Biosensor H2o2 Menggunakan Horseradish Peroksidase Teramobilisasi Dengan Glutaraldehid Pada Komposit Karbon-Nanoserat Polianilin

BIOSENSOR H2O2 MENGGUNAKAN HORSERADISH PEROKSIDASE
TERAMOBILISASI DENGAN GLUTARALDEHID PADA KOMPOSIT
KARBON-NANOSERAT POLIANILIN

RIZARULLAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul biosensor H2O2 menggunakan
horseradish peroksidase teramobilisasi dengan glutaraldehid pada komposit
karbon-nanoserat polianilin adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Rizarullah
NIM G851130091

RINGKASAN
RIZARULLAH. Biosensor H2O2 menggunakan horseradish peroksidase
teramobilisasi dengan glutaraldehid pada komposit karbon-nanoserat polianilin.
Dibimbing oleh SURYANI, LAKSMI AMBARSARI dan AKHIRUDDIN
MADDU.
Hidrogen peroksida merupakan salah satu senyawa radikal bebas yang
banyak diaplikasikan di berbagai bidang. Biosensor hidrogen peroksida menjadi
alternatif untuk mendeteksi keberadaan hidrogen peroksida. Tujuan penelitian ini
adalah untuk mengetahui karakteristik biosensor menggunakan enzim horseradish
peroksidase teramobil dengan glutaraldehid pada komposit karbon-polianilin
nanoserat (HRP/GA/PANI). Enzim horseradish peroksidase (HRP) diamobil
dengan glutaraldehid secara cross linking. Elektroda pasta karbon (EPK)
menghasilkan arus yang lebih kecil dibangdingkan elektroda pasta karbon
termodifikasi (EPKT) dengan arus EPK adalah 0.0851 mA pada tegangan 0.108 V
dan arus EPKT 0.2306 mA pada tegangan 0.188 V. Hal tersebut menunjukkan

bahwa penambahan polianilin dapat membantu proses transfer elektron.
Perkembangan biosensor dengan pemanfaatan enzim HRP sebagai
bioreseptor sangat penting untuk menkonversi reaksi redoks menjadi energi listrik
sebagai sinyal. Kinerja elektroda HRP/GA/PANI dipengaruhi oleh pH untuk dapat
menghasilkan performa maksimum sebagai biosensor. pH optimum elektroda
HRP/GA/PANI berada pada pH 7 yang menghasilkan arus pada puncak reduksi
sebesar 0.96 mA. Selain pH, kinerja elektroda HRP/GA/PANI juga dipengaruhi
oleh suhu. Hasil pengamatan menjelaskan bahwa suhu optimum elektroda
HRP/GA/PANI yaitu pada suhu 50oC. Energi aktivasi enzim pada suhu optimum
menjadi lebih rendah yang menyebabkan reaksi pembentukan produk terjadi lebih
cepat. Pada suhu dibawah 50oC, arus yang dihasilkan semakin meningkat yang
disebabkan oleh meningkatnya tumbukan yang terjadi antara substrat dan enzim.
Pada suhu di atas 50oC, arus yang dihasilkan semakin menurun yang disebabkan
oleh terdenaturasinya enzim sehingga kompleks enzim dan substrat yang terbentuk
akan berkurang.
Konsentrasi hidrogen peroksida sangat menentukan kinerja elektroda
HRP/GA/PANI sebagai biosensor. Hasil pengamatan pengaruh konsentrasi
hidrogen peroksida sebagai substrat didapatkan linieritas konsentrasi H2O2 sebesar
0.1 mM – 0.5 mM dengan nilai Km dan Imax yang dihasilkan elektroda secara
berturut-turut sebesar 1.71 mM dan 0.29 mA. Elektroda HRP/GA/PANI memiliki

nilai sensitifitas 12.14 mA/mMcm2. Besarnya jumlah substrat yang dapat
terabsorbsi ke dalam elektroda dijalaskan oleh nilai konsentrasi permukaan
elektroda. Nilai konsentrasi permukaan yang dihasilkan yaitu sebesar 7.136 x 10-9
mol/cm2.
Kata kunci: biosensor, hidrogen peroksida, horseradish peroksidase, glutaraldehid,
polianilin

SUMMARY
RIZARULLAH. Biosensor H2O2 by Used Immobilized Horseradish Peroxidase
Glutaraldehyde on Carbon Polyaniline Nanofiber Composite. Supervised by
SURYANI, LAKSMI AMBARSARI and AKHIRUDDIN MADDU.
Hydrogen peroxide is one of the many free radicals compounds was
applied in different fields. Hydrogen peroxide Biosensor into an altrnatif to detect
its presence. The purpose of this research is to make biosensor by used the
horseradish peroxidase enzyme immobilized with glutaraldehyde on carbonpolyaniline nanofiber composite (HRP/GA/PANI). The horseradish peroxidase
enzyme (HRP) with glutaraldehyde for cross linking. Carbon paste electrodes
(CPE) produced currents smaller than modified carbon electrodes (MCPE) with a
current CPE is 0.0851 mA at a voltage 0.108 V and MCPE 0.2306 mA at 0.188 V
voltage. It shows that the addition of the polyaniline can help the process of electron
transfer.

Development of biosensor with HRP enzyme utilization as bioreceptor is very
important for the convert redox reaction into electrical energy as a signal.
Performance of HRP/GA/PANI electrode is affected by the pH for maximum
performance can be produced as a biosensor. The optimum pH of HRP/GA/PANI
electrode at a pH 7 which resulted in the reduction of peak current in 0.96 mA. In
addition to pH, performance of HRP/GA/PANI electrode is also affected by
temperature. The observations explain that optimum temperature electrode
HRP/GA/PANI which is at a temperature of 50oC. The activation energy of the
enzyme at optimum
temperature being lower that
caused
the formation
o
of reaction products is faster. At temperature below 50 C, the resulting increased
current caused by the increased collisions between substrate and enzyme. At
temperature over 50oC, currents produced declining caused by denaturation of
enzymes thus formed complex enzyme and substrate will be reduced.
The concentration of hydrogen peroxide is very decisive of performance
HRP/GA/PANI electrodes as biosensor. The observations influence the
concentration of hydrogen peroxide was obtained linierity concentration of H2O2 as

a substrate at 0.1 mM-0.5 mM with a value of Km and Imax the resulting of electrodes
amounted to 1.71 mA and 0.29 mM, respectively. HRP/GA/PANI electrode has a
sensitivity value 12.14 mA/mMcm2. The amount of substrate that can
be absorbed into the electrode was explained by value of surface concentrations.
The value of the resulting surface concentration i.e. by .7.136 x 10-9 mol/cm2.
Keywords: biosensor, hydrogen peroxide, horseradish peroxidase, glutaraldehyde,
polyaniline

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

BIOSENSOR H2O2 MENGGUNAKAN HORSERADISH PEROKSIDASE
TERAMOBILISASI DENGAN GLUTARALDEHID PADA KOMPOSIT
KARBON-NANOSERAT POLIANILIN

RIZARULLAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis:

Dr. Mersi Kurniati, M.Si

Judul Tesis : Biosensor H2O2 menggunakan horseradish peroksidase
teramobilisasi dengan glutaraldehid pada komposit karbon-nanoserat polianilin

Nama
: Rizarullah
NIM
: G851130091

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Suryani, MSc
Ketua

Dr Laksmi Ambarsari, MS
Anggota

Dr Akhiruddin Maddu, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi

Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 28 Agustus 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat,
berkah, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Penelitian
ini berjudul: Biosensor H2O2 menggunakan horseradish peroksidase teramobilisasi
dengan glutaraldehid pada komposit karbon-nanoserat polianilin. Penelitian ini
merupakan salah satu persyaratan dalam menyelesaikan studi di Program Pascasarjana
Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Suryani, M.Sc, Dr. Laksmi

Ambarsari, MS dan Dr. Akhiruddin Maddu, M.Si sebagai komisi pembimbing yang
banyak memberi bimbingan dan arahan kepada penulis dalam menyelesaikan
penelitian dan karya penelitian ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada
seluruh staf Program Studi Biokimia dan semua pihak yang telah ikut membantu dan
berkontribusi dalam berbagai hal selama penyelesaian penelitian dan karya ilmiah.
Terima kasih pula kepada teman-teman Biokimia atas bantuan dan kebersamaannya,
kepada pihak-pihak lainnya yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Penulis
menyampaikan terima kasih dan rasa hormat setinggi-tingginya kepada orang tua dan
keluarga besar tercinta atas doa, pengorbanan, pengertian dan dukungan moril yang
tidak ternilai selama ini.
Akhirnya, semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi penulis,
civitas akademika, peneliti, pemerintah dan semua pihak yang terkait, sehingga mampu
memperkaya hasanah keilmuan di masa mendatang.

Bogor, Agustus 2015
Rizarullah

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
2
2

2
2
2

2 METODE
Bahan
Alat
Prosedur Penelitian

3
3
3
3

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

5
5
10

4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

18
18
18

DAFTAR PUSTAKA

19

LAMPIRAN

23

RIWAYAT HIDUP

27

DAFTAR GAMBAR
1 Rangkaian elektroda EPK dan EPKT
2 Voltamogram siklik EPK dan EPKT
3 Voltamogram siklik elektroda HRP/GA/PANI terhadap pengaruh pH
bufer fosfat 0.1 M dengan laju pemayaran 100 mV/s
7
4 Kurva pengaruh pH terhadap kinerja elektroda HRP/GA/PANI
5 Voltamogram siklik elektroda HRP/GA/PANI terhadap pengaruh suhu
dengan laju pemayaran 100 mV/s
6 Kurva pengaruh suhu terhadap kinerja elektroda HRP/GA/PANI
7 Voltamogram siklik pengaruh konsentrasi H2O2 terhadap arus elektroda
HRP/GA/PANI pada bufer fosfat 0.1 M dengan laju pemayaran 100
mV/s
8 Pengaruh konsentrasi substrat hidrogen peroksida terhadap nilai arus
elektroda HRP/GA/PANI
9 Voltamogram siklik linieritas Konsentrasi substrat hidrogen peroksida
dan aktivitas HRP/GA/PANI dengan laju pemayaran 100 mV/s
10 Kurva linieritas antara konsentrasi substrat hidrogen peroksida dan
aktivitas HRP/GA/PANI
11 Kurva Lineweaver-Burk dalam penentuan parameter kinetika
HRP/GA/PANI
12 Arah aliran elektron, elektrode kerja (W), elektrode pembanding (R) dan
elektroda pembantu (C)
13 Reaksi Redoks H2O2 yang terjadi pada elektroda
14 Interaksi residu asam amino dengan protoporfirin IX pada enzim
horseradish peroksidase (1H58)
15 Struktur 3D enzim Horseradish Peroksidase (1H58)
16 Reaksi protonisasi deprotonisasi polianilin

3
6

7
8
8

10
10
10
11
11
13
14
15
16
18

DAFTAR LAMPIRAN
1 Bagan Alir Penelitian
2 Nilai arus reduksi hidrogen peroksida oleh elektroda HRP/GA/PANI
terhadap pengaruh pH
3 Nilai arus reduksi hidrogen peroksida oleh elektroda HRP/GA/PANI
terhadap pengaruh suhu
4 Nilai arus reduksi hidrogen peroksida oleh elektroda HRP/GA/PANI
terhadap variasi konsentrasi H2O2
5 Nilai arus kurva linieritas reduksi hidrogen peroksida oleh elektroda
HRP/GA/PANI terhadap variasi konsentrasi H2O2
6 Nilai Arus kurva Lineweaver-Burk reduksi hidrogen peroksida oleh
elektroda HRP/GA/PANI terhadap variasi konsentrasi H2O2
7 Perhitungan nilai sensitifitas elektroda HRP/GA/PANI
8 Perhitungan nilai konsentrasi permukaan elektroda HRP/GA/PANI
9 Asam Amino Penyusun Enzim Horseradish Peroksidase (1H58)

25
25
26
26
26
27
27
27
28

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hidrogen peroksida merupakan salah satu molekul yang termasuk dalam
spesies oksigen reaktif. Spesies oksigen reaktif ini banyak digunakan dalam bidang
pangan, farmasi dan medis. Hidrogen peroksida banyak dihasilkan sebagai produk
dari hasil katalisis enzim glukosa oksidase, kolesterol oksidase, xantin oksidase,
alkohol oksidase, diamin oksidase dan urikase yang diaplikasikan untuk mengukur
kadar glukosa, kolesterol, santin, alkohol, histamin dan asam urat. Keunggulan
pemanfaatan biomolekul pada biosensor yaitu sifat selektifitas biomolekul yang
berinteraksi dengan substrat tertentu.
Ada beberapa senyawa biomolekul yang dapat digunakan untuk
pengembangan biosensor diantaranya katalase (Ortega et al. 2013), kolesterol
oksidase (Umar et al. 2014), mioglobin (Safavi et al. 2010), glukosa oksidase
(Pahurkar et al. 2015), bilirubin oksidase (Pita et al. 2013) lakase (Rawal et al.
2012) dan lain sebagainya. Horseradish peoksidase merupakan salah satu enzim
yang banyak dimanfaatkan dalam elektrokimia baik sebagai biosensor (Periasamy
et al. 2011) maupun biofuel cell (Agnes et al, 2013).
Enzim horseradish peroksidase (HRP) (1.11.1.7) termasuk enzim
oksidoreduktase yang dapat digunakan sebagai biosensor. HRP tergolong dalam
kelompok enzim peroksidase yang terdapat pada tanaman lobak yang dapat
mereduksi hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O). Enzim HRP dapat
disolasi dari beberapa organisme seperti pada akar tanaman lobak, E.coli, sel
mamalia dan yeast (Spadiut dan Herwig, 2013). Selain pemanfaatannya sebagai
biosensor dan biofuel cell, HRP juga dapat dimanfaatkan sebagai decolorisasi
(Abdel-Aty et al. 2013), immunoassay (Farzamfar et al. 2007), biodegradasi (Xu et
al. 2013) dan sintesis polianilin (Jin et al. 2001).
Salah satu aspek yang menjadi pertimbangan dalam pembuatan biosensor
yaitu tahapan transfer elektron. Proses transfer elektron dengan menggunakan
logam lebih efesien, namun logam memiliki harga yang mahal sehingga perlu dicari
alternatif lain sebagai pengganti logam. Senyawa lain yang dapat digunakan untuk
proses transfer elektron yaitu polianilin yang memiliki sifat unik yaitu doping
dedoping atau protonasi deprotonasi (Maddu et al. 2008). Polianilin merupakan
polimer yang memiliki sifat konduktif yang dijadikan solusi pada proses transfer
elektron. Polianilin juga dapat digunakan sebagai matrik untuk amobilisasi enzim
yang bertujuan untuk mengikat enzim bebas sehingga enzim lebih stabil sebagai
biosensor.
Polianilin (PANI) merupakan polimer yang memiliki sifat konduktivitas yang
baik. Sifat konduktif PANI menjadi perhatian untuk pengembangannya dalam
bidang elektrokimia. Penelitian sebelumnya telah dilakukan pembuatan biofuel cell
dengan penggunaan PANI (Fang et al. 2014) dan biosensor (Wang et al. 2011)
sebagai konduktur untuk membantu proses trasnfer elektron. Pemilihan PANI
sebagai konduktor karena sifat konduktifnya yang tinggi dan proses sintesis dengan
metode interfacial yang mudah serta murah (Maddu et al. 2008). Selain sifat
konduktif PANI, keunikan sifat PANI lainnya yaitu dapat mengalami perubahan
sifat listrik dan optik yang dapat balik (reversible) melalui reaksi redoks dan

2
doping-dedoping atau protonasi-deprotonasi sehingga sangat potensial
dimanfaatkan untuk berbagai aplikasi.
Kinerja HRP yang tinggi sebagai biosensor dengan PANI sebagai material
dipengaruhi oleh sifat elektrokimia untuk mentranfer elektron antara elektroda dan
sisi aktif enzim (Solanki et al. 2011). Kitosan merupakan salah satu egen amobil
enzim yang paling umum digunakan. Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan
penelitian amobilisasi biosensor hidrogen peroksida dengan menggunakan enzim
horseradish peroksidase teramobil pada komposit NiFe4O2-kitosan (Yalciner et al.
2011). Namun, amobilisasi enzim horseradih peroksidase menggunakan
glutaraldehid sebagai agen amobil dan PANI sebagai fasilitator transfer elektron
belum dilakukan. Glutaraldehid dan kitosan memiliki dua fungsi yang dapat
berperan sebagai agen cross-linking dan agen pengaktifasi (Crescenzi et al. 2003).
Dua agen amobil diharapkan dapat menjaga kestabilan enzim sebagai biosensor
hidrogen peroksida.

Perumusan Masalah
Penggunaan hidrogen peroksida yang tergolong sebagai senyawa oksigen
reaktif sangat berbahaya. Pemanfaatan enzim horseradish peroksidase yang dapat
mengkatalisis hidrogen peroksida dapat digunakan sebagai biosensor untuk
mendekteksi hidrogen peroksida sangat diperlukan baik di bidang makanan, medis
dan farmasi. Penggunaan teknik amobil HRP secara cross-linking dengan
glutaraldehid pada komposit karbon-nanoserat polianilin diharapkan mampu
sebagai biosensor hidrogen peroksida.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik biosensor hidrogen
peroksida menggunakan horseradish peroksidase teramobilisasi pada komposit
karbon-nanopartikel polianilin sehingga dapat mendeteksi keberadaan hidrogen
peroksida pada konsentrasi tertentu.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai teknologi biosensor
hidrogen peroksida dengan pemanfaatan enzim horseradish peroksidase yang
teramobil dengan glutaraldehid pada komposit karbon-nanoserat polianilin.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah:
1. Pembuatan elektroda HRP/GA/PANI
2. Amobilisasi enzim Horseradish Peroksidase
3. Karakterisasi elektroda HRP/GA/PANI

3

2 METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah polianilin nanoserat,
kalium klorida, aquades, enzim Horseradish peroksidase, glutaraldehid, bovine
serum albumin (BSA), bufer fosfat, grafit, parafin, K3Fe(CN)6, K4Fe(CN)6,kawat
tembaga, tabung teflon dan tabung kaca.

Alat
Peralatan yang digunakan antara lain alat-alat gelas, neraca analitik, tabung
sentrifus, eDAQ potensiostat-galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak
Echem v2.1.0., kertas membran, kain nilon, pipet mikro, pipet volumetrik, mortar,
parafilm, desikator, pH meter (HANNA pH 21 pH/Mv meter), termometer, dan
penangas air.

Prosedur Penelitian
Pembuatan Elektrode EPK dan EPKT (Colak et al. 2012)
Elektrode pasta karbon (EPK) dibuat dengan mencampurkan 0.15 gr grafit
dan 100 μL parafin. Campuran grafit dan parafin dipersiapkan menggunakan mortal
dan diaduk selama 30 menit hingga membentuk pasta karbon yang homogen.
Sebuah tabung gelas yang terbuat dari kaca (diameter 0.8 cm dan panjang 3 cm)
digunakan sebagai badan elektrode, selanjutnya dihubungkan dengan kawat
tembaga sebagai penghubung elektrode dengan sumber arus listrik dimasukkan ke
dalam tabung hingga tersisa ruang kosong sekitar 0.7 cm pada ujung tabung. Pasta
dimasukkan ke ujung tabung hingga penuh dan padat. Permukaan elektrode
dihaluskan dengan menggunakan kertas pasir halus dan kertas minyak hingga licin.
Sedangkan pembuatan elektrode pasta karbon termodifikasi (EPKT) polianilin
dibuat dengan cara dicampurkan 0.15 gr karbon dan 100 μL parafin dengan 2 mg
polianilin dalam mortal. Kemudian campuran tersebut diisi dalam tabung elektroda
yang terbuat dari kaca (diameter 0.8 cm dan panjang 3 cm) sebagai badan elektrode
yang telah dihubungkan dengan kawat tembaga sebagai penghubung antara
elektrode.

Gambar 1. Rangkaian elektroda EPK dan EPKT

4

Amobilisasi Enzim HRP
Amobilisasi enzim HRP dilakukan berdasarkan Yang et al (2004) dengan
metode ikatan silang (crosslinking) menggunakan pereaksi glutaraldehid.
Amobilisasi enzim dilakukan dengan mencampurkan 20 μL enzim HRP (5000
U/mL), 0.4 mg Bovin serum albumin (BSA), 10 μL (2.5% w/v) glutaraldehid dan
20 μL bufer fosfat dengan variasi pH (pH=6-8, dengan rentang 0.5). Semua larutan
tersebut dicampurkan dalam tabung Eppendorf dan dihomogenisasi. Seluruh
larutan enzim amobil sebanyak 50 μL dimasukkan ke dalam elektroda pasta karbon
teramobilisasi (EPKT), dikeringkan pada suhu 4oC hingga larutan enzim teramobil
terjerap dalam pasta karbon-nanopartikel polianilin. Elektode HRP/EPKT dicuci
dengan aquades untuk menentukan jumlah enzim yang teramobil.
Pengukuran Elektrokimia
Metode voltametri siklik dilakukan mengacu pada Colak et al. (2012). Pada
pengukuran elektrokimia digunakan tiga elektroda yaitu elektroda pembantu (Pt),
elektroda Pembanding (Ag/AgCl) dan elektroda kerja (HRP/GA/PANI). Penentuan
hidrogen peroksida dilakukan secara reaksi elektrokimia melalui reaksi enzimatis
yang menghasilkan H2O dan O2. Ketiga elektroda tersebut dimasukkan ke dalam
larutan bufer fosfat 0.1 M dan K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0.1 M sebagai larutan
elektrolit. Hidrogen peroksida ditambahkan ke dalam wadah sebagai subtrat enzim
HRP.
Penentuan pH Optimum pada Kinerja Elektroda HRP/GA/PANI
Penentuan pH optimum dilakukan secara elektrokimia (Colak et al. 2012).
Sebanyak 1 mL larutan bufer fosfat dengan pH yang bervariasi yang akan diuji (pH
6 hingga pH 8, dengan rentang 0.5) dan 180 µL H2O2 0.5 mM sebagai larutan
elektrolit dimasukkan ke dalam sel elektrokimia. Elektroda HRP/GA/PANI, Pt dan
Ag/AgCl dimasukkan ke dalam sel elektrokimia dan diamati valtamogram siklik
yang terbentuk.
Penentuan Suhu Optimum pada Kinerja Elektroda HRP/GA/PANI
Penentuan suhu optimum dilakukan secara elektrokimia seperti pengukuran
aktivitas pH optimum (Colak et al. 2012). Penentuan suhu optimum tersebut
dilakukan pada kondisi pH optimum yang telah diketahui dari penentuan pH
optimum sebelumnya. Sebanyak 1 mL larutan bufer fosfat dengan pH optimum dan
180 µL H2O2 0.5 mM ditambahkan ke dalam sel elektrokimia, lalu diukur
aktivitasnya pada variasi suhu 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, dan 80oC. Suhu diatur
dengan memanaskan campuran larutan pada penangas yang terus diamati melalui
termometer. Elektroda HRP/EPKT, Pt, dan Ag/AgCl dimasukkan ke dalam sel
elektrokimia tersebut diamati voltamogram siklik yang terbentuk.
Penentuan Parameter Kinetika
Penentuan parameter kinetika enzim ditentukan dengan penentuan aktivitas
enzim pada variasi konsentrasi substrat, dan pH optimum serta suhu optimum yang
telah diketahui. Larutan elektrolit yang digunakan yaitu H2O2 sebagai substrat.
Larutan hidrogen peroksida dibuat dengan beberapa konsentrasi berbeda, yaitu
konsentrasi 0.1 mM – 1 mM. Masing-masing larutan H2O2 tersebut kemudian diuji

5
pengaruhnya terhadap aktivitas enzim HRP secara elektrokimia. Sebanyak 1 mL
larutan H2O2, ditambah 1 mL bufer fosfat dengan pH otimum dan suhu optimum
dimasukkan ke dalam sel elektrokimia. Elektroda Pt dan Ag/AgCl juga digunakan
sebagai elektroda pembantu dan pembanding. Voltamogram siklik yang terbentuk
kemudian diamati dan dibuat kurva hubungan antara konsentrasi H2O2 dan arus
yang dihasilkan yang disebut dengan kurva Michaelis-Menten.

6

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Voltamogram Siklik Elektroda Pasta karbon (EPK) dan Elektroda Pasta
Karbon Termodifikasi (EPKT)
Pengukuran voltamogram siklik elektroda pasta karbon (EPK) dan elektroda
pasta karbon termodifikasi (EPKT) bertujuan untuk mengetahui perbedaan kinerja
elektroda yang didasarkan pada reaksi redoks yang terjadi di permukaan elektroda.
Modifikasi elektroda dilakukan dengan penambahan polianilin (PANI) untuk
meningkatkan proses transfer elektron. Penambahan polianilin dapat meningkatkan
proses transfer elektron yang ditandai dengan meningkatnya puncak reduksi
dibandingkan dengan EPK yang tanpa penambahan polianilin yang ditunjukkan
pada Gambar 2.
0.0006
0.0005
EPK
EPKT

0.0004

Arus (mA)

0.0003
0.0002
0.0001
0.0000

Puncak reduksi

-0.0001
-0.0002
-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Tegangan (V)

Gambar 2. Voltamogram siklik EPK dan EPKT.
pH Optimum elektroda EPKT
Salah satu faktor yang mempengaruhi kestabilan enzim yaitu pH. Penentuan
pH optimum bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim pada keadaan pH tertentu
sehingga menghasilkan kinerja enzim yang terbaik. Pengujian pH optimum
dilakukan dengan metode voltametri siklik menggunakan elektroda Pt sebagai
pembantu dan elektroda Ag/AgCl sebagai elektroda pembanding. Kinerja elektroda
HRP/GA/PANI diuji pada pH 6-8 (dengan rentang 0.5) menggunakan bufer fosfat
0.1 M.
Pengaruh pH terhadap kinerja elektroda HRP/GA/PANI dengan variasi pH 6
hingga 8 terlihat dari voltamogram siklik (Gambar 3) terjadi perbedaan
voltamogram siklik pada setiap pH. Berdasarkan optimasi pH, diperoleh pH
optimum yang ditandai dengan adanya puncak yang menunjukkan terjadinya reaksi
oksidasi dan reduksi. Reaksi reduksi H2O2 menjadi H2O ditandai dengan adanya
puncak bagian bawah. Semakin baik kinerja elektroda semakin besar puncak yang
dihasilkan pada voltamogram siklik. Berdasarkan hasil pengukaran pH optimum

7
dengan voltametri siklik diperoleh kinerja optimum elektroda HRP/GA/PANI pada
pH 7 yang ditandai oleh tingginya puncak reduksi tertinggi (Gambar 4).
Nilai arus reduksi yang dihasilkan elektroda HRP/GA/PANI sebesar 0.969
mA pada potensial -0.614 V. Nilai arus yang tertinggi yang dihasilkan pada pH 7
menandakan bahwa kinerja elektroda HRP/GA/PANI dapat menghasilkan arus
optimum pada pH 7 dibandingkan dengan pH lainnya. Pada pH 6, 6.5, 7.5 dan 8
tidak terbentuk puncak reduksi maupun puncak oksidasi yang menandakan
terjadinya reaksi oksidasi dan reduksi.
0.0012

pH 6
pH 6.5
pH 7
pH 7.5
pH 8

0.0010
0.0008
0.0006

Arus (A)

0.0004
0.0002
0.0000
-0.0002
-0.0004

Puncak reduksi

-0.0006
-0.0008
-0.0010
-0.0012
-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Potensial (V)

Gambar 3. Voltamogram siklik elektroda HRP/GA/PANI terhadap pengaruh pH
bufer fosfat 0.1 M dengan laju pemayaran 100 mV/s

Arus Reduksi (mA)

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

pH

Gambar 4. Kurva pengaruh pH terhadap kinerja elektroda HRP/GA/PANI
Suhu Optimum Elektroda HRP/GA/PANI
Selain pH, suhu juga merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi tingkat
aktivitas enzim. Metode voltametri siklik digunakan untuk menentukan suhu
optimum. Variasi suhu dilakukan untuk mengetahui kondisi optimum elektroda
HRP/GA/PANI yaitu 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, dan 80oC. Pengaruh suhu
terhadap kinerja elektroda HRP/GA/PANI menghasilkan perbedaan puncak arus
voltamogram siklik (Gambar 5). Penentuan suhu optimum dilakukan pada
keaadaan pH optimum yaitu pH 7. Berdasarkan hasil pengujian voltametri siklik,
diperoleh suhu optimum yang dihasilkan pada suhu 50oC (Gambar 6).

8

o

30 C
o
40 C
o
50 C
o
60 C
o
70 C
o
80 C

0.025
0.020
0.015

Arus (A)

0.010
0.005
0.000
-0.005
-0.010
-0.015
-0.020
-1.5

Puncak reduksi
-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Potensial (V)

Gambar 5. Voltamogram siklik elektroda HRP/GA/PANI terhadap pengaruh suhu
dengan laju pemayaran 100 mV/s

6

5

Arus Reduksi (mA)

4
3
2
1
0
0

20

40

60

80

100

Suhu (oC)

Gambar 6. Pengaruh suhu terhadap kinerja elektroda HRP/GA/PANI
Berdasarkan data pengujian suhu terhadap kinerja elektroda juga dapat
ditentukan nilai konsentrasi permukaan elektroda HRP/GA/PANI. Konsentrasi
permukaan (Γ) elektroda HRP/GA/PANI dihitung menggunakan persamaan
Brown–Anson (pers. 1):
Ip 4RT

Γ = n2 F2 Av

(1)

Nilai konsentrasi permukaan elektroda HRP/GA/PANI yang diperoleh adalah
7.136x10-9 mol/cm2. Dimana Ip merupakan nilai arus pada puncak reduksi, n adalah
jumlah elektron yang ditransfer, F adalah konstanta Faraday (96,485 C/mol), Γ

9
adalah konsentrasi permukaan elektroda HRP/GA/PANI (mol/cm2), A adalah luas
permukaan elektroda (cm2), v adalah laju pemayaran (mV/s), R adalah tetapan gas
(8.314 J/molK), dan T adalah temperatur (K).
Parameter Kinetika Enzim HRP
Penentuan parameter kinetika enzim horseradih peroksidase dilakukan untuk
mengetahui karakteristik bioelektroda yang dirancang untuk keperluan
pengembangan elektroda baik sebagai biosensor maupun sebagai biokatoda. Nilai
Km dan Imax diperoleh dari penentuan paarameter kinetika yang dilakukan
menggunakan metode voltametri siklik. Variasi konsentrasi yang diuji yaitu pada
rentang 0.1 mM – 0.8 mM pada kondisi pH optimum (pH 7). Voltamogram siklik
yang dihasilkan pada penentuan parameter kinetika enzim ditunjukkan pada
Gambar 10 terlihat perbedaan nilai puncak arus reduksi dari setiap konsentrasi
hidrogen peroksida.
Voltamogram siklik menghasilkan puncak reduksi yang menandakan adanya
reaksi reduksi hidrogen peroksida menjadi air. Puncak yang terbentuk dapat
memberikan informasi nilai arus yang dihasilkan dari setiap konsentrasi. Tingkat
kejenuhan kosentrasi substrat terhadap elektroda HRP/GA/PANI terlihat dari kurva
Michaelis-Menten (Gambar 8) yaitu pada konsentrasi 0.5 mM, sedangkan pada
konsentrasi dibawah 0.5 mM nilai arus yang dihasilkan meningkat secara signifikan
dengan meningkatnya konsentrasi hidrogen peroksida.
Kurva linieritas kinerja elektroda HRP/GA/PANI terhadap konsentrasi
hidrogen peroksida diperoleh dari daerah linier kurva Michaelis-Menten (Gambar
13). Nilai Km dan Imax diperoleh dari kurva Lineweaver-Burk (Gambar 11) dengan
nilai R2 yaitu 0.9947. Berdasarkan persamaan kurva Lineweaver-Burk diperoleh
nilai Km dan Imax secara berturut-turut yaitu sebesar 1.71 mM dan 0.29 mA. Selain
nilai Km dan Imax yang dihasilkan, dari kurva Lineweaver-Burk juga dihasilkan nilai
sensitifitas elektroda HRP/GA/PANI sebesar 12.14 mA/mMcm2. Nilai Km dan Imax
serta nilai sensitifitas yang diperoleh dapat dijadikan informasi untuk
pengembangan elektroda sebagai biokatoda atau biosensor selanjutnya.
0.012

0.10 mM
0.15 mM
0.20 mM
0.25 mM
0.30 mM
0.35 mM
0.40 mM
0.45 mM
0.50 mM
0.60 mM
0.70 mM
0.80 mM

0.010
0.008

Arus (A)

0.006
0.004
0.002
0.000
-0.002
-0.004
-0.006
-0.008

Puncak reduksi

-0.010
-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Potensial (V)

Gambar 7. Voltamogram siklik pengaruh konsentrasi H2O2 terhadap arus elektroda
HRP/GA/PANI pada bufer fosfat 0.1 M dengan laju pemayaran 100
mV/s.

10

3,3

Arus Reduksi (mA)

3,1

y = 0,6267ln(x) + 3,3348
R² = 0,9684

2,9
2,7
2,5
2,3

2,1
1,9
0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Konsentrasi (mM)

Gambar 8. Pengaruh konsentrasi substrat hidrogen peroksida terhadap nilai arus
elektroda HRP/GA/PANI.
0.020

0.100 mM
0.125 mM
0.150 mM
0.175 mM
0.200 mM
0.225 mM
0.250 mM
0.275 mM
0.300 mM

0.015

Arus (A)

0.010
0.005
0.000
-0.005
-0.010

Puncak reduksi
-0.015
-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Potensial (V)

Gambar 9. Voltamogram siklik linieritas Konsentrasi substrat hidrogen peroksida
dan aktivitas HRP/GA/PANI dengan laju pemayaran 100 mV/s

Arus Reduksi (mA)

6
5
4

y = 5,9003x + 3,4439
R² = 0,9947

3
2
1
0
0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

[H2O2] (mM)

Gambar 10. Kurva linieritas antara konsentrasi substrat hidrogen peroksida dan
aktivitas HRP/GA/PANI

11
6
5
1/I (mA-1)

4
y = 5,9003x + 3,4439
R² = 0,9947
3

2
1
0
-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

1/[H2O2] (mM-1)

Gambar 11. Kurva Lineweaver-Burk dalam penentuan parameter kinetika
HRP/GA/PANI

Pembahasan
Voltametri Siklik EPK dan EPKT
Perbedaan arus yang dihasilkan oleh elektroda EPK dan EPKT seperti yang
terlihat pada Gambar 2 dipengaruhi oleh penambahan polianilin pada elektroda
EPKT. Elektroda EPK memiliki puncak yang lebih rendah dibandingkan dengan
elektroda EPKT yang berarti bahwa arus yang dihasilkan elektroda EPKT jauh
lebih tinggi daripada elektroda EPK. Peningkatan arus yang dihasilkan disebabkan
adanya modifikasi elektroda dengan penambahan nanoserat polianilin yang
memiliki sifat konduktif. Selain sifat konduktif dari polianilin, kinerja elektroda
juga dipengaruhi oleh luas permukaan elektroda. Semakin luas permukaan
elektroda semakin sering terjadi reaksi antara elektroda dan larutan elektrolit (Virji
et al. 2009). Luas permukaan karbon lebih kecil yang hanya mencapai 16.30 m2/g,
sedangkan luas permukaan elektroda pasta karbon dengan modifikasi polianilin
mencapai 29.26 m2/g (Zhu et al. 2012). Oleh karena itu, elektroda EPKT lebih
efektif pada proses transfer elektron sehingga dapat digunakan sebagai biosensor.
Elektroda EPK terdapat puncak oksidasi dengan arus yang dihasilkan sebesar
0.0851 mA pada tegangan 0.108 V, sedangkan puncak reduksi tidak dihasilkan.
Dibandingkan dengan EPK, EPKT menghasilkan arus pada puncak reduksi lebih
tinggi sebesar 0.2306 mA pada tegangan 0.188 V. Perbedaan arus yang dihasilkan
dipengaruhi oleh adanya polimer konduktif yaitu nanoserat polianilin. Tahap
preparasi elektroda juga mempengaruhi proses transfer elektron. Semakin padat
elektroda, semakin baik transfer elektron.
Pada penelitian ini, polianilin diperoleh dari Kunarsih (2014) dengan ukuran
100-120 nm. Polianilin merupakan salah satu polimer dari monomer anilin yang
memiliki sifat konduktif. Polimer polianilin (PANI) yang disintesis dengan metode
polimerisasi antar permukaan (interfacial) memiliki beberapa keuntungan yaitu
proses sintesis yang mudah dan relatif murah (Maddu, 2008). PANI memiliki
beberapa bentuk yaitu leucomeraldine base (LB) yang tereduksi penuh, emeraldine
base (EB) yang teroksidasi setengah dan pernigraniline base (PB) yang teroksidasi
penuh. Namun, dari ketiga bentuk PANI yang paling stabil yaitu EB dengan nilai

12
konduktifitas mencapai 1.15x10-4-2.2x10-4 S/cm (Zhang et al. 2012). Selain PANI,
ada beberapa polimer lain yang dapat memfasilitasi proses trasfer elektron yang
dapat digunakan sebagai biosensor antara lain polypyrrole (PPY), polythiophene
(PT), polyaniline (PANi), poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT), and
poly(p-phenylene vinylene) (PPV) (Nalwa, 1997). Namun, pemilihan PANI
sebagai polimer konduktif pada penelitian ini karena proses sintesis PANI yang
mudah dan biaya yang murah (Maddu et al. 2008)
Suhu merupakan salah satu faktor yang menyebabkan konduktifitas PANI
menurun. Penurunan aktivitas elektrokimia PANI terjadi pada suhu diatas 35oC
yang disebabkan oleh terjadinya reaksi oksidasi berlebih sehingga merusak struktur
terkonjugasi PANI (Tang et al. 2014). Jenis asam yang ditambahkan sebagai proses
protonisasi juga mempengaruhi tingkat kestabilan PANI. Penambahan H2SO4 lebih
termostabil daripada penambahan HCl sebagai asam protonik (Ansari, 2006).
Pengujian kinerja elektroda pasta karbon (EPK) dan elektroda pasta karbon
termodifikasi (EPKT) dengan menggunakan larutan elektrolit KCl bertujuan untuk
mengetahui perbedaan kedua elektroda tersebut. Data voltamogram siklik (Gambar
2), EPK menghasilkan puncak oksidasi dan tidak menghasilkan puncak reduksi.
Hal tersebut dapat diartikan bahwa adanya pengotor pada EPK sehingga
menimbulkan puncak oksidasi. Voltamogram siklik EPKT menghasilkan puncak
oksidasi dan reduksi yang berarti polianilin pada EPKT terjadi proses protonasi dan
deprotonasi.
Hal lain yang dapat mempengaruhi performa biosensor yaitu luas permukaan
elektroda kerja dan elektroda pembantu. Menurut Stojek (2010) elektroda kerja
yang lebih besar dibandingkan dengan elektroda pembantu akan berefek pada
pengukuran arus yang berhubungan dengan deaktivasi, pasifasi dan penghambatan
permukaan elektroda. Namun, pada penilitian ini menggunakan elektroda kerja
yang lebih besar dibandingkan dengan elektroda pembantu sehingga pengukuran
arus kurang efektif. Potensial elektroda kerja dikontrol oleh elektroda pembanding
(Ag/AgCl). Pengontrol potensial yang terjadi pada dua elektroda dapat dianggap
sebagai sinyal eksitasi. Sinyal eksitasi untuk voltametri siklik adalah pemayaran
potensial dengan kecepatan 100 mV/s. Scan rate atau laju pemayaran merupakan
laju transfer elektron antar elektroda.
Laju pemayaran yang pada metode voltametri siklik dapat mempengaruhi
pengukuran arus. Laju pemayaran juga akan dipengaruhi oleh kedekatan letak
antara terjadi antara elektroda kerja dan elektroda pembantu melalui larutan
elektrolit (Marken et al. 2010). Semakin dekat jarak elektroda kerja dan elektroda
pembantu maka akan dapat mengurangi daya hambat proses tranfer elektron
(Gambar 12).

13

Gambar 12. Arah aliran elektron, elektrode kerja (W), elektrode pembanding (R)
dan elektroda pembantu (C)
pH Optimum Elektroda HRP/GA/PANI
Enzim horseradih peroksidase terlebih dahulu diamobilisasi dengan
menggunakan glutaraldehid (GA) sebelum dijerap ke dalam elektroda. Enzim HRP
diamobilisasi dengan metode ikatan silang (cross linking) untuk membuat enzim
tetap stabil pada kondisi tertentu dalam elektroda. Amobilisasi enzim diharapkan
dapat meningkatkan kestabilan yang baik selama kinerja enzim. Selain itu, tahap
amobilisasi juga bertujuan untuk menjaga keberadaan enzim tetap dalam elektroda
dengan adanya ikatan kovalen antara enzim dan agen pengamobil. Enzim HRP
teramobilisasi melalui interaksi antara gugus karboksil dari glutaraldehid dan gugus
amina dari enzim HRP. Pada penelitian ini terjadi multi-amobilisasi antara
glutaraldehid/HRP dan HRP/PANI. Interaksi antara enzim HRP dan PANI terjadi
melalui interaksi gugus karboksil dari enzim HRP dan gugus amina dari PANI.
Adanya multi agen ikatan silang (cross linking) menyebabkan enzim HRP akan
lebih terikat kuat dan tetap berada pada elektroda.
Enzim horseradish peroksidase merupakan salah satu enzim yang dapat
mereduksi hidrogen peroksida (H2O2) dengan air sebagai produk akhir seperti
reaksi pada Gambar 13. Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi kinerja
enzim diantaranya pH dan suhu. Penentuan pH optimum elektroda HRP/GA/PANI
dilakukan dengan menggunakan metode voltametri siklik. Semakin besar arus yang
dihasilkan, maka semakin baik kinerja enzim. Dari hasil pengujian pengaruh pH
terhadap kinerja elektroda HRP/GA/PANI yaitu dengan variasi pH dari 6 hingga 8,
dihasilkan pH optimum elektroda HRP/GA/PANI pH 7 seperti yang terlihat pada
Gambar 4. Elektroda HRP/GA/PANI pada pH 7 menghasilkan arus reduksi
hidrogen peroksida sebesar 0.96 mA pada potensial -0.168 V. Pada pH 6, 7.5 dan
8, tidak menghasilkan puncak reduksi. Hal tersebut diakibatkan karena perubahan
konformasi enzim selain pada pH optimum yang mengakibatkan penurunan
aktifitas enzim terhadap substrat.

14
H2O2
→ 2H+ + O2 + 2e
H2O2 + 2e
→ 2 OH−
+
2H2O2
→ 2H+ + 2OH- +O2
2H2O2
→ 2H2O + O2
Gambar 13. Reaksi redoks H2O2 yang terjadi pada elektroda

Oksidasi :
Reduksi :

Setiap enzim memiliki pH optimum tertentu. Tingkat keasaman (pH) akan
mempengaruhi konformasi enzim dan substrat. Semakin asam suatu sistem, maka
akan semakin banyak konsentrasi ion H+. Peningkatan dan penurunan pH akan
merubah konsentrasi ion H+ yang akan menyebabkan perubahan konformasi enzim
dan substrat. Perubahan konsentrasi ion H+ akan merusak ikatan membentuk ikatan
baru yang menyebabkan enzim terdenaturasi. Sisi aktif enzim horseradish
peroksidase akan mengalami gangguan dengan terjadinya perubahan konformasi
dari enzim sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat (ES) tidak akan
tercapai dengan baik dan kinerja enzim HRP akan menurun.
Asam amino penyusun suatu enzim akan mempengaruhi pH optimum untuk
menghasilkan kinerja yang maksimal. Enzim horseradish peroksidase adalah
glikoprotein globular yang memiliki berat molekul 44 kDa dengan bobot protein 34
kDa dan selebihnya merupakan gugus prostetik dan ion kalsium (Ahirwal dan Mitra,
2009). Asam amino penyusun enzim HRP merupakan asam amino bermuatan
sebesar 17% seperti yang dilihat pada Lampiran 8. Arginin merupakan salah satu
asam amino bermuatan yang juga termasuk sisi aktif enzim HRP yaitu Arg38
seperti yang terlihat pada Gambar 8. Perubahan pH akan mengubah muatan enzim
yang mengakibatkan perubahan struktur, bentuk dan ionisasi enzim HRP.
Perubahan struktur terutama perubahan sisi aktif enzim akan mempengaruhi
aktivitas enzim untuk membentuk kompleks enzim-substrat. Selain mengubah
konformasi enzim, perubahan pH juga dapat merubah muatan substrat yang
berpengaruh terhadap interaksi antara enzim dan substrat dan pada akhirnya akan
menurunkan aktivitas enzim. Kondisi utama yang mempengaruhi denaturasi protein
yaitu suhu, pH, kekuatan ionik, dan polaritas pelarut (Dissanayake et al. 2013).
Muatan lingkungan juga dapat mempengaruhi muatan asam amino penyusun
enzim yang menyebabkan perubahan konformasi enzim. Pada elektroda
HRP/GA/PANI digunakan polianilin sebagai polimer konduktif dan juga sebagai
agen amobil enzim HRP. Penggunaan polimer polianin juga dapat mempengaruhi
konsentrasi ion H+ dalam sistem yang dapat merusak konformasi enzim. Ion H+
yang berasal dari polianilin dapat mengimbangi muatan sistem lingkungan
elektroda untuk mencapai kondisi optimum. Namun, apabila jumlah ion H+ dalam
sistem terlalu banyak maka akan dapat mempengaruhi ikatan hidrogen enzim.
Perubahan ikatan hidrogen enzim akan menyebabkan perubahan konformasi enzim.
Selain itu, pH juga dapat menyebabkan enzim terdenaturasi yang dikarenakan
perubahan muatan residu penyusun enzim.
Enzim horseradish peroksidase memiliki sisi aktif untuk mengikat hidrogen
peroksida yaitu pada Arg38, His170, dan Phe41 (Torres dan Ayala, 2010). Selain
asam amino tersebut, enzim horseradish peroksidase juga memiliki gugus
protoporfirin IX yang mengandung besi sebagai pusat katalis. Interaksi yang terjadi
antara sisi aktif enzim dan ligan (protoporfirin) seperti yang pada Gambar 15. Ikatan
yang terjadi antara Phe41, His170 dan Arg38 adalah ikatan π melalui interaksi Van
Der Wall. Ada dua residu penting yang berperan pada tahap reduksi hidrogen

15
peroksida yaitu His42 dan Arg38. Mekanisme yang terjadi pada kondisi asam dan
basa berbeda dimana akan mempengaruhi muatan dari residu His42 (Lopez et al.
2001). Namun, residu His42 tidak berinteraksi langsung dengan gugus heme
sebagai ligan dari enzim horseradih peroksidase. Ada dua tahap penting dalam
mekanisme pembentukan zat intermediet senyawa I pada keadaan yaitu katalisis
asam atau basa oleh His42 dan stabilisasi muatan komplek prekorsor enzim-substrat
oleh Arg38. Perubahan pH larutan tersebut akan mempengaruhi sisi aktif enzim
horseradish yang akan menyebabkan interaksi terhadap substrat.
Menurut Chang dan Tang (2014) enzim dalam bentuk bebas memiliki pH
optimum yang lebih rendah dibandingkan dengan enzim yang teramobilisasi.
Perbedaan pH optimum tersebut disebabkan oleh perubahan status disosiasi enzim
dan perubahan konformasi enzim sehingga mempengaruhi kapasitas mengikat
substrat. pH optimum yang dihasilkan dalam penelitian ini sesuai dengan penelitian
sebelumnya yang menghasilkan pH optimum enzim HRP amobil pada pH 7
(Temocin dan Yigitoglu, 2009).

Gambar 14. Interaksi residu asam amino dengan protoporfirin IX pada enzim
horseradish peroksidase (1H58).
Suhu Optimum Elektroda HRP/GA/PANI
Suhu juga merupakan faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim HRP
selain pH. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan metode yang sama dengan
penentuan pH optimum yaitu dengan metode voltametri siklik. Dari hasil penelitian
diperoleh suhu optimum elektroda HRP/EPKT 50oC yang menunjukkan nilai arus
terbesar antara suhu 30oC-80oC. Pada penelitian sebelumnya suhu optimum enzim
HRP berada pada suhu 40oC yang diamobilisasi dengan glutaraldehid pada
nanopartikel magnetik Fe3O4/SiO2 (Chang dan Tang, 2014).
Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi laju suatu reaksi yaitu suhu. Suhu
sangat berpengaruh terhadap kinerja enzim dan pergerakan molekul yang ikut
berinteraksi. Semakin tinggi suhu maka semakin sering substrat bertumbukan
dengan enzim, namun suhu yang terlalu tinggi juga dapat menyebabkan penurunan

16
aktivitas enzim. Pergerakan molekul tersebut dipengaruhi oleh meningkatnya
energi kinetik enzim dan substrat yang akan menyebabkan kemungkinan substrat
bertumbukan dengan enzim akan semakin sering. Peningkatan energi kinetik sama
atau lebih besar dari energi akativasi akan mempermudah substrat dan enzim
memnentuk komplek enzim-substrat lebih cepat sehingga laju reaksi berlangsung
cepat. Energi aktivasi merupakan energi minimum yang diperlukan suatu molekul
untuk mencapai kompleks teraktivasi.
Setiap enzim memiliki suhu optimum masing-masing untuk menghasilkan
produk maksimum. Pada saat suhu enzim dinaikkan melebihi suhu optimum dapat
menyebabkan aktivitas enzim menurun dikarenakan enzim perubahan konformasi
struktur enzim, dengan kata lain enzim telah terdenaturasi. Peningkatan suhu akan
menyebabkan terputusnya beberapa ikatan hidrogen dan ikatan sulfida pada enzim
sehingga akan merusak konformasi enzim. Enzim horseradish peroksidase
memiliki 308 residu asam amino, gugus prostetik, dua ion kalsium dalam setiap
molekul dengan empat jembatan sulfida (Cys11-Cys91, Cys44-Cys49, Cys97Cys301, dan Cys177-Cys209) dan N-linked rantai karbohidrat dengan struktur 3D
seperti yang terlihat pada Gambar 13 (Chattopadhyay et al. 2000). Meningkatnya
suhu akan menjadikan energi kinetik enzim bertambah besar yang akan
menyebabkan terputusnya ikatan hidrogen dan ikatan sulfida. Denaturasi enzim
juga disebabkan oleh perubahan entalpi dalam sistem. Hal tersebut ditandai dengan
menurunnya arus yang dihasilkan pada suhu diatas 50oC yang merupakan suhu
optimum.

Gambar 15. Struktur 3D enzim Horseradish Peroksidase (1H58)
Dari hasil pengujian dapat dihitung nilai konsentrasi permukaan dengan
menggunakan persamaan (1). Konsentrasi permukaan adalah jumlah substrat yang
dapat terserap pada permukaan suatu elektroda. Semakin besar nilai konsentrasi
permukaan suatu elektroda maka akan semakin baik elektroda sebagai biosensor.
Nilai konsentrasi permukaan yang dihasilkan oleh elektroda HRP/GA/PANI yaitu
sebesar 7.136 x 10-9 mol/cm2. Konsentrasi permukaan elektroda HRP/GA/PANI
dihasilkan sebesar 7.136 x 10-9 mol/cm2 yang lebih besar dibandingkan dengan
elektroda HRP-PANI-ClO4/ITO 5.81 x 10-9 mol/cm2 (Solanki et al. 2013).
Kinerja Elektroda HRP/GA/PANI
Parameter kinerja elektroda HRP/GA/PANI diuji dengan metode voltametri
siklik dalam larutan elektrolit yang mengandung K3Fe(CN)6:K4Fe(CN)6 0.1M

17
dengan perbandingan 1:1 dan buffer fosfat 0.1 M serta H2O2 sebagai zat yang akan
direduksi. Laju reaksi reduksi H2O2 oleh enzim HRP dijelaskan dengan produk
yang dihasilkan yaitu berupa arus yang terukur dengan voltamogram siklik.
Pembentukan komplek enzim-substrat menentukan produk yang dihasilkan.
Semakin banyak kompleks enzim-substrat yang terbentuk maka semakin banyak
produk yang dihasilkan yang berarti laju reaksi berjalan cepat. Tahap laju reaksi
reduksi H2O2 terjadi dalam tiga keadaan. Pada keadaan awal dengan [S] rendah,
jumlah enzim yang berada dalam keadaan bebas lebih besar daripada kompleks
enzim-substrat sehingga laju pembentukan produk berlangsung lambat maka
perubahan konsentrasi hidrogen peroksida akan linier dengan kecepatan reaksi.
Lambatnya pembentukan produk berupa nilai arus yang rendah seperti pada
Gambar 5.
Pada konsentrasi substrat menengah selanjutnya, peningkatan konsentrasi
hidrogen peroksida yang semakin tinggi, laju reaksi semakin cepat untuk
menghasilkan produk berupa arus yang semakin besar. Pada keadaan statis atau
keadaan akhir, peningkatan konsentrasi hidrogen peroksida yang semakin tinggi
menyebabkan seluruh enzim berada pada keadaan komplek enzim-substrat. Pada
saat seluruh enzim berada pada keadaan enzim-substrat sehingga laju reaksi
mencapai titik maksimum karena enzim berada pada kondisi jenuh yang ditandai
dengan arus yang dihasilkan tidak meningkat secara signifikan.
Kinetika aktivitas enzim melebihi nilai konsentrasi substrat maka akan
terbentuk kurva hiperbola atau sering disebut dengan kurva Michaelis-Menten pada
Gambar 8 menjelaskan ketiga fase tersebut sebagai efek dari konsentrasi hidrogen
peroksida terhadap elektroda HRP/GA/PANI. Pada konsentrasi hidrogen peroksida
0.1 mM, arus yang dihasilkan semakin meningkat seiring dengan meningkatnya
konsentrasi hidrogen peroksida. Hal tersebut dikarenakan konsentrasi substrat lebih
kecil dibandingkan dengan enzim bebas. Namun, pada konsentrasi hidrogen
peroksida lebih besar dari 0.5 mM arus yang dihasilkan tidak meningkat secara
signifikan yang dikarenakan enzim HRP berada pada kondisi jenuh. Dengan kata
lain laju reaksi mencapai titik maksimum.
Penentuan Km dan Imax dihitung menggunakan kurva linieritas yang diperoleh
dari kurva Michaelis-Menten. Kurva linieritas diplot �� yang dinamakan dengan
�
�
kurva Lineweaver-Burk. Dari kurva tersebut diperoleh nilai Km dan Imax secara
berurutan sebesar 1.71 mM dan 0.29 mA. Nilai Km yang dihasilkan elektroda
HRP/GA/PANI lebih kecil dibandingkan dengan nilai Km yang dihasikan dari
elektroda HRP-PANI-ClO-4/ITO yaitu sebesar 1.984 mM (Solanki et al. 2011).
Km merupakan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk mencapai setengah
kecepatan reaksi maksimum. Nilai Km yang besar menjelaskan affinitas komplek
enzim-substrat rendah, sedangkan bila nila Km kecil menjelaskan affinitas subtratenzim tinggi. Nilai Km elektroda HRP/Chi-GAD/RuNPs (Periamasi et al. 2011)
sebesar 5.06 mM lebih kecil Dibandingkan dengan nilai Km pada penelitian ini
sebesar 1.71 mM. Ditinjau dari nilai Imax, penelitian ini menghasilkan nilai Imax yang
lebih besar senilai 0.29 mA dibandingkan dengan HRP/Chi-GAD/RuNPs sebesar
1.7999 µA.
Kinerja elektroda HRP/GA/PANI sebagai biosensor juga dapat ditinjau dari
nilai sensitifitas. Nilai sensitifitas elektroda HRP/GA/PANI pada penelitian ini
sebesar 12.14 mA/mMcm2 seperti pada Lampiran 4. Pada penelitian sebelumnya,
Solanki et al. (2011) yang membuat biosensor HRP-PANI-ClO-4/ITO dengan nilai

18
sensitifitas 0.5638 mA/mMcm2. Hal tersebut menjelaskan bahwa nilai sensitifitas
elektroda HRP/GA/PANI lebih besar dibandingkan dengan elektroda HRP-PANIClO-4/ITO. Berdasarkan hasil penelitian tersebut, kinerja elektroda pada penelitian
ini lebih baik yang menghasilkan arus sebesar 12.14 mA pada setiap 1 mM hidrogen
peroksida. Besarnya nilai arus yang dihasilkan dari elektroda tersebut dipengaruhi
oleh konduktifitas PANI dalam bentuk emeraldine salt (ES) yang dapat melakukan
reaksi oksidasi dengan asam-asam protonik seperti HCl, sebaliknya bentuk ES
dapat dikembalikan menjadi bentuk EB melalui reaksi reduksi dengan agen
reduktan seperti NH4OH, seperti ditunjukkan pada Gambar 14.

H
N

H
N

N

y

HO-(aq) NH4+(aq)

H
N

H
N

+

Cl

PANI-EB

1-y n

H+(aq) Cl-(aq)

H
N
-

N

H
N

PANI-ES

+

Cln

Gambar 16. Reaksi protonisasi deprotonisasi polianilin
Untuk mencapai setengah dari laju reaksi maksimum enzim terhadap substrat
diperlukan kosntentrasi substrat tertentu yang akan menjelaskan nilai Km. Laju
reaksi maksimum enzim HRP terhadap substrat yang dianalogikan dengan Imax
Nilai Km dan Imax yang dihasilkan dapat mempresentasikan kinetika enzim
horseradish peroksidase. Nilai arus yang dihasilkan mempresentasikan laju reaksi
katalis enzim HRP terhadap H2O2. Pembentukan kompleks enzim-subtrat menjadi
penentu laju reaksi yang terjadi. Semakin banyak kompleks enzim-substrat (ES)
yang terbentuk, semakin cepat reaksi dan produk yang dihasilkan. Pada konsentrasi
substrat yang rendah, kecepatan reaksi lebih tinggi sehingga akan menghasilkan
linieritas terhadap substrat. Namun pada konsentrasi subtrat yang tinggi perubahan
produk yang dihasilkan