Toksisitas Akut Ekstrak Daun Sirsak Ratu (Annona muricata) dan Sirsak Hutan (Annona glabra) sebagai Potensi Antikanker
TOKSISITAS AKUT EKSTRAK DAUN SIRSAK RATU
(Annona muricata) DAN SIRSAK HUTAN (Annona
glabra) SEBAGAI POTENSI ANTIKANKER
WAHYU HENDANA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Toksisitas Akut Ekstrak
Daun Sirsak Ratu (Annona muricata) dan Sirsak Hutan (Annona glabra) sebagai
Potensi Antikanker adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2012
Wahyu Hendana
NIM G44060953
ABSTRAK
WAHYU HENDANA. Toksisitas Akut Ekstrak Daun Sirsak Ratu (Annona
muricata) dan Sirsak Hutan (A. glabra) sebagai Antikanker Potensial. Dibimbing
oleh GUSTINI SYAHBIRIN.
Tanaman sirsak diketahui memiliki aktivitas farmakologi seperti antikanker.
Spesies sirsak yang cukup banyak terdapat di Indonesia adalah sirsak ratu
(Annona muricata) dan sirsak hutan (A. glabra). Penelitian ini berhasil
menentukan sifat toksisitas ekstrak daun kedua spesies ini terhadap larva udang
dan embrio ikan zebra. Ekstrak sirsak hutan secara keseluruhan menghasilkan
toksisitas paling tinggi. Nilai LC 50 terbaik diberikan oleh ekstrak heksana daun
sirsak hutan, yaitu 197 µg/mL terhadap larva udang dan 326 µg/mL terhadap
embrio ikan zebra. Nilai ini sudah menunjukkan korelasi yang signifikan sebagai
senyawa antikanker. Ekstrak ini menghasilkan 8 noda pada pemisahan dengan
kromatografi lapis tipis. Pengukuran 1H-NMR terhadap 2 noda yang terpisah
dengan baik belum menunjukkan kandungan asetogenin yang telah dilaporkan
sebagai komponen antikanker pada tanaman sirsak. Diperlukan fraksionasi lebih
lanjut pada ekstrak untuk menentukan struktur senyawa aktif antikanker di
dalamnya.
Kata kunci: Annona glabra, Annona muricata, daun sirsak, uji ikan zebra, uji
letalitas larva udang
ABSTRACT
WAHYU HENDANA. Acute Toxicity of Leaf Extracts from Soursop (Annona
muricata) and Pond Apple (A. glabra) as Potential Anticancer. Supervised by
GUSTINI SYAHBIRIN.
Soursop plants has been known to have pharmacological activities such as
anticancer. Soursop species that are widely found in Indonesia are soursop
(Annona muricata) and pond apple (A. glabra). This study has determined the
toxicity properties of leaf extracts of these species to brine shrimps larvae and
zebra fish embryos. Overall, the pond apple extract showed higher toxicity then the
soursop. The best LC 50 values were obtained from hexane extract of pond apple
leaves, namely 197 µg/mL to brine shrimps larvae and 326 µg/mL to zebra fish
embryo. These values indicate a significant correlation as anticancer compounds.
This extract of pond apple resulted 8 spots in separation by using thin layer
chromatography. 1H-NMR measurement towards these 2 well-separated spot did
not show acetogenin component, as previously reported as the anticancer
components in soursop plants. Further fractionation of the extract is needed to
ensure the structure of the anticancer active component it contained.
Keywords: Annona glabra, Annona muricata, brine shrimps lethality test, soursop
leaf, zebra fish test
TOKSISITAS AKUT EKSTRAK DAUN SIRSAK RATU
(Annona muricata) DAN SIRSAK HUTAN (Annona
glabra) SEBAGAI POTENSI ANTIKANKER
WAHYU HENDANA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Toksisitas Akut Ekstrak Daun Sirsak Ratu (Annona muricata) dan
Sirsak Hutan (Annona glabra) sebagai Potensi Antikanker
Nama
: Wahyu Hendana
NIM
: G44060953
Disetujui oleh
Dr Gustini Syahbirin, MS
Pembimbing
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
Ketua Departemen Kimia
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas berkat limpahan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang
berjudul Toksisitas Akut Ekstrak Daun Sirsak Ratu (Annona muricata) dan Sirsak
Hutan (Annona glabra) sebagai Potensi Antikanker. Shalawat serta salam semoga
selalu tercurahkan kepada junjungan Nabi Muhammad SAW yang telah
membimbing umatnya hingga akhir zaman. Penelitian ini bertujuan menganalisis
potensi ekstrak kasar daun sirsak sebagai potensi antikanker. Penelitian
dilaksanakan sejak Maret 2011 sampai Mei 2012 di Laboratorium Kimia Organik,
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan
Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi,
Fakultas Kedokteran Hewan.
Penghargaan luar biasa penulis berikan kepada kedua orang tua dan
keluarga penulis yang selalu memberi motivasi dan kasih sayang kepada penulis.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Dr Gustini Syahbirin, MS
selaku pembimbing dan Bapak Novriyandi Hanif, DSc yang senantiasa
memberikan arahan, dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama
melaksanakan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh
staf Laboratorium Kimia Organik, Bapak Budi Arifin MSi, Bapak drh.
Kusdiantoro Muhamad, MSi, Kak Steven Gunawan dan Astari Wendarningtyas
atas bantuan serta masukan selama penelitian berlangsung. Apresiasi penulis
berikan kepada Mas Ryan dan Shiddiq (STK 43) atas bantuannya dalam
pengolahan data penulis. Salam hangat penulis ucapkan kepada teman
seperjuangan, Ridho Putrotomo, Indra Sugiarto, dan Lia Anggraini. Salam
semangat untuk Livia, Fijar, Dwi Utami, Dwi Artha, Laras, Rina, Indra, Lita, dan
keluarga besar Kimia atas doa, kasih sayang, motivasi, serta segala dukungan
yang telah kalian berikan.
Atas segala khilaf dan kekurangan, semoga dapat dibukakan pintu maaf
yang sebesar-besarnya. Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi
semua pihak juga perkembangan ilmu pengetahuan.
November 2012
Wahyu Hendana
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Lingkup Kerja
Penentuan Kadar Air
Ekstraksi Daun Sirsak
Partisi Ekstrak Etanol Daun Sirsak
Uji Toksisitas In Vitro Ekstrak Terhadap A. salina
Uji Toksisitas In Vivo Ekstrak terhadap Embrio Ikan Zebra
Fraksionasi Ekstrak Teraktif
Pemisahan dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
Rendemen Ekstrak
Toksisitas In Vitro Terhadap Larva Udang
Toksisitas In Vitro Terhadap Embrio Ikan Zebra
Hasil Pengamatan Embrio Ikan Zebra secara In Vivo
Hasil Fraksionasi dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
1
3
3
3
3
3
4
4
5
5
5
6
6
6
7
8
8
12
15
15
15
15
18
30
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Salah satu struktur asetogenin
Sirsak ratu (A. muricata)
Sirsak hutan (A. glabra)
Embrio ikan zebra (D. rerio)
Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap A. salina
Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap ikan zebra
Foto embrio ikan zebra
Profil kromatogram ekstrak heksana sirsak hutan
Spektrum 1H-NMR noda e
Spektrum 1H-NMR noda h
1
1
2
2
7
8
9
13
14
14
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Diagram alir penelitian
Kadar air dan rendemen daun sirsak
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak air sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Hasil pengamatan embrio ikan zebra ekstrak heksana daun sirsak ratu
Hasil pengamatan embrio ikan zebra ekstrak heksana daun sirsak hutan
Nilai F hitung pengamatan embrio ikan zebra
Hasil uji Dunnet pengamatan embrio ikan zebra
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
29
1
PENDAHULUAN
Tanaman sirsak termasuk famili Annonaceae dan memiliki aktivitas
farmakologi seperti antikanker. Secara umum tanaman famili Annonaceae dapat
dibedakan dari bentuk buahnya. McLaughlin (2008) melaporkan bahwa tanaman
famili Annonaceae mengandung banyak senyawa asetogenin, di antaranya
ditunjukkan pada Gambar 1. Asetogenin merupakan senyawa metabolit sekunder
yang secara alami terbentuk dalam tumbuhan, yang secara spesifik menyerang sel
kanker tanpa memengaruhi sel normal pada makhluk hidup.
Gambar 1 Salah satu struktur asetogenin
Sirsak ratu (Annona muricata) (Gambar 2) merupakan jenis tanaman sirsak
yang lebih dulu diteliti. Wu et al. (1995a dan 1995b), Zeng et al. (1996), dan Kim
et al. (1998) meneliti bagian daun, sementara Rieser et al. (1996), Li et al. (2000),
Chang dan Wu (2001) meneliti bagian biji. Gleye et al. (1998 dan 2000) meneliti
bagian akar. Akan tetapi, jenis tanaman sirsak ini sulit diperoleh dalam jumlah
yang banyak di Indonesia.
Gambar 2 Sirsak ratu (A. muricata)
Banyak peneliti mencari jenis tanaman sirsak lain untuk dikaji lebih lanjut,
salah satunya yang diduga memiliki aktivitas antikanker ialah sirsak hutan
(Annona glabra) (Gambar 3). Serupa dengan sirsak ratu, sirsak hutan juga banyak
diteliti pada bagian buah, daun, biji, dan akar. Cochrane et al. (2008) telah
menguji khasiat antikanker bagian-bagian tanaman A. glabra pada sel leukemia.
Biji, daun, dan buah dilaporkan memiliki efek antikanker, dan bagian biji paling
tinggi khasiatnya.
2
Gambar 3 Sirsak hutan (A. glabra)
Metode uji letalitas larva udang (BSLT) telah banyak digunakan sebagai
metode pendahuluan untuk mengetahui toksisitas suatu bahan. Hasil uji toksisitas
dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksik
senyawa antikanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat,
dan cukup akurat (Colegate dan Molyneux 2008).
Embrio ikan zebra (Danio rerio) (Gambar 4) secara in vivo juga dapat
digunakan dalam pengujian awal terhadap aktivitas antikanker pada suatu bahan.
Hasil uji toksisitas pada embrio ikan zebra telah terbukti memiliki korelasi positif
dengan hasil uji toksisitas pada mamalia (Ma et al. 2007). Pengujian senyawa
antikanker secara in vivo pada embrio ikan zebra juga telah dilakukan oleh
Berghmans et al. (2005), Moore et al. (2006), Hsu et al. (2007), dan Nicoli dan
Presta (2007). Menurut Berghmans et al. (2005), ikan zebra telah dikembangkan
sebagai hewan uji dalam penelitian terhadap penyakit manusia, untuk memperoleh
obat-obatan baru dari senyawa bahan alam.
Gambar 4 Embrio ikan zebra (D. rerio)
Penelitian ini bertujuan membandingkan potensi antikanker sirsak ratu dan
sirsak gundul atau sirsak hutan pada bagian daunnya. Pengujian dilakukan dengan
menggunakan metode BSLT dan metode embrio ikan zebra.
3
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan selama penelitian ini adalah alat kaca yang umum
digunakan di laboratorium, mikropipet, neraca analitik, oven, penguap putar,
pengering beku, multiwell, stereomikroskop yang dilengkapi dengan kamera
digital di Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan, IPB dan
spektrometer VNMRS frekuensi 500 MHz (1H) untuk mengukur resonans magnet
inti (NMR) di Laboratorium NMR, Gedung Basic Science A, ITB Bandung.
Bahan-bahan yang digunakan selama penelitian ini adalah daun sirsak hutan
yang berasal dari Laboratorium Agronomi IPB Leuwikopo, daun sirsak ratu yang
berasal dari daerah Sukabumi, etanol 80%, etil asetat, aseton, n-heksana, dimetil
sulfoksida (DMSO), CDCl 3 , silika gel 60 F 254 untuk kromatografi lapis tipis
(KLT), larva A. salina Leach, dan embrio ikan zebra yang didapat dari peternak
ikan di daerah Cikaret.
Lingkup Kerja
Metode penelitian dilakukan mengikuti diagram alir pada Lampiran 1.
Tahapannya meliputi penyiapan sampel daun sirsak, penentuan kadar air,
ekstraksi daun sirsak, partisi ekstrak etanol daun sirsak, pengujian toksisitas, dan
pencirian senyawa bioaktif.
Penentuan Kadar Air
Cawan porselen dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 °C selama 60
menit. Selanjutnya cawan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan
ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak 3 g sampel dimasukkan ke dalam cawan
dan dikeringkan di dalam oven selama 24 jam pada suhu 105 °C. Setelah itu,
cawan didinginkan dalam eksikator sekitar 30 menit dan ditimbang kembali.
Pemanasan dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Penentuan kadar air
dilakukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo) (AOAC 1984).
Kadar air (%) = A − B × 100%
A
Keterangan:
A = bobot bahan sebelum dikeringkan (g)
B = bobot bahan setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Daun Sirsak
Daun sirsak dikeringkan kemudian digiling sampai berbentuk serbuk.
Sebanyak ±100 g sampel daun dimaserasi dengan etanol 80% dengan nisbah 1:8
selama 3×24 jam. Penggantian pelarut dilakukan setiap 24 jam. Ekstrak lalu
dipekatkan dengan penguap putar dan pengering beku. Ekstrak pekat yang
4
diperoleh ditimbang dan dihitung rendemennya dengan persamaan sebagai
berikut:
a
×100%
Rendemen ekstrak =
(1 − kadar air)b
Keterangan:
a = bobot ekstrak (g)
b = bobot contoh awal (g)
Partisi Ekstrak Etanol Daun Sirsak
Partisi dengan heksana 1:1 berdasarkan volume terhadap ekstrak etanol
dilakukan untuk mengambil fraksi nonpolar sehingga didapat fraksi polar dan
nonpolar (ekstrak heksana). Penambahan heksana dilakukan beberapa kali hingga
fraksi nonpolar tidak berwarna. Kedua fraksi dipekatkan dengan penguap putar.
Fraksi polar pekat kemudian dilarutkan dengan 200 mL air dan dimasukkan ke
dalam corong pisah. Setelah itu, diekstraksi menggunakan etil asetat dengan
nisbah air-etil asetat 1:3 dan didapat fraksi polar (ekstrak air) dan semipolar
(ekstrak etil asetat). Penambahan etil asetat dilakukan beberapa kali sampai fraksi
semipolar tidak berwarna. Kedua fraksi dipisahkan, masing-masing dipekatkan
dengan penguap putar dan dikeringbekukan.
Uji Toksisitas In Vitro Ekstrak Terhadap A. salina
Penetasan Telur A. salina
Telur A. salina yang sudah siap ditetaskan ditimbang sebanyak 0.5 g
kemudian dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air laut yang sudah disaring
dan diaerasi. Telur dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar
menetas sempurna. Telur yang telah menetas menjadi larva digunakan untuk uji
toksisitas.
Uji Toksisitas terhadap A. salina
Larutan standar ekstrak etanol, ekstrak heksana, ekstrak etil asetat, dan
ekstrak air dibuat dalam konsentrasi 5000 µg/mL kemudian diencerkan dengan air
laut hingga diperoleh konsentrasi 100, 500, 1000, 1500, dan 2000 µg/mL. Apabila
ekstrak tidak larut ditambahkan DMSO. Ke dalam multiwell dimasukkan 400 μL
air laut, 10 ekor larva udang dalam 600 μL air laut, dan 1 mL ekstrak. Ulangan
dilakukan sebanyak 4 kali. Multiwell ditutup dengan aluminium foil dan
diinkubasi selama 24 jam. Nilai konsentrasi letal 50% (LC 50 ) ditentukan dengan
menggunakan kurva hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (sumbu x) dan
rerata persen kematian larva udang (sumbu y) (Krishnaraju et al. 2005).
5
Uji Toksisitas In Vivo Ekstrak terhadap Embrio Ikan Zebra (Heiden et al.
2007, Wei et al. 2010, dan Coelho et al. 2011)
Uji Toksisitas
Larutan standar ekstrak etanol, ekstrak heksana, ekstrak etil asetat, dan
ekstrak air dibuat dalam konsentrasi 5000 µg/mL kemudian diencerkan hingga
diperoleh konsentrasi 100, 500, 1000, 1500, dan 2000 µg/mL. DMSO
ditambahkan apabila ekstrak tidak larut. Sebanyak 10 telur ikan zebra dalam 1 mL
air tawar dan 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam multiwell. Ulangan dilakukan
sebanyak 4 kali. Multiwell ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi selama
24 jam. Nilai LC 50 ditentukan dengan menggunakan kurva hubungan logaritma
konsentrasi ekstrak (sumbu x) dengan rerata persen kematian larva udang (sumbu
y).
Pengamatan Embrio Ikan Zebra
Embrio ikan zebra yang telah terpapar oleh ekstrak aktif selama 24 jam
diamati morfologinya yaitu pigmentasi, panjang tubuh, diameter embrio (jika
embrio tidak menetas), kepala, mata, jantung, kantung kuning telur, dan ekor
dengan menggunakan stereomikroskop.
Fraksionasi Ekstrak Teraktif
Ekstrak teraktif daun sirsak ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering,
langsung dielusi dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen
pengembang. Elusi tahap pertama dilakukan dengan eluen tunggal etil asetat,
kloroform, dan n-heksana. Noda yang dihasilkan dari proses elusi masing-masing
eluen diamati di bawah lampu ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 254 nm.
Eluen terbaik ialah yang menghasilkan noda terbanyak dan terpisah dengan baik.
Jika lebih dari 1 eluen menghasilkan noda terbanyak dan terpisah baik, maka
eluen-eluen tersebut dicampurkan dengan nisbah tertentu hingga diperoleh
campuran eluen terbaik (Houghton dan Raman 1998).
Pemisahan dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
Fraksi ekstrak teraktif dipisahkan dengan pelat KLT preparatif. Digunakan
eluen terbaik yang didapat dari pengujian sebelumnya. Noda yang terpisah dengan
baik pada pelat dikerok tanpa tercampur dengan noda lainnya kemudian
dilarutkan dengan aseton dan disaring untuk mendapatkan fraksi ekstrak teraktif.
Fraksi yang didapat kemudian dikeringkan dengan penguap putar lalu dilakukan
pengukuran 1H-NMR dengan pelarut CDCl 3 .
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
Penyimpanan contoh dalam jangka waktu lama menjadi masalah tersendiri
jika sifat contoh tersebut tidak diketahui. Menurut Winarno (1995), contoh dapat
disimpan dalam jangka waktu lama apabila kadar airnya kurang dari 10%. Selain
itu, kadar air juga digunakan sebagai faktor koreksi dalam perhitungan rendemen
ekstrak (Harborne 1987). Pemanasan pada suhu 105 ⁰C dapat menghilangkan air
yang terikat secara fisik pada daun sirsak (Harjadi 1986). Kadar air daun sirsak
ratu diperoleh sebesar 8.61% dan daun sirsak hutan 7.10% (Lampiran 2). Kadar
air keduanya kurang dari 10% sehingga dapat disimpan dalam jangka panjang.
Rendemen Ekstrak
Daun sirsak ratu dan sirsak hutan diekstraksi dengan 4 pelarut berbeda
kepolaran, mulai dari yang paling polar ialah air, etanol, etil asetat, dan heksana.
Daun sirsak terlebih dahulu diekstraksi dengan pelarut etanol karena pelarut
tersebut dapat mengekstraksi senyawa polar dan nonpolar dengan baik (Harbone
1987). Wu et al. (1995), Zeng et al. (1996), dan Kim et al. (1998) juga
menggunakan pelarut etanol untuk ekstraksi sampel sirsak ratu. Rendemen ekstrak
etanol yang didapat sebesar 5.91% untuk sirsak ratu dan 3.98% untuk sirsak hutan
(Tabel).
Tabel Rendemen ekstrak daun sirsak
Rendemen (% (b/b))
Bahan
Ekstrak Ekstrak
Ekstrak
etanol heksana etil asetat
Sirsak ratu
5.91
1.94
0.49
Sirsak hutan
3.98
1.93
1.85
Ekstrak
air
3.47
0.19
Partisi dengan pelarut heksana ke dalam ekstrak etanol bertujuan
memisahkan komponen nonpolar dalam etanol ke dalam heksana. Rendemen yang
didapat sebesar 1.94 dan 1.93% untuk sirsak ratu dan hutan (Tabel). Tahap
selanjutnya, ekstrak polar (etanol) dilarutkan dengan air dan diekstraksi dengan
etil asetat untuk memisahkan komponen semipolar yang terdapat dalam ekstrak
polar. Colegate dan Molyneux (2008) menyatakan bahwa ekstrak metanol atau
etanol dari contoh segar dapat dipartisi kembali dengan etil asetat untuk
memisahkan komponen semipolar dari fraksi air. Rendemen ekstrak etil asetat
sirsak ratu dan hutan sebesar 0.49 dan 1.85%, sedangkan untuk ekstrak air
berturut-turut 3.47 dan 0.19%.
Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi sampel daun sirsak karena
kandungan senyawa yang terdapat dalam sampel belum diketahui daya tahannya
terhadap panas. Maserasi dilakukan hingga pelarut tidak berwarna dengan asumsi
semua senyawa yang terdapat dalam sampel telah terekstraksi.
7
Toksisitas In Vitro Terhadap Larva Udang
Data nilai LC 50 dengan metode BSLT (Gambar 5) menunjukkan bahwa
daun sirsak hutan lebih toksik daripada daun sirsak ratu. Ketiga ekstrak dari daun
sirsak hutan memiliki nilai LC 50 yang lebih rendah daripada sirsak ratu, yang
mengindikasikan bahwa ekstrak tersebut lebih toksik. Urutan tingkat toksisitas
daun sirsak hutan ialah ekstrak heksana > etanol > etil asetat. Hal yang sama juga
dijumpai pada daun sirsak ratu.
1378.79
µg/mL
1500
1000
500
484.95
429.14
243.55
196.69
501.07
0
heksana
sirsak ratu
etanol
etil asetat
sirsak hutan
Gambar 5 Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap A. salina
Ekstrak heksana untuk kedua jenis sirsak mempunyai nilai LC 50 lebih
rendah dibandingkan dengan ekstrak etanol dan etil asetat. Ekstrak heksana sirsak
ratu memiliki nilai LC 50 429.14 µg/mL (r2 = 0.9225) dan ekstrak heksana sirsak
hutan memiliki nilai LC 50 196.69 µg/mL (r2 = 0.9548) (Lampiran 3). Nilai ini
cukup sebanding dengan hasil penelitian Rieser et al. (1996) dan Zeng et al.
(1996) yang mendapatkan nilai LC 50 untuk ekstrak kasar teraktif daun sirsak ratu
berada di bawah 250 mg/L.
Ekstrak heksana selain mengandung lemak juga mengandung sebagian besar
komponen organik nonpolar. Senyawa asetogenin dalam daun juga dapat
terekstraksi ke dalam fase heksana. Sifat toksik senyawa metabolit sekunder ini
diduga menyebabkan ekstrak heksana mempunyai nilai LC 50 lebih rendah.
Ekstrak etanol sirsak ratu dan sirsak hutan memiliki nilai LC 50 masingmasing 484.95 µg/mL (r2 = 0.9996) dan 243.55 µg/mL (r2 = 0.94374) (Lampiran
4). Dalam penelitian sebelumnya, Zeng et al. (1996) mendapatkan nilai LC 50
ekstrak etanol daun sirsak ratu sebesar 30.5 µg/mL, lebih kecil dibandingkan
dengan hasil penelitian ini.
Ekstrak etil asetat sirsak ratu dan sirsak hutan memiliki toksisitas paling
rendah dibandingkan dengan kedua ekstrak lainnya. Nilai LC 50 berturut-turut
sebesar 1378.79 µg/mL (r2 = 0.8099) dan 501.07 µg/mL (r2 = 0.9999) (Lampiran
5). Ekstrak air sirsak ratu dan sirsak hutan tidak dapat ditentukan nilai LC 50 -nya
karena ekstrak ini tidak mampu mematikan larva udang yang diujikan (Lampiran
6).
Berdasarkan AOAC (2002), nilai koefisien korelasi (r2) yang baik adalah
lebih besar atau sama dengan 0.9900. Meskipun uji toksisitas BSLT tidak spesifik
8
untuk antikanker, hasil uji senyawa antikanker telah dilaporkan menunjukkan
korelasi yang signifikan dengan kematian larva udang (Mukhtar et al. 2007).
Toksisitas In Vitro Terhadap Embrio Ikan Zebra
Uji in vitro toksisitas daun sirsak ratu dan sirsak hutan juga dilakukan
terhadap embrio ikan zebra. Tingkat kematian embrio serta penghambatan dalam
pertumbuhannya diamati setelah pemberian ekstrak. Hasil yang diperoleh
sebanding dengan hasil uji BSLT, tetapi dengan nilai LC 50 hasil pengujian ikan
zebra secara keseluruhan lebih besar.
Ekstrak heksana sirsak ratu dan sirsak hutan memiliki nilai LC 50 492.15
µg/mL (r2 = 0.9815) dan 325.61 µg/mL (r2 = 0.9902) (Lampiran 7), ekstrak etanol
berturut-turut 729.12 µg/mL (r2 = 0.9283) dan 491.47 µg/mL (r2 = 0.9721)
(Lampiran 8), sedangkan ekstrak etil asetat berturut-turut 1397.65 µg/mL (r2 =
0.9357) dan 608.97 µg/mL (r2 = 0.9259) (Lampiran 9). Hasil ini diringkaskan
pada Gambar 6.
1397.65
µg/mL
1500
1000
500
729.12
492.15
325.61
491.47
608.97
0
heksana
etanol
etil asetat
sirsak ratu
sirsak hutan
Gambar 6 Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap ikan zebra
Nilai LC 50 yang relatif lebih besar pada pengujian ikan zebra disebabkan
kekuatan hidup hewan uji tersebut lebih besar dibandingkan dengan larva udang.
Selain itu, tingkat kematian ikan zebra lebih mudah diamati dibandingkan dengan
pengamatan larva udang karena ukurannya yang lebih besar. Meskipun demikian,
dalam uji dengan embrio ikan zebra, ekstrak heksana tetap memiliki nilai LC 50
paling rendah. Oleh karena itu, pengamatan morfologi secara mikroskopik (uji in
vivo) dilakukan terhadap embrio ikan zebra yang telah terpapar ekstrak heksana
dalam penentuan nilai LC 50 (uji in vitro).
Hasil Pengamatan Embrio Ikan Zebra secara In Vivo
Embrio ikan zebra secara in vivo dapat mewakili kompleksitas fisiologis dan
morfologis pada organisme dewasa. Oleh karena itu, embrio tersebut dapat
menggambarkan informasi organisme yang lengkap dalam uji toksisitas (Ma et al.
2007). Suatu ekstrak dapat dikatakan memiliki potensi antikanker apabila
9
penambahan ekstrak tersebut pada embrio ikan zebra berpengaruh signifikan
terhadap pertumbuhan morfologi embrio (Coelho et al. 2011).
Pengamatan embrio dilakukan dengan stereomikroskop. Foto objek dapat
digunakan untuk mengukur organ-organ embrio dengan menggunakan skala
preparat, setelah semua embrio dari masing-masing konsentrasi uji diamati.
Pengamatan meliputi pigmentasi, panjang tubuh, diameter embrio (jika embrio
tidak menetas), kepala, mata, jantung, kantung kuning telur, dan ekor.
Perlakuan dengan ekstrak heksana sirsak ratu tidak berpengaruh signifikan
pada morfologi embrio (Gambar 7a). Perlakuan pada kontrol (0 µg/mL),
konsentrasi 50 dan 250 µg/mL menghasilkan perkembangan embrio yang serupa.
Heiden et al. (2007) dan Wei et al. (2010) melaporkan bahwa larva ikan zebra
yang normal akan memiliki sumbu tubuh yang lurus.
(a)
(b)
Gambar 7 Foto embrio ikan zebra dengan penambahan ekstrak heksana sirsak
ratu (a) dan sirsak hutan (b) pada konsentrasi 0 (A), 50 (B), 250 (C),
500 (D), 750 (E), dan 1000 µg/mL (F)
10
Larva pada kontrol (0 µg/mL) memiliki sumbu tubuh yang lurus sehingga
dapat dikatakan tumbuh normal (A). Perkembangan sempurna larva kontrol juga
dapat ditunjukkan dengan pigmentasi yang terjadi. Coelho et al. (2011)
menyatakan, jika larva ikan zebra memiliki kelainan, maka intensitas pigmennya
akan berkurang. Intensitas pigmen pada larva kontrol sudah cukup terbentuk dan
organ lain seperti jantung, kantung kuning telur, ekor, dan kepala juga telah
berkembang dengan baik.
Perlakuan dengan konsentrasi 50 (B) dan 250 µg/mL (C) menghasilkan
embrio yang menetas menjadi larva dan berkembang hampir sempurna. Sumbu
tubuh keduanya lurus, namun intensitas pigmen berkurang. Pada larva C terbentuk
mata yang kurang sempurna dan kantung telur agak membesar. Kantung kuning
telur merupakan membran yang berfungsi menyediakan nutrisi bagi embrio.
Pembesaran kantung kuning telur merupakan salah satu indikasi nutrisi tidak
terdistribusi sempurna pada embrio. Hal tersebut akan menyebabkan kekurangan
nutrisi pada embrio yang lambat laun akan menyebabkan kematian (Bie 2001).
Namun, perkembangan kedua larva ini tergolong normal dibandingkan dengan
larva pada konsentrasi lebih tinggi. Organ jantung keduanya dapat teramati
dengan baik. Berdasarkan hasil ini, dapat dikatakan konsentrasi 50 dan 250
µg/mL ekstrak heksana sirsak ratu kurang toksik.
Perlakuan selanjutnya (D) merupakan pemaparan ekstrak dengan
konsentrasi 500 µg/mL. Embrio menetas menjadi larva, namun terjadi
keabnormalan pada perkembangannya. Sumbu tubuh melengkung ke atas dan
ukurannya lebih kecil dibandingkan dengan kontrol. Kantung kuning telur sangat
besar sehingga organ jantung tidak terlihat. Hal ini menyebabkan asupan makanan
tidak merata sehingga sumbu tubuh terlihat lebih kecil. Selain itu, terjadi kebutaan
pada organ mata dan ukurannya pun lebih kecil daripada kontrol. Semua
keabnormalan tersebut menunjukkan bahwa ekstrak pada konsentrasi 500 µg/mL
toksik. Konsentrasi 750 (E) dan 1000 (F) µg/mL menunjukkan kemiripan
perkembangan larva. Larva menetas, namun pertumbuhan organ mata, jantung,
kantung kuning telur, dan ekor tidak terlihat. Hal ini menunjukkan bahwa kedua
konsentrasi ekstrak tersebut sangat toksik (Lampiran 10).
Berbeda dengan sirsak ratu, ekstrak heksana sirsak hutan (Gambar 7b) telah
menampakkan keabnormalan sejak konsentrasi 50 µg/mL (B). Embrio kontrol (0
µg/mL) menetas dan berkembang dengan sempurna (A). Pigmentasi dan
perkembangan organ-organ juga terjadi dengan baik.
Embrio dengan perlakuan konsentrasi 50 µg/mL (B) menetas menjadi larva.
Namun, terdapat beberapa abnormalitas. Sumbu tubuh agak melengkung ke atas,
intensitas pigmen tidak sebaik kontrol, kepala membesar, terjadi kelainan pada
mata, dan ukuran kantung kuning telur lebih besar dibandingkan dengan kontrol
(Lampiran 11). Ini merupakan indikasi bahwa pada konsentrasi 50 µg/mL, daya
sitotoksik ekstrak sirsak hutan telah memengaruhi perkembangan embrio dan
lebih kuat daripada ekstrak sirsak ratu. Hasil ini berkorelasi dengan nilai LC 50
yang dihasilkan; nilai LC 50 ekstrak heksana sirsak hutan lebih kecil dibandingkan
dengan ekstrak sirsak ratu.
Konsentrasi 250 µg/mL (C) memberikan pengaruh yang lebih signifikan
pada larva. Larva C lebih pendek daripada kontrol karena terjadi pemutusan
bagian tubuh sampai ekor (Lampiran 11). Organ lain seperti kepala tidak
11
terbentuk dengan sempurna, bahkan untuk mata dan jantung tidak terlihat. Selain
itu, kantung kuning telur membesar dan sedikit hancur pada bagian bawahnya.
Pada konsentrasi 500 µg/mL (D) embrio mulai tumbuh dan cangkang telur sudah
terlepas. Namun, embrio tidak berkembang lagi dan mati.
Pengamatan embrio E (750 µg/mL) dan F (1000 µg/mL) menunjukkan daya
sitotoksik tertinggi pada ekstrak heksana sirsak hutan. Embrio E tidak menetas,
namun cangkang telur telah rusak dan terlihat embrio mulai berkembang di dalam
telur. Embrio F tidak berkembang dalam telur dan juga tidak menetas. Embrio
diperkirakan sudah mati sebelum 24 jam. Hal ini sesuai dengan meningkatnya
sitotoksisitas pada konsentrasi ekstrak yang semakin tinggi.
Hasil pengamatan di atas menunjukkan bahwa ekstrak heksana sirsak ratu
dan hutan sama-sama toksik terhadap ikan zebra. Organ tubuh ikan zebra seperti
mata, jantung, dan kantung kuning telur dihambat pertumbuhannya. Peredaran
darah dan pertumbuhan panjang tubuh mengalami keabnormalan yang beragam
pada konsentrasi 50 sampai 500 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi
tersebut dapat menghambat pertumbuhan organ tubuh tanpa membunuh langsung
hewan uji. Pengaruh inilah yang diharapkan terjadi pada sel kanker yang
menyerang manusia. Sel kanker dihambat pertumbuhannya tanpa efek samping
yang serius pada penderita kanker.
Analisis statistik yang digunakan untuk menguji data pengamatan embrio
ikan zebra adalah uji Anova 2-arah dan uji lanjutan Dunnet post hoc dengan
menggunakan perangkat lunak SPSS 17. Uji Anova 2-arah digunakan untuk
membandingkan rata-rata lebih dari 2 kelompok dan untuk menganalisis apakah
konsentrasi ekstrak yang diberikan memengaruhi morfologi embrio secara
signifikan. Hipotesis yang digunakan adalah H 0 : konsentrasi tidak berpengaruh
terhadap morfologi embrio, dan H 1 : konsentrasi berpengaruh terhadap morfologi
embrio. Pengambilan putusan didasarkan perbandingan nilai F hitung dengan F tabel .
Jika F hitung > F tabel , maka H 0 ditolak (Walpole 1993). Nilai F tabel yang digunakan
pada taraf nyata 0.05 adalah 3.106.
Uji Dunnet digunakan untuk membandingkan perlakuan dengan kontrol.
Taraf signifikansi yang digunakan 0.05. Hal ini berarti jika nilai signifikansi dari
pengukuran embrio (p) < 0.05, maka perlakuan konsentrasi berbeda signifikan
dengan kontrol (Mattjik dan Sumertajaya 2006).
Data pengamatan embrio sirsak ratu menghasilkan nilai F hitung > F tabel
kecuali pada pengamatan organ mata (Lampiran 12), maka konsentrasi yang
diberikan berpengaruh terhadap morfologi embrio, kecuali perkembangan mata.
Pengamatan embrio sirsak hutan menunjukkan F hitung < F tabel pada organ jantung,
kantung kuning telur, dan mata. Namun, hal tersebut bukan karena ekstrak tidak
berpengaruh, melainkan karena mulai konsentrasi 50 dan 250 µg/mL, organ
jantung dan mata sudah tidak terbentuk.
Hasil uji Dunnet untuk panjang tubuh embrio (Lampiran 13) memberikan
nilai p < 0.05 pada konsentrasi ekstrak sirsak ratu 250 sampai 1000 µg/mL.
Konsentrasi 50 µg/mL menghasilkan nilai p > 0.05. Jadi, pada konsentrasi 50
µg/mL, panjang tubuh embrio tidak berbeda signifikan dengan kontrol, sedangkan
pada konsentrasi 250–1000 µg/mL panjang tubuh embrio berbeda secara
signifikan. Ekstrak sirsak hutan memberikan hasil yang sama untuk konsentrasi
50 µg/mL, namun mulai konsentrasi 250–1000 µg/mL tidak terdapat nilai p
karena larva tidak memiliki panjang tubuh.
12
Data pigmentasi untuk ekstrak sirsak ratu menghasilkan nilai signifikansi
kurang dari 0.05 pada konsentrasi 50 dan 250 µg/mL. Konsentrasi 500–1000
µg/mL tidak menghasilkan nilai signifikansi karena pigmentasi tidak terbentuk.
Hal ini juga terjadi pada ekstrak sirsak hutan, bahkan larva tidak menunjukkan
pigmentasi sejak konsentrasi 250 µg/mL sehingga uji Dunnet tidak menghasilkan
signifikansi sama sekali. Uji Dunnet akan menghasilkan nilai signifikansi jika
sedikitnya ada 3 data.
Pada data jantung embrio, perlakuan ekstrak sirsak ratu memberikan nilai p
< 0.05 untuk konsentrasi 50 dan 250 µg/mL (Lampiran 13) dan tidak ada
pertumbuhan jantung pada konsentrasi 500–1000 µg/mL (Lampiran 10). Pada
perlakuan ekstrak sirsak hutan kembali tidak diperoleh signifikansi karena mulai
konsentrasi 250 µg/mL jantung tidak terbentuk.
Data kantung kuning telur (Lampiran 13) untuk perlakuan ekstrak sirsak ratu
dan sirsak hutan menghasilkan nilai p > 0.05 pada konsentrasi 50 dan 250 µg/mL,
artinya pada konsentrasi tersebut ekstrak tidak memengaruhi kantung kuning telur
ikan zebra. Selanjutnya untuk sirsak ratu, pada konsentrasi 500 dan 750 µg/mL
nilai p < 0.05, sedangkan pada 1000 µg/mL nilai p tidak terdeteksi. Untuk sirsak
hutan, mulai konsentrasi 500 µg/mL kantung kuning telur sudah tidak terbentuk.
Pengukuran kepala embrio (Lampiran 13) dengan perlakuan ekstrak sirsak
ratu menghasilkan nilai p < 0.05 untuk konsentrasi 500 dan 750 µg/mL.
Konsentrasi 50 dan 250 µg/mL tidak berbeda nyata dengan kontrol. Embrio ikan
pada konsentrasi 1000 µg/mL menetas menjadi larva, namun ukuran kepala tidak
dapat ditentukan. Untuk sirsak hutan mulai konsentrasi 250 µg/mL ukuran kepala
tidak dapat ditentukan sehingga uji Dunnet tak dapat dilakukan.
Ukuran mata embrio (Lampiran 13) tidak berbeda nyata pada perlakuan
ekstrak sirsak ratu dengan konsentrasi 50–500 µg/mL. Pada konsentrasi 750 dan
1000 µg/mL, mata sudah rusak dan tidak dapat diukur. Pada perlakuan ekstrak
sirsak hutan kerusakan mata terjadi mulai konsentrasi 250 µg/mL, maka tidak
dapat diuji Dunnet.
Pengukuran ekor embrio (Lampiran 13) pada perlakuan ekstrak sirsak ratu
memberikan nilai p < 0.05 pada konsentrasi 250 dan 500 µg/mL dan tidak
memberikan nilai p pada konsentrasi 750 dan 1000 µg/mL. Konsentrasi 50 µg/mL
memberikan nilai p > 0.05. Hasil pengukuran ekor pada ekstrak sirsak hutan tidak
ada mulai konsentrasi 250 µg/mL karena tubuh ikan sudah terpengaruh oleh
ekstrak. Akibatnya, tidak dapat dilakukan uji Dunnet.
Berdasarkan hasil pengamatan embrio dan analisis statistika di atas, kedua
ekstrak daun memberikan daya sitotoksik, tetapi ekstrak sirsak hutan lebih tinggi
sitotoksisitasnya. Hal itu ditunjukkan dengan pengaruh signifikan pada
konsentrasi yang lebih rendah terhadap panjang tubuh, pigmentasi, jantung,
kantung kuning telur, kepala, mata, dan ekor.
Hasil Fraksionasi dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
Penentuan fraksi ekstrak teraktif dilakukan dengan menggunakan metode
KLT. Langkah awal adalah penentuan eluen terbaik. Pelarut yang digunakan
memiliki tingkat kepolaran yang berbeda, antara lain etil asetat, kloroform, dan n-
13
heksana. Pelarut yang dijadikan sebagai penyusun fase gerak adalah yang
menghasilkan jumlah noda terbanyak dan memiliki keterpisahan yang baik. Eluen
tunggal n-heksana dan kloroform memberikan keterpisahan yang terbaik. Kedua
pelarut tersebut digabungkan dengan nisbah tertentu untuk mendapatkan eluen
campuran yang dapat memisahkan ekstrak dengan baik. Campuran eluen yang
diujikan pada ekstrak heksana sirsak hutan sebagai ekstrak teraktif adalah
kloroform:n-heksana (1:9 hingga 9:1) (Houghton dan Raman 1998).
Pola keterpisahan terbaik didapatkan dengan eluen kloroform:n-heksana
(7:3). Ekstrak heksana sirsak hutan memisah menjadi 8 noda dengan nilai R f
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8. Hasil KLT ini menunjukkan bahwa
diduga terdapat 8 komponen atau senyawa pada ekstrak aktif sirsak hutan yang
memiliki kemungkinan sebagai antikanker.
Gambar 8
Profil kromatogram ekstrak heksana sirsak hutan dengan eluen
kloroform:n-heksana (7:3)
Kedelapan komponen tersebut selanjutnya dipisahkan dengan menggunakan
KLTP dengan eluen kloroform:n-heksana (7:3). Empat noda tepisah dengan baik,
yaitu e, f, g, dan h. Noda yang berhasil dimurnikan dan dilanjutkan untuk
pengukuran NMR ialah noda e dan h.
Spektrum 1H-NMR noda e (Gambar 9) menunjukkan 2 sinyal proton pada
geseran kimia (δ) 0.91 ppm dengan angka banding proton (ABP) 3.0 dan δ 1.31
ppm dengan ABP 11.3. Dua sinyal juga ditunjukkan oleh spektrum 1H-NMR noda
h (Gambar 10), yaitu pada δ 0.88 ppm dengan ABP 3.0 dan δ 1.29 ppm dengan
ABP 12. Namun, pola pembelahan sinyal yang berbeda menunjukkan 2 senyawa
yang berbeda. Hasil ini belum dapat diperkirakan strukturnya karena analisis 13CNMR tidak dilakukan.
14
Gambar 9 Spektrum 1H-NMR noda e
Gambar 10 Spektrum 1H-NMR noda h
Secara umum, asetogenin memiliki cincin tetrahidrofuran (THF) dan gugus
alkohol (McLaughlin 2008). Cincin mono-THF teridentifikasi oleh 1H-NMR pada
δ 3.45, 3.85, 3.87, dan 3.46 ppm (Wu et al. 1995), sedangkan noda e dan h hanya
menghasilkan sinyal di 0.8−1.3 ppm. Menurut Kim et al. (1998), asetogenin akan
menunjukkan sinyal 1H-NMR pada δ 7.20, 5.06 dan 1.44 ppm. Oleh karena itu,
15
baik noda e maupun h bukan senyawa asetogenin atau turunannya sehingga tidak
dilakukan analisis 13C-NMR.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak daun sirsak (sirsak ratu dan sirsak hutan) berpotensi sebagai
antikanker. Ekstrak sirsak hutan lebih sitotoksik daripada sirsak ratu. Ekstrak
heksana paling aktif, dengan nilai LC 50 ekstrak heksana sirsak hutan pada larva
udang 197 µg/mL dan pada embrio ikan zebra 326 µg/mL. Fraksionasi ekstrak ini
diduga menghasilkan 8 senyawa, namun belum diperoleh senyawa target, yaitu
asetogenin.
Saran
Ekstrak aktif daun sirsak perlu difraksionasi lebih lanjut. Pengukuran
spektroskopi yang lebih lengkap juga dibutuhkan untuk menentukan jenis
senyawa yang berperan sebagai antikanker.
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 1984. Official Methods of
Analysis. Ed ke-14. Arlington: AOAC.
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2002. AOAC International
Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and
Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis. J AOAC
Int. 85:1-5.
Berghmans S, Jette C, Langenau D, Hsu K, Stewart R, Look T, Kanki JP. 2005.
Making waves in cancer research: new models in the Zebrafish.
BioTechniques. 39:227-237.
Bie GVD. 2001. Embryology: Early Development from a Phenomenological
Point of View. Driebergen: Louis Bolk Institute.
Chang FR, Wu YC. 2001. Novel cytotoxic Annonaceous acetogenins from
Annona muricata. J Nat Prod. 64:925-931.
Cochrane CB, Nair PKR, Melnick SJ, Resek AP, Ramachandran C. 2008.
Anticancer effects of Annona glabra plant extracts in human leukemia cell
lines. Anticancer Res. 28:965-972.
Coelho S, Oliveira R, Pereira S, Musso C, Domingues I, Bhujel RC, Soares
AMVM, Nogueira AJA. 2011. Assessing lethal and sub-lethal effects of
trichlorfon on different trophic levels. Aqua Toxicol. 103:191-198.
Colegate SM, Molyneux RJ. 2008. Bioactive Natural Products: Detection,
Isolation, and Structural Determination. California: CRC Pr.
16
Gleye C, Duret P, Laurens A, Hocquemiller R, Cave A. 1998. cisMonotetrahydrofuran acetogenins from the roots of Annona muricata. J
Nat Prod. 61:576-579.
Gleye C, Raynaud S, Fourneau C, Laurens A, Laprevote O, Serani L, Fournet A,
Hacquemiller R. 2000. Cohibin C and D, two important metabolites in the
biogenesis of acetogenins from Annona muricata and Annona nutans. J
Nat Prod. 63:1192-1196.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari:
Phytochemical Methods.
Harjadi W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia.
Heiden TCK, Dengler E, Kao WJ, Heideman W, Peterson RE. 2007.
Developmental toxicity of low generation PAMAM dendrimers in
zebrafish. Toxicol Appl Pharmacol. 225:70-79.
Houghton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractionation of
Natural Extract. London: Chapman & Hall.
Hsu CH, Wen ZH, Lin CS, Chakraborty C. 2007. The zebrafish model: Use in
studying cellular mechanism for a spectrum of clinical disease entities.
Curr Neurovascular Res. 4:111-120.
Kim G, Zeng L, Alali F, Rogers LL, Wu FE, McLaughlin JL, Sastrodihardjo S.
1998. Two new mono-tetrahydrofuran ring acetogenins, annomuricin E
and muricapentocin, from the leaves of Annona muricata. J Nat Prod.
61:432-436.
Krishnaraju AV, Rao TVN, Sundararaju D, Vanisree M, Tsay HS, Subbaraju GV.
2005. Assessment of bioactivity of Indian medicinal plants using Brine
Shrimp (A. salina) lethality assay. Int J Appl Sci Eng. 3:125-134.
Li DY, Yu JG, Luo XZ, Sun L, Yang SL. 2000. Muricatenol, a linear acetogenin
from Annona muricata (Annonaceae). Chinese Chem Lett. 11:239-242.
Ma C, Parng C, Seng WL, Zhang C, Willet C, Mc Grath P. 2007. Zebrafish, an in
vivo model for drug screening. Drug Discovery. 6:38-45.
Mattjik AA, Sumertajaya IM. 2006. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi
SAS dan MINITAB. Bogor (ID): IPB Pr.
McLaughlin JL. 2008. Paw paw and cancer: Annonaceous acetogenins from
discovery to commercial products. J Nat Prod. 71:1311-1321.
Moore JL, Rush LM, Breneman C, Mohideen MAPK, Cheng KCl. 2006.
Zebrafish genomic instability mutants and cancer susceptibility. Genetics.
10:1-33.
Mukhtar MH, Adnan AZ, Pitra MW. 2007. Uji sitotoksisitas minyak atsiri daun
Kamanggi (Ocimum basilicum L) dengan metode Brine Shrimp Lethality
Test Bioassay. J Sains Tek Far. 12:1-4.
Nicoli S, Presta M. 2007. The Zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.
Nature Protocols. 2:2918-2923.
Rieser MJ, Gu ZM, Fang XP, Zeng L, Wood KV, McLaughlin JL. 1996. Five
novel mono-tetrahydrofuran ring acetogenins from the seeds of Annona
muricata. J Nat Prod. 59:100-108.
Walpole RE. 1993. Pengantar Statistika. Ed ke-3. Sumantri B, penerjemah.
Jakarta: Gramedia. Terjemahan dari: Introduction to Statistics 3rd Edition.
17
Wei X, Bugni TS, Harper MK, Sandoval IT, Manos EJ, Swift J, Wagoner RMV,
Jones DA, Ireland CM. 2010. Evaluation of pyridoacridine alkaloids in a
zebrafish phenotypic assay. Mar Drugs. 8: 1769-1778.
Winarno FG. 1995. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.
Wu FE, Gu ZM, Zeng L, Zhao GX, Zhang Y, McLaughlin JL, Sastrodihardjo S.
1995a. Two new cytotoxic monotetrahydrofuran Annonaceous
acetogenins, annomuricins A and B, from the leaves of Annona muricata.
J Nat Prod. 58:830-836.
Wu FE, Zeng L, Gu ZM, Zhao GX, Zhang Y, Schwedler JT, McLaughlin JL,
Sastrodihardjo S. 1995b. Muricatocins A and B, two new bioactive
monotetrahydrofuran annonaceous acetogenins from the leaves of Annona
muricata. J Nat Prod. 58: 902-908.
Zeng L, Wu FE, Oberlies NH, McLaughlin JL, Sastrodihardjo S. 1996. Five new
monotetrahydrofuran ring acetogenins from the leaves of Annona
muricata. J Nat Prod. 59:1035-1042.
18
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Daun sirsak
Penentuan kadar air
Maserasi dengan etanol
Partisi dengan heksana
Ekstrak etanol
Partisi dengan etil asetat-air
Ekstrak etil asetat
Ekstrak air
Uji toksisitas (BSLT)
Ekstrak aktif
Pengamatan embrio ikan zebra
1
H-NMR
Ekstrak heksana
19
Lampiran 2 Kadar air dan rendemen daun sirsak
a) Kadar air daun sirsak
Sirsak ratu
Sirsak hutan
Ulangan
Kadar air
Kadar air
A (g)
B (g)
A (g)
B (g)
(%)
(%)
1
2.0066
1.8359
8.51
3.0364
2.8206
7.11
2
2.0034
1.8295
8.68
3.1032
2.8834
7.08
3
2.0039
1.8306
8.65
3.1018
2.8816
7.10
Rerata
8.61
Rerata
7.10
Contoh perhitungan:
Kadar air (%) = A − B × 100% =
A
2.0066-1.8359
2.0066
×100%
= 8.51%
b) Rendemen daun sirsak
Sampel
Ekstrak
b (gram)
a (gram)
Rendemen (% b/b)
Etanol
50.0200
2.7025
5.91
Heksana
50.0200
0.8881
1.94
Sirsak ratu
Etil asetat
50.0200
0.2285
0.49
Air
50.0200
1.5859
3.47
Etanol
50.0400
1.8476
3.98
Heksana
50.0400
0.8971
1.93
Sirsak hutan
Etil asetat
50.0400
0.8601
1.85
Air
50.0400
0.0904
0.19
Contoh perhitungan rendemen ekstrak etanol sirsak ratu:
Rendemen ekstrak=
a
2.7025 g
×100% = (1 − 0.0861)50.0200 g ×100%
(1− kadar air)b
= 5.91% (b/b)
20
Lampiran 3 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
1.75
17.5
0
10
0
10
4
6
10
2
7
10
1
4
3
30
5
10
2
10
4
7
10
3
7
10
3
6
4.5
45
3
10
4
10
4
7
10
5
9
10
5
6
8
80
7
10
9
10
5
7
10
9
9
10
9
9
9.25
92.5
7
10
10
10
7
10
9
10
10
10
10
10
9
0
0
5.5
55
5.75
57.5
7.25
72.5
8
80
9.5
95
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 107.6120x − 233.3039
50 = 107.6120x − 233.3039
x = 2.6326
LC50 = 102.6326
LC50 = 429.1410 µg/mL
ekstrak heksana sirsak hutan
ekstrak heksana sirsak ratu
100
y = 107.6120x − 233.3039
r² = 0.9225
80
% kematian
% kematian
100
60
40
20
y = 58.4318x − 84.0280
r² = 0.9548
80
60
40
0
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
21
Lampiran 4 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
4
10
0
4
10
0
4
1.5
3
10
1
10
2
15
6
10
1
4
10
2
4
5.25
5
10
7
10
5
52.5
6
10
5
6
10
4
5
7.25
5
10
6
10
7
72.5
7
10
7
5
10
9
7
8.75
6
10
9
10
9
87.5
8
9
10
8
9
10
9
9
0
0
3.75
37.5
4.75
47.5
5.5
55
6.25
62.5
8.75
87.5
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 120.1799x − 272.7777
50 = 120.1799x − 272.7777
x = 2.6857
LC50 = 102.6857
LC50 = 484.9534 µg/mL
ekstrak etanol sirsak hutan
ekstrak etanol sirsak ratu
80
y = 120.1799x − 272.7777
r² = 0.9996
80
60
% kematian
% kematian
100
40
20
0
y = 20.0642x + 2.1151
r² = 0.9474
60
40
20
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
1
1.5
2
2.5
log konsentrasi
3
3.5
22
Lampiran 5 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
0
50
250
500
750
1000
Jumlah larva
awal
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
0.25
0
10
0
10
0
2.5
2
10
0
4
10
1
1
0.5
2
10
1
10
0
5
3
10
1
5
10
0
3
2
2
10
0
10
3
3
10
2
5
10
3
4
2.25
20
8
10
3
10
4
22.5
6
10
0
4
10
2
7
10
6
10
6
7
10
4
8
10
4
5
5
7
50
7
0
0
2.25
22.5
3.25
32.5
5
50
6
60
6.75
67.5
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 64.6286x − 152.9008
50 = 64.6286x − 152.9008
x = 3.1395
LC50 = 103.1395
LC50 = 1378.7960 µg/mL
ekstrak etil asetat sirsak ratu
ekstrak etil asetat sirsak hutan
50
y = 64.6286x − 152.9008
r² = 0.8099
40
% kematian
% kematian
60
30
20
10
0
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 57.9808x − 106.5409
r² = 0.9999
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
23
Lampiran 6 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak air sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
0
50
250
500
750
1000
Jumlah larva
awal
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0.5
0
10
1
10
0
5
1
1
10
0
0
10
1
1
ekstrak air sirsak ratu
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.75
7.5
ekstrak air sirsak hutan
10
% kematian
% kematian
10
y = 0.0000
r² = #N/A
0
2
2.5
y = 0.0000
r² = #N/A
0
3
log konsentrasi
3.5
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
24
Lampiran 7 Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
1.733
17.33
0
10
0
10
3
0
10
2
0
10
1
0
2.571
25.71
0
10
2
10
3
4
10
2
6
10
3
5
4.6
46
3
10
4
10
4
6
10
5
7
10
5
6
6.666
66.66
7
10
6
10
5
8
10
4
6
10
7
6
8
80
8
10
9
10
8
10
8
10
7
7
10
8
7
0
0
0
0
4
40
6.666
66.66
7
70
8
80
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 90.3101x − 193.1275
50 = 90.3101x − 193.1275
x = 2.6921
LC50 = 102.6921
LC50 = 492.1528 µg/mL
ekstrak heksana sirsak hutan
ekstrak heksana sirsak ratu
100
y = 90.3101x − 193.1275
r² = 0.9815
80
% kematian
% kematian
100
60
40
80
60
40
20
0
-20 1.5
20
2
2.5
3
log konsentrasi
y = 61.9244x − 105.5961
r² = 0.9902
2
2.5
3.5
log konsentrasi
3
3.5
25
Lampiran 8 Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
1.666
0
10
1
10
2
16.66
0
10
2
2
10
0
2
3
30
2
10
3
10
4
3
10
2
3
10
3
2
4.166
2
10
5
10
3
41.66
4
10
5
6
10
4
4
5
50
4
10
5
10
4
7
10
5
5
10
6
7
6
6
10
7
10
4
60
8
9
10
6
7
10
7
8
0
0
1.6
16
2.666
26.66
4.5
45
6.666
66.66
8
80
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 31.4497x − 40.0354
50 = 31.4497x − 40.0354
x = 2.8628
LC50 = 102.8628
LC50 = 729.1217 µg/mL
ekstrak etanol sirsak ratu
ekstrak etanol sirsak hutan
100
% kematian
% kematian
80
y = 31.4497x − 40.0354
r² = 0.9283
60
40
y = 88.9289x − 189.3488
r² = 0.9721
80
60
40
20
0
20
1.5
2
2.5
log konsentrasi
3
3.5
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
26
Lampiran 9 Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Kons
(Annona muricata) DAN SIRSAK HUTAN (Annona
glabra) SEBAGAI POTENSI ANTIKANKER
WAHYU HENDANA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Toksisitas Akut Ekstrak
Daun Sirsak Ratu (Annona muricata) dan Sirsak Hutan (Annona glabra) sebagai
Potensi Antikanker adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2012
Wahyu Hendana
NIM G44060953
ABSTRAK
WAHYU HENDANA. Toksisitas Akut Ekstrak Daun Sirsak Ratu (Annona
muricata) dan Sirsak Hutan (A. glabra) sebagai Antikanker Potensial. Dibimbing
oleh GUSTINI SYAHBIRIN.
Tanaman sirsak diketahui memiliki aktivitas farmakologi seperti antikanker.
Spesies sirsak yang cukup banyak terdapat di Indonesia adalah sirsak ratu
(Annona muricata) dan sirsak hutan (A. glabra). Penelitian ini berhasil
menentukan sifat toksisitas ekstrak daun kedua spesies ini terhadap larva udang
dan embrio ikan zebra. Ekstrak sirsak hutan secara keseluruhan menghasilkan
toksisitas paling tinggi. Nilai LC 50 terbaik diberikan oleh ekstrak heksana daun
sirsak hutan, yaitu 197 µg/mL terhadap larva udang dan 326 µg/mL terhadap
embrio ikan zebra. Nilai ini sudah menunjukkan korelasi yang signifikan sebagai
senyawa antikanker. Ekstrak ini menghasilkan 8 noda pada pemisahan dengan
kromatografi lapis tipis. Pengukuran 1H-NMR terhadap 2 noda yang terpisah
dengan baik belum menunjukkan kandungan asetogenin yang telah dilaporkan
sebagai komponen antikanker pada tanaman sirsak. Diperlukan fraksionasi lebih
lanjut pada ekstrak untuk menentukan struktur senyawa aktif antikanker di
dalamnya.
Kata kunci: Annona glabra, Annona muricata, daun sirsak, uji ikan zebra, uji
letalitas larva udang
ABSTRACT
WAHYU HENDANA. Acute Toxicity of Leaf Extracts from Soursop (Annona
muricata) and Pond Apple (A. glabra) as Potential Anticancer. Supervised by
GUSTINI SYAHBIRIN.
Soursop plants has been known to have pharmacological activities such as
anticancer. Soursop species that are widely found in Indonesia are soursop
(Annona muricata) and pond apple (A. glabra). This study has determined the
toxicity properties of leaf extracts of these species to brine shrimps larvae and
zebra fish embryos. Overall, the pond apple extract showed higher toxicity then the
soursop. The best LC 50 values were obtained from hexane extract of pond apple
leaves, namely 197 µg/mL to brine shrimps larvae and 326 µg/mL to zebra fish
embryo. These values indicate a significant correlation as anticancer compounds.
This extract of pond apple resulted 8 spots in separation by using thin layer
chromatography. 1H-NMR measurement towards these 2 well-separated spot did
not show acetogenin component, as previously reported as the anticancer
components in soursop plants. Further fractionation of the extract is needed to
ensure the structure of the anticancer active component it contained.
Keywords: Annona glabra, Annona muricata, brine shrimps lethality test, soursop
leaf, zebra fish test
TOKSISITAS AKUT EKSTRAK DAUN SIRSAK RATU
(Annona muricata) DAN SIRSAK HUTAN (Annona
glabra) SEBAGAI POTENSI ANTIKANKER
WAHYU HENDANA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Toksisitas Akut Ekstrak Daun Sirsak Ratu (Annona muricata) dan
Sirsak Hutan (Annona glabra) sebagai Potensi Antikanker
Nama
: Wahyu Hendana
NIM
: G44060953
Disetujui oleh
Dr Gustini Syahbirin, MS
Pembimbing
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
Ketua Departemen Kimia
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas berkat limpahan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang
berjudul Toksisitas Akut Ekstrak Daun Sirsak Ratu (Annona muricata) dan Sirsak
Hutan (Annona glabra) sebagai Potensi Antikanker. Shalawat serta salam semoga
selalu tercurahkan kepada junjungan Nabi Muhammad SAW yang telah
membimbing umatnya hingga akhir zaman. Penelitian ini bertujuan menganalisis
potensi ekstrak kasar daun sirsak sebagai potensi antikanker. Penelitian
dilaksanakan sejak Maret 2011 sampai Mei 2012 di Laboratorium Kimia Organik,
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan
Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi,
Fakultas Kedokteran Hewan.
Penghargaan luar biasa penulis berikan kepada kedua orang tua dan
keluarga penulis yang selalu memberi motivasi dan kasih sayang kepada penulis.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Dr Gustini Syahbirin, MS
selaku pembimbing dan Bapak Novriyandi Hanif, DSc yang senantiasa
memberikan arahan, dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama
melaksanakan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh
staf Laboratorium Kimia Organik, Bapak Budi Arifin MSi, Bapak drh.
Kusdiantoro Muhamad, MSi, Kak Steven Gunawan dan Astari Wendarningtyas
atas bantuan serta masukan selama penelitian berlangsung. Apresiasi penulis
berikan kepada Mas Ryan dan Shiddiq (STK 43) atas bantuannya dalam
pengolahan data penulis. Salam hangat penulis ucapkan kepada teman
seperjuangan, Ridho Putrotomo, Indra Sugiarto, dan Lia Anggraini. Salam
semangat untuk Livia, Fijar, Dwi Utami, Dwi Artha, Laras, Rina, Indra, Lita, dan
keluarga besar Kimia atas doa, kasih sayang, motivasi, serta segala dukungan
yang telah kalian berikan.
Atas segala khilaf dan kekurangan, semoga dapat dibukakan pintu maaf
yang sebesar-besarnya. Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi
semua pihak juga perkembangan ilmu pengetahuan.
November 2012
Wahyu Hendana
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Lingkup Kerja
Penentuan Kadar Air
Ekstraksi Daun Sirsak
Partisi Ekstrak Etanol Daun Sirsak
Uji Toksisitas In Vitro Ekstrak Terhadap A. salina
Uji Toksisitas In Vivo Ekstrak terhadap Embrio Ikan Zebra
Fraksionasi Ekstrak Teraktif
Pemisahan dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
Rendemen Ekstrak
Toksisitas In Vitro Terhadap Larva Udang
Toksisitas In Vitro Terhadap Embrio Ikan Zebra
Hasil Pengamatan Embrio Ikan Zebra secara In Vivo
Hasil Fraksionasi dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
1
3
3
3
3
3
4
4
5
5
5
6
6
6
7
8
8
12
15
15
15
15
18
30
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Salah satu struktur asetogenin
Sirsak ratu (A. muricata)
Sirsak hutan (A. glabra)
Embrio ikan zebra (D. rerio)
Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap A. salina
Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap ikan zebra
Foto embrio ikan zebra
Profil kromatogram ekstrak heksana sirsak hutan
Spektrum 1H-NMR noda e
Spektrum 1H-NMR noda h
1
1
2
2
7
8
9
13
14
14
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Diagram alir penelitian
Kadar air dan rendemen daun sirsak
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak air sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Hasil pengamatan embrio ikan zebra ekstrak heksana daun sirsak ratu
Hasil pengamatan embrio ikan zebra ekstrak heksana daun sirsak hutan
Nilai F hitung pengamatan embrio ikan zebra
Hasil uji Dunnet pengamatan embrio ikan zebra
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
29
1
PENDAHULUAN
Tanaman sirsak termasuk famili Annonaceae dan memiliki aktivitas
farmakologi seperti antikanker. Secara umum tanaman famili Annonaceae dapat
dibedakan dari bentuk buahnya. McLaughlin (2008) melaporkan bahwa tanaman
famili Annonaceae mengandung banyak senyawa asetogenin, di antaranya
ditunjukkan pada Gambar 1. Asetogenin merupakan senyawa metabolit sekunder
yang secara alami terbentuk dalam tumbuhan, yang secara spesifik menyerang sel
kanker tanpa memengaruhi sel normal pada makhluk hidup.
Gambar 1 Salah satu struktur asetogenin
Sirsak ratu (Annona muricata) (Gambar 2) merupakan jenis tanaman sirsak
yang lebih dulu diteliti. Wu et al. (1995a dan 1995b), Zeng et al. (1996), dan Kim
et al. (1998) meneliti bagian daun, sementara Rieser et al. (1996), Li et al. (2000),
Chang dan Wu (2001) meneliti bagian biji. Gleye et al. (1998 dan 2000) meneliti
bagian akar. Akan tetapi, jenis tanaman sirsak ini sulit diperoleh dalam jumlah
yang banyak di Indonesia.
Gambar 2 Sirsak ratu (A. muricata)
Banyak peneliti mencari jenis tanaman sirsak lain untuk dikaji lebih lanjut,
salah satunya yang diduga memiliki aktivitas antikanker ialah sirsak hutan
(Annona glabra) (Gambar 3). Serupa dengan sirsak ratu, sirsak hutan juga banyak
diteliti pada bagian buah, daun, biji, dan akar. Cochrane et al. (2008) telah
menguji khasiat antikanker bagian-bagian tanaman A. glabra pada sel leukemia.
Biji, daun, dan buah dilaporkan memiliki efek antikanker, dan bagian biji paling
tinggi khasiatnya.
2
Gambar 3 Sirsak hutan (A. glabra)
Metode uji letalitas larva udang (BSLT) telah banyak digunakan sebagai
metode pendahuluan untuk mengetahui toksisitas suatu bahan. Hasil uji toksisitas
dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksik
senyawa antikanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat,
dan cukup akurat (Colegate dan Molyneux 2008).
Embrio ikan zebra (Danio rerio) (Gambar 4) secara in vivo juga dapat
digunakan dalam pengujian awal terhadap aktivitas antikanker pada suatu bahan.
Hasil uji toksisitas pada embrio ikan zebra telah terbukti memiliki korelasi positif
dengan hasil uji toksisitas pada mamalia (Ma et al. 2007). Pengujian senyawa
antikanker secara in vivo pada embrio ikan zebra juga telah dilakukan oleh
Berghmans et al. (2005), Moore et al. (2006), Hsu et al. (2007), dan Nicoli dan
Presta (2007). Menurut Berghmans et al. (2005), ikan zebra telah dikembangkan
sebagai hewan uji dalam penelitian terhadap penyakit manusia, untuk memperoleh
obat-obatan baru dari senyawa bahan alam.
Gambar 4 Embrio ikan zebra (D. rerio)
Penelitian ini bertujuan membandingkan potensi antikanker sirsak ratu dan
sirsak gundul atau sirsak hutan pada bagian daunnya. Pengujian dilakukan dengan
menggunakan metode BSLT dan metode embrio ikan zebra.
3
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan selama penelitian ini adalah alat kaca yang umum
digunakan di laboratorium, mikropipet, neraca analitik, oven, penguap putar,
pengering beku, multiwell, stereomikroskop yang dilengkapi dengan kamera
digital di Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan, IPB dan
spektrometer VNMRS frekuensi 500 MHz (1H) untuk mengukur resonans magnet
inti (NMR) di Laboratorium NMR, Gedung Basic Science A, ITB Bandung.
Bahan-bahan yang digunakan selama penelitian ini adalah daun sirsak hutan
yang berasal dari Laboratorium Agronomi IPB Leuwikopo, daun sirsak ratu yang
berasal dari daerah Sukabumi, etanol 80%, etil asetat, aseton, n-heksana, dimetil
sulfoksida (DMSO), CDCl 3 , silika gel 60 F 254 untuk kromatografi lapis tipis
(KLT), larva A. salina Leach, dan embrio ikan zebra yang didapat dari peternak
ikan di daerah Cikaret.
Lingkup Kerja
Metode penelitian dilakukan mengikuti diagram alir pada Lampiran 1.
Tahapannya meliputi penyiapan sampel daun sirsak, penentuan kadar air,
ekstraksi daun sirsak, partisi ekstrak etanol daun sirsak, pengujian toksisitas, dan
pencirian senyawa bioaktif.
Penentuan Kadar Air
Cawan porselen dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 °C selama 60
menit. Selanjutnya cawan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan
ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak 3 g sampel dimasukkan ke dalam cawan
dan dikeringkan di dalam oven selama 24 jam pada suhu 105 °C. Setelah itu,
cawan didinginkan dalam eksikator sekitar 30 menit dan ditimbang kembali.
Pemanasan dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Penentuan kadar air
dilakukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo) (AOAC 1984).
Kadar air (%) = A − B × 100%
A
Keterangan:
A = bobot bahan sebelum dikeringkan (g)
B = bobot bahan setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Daun Sirsak
Daun sirsak dikeringkan kemudian digiling sampai berbentuk serbuk.
Sebanyak ±100 g sampel daun dimaserasi dengan etanol 80% dengan nisbah 1:8
selama 3×24 jam. Penggantian pelarut dilakukan setiap 24 jam. Ekstrak lalu
dipekatkan dengan penguap putar dan pengering beku. Ekstrak pekat yang
4
diperoleh ditimbang dan dihitung rendemennya dengan persamaan sebagai
berikut:
a
×100%
Rendemen ekstrak =
(1 − kadar air)b
Keterangan:
a = bobot ekstrak (g)
b = bobot contoh awal (g)
Partisi Ekstrak Etanol Daun Sirsak
Partisi dengan heksana 1:1 berdasarkan volume terhadap ekstrak etanol
dilakukan untuk mengambil fraksi nonpolar sehingga didapat fraksi polar dan
nonpolar (ekstrak heksana). Penambahan heksana dilakukan beberapa kali hingga
fraksi nonpolar tidak berwarna. Kedua fraksi dipekatkan dengan penguap putar.
Fraksi polar pekat kemudian dilarutkan dengan 200 mL air dan dimasukkan ke
dalam corong pisah. Setelah itu, diekstraksi menggunakan etil asetat dengan
nisbah air-etil asetat 1:3 dan didapat fraksi polar (ekstrak air) dan semipolar
(ekstrak etil asetat). Penambahan etil asetat dilakukan beberapa kali sampai fraksi
semipolar tidak berwarna. Kedua fraksi dipisahkan, masing-masing dipekatkan
dengan penguap putar dan dikeringbekukan.
Uji Toksisitas In Vitro Ekstrak Terhadap A. salina
Penetasan Telur A. salina
Telur A. salina yang sudah siap ditetaskan ditimbang sebanyak 0.5 g
kemudian dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air laut yang sudah disaring
dan diaerasi. Telur dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar
menetas sempurna. Telur yang telah menetas menjadi larva digunakan untuk uji
toksisitas.
Uji Toksisitas terhadap A. salina
Larutan standar ekstrak etanol, ekstrak heksana, ekstrak etil asetat, dan
ekstrak air dibuat dalam konsentrasi 5000 µg/mL kemudian diencerkan dengan air
laut hingga diperoleh konsentrasi 100, 500, 1000, 1500, dan 2000 µg/mL. Apabila
ekstrak tidak larut ditambahkan DMSO. Ke dalam multiwell dimasukkan 400 μL
air laut, 10 ekor larva udang dalam 600 μL air laut, dan 1 mL ekstrak. Ulangan
dilakukan sebanyak 4 kali. Multiwell ditutup dengan aluminium foil dan
diinkubasi selama 24 jam. Nilai konsentrasi letal 50% (LC 50 ) ditentukan dengan
menggunakan kurva hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (sumbu x) dan
rerata persen kematian larva udang (sumbu y) (Krishnaraju et al. 2005).
5
Uji Toksisitas In Vivo Ekstrak terhadap Embrio Ikan Zebra (Heiden et al.
2007, Wei et al. 2010, dan Coelho et al. 2011)
Uji Toksisitas
Larutan standar ekstrak etanol, ekstrak heksana, ekstrak etil asetat, dan
ekstrak air dibuat dalam konsentrasi 5000 µg/mL kemudian diencerkan hingga
diperoleh konsentrasi 100, 500, 1000, 1500, dan 2000 µg/mL. DMSO
ditambahkan apabila ekstrak tidak larut. Sebanyak 10 telur ikan zebra dalam 1 mL
air tawar dan 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam multiwell. Ulangan dilakukan
sebanyak 4 kali. Multiwell ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi selama
24 jam. Nilai LC 50 ditentukan dengan menggunakan kurva hubungan logaritma
konsentrasi ekstrak (sumbu x) dengan rerata persen kematian larva udang (sumbu
y).
Pengamatan Embrio Ikan Zebra
Embrio ikan zebra yang telah terpapar oleh ekstrak aktif selama 24 jam
diamati morfologinya yaitu pigmentasi, panjang tubuh, diameter embrio (jika
embrio tidak menetas), kepala, mata, jantung, kantung kuning telur, dan ekor
dengan menggunakan stereomikroskop.
Fraksionasi Ekstrak Teraktif
Ekstrak teraktif daun sirsak ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering,
langsung dielusi dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen
pengembang. Elusi tahap pertama dilakukan dengan eluen tunggal etil asetat,
kloroform, dan n-heksana. Noda yang dihasilkan dari proses elusi masing-masing
eluen diamati di bawah lampu ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 254 nm.
Eluen terbaik ialah yang menghasilkan noda terbanyak dan terpisah dengan baik.
Jika lebih dari 1 eluen menghasilkan noda terbanyak dan terpisah baik, maka
eluen-eluen tersebut dicampurkan dengan nisbah tertentu hingga diperoleh
campuran eluen terbaik (Houghton dan Raman 1998).
Pemisahan dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
Fraksi ekstrak teraktif dipisahkan dengan pelat KLT preparatif. Digunakan
eluen terbaik yang didapat dari pengujian sebelumnya. Noda yang terpisah dengan
baik pada pelat dikerok tanpa tercampur dengan noda lainnya kemudian
dilarutkan dengan aseton dan disaring untuk mendapatkan fraksi ekstrak teraktif.
Fraksi yang didapat kemudian dikeringkan dengan penguap putar lalu dilakukan
pengukuran 1H-NMR dengan pelarut CDCl 3 .
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
Penyimpanan contoh dalam jangka waktu lama menjadi masalah tersendiri
jika sifat contoh tersebut tidak diketahui. Menurut Winarno (1995), contoh dapat
disimpan dalam jangka waktu lama apabila kadar airnya kurang dari 10%. Selain
itu, kadar air juga digunakan sebagai faktor koreksi dalam perhitungan rendemen
ekstrak (Harborne 1987). Pemanasan pada suhu 105 ⁰C dapat menghilangkan air
yang terikat secara fisik pada daun sirsak (Harjadi 1986). Kadar air daun sirsak
ratu diperoleh sebesar 8.61% dan daun sirsak hutan 7.10% (Lampiran 2). Kadar
air keduanya kurang dari 10% sehingga dapat disimpan dalam jangka panjang.
Rendemen Ekstrak
Daun sirsak ratu dan sirsak hutan diekstraksi dengan 4 pelarut berbeda
kepolaran, mulai dari yang paling polar ialah air, etanol, etil asetat, dan heksana.
Daun sirsak terlebih dahulu diekstraksi dengan pelarut etanol karena pelarut
tersebut dapat mengekstraksi senyawa polar dan nonpolar dengan baik (Harbone
1987). Wu et al. (1995), Zeng et al. (1996), dan Kim et al. (1998) juga
menggunakan pelarut etanol untuk ekstraksi sampel sirsak ratu. Rendemen ekstrak
etanol yang didapat sebesar 5.91% untuk sirsak ratu dan 3.98% untuk sirsak hutan
(Tabel).
Tabel Rendemen ekstrak daun sirsak
Rendemen (% (b/b))
Bahan
Ekstrak Ekstrak
Ekstrak
etanol heksana etil asetat
Sirsak ratu
5.91
1.94
0.49
Sirsak hutan
3.98
1.93
1.85
Ekstrak
air
3.47
0.19
Partisi dengan pelarut heksana ke dalam ekstrak etanol bertujuan
memisahkan komponen nonpolar dalam etanol ke dalam heksana. Rendemen yang
didapat sebesar 1.94 dan 1.93% untuk sirsak ratu dan hutan (Tabel). Tahap
selanjutnya, ekstrak polar (etanol) dilarutkan dengan air dan diekstraksi dengan
etil asetat untuk memisahkan komponen semipolar yang terdapat dalam ekstrak
polar. Colegate dan Molyneux (2008) menyatakan bahwa ekstrak metanol atau
etanol dari contoh segar dapat dipartisi kembali dengan etil asetat untuk
memisahkan komponen semipolar dari fraksi air. Rendemen ekstrak etil asetat
sirsak ratu dan hutan sebesar 0.49 dan 1.85%, sedangkan untuk ekstrak air
berturut-turut 3.47 dan 0.19%.
Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi sampel daun sirsak karena
kandungan senyawa yang terdapat dalam sampel belum diketahui daya tahannya
terhadap panas. Maserasi dilakukan hingga pelarut tidak berwarna dengan asumsi
semua senyawa yang terdapat dalam sampel telah terekstraksi.
7
Toksisitas In Vitro Terhadap Larva Udang
Data nilai LC 50 dengan metode BSLT (Gambar 5) menunjukkan bahwa
daun sirsak hutan lebih toksik daripada daun sirsak ratu. Ketiga ekstrak dari daun
sirsak hutan memiliki nilai LC 50 yang lebih rendah daripada sirsak ratu, yang
mengindikasikan bahwa ekstrak tersebut lebih toksik. Urutan tingkat toksisitas
daun sirsak hutan ialah ekstrak heksana > etanol > etil asetat. Hal yang sama juga
dijumpai pada daun sirsak ratu.
1378.79
µg/mL
1500
1000
500
484.95
429.14
243.55
196.69
501.07
0
heksana
sirsak ratu
etanol
etil asetat
sirsak hutan
Gambar 5 Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap A. salina
Ekstrak heksana untuk kedua jenis sirsak mempunyai nilai LC 50 lebih
rendah dibandingkan dengan ekstrak etanol dan etil asetat. Ekstrak heksana sirsak
ratu memiliki nilai LC 50 429.14 µg/mL (r2 = 0.9225) dan ekstrak heksana sirsak
hutan memiliki nilai LC 50 196.69 µg/mL (r2 = 0.9548) (Lampiran 3). Nilai ini
cukup sebanding dengan hasil penelitian Rieser et al. (1996) dan Zeng et al.
(1996) yang mendapatkan nilai LC 50 untuk ekstrak kasar teraktif daun sirsak ratu
berada di bawah 250 mg/L.
Ekstrak heksana selain mengandung lemak juga mengandung sebagian besar
komponen organik nonpolar. Senyawa asetogenin dalam daun juga dapat
terekstraksi ke dalam fase heksana. Sifat toksik senyawa metabolit sekunder ini
diduga menyebabkan ekstrak heksana mempunyai nilai LC 50 lebih rendah.
Ekstrak etanol sirsak ratu dan sirsak hutan memiliki nilai LC 50 masingmasing 484.95 µg/mL (r2 = 0.9996) dan 243.55 µg/mL (r2 = 0.94374) (Lampiran
4). Dalam penelitian sebelumnya, Zeng et al. (1996) mendapatkan nilai LC 50
ekstrak etanol daun sirsak ratu sebesar 30.5 µg/mL, lebih kecil dibandingkan
dengan hasil penelitian ini.
Ekstrak etil asetat sirsak ratu dan sirsak hutan memiliki toksisitas paling
rendah dibandingkan dengan kedua ekstrak lainnya. Nilai LC 50 berturut-turut
sebesar 1378.79 µg/mL (r2 = 0.8099) dan 501.07 µg/mL (r2 = 0.9999) (Lampiran
5). Ekstrak air sirsak ratu dan sirsak hutan tidak dapat ditentukan nilai LC 50 -nya
karena ekstrak ini tidak mampu mematikan larva udang yang diujikan (Lampiran
6).
Berdasarkan AOAC (2002), nilai koefisien korelasi (r2) yang baik adalah
lebih besar atau sama dengan 0.9900. Meskipun uji toksisitas BSLT tidak spesifik
8
untuk antikanker, hasil uji senyawa antikanker telah dilaporkan menunjukkan
korelasi yang signifikan dengan kematian larva udang (Mukhtar et al. 2007).
Toksisitas In Vitro Terhadap Embrio Ikan Zebra
Uji in vitro toksisitas daun sirsak ratu dan sirsak hutan juga dilakukan
terhadap embrio ikan zebra. Tingkat kematian embrio serta penghambatan dalam
pertumbuhannya diamati setelah pemberian ekstrak. Hasil yang diperoleh
sebanding dengan hasil uji BSLT, tetapi dengan nilai LC 50 hasil pengujian ikan
zebra secara keseluruhan lebih besar.
Ekstrak heksana sirsak ratu dan sirsak hutan memiliki nilai LC 50 492.15
µg/mL (r2 = 0.9815) dan 325.61 µg/mL (r2 = 0.9902) (Lampiran 7), ekstrak etanol
berturut-turut 729.12 µg/mL (r2 = 0.9283) dan 491.47 µg/mL (r2 = 0.9721)
(Lampiran 8), sedangkan ekstrak etil asetat berturut-turut 1397.65 µg/mL (r2 =
0.9357) dan 608.97 µg/mL (r2 = 0.9259) (Lampiran 9). Hasil ini diringkaskan
pada Gambar 6.
1397.65
µg/mL
1500
1000
500
729.12
492.15
325.61
491.47
608.97
0
heksana
etanol
etil asetat
sirsak ratu
sirsak hutan
Gambar 6 Nilai LC 50 uji toksisitas terhadap ikan zebra
Nilai LC 50 yang relatif lebih besar pada pengujian ikan zebra disebabkan
kekuatan hidup hewan uji tersebut lebih besar dibandingkan dengan larva udang.
Selain itu, tingkat kematian ikan zebra lebih mudah diamati dibandingkan dengan
pengamatan larva udang karena ukurannya yang lebih besar. Meskipun demikian,
dalam uji dengan embrio ikan zebra, ekstrak heksana tetap memiliki nilai LC 50
paling rendah. Oleh karena itu, pengamatan morfologi secara mikroskopik (uji in
vivo) dilakukan terhadap embrio ikan zebra yang telah terpapar ekstrak heksana
dalam penentuan nilai LC 50 (uji in vitro).
Hasil Pengamatan Embrio Ikan Zebra secara In Vivo
Embrio ikan zebra secara in vivo dapat mewakili kompleksitas fisiologis dan
morfologis pada organisme dewasa. Oleh karena itu, embrio tersebut dapat
menggambarkan informasi organisme yang lengkap dalam uji toksisitas (Ma et al.
2007). Suatu ekstrak dapat dikatakan memiliki potensi antikanker apabila
9
penambahan ekstrak tersebut pada embrio ikan zebra berpengaruh signifikan
terhadap pertumbuhan morfologi embrio (Coelho et al. 2011).
Pengamatan embrio dilakukan dengan stereomikroskop. Foto objek dapat
digunakan untuk mengukur organ-organ embrio dengan menggunakan skala
preparat, setelah semua embrio dari masing-masing konsentrasi uji diamati.
Pengamatan meliputi pigmentasi, panjang tubuh, diameter embrio (jika embrio
tidak menetas), kepala, mata, jantung, kantung kuning telur, dan ekor.
Perlakuan dengan ekstrak heksana sirsak ratu tidak berpengaruh signifikan
pada morfologi embrio (Gambar 7a). Perlakuan pada kontrol (0 µg/mL),
konsentrasi 50 dan 250 µg/mL menghasilkan perkembangan embrio yang serupa.
Heiden et al. (2007) dan Wei et al. (2010) melaporkan bahwa larva ikan zebra
yang normal akan memiliki sumbu tubuh yang lurus.
(a)
(b)
Gambar 7 Foto embrio ikan zebra dengan penambahan ekstrak heksana sirsak
ratu (a) dan sirsak hutan (b) pada konsentrasi 0 (A), 50 (B), 250 (C),
500 (D), 750 (E), dan 1000 µg/mL (F)
10
Larva pada kontrol (0 µg/mL) memiliki sumbu tubuh yang lurus sehingga
dapat dikatakan tumbuh normal (A). Perkembangan sempurna larva kontrol juga
dapat ditunjukkan dengan pigmentasi yang terjadi. Coelho et al. (2011)
menyatakan, jika larva ikan zebra memiliki kelainan, maka intensitas pigmennya
akan berkurang. Intensitas pigmen pada larva kontrol sudah cukup terbentuk dan
organ lain seperti jantung, kantung kuning telur, ekor, dan kepala juga telah
berkembang dengan baik.
Perlakuan dengan konsentrasi 50 (B) dan 250 µg/mL (C) menghasilkan
embrio yang menetas menjadi larva dan berkembang hampir sempurna. Sumbu
tubuh keduanya lurus, namun intensitas pigmen berkurang. Pada larva C terbentuk
mata yang kurang sempurna dan kantung telur agak membesar. Kantung kuning
telur merupakan membran yang berfungsi menyediakan nutrisi bagi embrio.
Pembesaran kantung kuning telur merupakan salah satu indikasi nutrisi tidak
terdistribusi sempurna pada embrio. Hal tersebut akan menyebabkan kekurangan
nutrisi pada embrio yang lambat laun akan menyebabkan kematian (Bie 2001).
Namun, perkembangan kedua larva ini tergolong normal dibandingkan dengan
larva pada konsentrasi lebih tinggi. Organ jantung keduanya dapat teramati
dengan baik. Berdasarkan hasil ini, dapat dikatakan konsentrasi 50 dan 250
µg/mL ekstrak heksana sirsak ratu kurang toksik.
Perlakuan selanjutnya (D) merupakan pemaparan ekstrak dengan
konsentrasi 500 µg/mL. Embrio menetas menjadi larva, namun terjadi
keabnormalan pada perkembangannya. Sumbu tubuh melengkung ke atas dan
ukurannya lebih kecil dibandingkan dengan kontrol. Kantung kuning telur sangat
besar sehingga organ jantung tidak terlihat. Hal ini menyebabkan asupan makanan
tidak merata sehingga sumbu tubuh terlihat lebih kecil. Selain itu, terjadi kebutaan
pada organ mata dan ukurannya pun lebih kecil daripada kontrol. Semua
keabnormalan tersebut menunjukkan bahwa ekstrak pada konsentrasi 500 µg/mL
toksik. Konsentrasi 750 (E) dan 1000 (F) µg/mL menunjukkan kemiripan
perkembangan larva. Larva menetas, namun pertumbuhan organ mata, jantung,
kantung kuning telur, dan ekor tidak terlihat. Hal ini menunjukkan bahwa kedua
konsentrasi ekstrak tersebut sangat toksik (Lampiran 10).
Berbeda dengan sirsak ratu, ekstrak heksana sirsak hutan (Gambar 7b) telah
menampakkan keabnormalan sejak konsentrasi 50 µg/mL (B). Embrio kontrol (0
µg/mL) menetas dan berkembang dengan sempurna (A). Pigmentasi dan
perkembangan organ-organ juga terjadi dengan baik.
Embrio dengan perlakuan konsentrasi 50 µg/mL (B) menetas menjadi larva.
Namun, terdapat beberapa abnormalitas. Sumbu tubuh agak melengkung ke atas,
intensitas pigmen tidak sebaik kontrol, kepala membesar, terjadi kelainan pada
mata, dan ukuran kantung kuning telur lebih besar dibandingkan dengan kontrol
(Lampiran 11). Ini merupakan indikasi bahwa pada konsentrasi 50 µg/mL, daya
sitotoksik ekstrak sirsak hutan telah memengaruhi perkembangan embrio dan
lebih kuat daripada ekstrak sirsak ratu. Hasil ini berkorelasi dengan nilai LC 50
yang dihasilkan; nilai LC 50 ekstrak heksana sirsak hutan lebih kecil dibandingkan
dengan ekstrak sirsak ratu.
Konsentrasi 250 µg/mL (C) memberikan pengaruh yang lebih signifikan
pada larva. Larva C lebih pendek daripada kontrol karena terjadi pemutusan
bagian tubuh sampai ekor (Lampiran 11). Organ lain seperti kepala tidak
11
terbentuk dengan sempurna, bahkan untuk mata dan jantung tidak terlihat. Selain
itu, kantung kuning telur membesar dan sedikit hancur pada bagian bawahnya.
Pada konsentrasi 500 µg/mL (D) embrio mulai tumbuh dan cangkang telur sudah
terlepas. Namun, embrio tidak berkembang lagi dan mati.
Pengamatan embrio E (750 µg/mL) dan F (1000 µg/mL) menunjukkan daya
sitotoksik tertinggi pada ekstrak heksana sirsak hutan. Embrio E tidak menetas,
namun cangkang telur telah rusak dan terlihat embrio mulai berkembang di dalam
telur. Embrio F tidak berkembang dalam telur dan juga tidak menetas. Embrio
diperkirakan sudah mati sebelum 24 jam. Hal ini sesuai dengan meningkatnya
sitotoksisitas pada konsentrasi ekstrak yang semakin tinggi.
Hasil pengamatan di atas menunjukkan bahwa ekstrak heksana sirsak ratu
dan hutan sama-sama toksik terhadap ikan zebra. Organ tubuh ikan zebra seperti
mata, jantung, dan kantung kuning telur dihambat pertumbuhannya. Peredaran
darah dan pertumbuhan panjang tubuh mengalami keabnormalan yang beragam
pada konsentrasi 50 sampai 500 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi
tersebut dapat menghambat pertumbuhan organ tubuh tanpa membunuh langsung
hewan uji. Pengaruh inilah yang diharapkan terjadi pada sel kanker yang
menyerang manusia. Sel kanker dihambat pertumbuhannya tanpa efek samping
yang serius pada penderita kanker.
Analisis statistik yang digunakan untuk menguji data pengamatan embrio
ikan zebra adalah uji Anova 2-arah dan uji lanjutan Dunnet post hoc dengan
menggunakan perangkat lunak SPSS 17. Uji Anova 2-arah digunakan untuk
membandingkan rata-rata lebih dari 2 kelompok dan untuk menganalisis apakah
konsentrasi ekstrak yang diberikan memengaruhi morfologi embrio secara
signifikan. Hipotesis yang digunakan adalah H 0 : konsentrasi tidak berpengaruh
terhadap morfologi embrio, dan H 1 : konsentrasi berpengaruh terhadap morfologi
embrio. Pengambilan putusan didasarkan perbandingan nilai F hitung dengan F tabel .
Jika F hitung > F tabel , maka H 0 ditolak (Walpole 1993). Nilai F tabel yang digunakan
pada taraf nyata 0.05 adalah 3.106.
Uji Dunnet digunakan untuk membandingkan perlakuan dengan kontrol.
Taraf signifikansi yang digunakan 0.05. Hal ini berarti jika nilai signifikansi dari
pengukuran embrio (p) < 0.05, maka perlakuan konsentrasi berbeda signifikan
dengan kontrol (Mattjik dan Sumertajaya 2006).
Data pengamatan embrio sirsak ratu menghasilkan nilai F hitung > F tabel
kecuali pada pengamatan organ mata (Lampiran 12), maka konsentrasi yang
diberikan berpengaruh terhadap morfologi embrio, kecuali perkembangan mata.
Pengamatan embrio sirsak hutan menunjukkan F hitung < F tabel pada organ jantung,
kantung kuning telur, dan mata. Namun, hal tersebut bukan karena ekstrak tidak
berpengaruh, melainkan karena mulai konsentrasi 50 dan 250 µg/mL, organ
jantung dan mata sudah tidak terbentuk.
Hasil uji Dunnet untuk panjang tubuh embrio (Lampiran 13) memberikan
nilai p < 0.05 pada konsentrasi ekstrak sirsak ratu 250 sampai 1000 µg/mL.
Konsentrasi 50 µg/mL menghasilkan nilai p > 0.05. Jadi, pada konsentrasi 50
µg/mL, panjang tubuh embrio tidak berbeda signifikan dengan kontrol, sedangkan
pada konsentrasi 250–1000 µg/mL panjang tubuh embrio berbeda secara
signifikan. Ekstrak sirsak hutan memberikan hasil yang sama untuk konsentrasi
50 µg/mL, namun mulai konsentrasi 250–1000 µg/mL tidak terdapat nilai p
karena larva tidak memiliki panjang tubuh.
12
Data pigmentasi untuk ekstrak sirsak ratu menghasilkan nilai signifikansi
kurang dari 0.05 pada konsentrasi 50 dan 250 µg/mL. Konsentrasi 500–1000
µg/mL tidak menghasilkan nilai signifikansi karena pigmentasi tidak terbentuk.
Hal ini juga terjadi pada ekstrak sirsak hutan, bahkan larva tidak menunjukkan
pigmentasi sejak konsentrasi 250 µg/mL sehingga uji Dunnet tidak menghasilkan
signifikansi sama sekali. Uji Dunnet akan menghasilkan nilai signifikansi jika
sedikitnya ada 3 data.
Pada data jantung embrio, perlakuan ekstrak sirsak ratu memberikan nilai p
< 0.05 untuk konsentrasi 50 dan 250 µg/mL (Lampiran 13) dan tidak ada
pertumbuhan jantung pada konsentrasi 500–1000 µg/mL (Lampiran 10). Pada
perlakuan ekstrak sirsak hutan kembali tidak diperoleh signifikansi karena mulai
konsentrasi 250 µg/mL jantung tidak terbentuk.
Data kantung kuning telur (Lampiran 13) untuk perlakuan ekstrak sirsak ratu
dan sirsak hutan menghasilkan nilai p > 0.05 pada konsentrasi 50 dan 250 µg/mL,
artinya pada konsentrasi tersebut ekstrak tidak memengaruhi kantung kuning telur
ikan zebra. Selanjutnya untuk sirsak ratu, pada konsentrasi 500 dan 750 µg/mL
nilai p < 0.05, sedangkan pada 1000 µg/mL nilai p tidak terdeteksi. Untuk sirsak
hutan, mulai konsentrasi 500 µg/mL kantung kuning telur sudah tidak terbentuk.
Pengukuran kepala embrio (Lampiran 13) dengan perlakuan ekstrak sirsak
ratu menghasilkan nilai p < 0.05 untuk konsentrasi 500 dan 750 µg/mL.
Konsentrasi 50 dan 250 µg/mL tidak berbeda nyata dengan kontrol. Embrio ikan
pada konsentrasi 1000 µg/mL menetas menjadi larva, namun ukuran kepala tidak
dapat ditentukan. Untuk sirsak hutan mulai konsentrasi 250 µg/mL ukuran kepala
tidak dapat ditentukan sehingga uji Dunnet tak dapat dilakukan.
Ukuran mata embrio (Lampiran 13) tidak berbeda nyata pada perlakuan
ekstrak sirsak ratu dengan konsentrasi 50–500 µg/mL. Pada konsentrasi 750 dan
1000 µg/mL, mata sudah rusak dan tidak dapat diukur. Pada perlakuan ekstrak
sirsak hutan kerusakan mata terjadi mulai konsentrasi 250 µg/mL, maka tidak
dapat diuji Dunnet.
Pengukuran ekor embrio (Lampiran 13) pada perlakuan ekstrak sirsak ratu
memberikan nilai p < 0.05 pada konsentrasi 250 dan 500 µg/mL dan tidak
memberikan nilai p pada konsentrasi 750 dan 1000 µg/mL. Konsentrasi 50 µg/mL
memberikan nilai p > 0.05. Hasil pengukuran ekor pada ekstrak sirsak hutan tidak
ada mulai konsentrasi 250 µg/mL karena tubuh ikan sudah terpengaruh oleh
ekstrak. Akibatnya, tidak dapat dilakukan uji Dunnet.
Berdasarkan hasil pengamatan embrio dan analisis statistika di atas, kedua
ekstrak daun memberikan daya sitotoksik, tetapi ekstrak sirsak hutan lebih tinggi
sitotoksisitasnya. Hal itu ditunjukkan dengan pengaruh signifikan pada
konsentrasi yang lebih rendah terhadap panjang tubuh, pigmentasi, jantung,
kantung kuning telur, kepala, mata, dan ekor.
Hasil Fraksionasi dan Pengukuran NMR Ekstrak Teraktif
Penentuan fraksi ekstrak teraktif dilakukan dengan menggunakan metode
KLT. Langkah awal adalah penentuan eluen terbaik. Pelarut yang digunakan
memiliki tingkat kepolaran yang berbeda, antara lain etil asetat, kloroform, dan n-
13
heksana. Pelarut yang dijadikan sebagai penyusun fase gerak adalah yang
menghasilkan jumlah noda terbanyak dan memiliki keterpisahan yang baik. Eluen
tunggal n-heksana dan kloroform memberikan keterpisahan yang terbaik. Kedua
pelarut tersebut digabungkan dengan nisbah tertentu untuk mendapatkan eluen
campuran yang dapat memisahkan ekstrak dengan baik. Campuran eluen yang
diujikan pada ekstrak heksana sirsak hutan sebagai ekstrak teraktif adalah
kloroform:n-heksana (1:9 hingga 9:1) (Houghton dan Raman 1998).
Pola keterpisahan terbaik didapatkan dengan eluen kloroform:n-heksana
(7:3). Ekstrak heksana sirsak hutan memisah menjadi 8 noda dengan nilai R f
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8. Hasil KLT ini menunjukkan bahwa
diduga terdapat 8 komponen atau senyawa pada ekstrak aktif sirsak hutan yang
memiliki kemungkinan sebagai antikanker.
Gambar 8
Profil kromatogram ekstrak heksana sirsak hutan dengan eluen
kloroform:n-heksana (7:3)
Kedelapan komponen tersebut selanjutnya dipisahkan dengan menggunakan
KLTP dengan eluen kloroform:n-heksana (7:3). Empat noda tepisah dengan baik,
yaitu e, f, g, dan h. Noda yang berhasil dimurnikan dan dilanjutkan untuk
pengukuran NMR ialah noda e dan h.
Spektrum 1H-NMR noda e (Gambar 9) menunjukkan 2 sinyal proton pada
geseran kimia (δ) 0.91 ppm dengan angka banding proton (ABP) 3.0 dan δ 1.31
ppm dengan ABP 11.3. Dua sinyal juga ditunjukkan oleh spektrum 1H-NMR noda
h (Gambar 10), yaitu pada δ 0.88 ppm dengan ABP 3.0 dan δ 1.29 ppm dengan
ABP 12. Namun, pola pembelahan sinyal yang berbeda menunjukkan 2 senyawa
yang berbeda. Hasil ini belum dapat diperkirakan strukturnya karena analisis 13CNMR tidak dilakukan.
14
Gambar 9 Spektrum 1H-NMR noda e
Gambar 10 Spektrum 1H-NMR noda h
Secara umum, asetogenin memiliki cincin tetrahidrofuran (THF) dan gugus
alkohol (McLaughlin 2008). Cincin mono-THF teridentifikasi oleh 1H-NMR pada
δ 3.45, 3.85, 3.87, dan 3.46 ppm (Wu et al. 1995), sedangkan noda e dan h hanya
menghasilkan sinyal di 0.8−1.3 ppm. Menurut Kim et al. (1998), asetogenin akan
menunjukkan sinyal 1H-NMR pada δ 7.20, 5.06 dan 1.44 ppm. Oleh karena itu,
15
baik noda e maupun h bukan senyawa asetogenin atau turunannya sehingga tidak
dilakukan analisis 13C-NMR.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak daun sirsak (sirsak ratu dan sirsak hutan) berpotensi sebagai
antikanker. Ekstrak sirsak hutan lebih sitotoksik daripada sirsak ratu. Ekstrak
heksana paling aktif, dengan nilai LC 50 ekstrak heksana sirsak hutan pada larva
udang 197 µg/mL dan pada embrio ikan zebra 326 µg/mL. Fraksionasi ekstrak ini
diduga menghasilkan 8 senyawa, namun belum diperoleh senyawa target, yaitu
asetogenin.
Saran
Ekstrak aktif daun sirsak perlu difraksionasi lebih lanjut. Pengukuran
spektroskopi yang lebih lengkap juga dibutuhkan untuk menentukan jenis
senyawa yang berperan sebagai antikanker.
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 1984. Official Methods of
Analysis. Ed ke-14. Arlington: AOAC.
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2002. AOAC International
Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and
Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis. J AOAC
Int. 85:1-5.
Berghmans S, Jette C, Langenau D, Hsu K, Stewart R, Look T, Kanki JP. 2005.
Making waves in cancer research: new models in the Zebrafish.
BioTechniques. 39:227-237.
Bie GVD. 2001. Embryology: Early Development from a Phenomenological
Point of View. Driebergen: Louis Bolk Institute.
Chang FR, Wu YC. 2001. Novel cytotoxic Annonaceous acetogenins from
Annona muricata. J Nat Prod. 64:925-931.
Cochrane CB, Nair PKR, Melnick SJ, Resek AP, Ramachandran C. 2008.
Anticancer effects of Annona glabra plant extracts in human leukemia cell
lines. Anticancer Res. 28:965-972.
Coelho S, Oliveira R, Pereira S, Musso C, Domingues I, Bhujel RC, Soares
AMVM, Nogueira AJA. 2011. Assessing lethal and sub-lethal effects of
trichlorfon on different trophic levels. Aqua Toxicol. 103:191-198.
Colegate SM, Molyneux RJ. 2008. Bioactive Natural Products: Detection,
Isolation, and Structural Determination. California: CRC Pr.
16
Gleye C, Duret P, Laurens A, Hocquemiller R, Cave A. 1998. cisMonotetrahydrofuran acetogenins from the roots of Annona muricata. J
Nat Prod. 61:576-579.
Gleye C, Raynaud S, Fourneau C, Laurens A, Laprevote O, Serani L, Fournet A,
Hacquemiller R. 2000. Cohibin C and D, two important metabolites in the
biogenesis of acetogenins from Annona muricata and Annona nutans. J
Nat Prod. 63:1192-1196.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari:
Phytochemical Methods.
Harjadi W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia.
Heiden TCK, Dengler E, Kao WJ, Heideman W, Peterson RE. 2007.
Developmental toxicity of low generation PAMAM dendrimers in
zebrafish. Toxicol Appl Pharmacol. 225:70-79.
Houghton PJ, Raman A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractionation of
Natural Extract. London: Chapman & Hall.
Hsu CH, Wen ZH, Lin CS, Chakraborty C. 2007. The zebrafish model: Use in
studying cellular mechanism for a spectrum of clinical disease entities.
Curr Neurovascular Res. 4:111-120.
Kim G, Zeng L, Alali F, Rogers LL, Wu FE, McLaughlin JL, Sastrodihardjo S.
1998. Two new mono-tetrahydrofuran ring acetogenins, annomuricin E
and muricapentocin, from the leaves of Annona muricata. J Nat Prod.
61:432-436.
Krishnaraju AV, Rao TVN, Sundararaju D, Vanisree M, Tsay HS, Subbaraju GV.
2005. Assessment of bioactivity of Indian medicinal plants using Brine
Shrimp (A. salina) lethality assay. Int J Appl Sci Eng. 3:125-134.
Li DY, Yu JG, Luo XZ, Sun L, Yang SL. 2000. Muricatenol, a linear acetogenin
from Annona muricata (Annonaceae). Chinese Chem Lett. 11:239-242.
Ma C, Parng C, Seng WL, Zhang C, Willet C, Mc Grath P. 2007. Zebrafish, an in
vivo model for drug screening. Drug Discovery. 6:38-45.
Mattjik AA, Sumertajaya IM. 2006. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi
SAS dan MINITAB. Bogor (ID): IPB Pr.
McLaughlin JL. 2008. Paw paw and cancer: Annonaceous acetogenins from
discovery to commercial products. J Nat Prod. 71:1311-1321.
Moore JL, Rush LM, Breneman C, Mohideen MAPK, Cheng KCl. 2006.
Zebrafish genomic instability mutants and cancer susceptibility. Genetics.
10:1-33.
Mukhtar MH, Adnan AZ, Pitra MW. 2007. Uji sitotoksisitas minyak atsiri daun
Kamanggi (Ocimum basilicum L) dengan metode Brine Shrimp Lethality
Test Bioassay. J Sains Tek Far. 12:1-4.
Nicoli S, Presta M. 2007. The Zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.
Nature Protocols. 2:2918-2923.
Rieser MJ, Gu ZM, Fang XP, Zeng L, Wood KV, McLaughlin JL. 1996. Five
novel mono-tetrahydrofuran ring acetogenins from the seeds of Annona
muricata. J Nat Prod. 59:100-108.
Walpole RE. 1993. Pengantar Statistika. Ed ke-3. Sumantri B, penerjemah.
Jakarta: Gramedia. Terjemahan dari: Introduction to Statistics 3rd Edition.
17
Wei X, Bugni TS, Harper MK, Sandoval IT, Manos EJ, Swift J, Wagoner RMV,
Jones DA, Ireland CM. 2010. Evaluation of pyridoacridine alkaloids in a
zebrafish phenotypic assay. Mar Drugs. 8: 1769-1778.
Winarno FG. 1995. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.
Wu FE, Gu ZM, Zeng L, Zhao GX, Zhang Y, McLaughlin JL, Sastrodihardjo S.
1995a. Two new cytotoxic monotetrahydrofuran Annonaceous
acetogenins, annomuricins A and B, from the leaves of Annona muricata.
J Nat Prod. 58:830-836.
Wu FE, Zeng L, Gu ZM, Zhao GX, Zhang Y, Schwedler JT, McLaughlin JL,
Sastrodihardjo S. 1995b. Muricatocins A and B, two new bioactive
monotetrahydrofuran annonaceous acetogenins from the leaves of Annona
muricata. J Nat Prod. 58: 902-908.
Zeng L, Wu FE, Oberlies NH, McLaughlin JL, Sastrodihardjo S. 1996. Five new
monotetrahydrofuran ring acetogenins from the leaves of Annona
muricata. J Nat Prod. 59:1035-1042.
18
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Daun sirsak
Penentuan kadar air
Maserasi dengan etanol
Partisi dengan heksana
Ekstrak etanol
Partisi dengan etil asetat-air
Ekstrak etil asetat
Ekstrak air
Uji toksisitas (BSLT)
Ekstrak aktif
Pengamatan embrio ikan zebra
1
H-NMR
Ekstrak heksana
19
Lampiran 2 Kadar air dan rendemen daun sirsak
a) Kadar air daun sirsak
Sirsak ratu
Sirsak hutan
Ulangan
Kadar air
Kadar air
A (g)
B (g)
A (g)
B (g)
(%)
(%)
1
2.0066
1.8359
8.51
3.0364
2.8206
7.11
2
2.0034
1.8295
8.68
3.1032
2.8834
7.08
3
2.0039
1.8306
8.65
3.1018
2.8816
7.10
Rerata
8.61
Rerata
7.10
Contoh perhitungan:
Kadar air (%) = A − B × 100% =
A
2.0066-1.8359
2.0066
×100%
= 8.51%
b) Rendemen daun sirsak
Sampel
Ekstrak
b (gram)
a (gram)
Rendemen (% b/b)
Etanol
50.0200
2.7025
5.91
Heksana
50.0200
0.8881
1.94
Sirsak ratu
Etil asetat
50.0200
0.2285
0.49
Air
50.0200
1.5859
3.47
Etanol
50.0400
1.8476
3.98
Heksana
50.0400
0.8971
1.93
Sirsak hutan
Etil asetat
50.0400
0.8601
1.85
Air
50.0400
0.0904
0.19
Contoh perhitungan rendemen ekstrak etanol sirsak ratu:
Rendemen ekstrak=
a
2.7025 g
×100% = (1 − 0.0861)50.0200 g ×100%
(1− kadar air)b
= 5.91% (b/b)
20
Lampiran 3 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
1.75
17.5
0
10
0
10
4
6
10
2
7
10
1
4
3
30
5
10
2
10
4
7
10
3
7
10
3
6
4.5
45
3
10
4
10
4
7
10
5
9
10
5
6
8
80
7
10
9
10
5
7
10
9
9
10
9
9
9.25
92.5
7
10
10
10
7
10
9
10
10
10
10
10
9
0
0
5.5
55
5.75
57.5
7.25
72.5
8
80
9.5
95
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 107.6120x − 233.3039
50 = 107.6120x − 233.3039
x = 2.6326
LC50 = 102.6326
LC50 = 429.1410 µg/mL
ekstrak heksana sirsak hutan
ekstrak heksana sirsak ratu
100
y = 107.6120x − 233.3039
r² = 0.9225
80
% kematian
% kematian
100
60
40
20
y = 58.4318x − 84.0280
r² = 0.9548
80
60
40
0
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
21
Lampiran 4 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
4
10
0
4
10
0
4
1.5
3
10
1
10
2
15
6
10
1
4
10
2
4
5.25
5
10
7
10
5
52.5
6
10
5
6
10
4
5
7.25
5
10
6
10
7
72.5
7
10
7
5
10
9
7
8.75
6
10
9
10
9
87.5
8
9
10
8
9
10
9
9
0
0
3.75
37.5
4.75
47.5
5.5
55
6.25
62.5
8.75
87.5
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 120.1799x − 272.7777
50 = 120.1799x − 272.7777
x = 2.6857
LC50 = 102.6857
LC50 = 484.9534 µg/mL
ekstrak etanol sirsak hutan
ekstrak etanol sirsak ratu
80
y = 120.1799x − 272.7777
r² = 0.9996
80
60
% kematian
% kematian
100
40
20
0
y = 20.0642x + 2.1151
r² = 0.9474
60
40
20
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
1
1.5
2
2.5
log konsentrasi
3
3.5
22
Lampiran 5 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
0
50
250
500
750
1000
Jumlah larva
awal
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
0.25
0
10
0
10
0
2.5
2
10
0
4
10
1
1
0.5
2
10
1
10
0
5
3
10
1
5
10
0
3
2
2
10
0
10
3
3
10
2
5
10
3
4
2.25
20
8
10
3
10
4
22.5
6
10
0
4
10
2
7
10
6
10
6
7
10
4
8
10
4
5
5
7
50
7
0
0
2.25
22.5
3.25
32.5
5
50
6
60
6.75
67.5
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 64.6286x − 152.9008
50 = 64.6286x − 152.9008
x = 3.1395
LC50 = 103.1395
LC50 = 1378.7960 µg/mL
ekstrak etil asetat sirsak ratu
ekstrak etil asetat sirsak hutan
50
y = 64.6286x − 152.9008
r² = 0.8099
40
% kematian
% kematian
60
30
20
10
0
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 57.9808x − 106.5409
r² = 0.9999
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
23
Lampiran 6 Hasil uji toksisitas BSLT ekstrak air sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
0
50
250
500
750
1000
Jumlah larva
awal
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0
0
10
0
10
0
0
0
10
0
0
10
0
0
0.5
0
10
1
10
0
5
1
1
10
0
0
10
1
1
ekstrak air sirsak ratu
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.75
7.5
ekstrak air sirsak hutan
10
% kematian
% kematian
10
y = 0.0000
r² = #N/A
0
2
2.5
y = 0.0000
r² = #N/A
0
3
log konsentrasi
3.5
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
24
Lampiran 7 Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak heksana sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
1.733
17.33
0
10
0
10
3
0
10
2
0
10
1
0
2.571
25.71
0
10
2
10
3
4
10
2
6
10
3
5
4.6
46
3
10
4
10
4
6
10
5
7
10
5
6
6.666
66.66
7
10
6
10
5
8
10
4
6
10
7
6
8
80
8
10
9
10
8
10
8
10
7
7
10
8
7
0
0
0
0
4
40
6.666
66.66
7
70
8
80
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 90.3101x − 193.1275
50 = 90.3101x − 193.1275
x = 2.6921
LC50 = 102.6921
LC50 = 492.1528 µg/mL
ekstrak heksana sirsak hutan
ekstrak heksana sirsak ratu
100
y = 90.3101x − 193.1275
r² = 0.9815
80
% kematian
% kematian
100
60
40
80
60
40
20
0
-20 1.5
20
2
2.5
3
log konsentrasi
y = 61.9244x − 105.5961
r² = 0.9902
2
2.5
3.5
log konsentrasi
3
3.5
25
Lampiran 8 Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etanol sirsak ratu dan hutan
Konsentrasi
(µg/mL)
Jumlah larva
awal
0
50
250
500
750
1000
Sirsak ratu
Jumlah larva
mati
Rerata
%kematian
0
0
Sirsak hutan
Jumlah larva
Rerata %kematian
mati
10
0
10
0
0
10
0
0
10
0
0
1.666
0
10
1
10
2
16.66
0
10
2
2
10
0
2
3
30
2
10
3
10
4
3
10
2
3
10
3
2
4.166
2
10
5
10
3
41.66
4
10
5
6
10
4
4
5
50
4
10
5
10
4
7
10
5
5
10
6
7
6
6
10
7
10
4
60
8
9
10
6
7
10
7
8
0
0
1.6
16
2.666
26.66
4.5
45
6.666
66.66
8
80
Contoh perhitungan LC 50 :
y = 31.4497x − 40.0354
50 = 31.4497x − 40.0354
x = 2.8628
LC50 = 102.8628
LC50 = 729.1217 µg/mL
ekstrak etanol sirsak ratu
ekstrak etanol sirsak hutan
100
% kematian
% kematian
80
y = 31.4497x − 40.0354
r² = 0.9283
60
40
y = 88.9289x − 189.3488
r² = 0.9721
80
60
40
20
0
20
1.5
2
2.5
log konsentrasi
3
3.5
2
2.5
3
log konsentrasi
3.5
26
Lampiran 9 Hasil uji toksisitas ikan zebra ekstrak etil asetat sirsak ratu dan hutan
Kons