3.6.2 Pengenceran bahan coba
Ekstrak siwak ditimbang memakai electonic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara melarutkannya dengan media Mueller
Hinton Broth MHB. Sediakan 5 buah tabung, pada masing-masing tabung diisikan 1 ml MHB. Pada tabung pertama dimasukkan 200 mg ekstrak kental siwak kemudian
dicampur dengan menggunakan vorteks. Dari tabung pertama diambil setengahnya lalu dimasukkan ke tabung kedua, dari tabung kedua diambil lagi setengahnya lalu
dimasukkan ke tabung ketiga begitu seterusnya sampai tabung kelima sehingga didapat konsentrasi 20, 10, 5, 2,5 dan 1,25.
Gambar 10. Siwak yang sudah kering
kemudian ditimbang Gambar 11. Siwak
dimemarkan Gambar 12. Siwak diblender sampai
berupa serat-serat halus.
Gambar 13. Simplisia dimaserasi
Gambar 14. Simplisia diperkolasi
Gambar 15. Proses penguapan dengan rotavapor dan didapat ekstrak etanol
siwak
.
3.6.3 Pembuatan media bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Muller Hinton Agar, sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest kemudian dituangkan kedalam
petri 20 mlpetri, kemudian media disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 atm pada suhu 121ºC. Kemudian selama 24 jam media
dimasukkan dalam inkobator untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak.
3.6.4 Pembiakan spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Fusobacterium nucletaum yang digunakan adalah spesimen stem cell F. nucletaum ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang telah disiapkan
pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan
larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc Farland atau sebanding dengan jumlah 1 x 10
8
CFUml.
3.6.5 Penentuan nilai KHM dan KBM a. Penentuan KHM bahan coba
Ekstrak siwak yang dipakai terdiri dari konsentrasi 20, 10, 5, 2,5 dan 1,25. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya
dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba kemudian dicampur dengan vorteks. Lalu tabung tersebut diinkubasi pada
suhu 37ºC selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektofotometer, lalu bandingkan tabung-tabung tersebut dengan
kontrol Mc Farland untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan
merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Fusobacterium nucleatum dalam media pembenihan setelah
diinkubasi 24 jam dan secara visual diamati.
b. Penentuan KBM bahan coba
Kategori