High Pressure Liquid Chromatography HPLC

Contoh proses terjadinya pemisahan ditunjukkan pada gambar 2.2, misalnya ada molekul A dan B yang terdapat dalam suatu sampel, sampel tersebut dimasukkan ke dalam sistem. Kedua senyawa tersebut akan terdistribusi di antara fase gerak dan diamnya menurut sifat masing – masing. Komponen yang tertahan kuat akan berjalan lambat, sebaliknya yang tertahan lemah akan berjalan cepat. Karena perbedaan mobilitas inilah komponen – komponen sampel akan terpisah – pisah yang kemudian dapat dideteksi dan dianalisa dengan detektor. Gambar 2.2. Proses pemisahan pada kolom Sampel yang terdiri dari molekul A dan B diinjeksikan pada saat t0, sampel mulai memasuki kolom lalu pada saat t1 sampel mulai terpisah. Pada saat t2 jarak antara molekul A dan molekul B mulai terlihat, molekul B bergerak lebih cepat dibandingkan dengan molekul A. Pada saat t3 molekul B telah sampai di detektor sedangkan molekul A masih berada di dalam kolom. Pasa saat t4 molekul A baru sampai di detektor. Hasil dari proses pemisahan tersebut akan berupa grafik dengan dua puncak yang ditunjukkan oleh gambar 2.3. Masing – masing puncak mewakili molekul tertentu. Gambar 2.3. Grafik pemisahan Dilihat dari jenis fase gerak dan fase diamnya ada dua metode pemisahan pada HPLC, yaitu pemisahan fase normal dan pemisahan fase terbalik. Pada metode pemisahan fase normal, fase diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Sedangkan pada metode pemisahan fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar. Terjadinya pemisahan ditandai dengan didapatkannya waktu retensi yang berbeda antara molekul yang satu dengan yang lain. Dalam proses pemisahannya HPLC menggunakan laju alir dan tekanan tertentu. Untuk penelitian analitis pada HPLC, laju alirfase gerak yang digunakan berkisar antara 0.5 – 5 mlmin [Johnson dan Stevenson, 1991].Semakin rendah laju alirnya maka kemampuan untuk memisahkan komponen – komponen akan semakin tinggi serta menghemat penggunaan fase gerak dan waktu yang dibutuhkan untuk analisis Ke luaran de te ktor w aktu t1 t2 t3 t4 t0 Molekul Molekul A akan semakin lama. Besar waktu retensi suatu molekul dipengaruhi oleh laju alir fase gerak, tekanan, parameter kolom serta sifat – sifat molekul itu sendiri. Kolom pada HPLC tersusun atas bagian - bagian penyusun kolom. Ketika ada suatu molekul tertentu yang melewati kolom maka terjadi interaksi antara molekul yang lewat dengan bagian – bagian penyusun kolom. Interaksi yang terjadi dipengaruhi oleh jenis kolom dan molekul yang lewat. Jika jenis kolomnya tetap maka besar waktu retensi bergantung pada molekul yang lewat. Besar waktu retensi satu jenis molekul yang melewati kolom pada suatu tekanan tertentu ditunjukkan oleh persamaan 2.1 di bawah ini [Willard, et. al., 1988]. Dengan v = kecepatan linear fase gerak mlmin d c = diameter kolom bagian dalam µm ε = faktor porositas kolom L = panjang kolom mm t R =waktu yang diperlukan oleh molekul untuk melewati kolom min V col = volume kolom Waktu retensi t R berbanding lurus terhadap volum kolom V col serta faktor porositas kolom ε dan berbanding terbalik terhadap kecepatan fase gerak v. Kecepatan fase gerak v pada persamaan 2.1 dapat disebut juga sebagai jumlah volume fase gerak per satuan waktu.Besar volum kolom bergantung pada ukuran kolom.Besar faktor porositas kolom bergantung pada jenis kolom [Willard, et. al., 1988]. Laju alir berpengaruh terhadap waktu retensi, untuk laju alir yang tinggi akan didapatkan waktu retensi yang singkat sedangkan untuk laju alir yang rendah akan didapatkan waktu retensi yang lama. Dalam proses kerja sistem HPLC digunakan tekanan. Tekanan pada sistem HPLC dihasilkan oleh pompa.Penurunan tekanan yang terjadi pada kolom pada suatu laju alir tertentu ditunjukkan oleh persamaan 2.2 [Kuwana, 1980]. Dengan ΔP = penurunan tekanan pada kolom bar Ø = faktor resistan kolom η = viskositas fase gerak mbar s L = panjang kolom mm v = laju alir fase gerak mmmin d p = diameter bagian - bagianpenyusun kolom µm Penurunan tekanan ΔP berbanding lurus terhadap faktor resistan kolom Ø, viskositas fase gerak η, panjang kolom L serta laju alir fase gerak v dan berbanding terbalik terhadap kuadrat diameter bagian – bagian penyusun kolom d p 2 . 15

BAB III EKSPERIMEN

A. Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat, Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan Maguwoharjo Depok Sleman Yogyakarta.

B. Alat dan Bahan 1.

Alat – alat: a. Satu unit HPLC, yang terdiri dari:  Pompa HPLC Pompa yang digunakan adalah pompa LKB – BROMA tipe 2150. Pompa ini memiliki 2 buah kepala pompa. Fase gerak selalu bergerak melalui kedua kepala pompa dalam satu arah. Pompa ini bertugas memberikan tekanan sehingga mendorong fase gerak masuk ke dalam kolom. Tekanan tertinggi yang bisa diberikan oleh pompa ini adalah 400 bar.  Injektor Injektor merupakan tempat untuk memasukkan sampel. Sampel dimasukkan dengan cara disuntikkan. Injektor memiliki tuas dengan 2 buah kondisi yaitu LOAD dan INJECT. Sampel diinjeksikan ketika tuas berada pada posisi LOAD. Sampel akanbergerak masuk ke dalam kolom ketika tuas berada pada posisi INJECT. Injektor ini mampu menampung sampel sebanyak 20 μl.  Kolom Kolom yang digunakan adalah kolom CPTM sphere C-18 Oktadesil Silica dengan panjang 100 mm dan diameter sebesar 4,6 mm.  Detektor Detektor yang digunakan adalah detektor Spectroflow 757. Detektor ini berfungsi untuk mendeteksi molekul – molekul yang telah terpisah. Prinsip kerja detektor ini berdasarkan prinsip serapan cahaya. Detektor ini mengubah besaran cahaya menjadi besaran listrik,memiliki sumber lampu deuterium 190 nm – 380 nm dan tungsten 380 nm – 800 nm.  Perekam dan penampil data Untuk merekam dan menampilkan data digunakan recorder BD Kipp zonen. Komponen – komponen tersebutdirangkaimengikuti Gambar 3.1. Gambar 3.1.Skema rangkaian alat yang digunakan dalam eksperimen. b. Perangkat penyiapan larutan  Pipet skala dan tetes  Labu ukur  Beaker glass  Refrigerator ultrasonic UR 275  Milipore  Neraca digital

2. Bahan – bahan :

a. Methanol Methanol berfungsi sebagai fase gerak dan pelarut. pembuangan Detektor SF 757 recorder Injeksi sampel kolom injektor Pompa 2150 Fase gerak