Analisis Asam Amino dengan KCKT Kromatografi Cair Kinerja
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
KCKT didasarkan pada pengukuran luasarea puncak analit dalam
kromatogram, dibandingkan dengan luasarea standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan
satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan sistem
pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan
tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara
kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi,
lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa
biologis, analisis ketidakmurnian impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatil. KCKT paling sering digunakan
untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis,
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain. Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa,
fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase gerak dan fase diam. Fase gerak berupa zat cair yang disebut eluen atau pelarut,
sedangkan fase diam berupa silika gel yang mengandung hidrokarbon Pare, J.R.J., Belanger, J.M.R, 1997. Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri
atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,kolom, detektor, wadah penampung
buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4. Ideal untuk molekul besar dan ion Johnson dan Stevenson, 1991.
KCKT banyak digunakan untuk analisis asam amino karena analisa memerlukan waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti.
Untuk mendeteksi asam amino dapat digunakan detektor UV atau detektor fluoresen. Akan tetapi kebanyakan asam amino tidak mempunyai serapan
baik didaerah ultraviolet atau didaerah visibel. Dalam hal ini asam amino harus diderivatisasi terlebih dahulu supaya membentuk derivat yang dapat
menyerap cahaya UV, tampak, atau berfluoresensi Rediatning Kartini 1987, h. 2-3.
Tujuan dari derivatisasi pada HPLC untuk meningkatkan deteksi, mengubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan
puncak kromatogram yang lebih baik, mengubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik, dan menstabilkan analit yang sensitif. Suatu
reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yaitu produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau
sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofotometri, proses derivatisasi harus cepat dan
menghasilkan produk yang sebesar mungkin 100, produk hasil
derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi, serta sisa pereaksi untuk derivatisasi tidak mengganggu ketika pemisahan pada
kromatografi Abdul Rohman et al., 2007 . Ada dua macam derivatisasi yaitu derivatisasi pascakolom dan
derivatisasi prakolom.
Beberapa metode
menggunakan pacakolom
derivatisasi di mana asam amino yang dipisahkan pada kolom pertukaran ion diikuti dengan derivatisasi dengan ninhidrin, o-phthalaldehyde. Pada
derivatisasi pascakolom, pemisahan asam amino berdasarkan pertukaran ion antara gugus amino yang terprotonasi dengan ion Na
+
dari resin penukar kation R-SO
3
-NA
+
pada pH rendah. Pendekatan lain adalah untuk derivatisasi asam amino sebelum pemisahan pada kolom HPLC fase terbalik
seperti fenil
isothiosianat; 6-amino-quinolil-N-hidroksisuccinimidil
karbamate; 9-fluorenil metil kloroformate Cooper et al., vol. 159. Pada
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kromatografi fase terbalik, silika non polar dimodifikasi melalui perlekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang berupa atom karbon 8 atau 18 dan
menggunakan pelarut polar berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk
interaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der waals. Senyawa ini juga kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan
waktu untuk pemutusan hidrogen, sehingga senyawa non polar akan tertahan lebih lama di dalam kolom, sedangkan molekul-molekul polar akan bergerak
lebih cepat melalui kolom.