jam.

Ekstrak etanol buah mahkota dewa dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%. Suspensi bakteri F.nucleatum ATCC 25586

LAMPIRAN 2. Skema Alur Penelitian

2.1 Pembuatan ekstrak buah mahkota dewa

Sediaan buah mahkota dewa yang segar dan matang.

Bahan baku dicuci bersih, ditimbang lalu diiris halus dan dikeringkan selama 10 hari di lemari pengering.

Sampel diblender menjadi serbuk, lalu dimaserasi dengan pelarut etanol 96% selama 3 jam kemudian diperkolasi. Ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selaman 24 jam.

Semua maserat yang didapat,digabung dan disaring, lalu diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada tekanan < 1 ATM dengan temperatur ≤ 60°C.

Ekstrak kental berwarna coklat dengan konsentrasi 100 %.

Setelah 24 jam, cairan (maserat) ditampung. Ulangi prosedur tersebut sampai maserat yang dihasilkan berwarna jernih.

2.2 Pembuatan media pertumbuhan

2.3 Pembiakan spesimen

Mueller Hinton Agar 12 gram + aquadest 240 ml

Diperoleh sesuai kekeruhan Mac Farland (Kekeruhan 0,5 Mac Farland / 1.108 CFU/ml.) Dituangkan ke dalam petri.

Jika akan digunakan,dipanaskan kembali hingga Disterilkan dengan autoklaf selama 3 jam. Dipanaskan hingga mendidih.

1 – 2 ose koloni disuspensikan dengan larutan NaCl 0,9%.

Dibiakkan pada media pertumbuhan.

2.4 Skema Ujibakteri

Hasil Metode Drop Plate Mills Mesra.

Menghitung jumlah koloni bakteri pada kelompok perlakuan yang mulai tampak jernih.

Penentuan nilai MIC dari kelompok perlakuan yang mulai tampak jernih.

Membandingkan kekeruhan dengan kontrol (Mac Farland yang diinkubasi 24 jam.)

Dimasukkan dalam inkubator CO2 dengan suhu 37°C selama 24 jam.

Ekstrak etanol buah mahkota dewa dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%. Suspensi bakteri F.nucleatum ATCC 25586

LAMPIRAN 3.

SERTIFIKAT HASIL UJI Penguj ian Mikrobiologi

1. Contoh uji : Ekstraks mahkota dewa terhadap Fusobacterium nucleatem subspecies nucleatum ATCC 25586 2. Penguji : Staf Laboratorium Lembaga Penyakit Tropis 3. Permintaan : Carolina Kere (Mahasiswa FKG USU) Uraian Jenis Pengujian

No PARAMATER Hasil Uji

1 Hasil Hitung Kuman a. Konsentrasi 100% - Ulangan 1

- Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 b. Konsentrasi 50% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 c. Konsentrasi 25% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6

0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril)

0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril)

0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril)

d. Konsentrasi 12,5% - Ulangan 1

- Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6

e. Konsentrasi 6,25% - Ulangan 1

- Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6

f. Konsentrasi 3,125% - Ulangan 1

- Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6

g. Konsentrasi 1.56% - Ulangan 1

- Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6

0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril)

0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril)

0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril) 0 CFU/ml (steril)

141.20 CFU/ml 166.20 CFU/ml 172.20 CFU/ml 125.20 CFU/ml 120.20 CFU/ml 116.20 CFU/ml

Catatan: Hasil uji hanya berlaku untuk contoh yang diuji. Faktor pengenceran 20 kali Surabaya, 23 Juni2011 Penanggung Jawab Pengujian