Analisis Asam Amino dengan KCKT Kromatografi Cair Kinerja

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta KCKT didasarkan pada pengukuran luasarea puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luasarea standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatil. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain. Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase gerak dan fase diam. Fase gerak berupa zat cair yang disebut eluen atau pelarut, sedangkan fase diam berupa silika gel yang mengandung hidrokarbon Pare, J.R.J., Belanger, J.M.R, 1997. Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4. Ideal untuk molekul besar dan ion Johnson dan Stevenson, 1991. KCKT banyak digunakan untuk analisis asam amino karena analisa memerlukan waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti. Untuk mendeteksi asam amino dapat digunakan detektor UV atau detektor fluoresen. Akan tetapi kebanyakan asam amino tidak mempunyai serapan baik didaerah ultraviolet atau didaerah visibel. Dalam hal ini asam amino harus diderivatisasi terlebih dahulu supaya membentuk derivat yang dapat menyerap cahaya UV, tampak, atau berfluoresensi Rediatning Kartini 1987, h. 2-3. Tujuan dari derivatisasi pada HPLC untuk meningkatkan deteksi, mengubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatogram yang lebih baik, mengubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik, dan menstabilkan analit yang sensitif. Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yaitu produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofotometri, proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin 100, produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi, serta sisa pereaksi untuk derivatisasi tidak mengganggu ketika pemisahan pada kromatografi Abdul Rohman et al., 2007 . Ada dua macam derivatisasi yaitu derivatisasi pascakolom dan derivatisasi prakolom. Beberapa metode menggunakan pacakolom derivatisasi di mana asam amino yang dipisahkan pada kolom pertukaran ion diikuti dengan derivatisasi dengan ninhidrin, o-phthalaldehyde. Pada derivatisasi pascakolom, pemisahan asam amino berdasarkan pertukaran ion antara gugus amino yang terprotonasi dengan ion Na + dari resin penukar kation R-SO 3 -NA + pada pH rendah. Pendekatan lain adalah untuk derivatisasi asam amino sebelum pemisahan pada kolom HPLC fase terbalik seperti fenil isothiosianat; 6-amino-quinolil-N-hidroksisuccinimidil karbamate; 9-fluorenil metil kloroformate Cooper et al., vol. 159. Pada UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kromatografi fase terbalik, silika non polar dimodifikasi melalui perlekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang berupa atom karbon 8 atau 18 dan menggunakan pelarut polar berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk interaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der waals. Senyawa ini juga kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan waktu untuk pemutusan hidrogen, sehingga senyawa non polar akan tertahan lebih lama di dalam kolom, sedangkan molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

2.7 PCA

Principal Component Analysis Teknik menggunakan kemometri untuk menginterpretasi sejumlah besar data yaitu PCA Principle Component Analysis. PCA adalah teknik untuk menentukan komponen utama yang merupakan kombinasi linier dari variabel asli. Analisis data komponen utama menggunakan software Minitab 15. Analisis komponen utama dilakukan dengan cara menghilangkan korelasi diantara variabel bebas melalui transformasi variabel bebas asal ke variabel baru yang tidak berkorelasi sama sekali atau multikolinearitas. PCA juga digunakan untuk mengurangi dimensi dari satu set data, tetapi bisa memberikan informasi terhadap seluruh variabel asli Miller, J.N., Miller, J.C. 2005. Berdasarkan Kaiser Criterion, komponen utama atau Principal Component PC yang digunakan adalah PC dengan eigen value nilai ciri atau varians setiap komponen utama lebih dari 1 sedangkan proporsi keragaman yang dianggap cukup mewakili total keragaman data jika keragaman kumulatif mencapai 70-80 Miller, J.N., Miller, J.C. 2005. Komponen utama dibentuk berdasarkan urutan varians yang terbesar hingga terkecil. Komponen utama pertama PC1 merupakan kombinasi linier dari seluruh variabel yang diamati dan memiliki varians terbesar. Komponen utama kedua PC2 merupakan kombinasi linier dari seluruh variabel yang diamati yang bersifat ortogonal terhadap PC1 dan memiliki varians kedua terbesar. Komponen utama ke-n PCn merupakan kombinasi linier dari seluruh variabel yang diamati yang bersifat ortogonal terhadap PC1, PC2, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta PCn-1 dan memiliki varians terkecil. Sebagian besar variasi keragaman atau informasi dalam keseluruhan variabel cenderung berkumpul pada komponen utama pertama, dan semakin sedikit informasi dari variabel asal akan berkumpul pada komponen utama terakhir. Komponen utama bersifat orthogonal Miller, J.N., Miller, J.C. 2005. Berdasarkan kontribusi PC1 dan PC2 maka dapat dibuat kurva score plot. Kurva score plot digunakan jika ada 2 komponen pertama merupakan nilai terbanyak dalam variabilitas di dalam data. Komponen utama pertama PC1 sebagai absis sedangkan komponen utama kedua PC2 sebagai ordinat. Semakin dekat letak antar sampel pada score plot, maka semakin besar pula kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama. 27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada Maret-Juli 2014 di Laboratorium Product Halal Analysis, Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan Laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Waters 2695 HPLC, Shimadzu FTIR, lemari pendingin refrigerator, sentrifuge 5417R, oven, neraca analitik, hote plat, labu ukur, erlenmeyer, kaca arloji, tabung reaksi bertutup, mikro pipet 100-1000 ul beserta tip nya, spatula, gelas ukur, beaker glass, vortex, pipet tetes, pinset, syringe filter, termometer, membran filter 0,45 µm ,vial, cawan porselen, batang pengaduk.

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: standar asam amino yaitu: asam L- aspartat, L- serin, asam L- glutamat, glisin, L- histidin, L- arginin, L- treonin, L-alanin, L- prolin, L- sistein, L- tirosin, L- valin, L- metionin, L- lisin, L- isoleusin, L- leusin, L- fenilalanin, triptofan, standar gelatin sapi sigma aldrich, standar gelatin babi sigma aldrich, internal standar AABA alpha amino butiric acid, Accq-fluor borat, reagen fluor A, HCl, asetonitril grade HPLC, aquabidest, aseton, sampel cangkang kapsul, gliserin, titanium dioksida dan pewarna tartrazin.

3.3 Tahapan Penelitian

3.3.1 Pengumpulan Sampel dari Pasaran

Pengumpulan sampel dilakukan secara acak dengan cara mendata berbagai macam produk kapsul dari populasi obat vitamin dan mineral yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta terdapat di dalam buku mims edisi 2014. Lalu didata semua produk vitamin bercangkang kapsul keras dan diperoleh 25 produk vitamin bercangkang kapsul keras. Kemudian diambil secara acak 5 produk kapsul bercangkang keras dengan produsen yang berbeda-beda yang resmi beredar di Indonesia. 3.3.2 Pembuatan Lembaran Cangkang Kapsul Gelatin Keras Simulasi Menggunakan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi Formulasi lembaran cangkang kapsul gelatin keras simulasi dapat dilihat pada tabel berikut : Tabel 3.1 Formulasi Lembaran Cangkang kapsul gelatin keras Bahan Jumlah Gelatin 50 Gliserin 10 Titanium dioksida 1,25 Tartrazin 0,05 Aquadest Ad 100 Dibuat total sediaan : 10 mL Sebanyak 5 g gelatin dimasukkan ke dalam becker glass 50 mL, dibasahi dengan 5 mL aquadest. Kemudian dipanaskan pada suhu 60 o C sampai membentuk larutan jernih. Lalu ditambahkan 1 mL gliserin, 0,125 g titanium dioksida yang telah didispersikan dalam 1 mL aquadest dan 5 mg pewarna tartrazin yang telah dilarutkan dalam 1 mL aquadest lalu di add kan dengan aquadest hingga 10 mL. Diaduk hingga homogen. Campuran dituangkan ke dalam cetakan untuk memperoleh lapisan tipis larutan gelatin. Lalu disimpan di dalam desikator bersilika untuk menurunkan kandungan air pada lembaran cangkang kapsul keras Widyaninggar et al., 2012.