High Pressure Liquid Chromatography HPLC
Contoh proses terjadinya pemisahan ditunjukkan pada gambar 2.2, misalnya ada molekul A dan B yang terdapat dalam suatu sampel, sampel tersebut
dimasukkan ke dalam sistem. Kedua senyawa tersebut akan terdistribusi di antara fase gerak dan diamnya menurut sifat masing – masing. Komponen yang tertahan
kuat akan berjalan lambat, sebaliknya yang tertahan lemah akan berjalan cepat. Karena perbedaan mobilitas inilah komponen – komponen sampel akan terpisah –
pisah yang kemudian dapat dideteksi dan dianalisa dengan detektor.
Gambar 2.2. Proses pemisahan pada kolom
Sampel yang terdiri dari molekul A dan B diinjeksikan pada saat t0, sampel mulai memasuki kolom lalu pada saat t1 sampel mulai terpisah. Pada saat t2 jarak antara
molekul A dan molekul B mulai terlihat, molekul B bergerak lebih cepat dibandingkan dengan molekul A. Pada saat t3 molekul B telah sampai di detektor
sedangkan molekul A masih berada di dalam kolom. Pasa saat t4 molekul A baru sampai di detektor. Hasil dari proses pemisahan tersebut akan berupa grafik
dengan dua puncak yang ditunjukkan oleh gambar 2.3. Masing – masing puncak mewakili molekul tertentu.
Gambar 2.3. Grafik pemisahan
Dilihat dari jenis fase gerak dan fase diamnya ada dua metode pemisahan pada HPLC, yaitu pemisahan fase normal dan pemisahan fase terbalik.
Pada metode pemisahan fase normal, fase diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Sedangkan pada metode pemisahan fase terbalik, fase
diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar. Terjadinya pemisahan ditandai dengan didapatkannya waktu retensi
yang berbeda antara molekul yang satu dengan yang lain. Dalam proses pemisahannya HPLC menggunakan laju alir dan tekanan tertentu. Untuk
penelitian analitis pada HPLC, laju alirfase gerak yang digunakan berkisar antara 0.5 – 5 mlmin [Johnson dan Stevenson, 1991].Semakin rendah laju alirnya maka
kemampuan untuk memisahkan komponen – komponen akan semakin tinggi serta menghemat penggunaan fase gerak dan waktu yang dibutuhkan untuk analisis
Ke luaran de te ktor
w aktu t1
t2 t3
t4 t0
Molekul Molekul A
akan semakin lama. Besar waktu retensi suatu molekul dipengaruhi oleh laju alir fase gerak, tekanan, parameter kolom serta sifat – sifat molekul itu sendiri.
Kolom pada HPLC tersusun atas bagian - bagian penyusun kolom. Ketika ada suatu molekul tertentu yang melewati kolom maka terjadi interaksi
antara molekul yang lewat dengan bagian – bagian penyusun kolom. Interaksi yang terjadi dipengaruhi oleh jenis kolom dan molekul yang lewat. Jika jenis
kolomnya tetap maka besar waktu retensi bergantung pada molekul yang lewat. Besar waktu retensi satu jenis molekul yang melewati kolom pada suatu
tekanan tertentu ditunjukkan oleh persamaan 2.1 di bawah ini [Willard, et. al., 1988].
Dengan v
= kecepatan linear fase gerak mlmin d
c
= diameter kolom bagian dalam µm ε = faktor porositas kolom
L = panjang kolom mm t
R
=waktu yang diperlukan oleh molekul untuk melewati kolom min
V
col
= volume kolom
Waktu retensi t
R
berbanding lurus terhadap volum kolom V
col
serta faktor porositas kolom
ε dan berbanding terbalik terhadap kecepatan fase gerak v. Kecepatan fase gerak v pada persamaan 2.1 dapat disebut juga sebagai
jumlah volume fase gerak per satuan waktu.Besar volum kolom bergantung pada ukuran kolom.Besar faktor porositas kolom bergantung pada jenis kolom
[Willard, et. al., 1988]. Laju alir berpengaruh terhadap waktu retensi, untuk laju alir yang tinggi akan didapatkan waktu retensi yang singkat sedangkan untuk laju
alir yang rendah akan didapatkan waktu retensi yang lama. Dalam proses kerja sistem HPLC digunakan tekanan. Tekanan pada
sistem HPLC dihasilkan oleh pompa.Penurunan tekanan yang terjadi pada kolom pada suatu laju alir tertentu ditunjukkan oleh persamaan 2.2 [Kuwana, 1980].
Dengan ΔP = penurunan tekanan pada kolom bar
Ø = faktor resistan kolom
η = viskositas fase gerak mbar s
L = panjang kolom mm
v = laju alir fase gerak mmmin
d
p
= diameter bagian - bagianpenyusun kolom µm
Penurunan tekanan ΔP berbanding lurus terhadap faktor resistan kolom Ø, viskositas fase gerak
η, panjang kolom L serta laju alir fase gerak v dan
berbanding terbalik terhadap kuadrat diameter bagian – bagian penyusun kolom d
p 2
.
15