22
1. Produksi Enzim a. Persiapan medium
Shin et al 1997; Putri 2010
Media Luria Bertani LB cair sebanyak 100 mL dibuat dengan komposisi mv 1 bacto-pepton , 1 NaCl, dan 0.5 ekstrak khamir. Limbah cair tahu
LCT diatur pH-nya menjadi 6.71-6.73 kemudian ditambahkan ekstrak khamir 0.5 g per 100 mL LCT+YE. Medium LCT dan LB disterilisasi pada temperatur
121ºC selama 15 menit.
b. Persiapan kultur E. coli transfroman
Untuk persiapan dan penyegaran, kultur E. coli transfroman sebanyak 20 µl ditumbuhkan dalam 2 ml media cair Luria Bertani LB yang mengandung 50
µgml ampisilin dan 50 µgml kloramfenikol. Selanjutnya diinkubasi selama 16 jam pada shaker inkubator 37ºC, 150 rpm. Setelah inkubasi, kultur sebanyak
800 µl dimasukkan ke dalam effendof dan ditambahkan 200 µl gliserol, kemudian disimpan pada suhu -20ºC. Setiap satu bulan dilakukan penyegaran terhadap
kultur E. coli transforman.
c. Produksi enzim dengan membandingkan medium ekspresi standar dengan medium ekspresi yang dimodifikasi
Modifikasi Cheng et al 2009
Kultur E. coli dengan umur 16 jam diinokulasikan masing-masing sebanyak 50 µl pada 5 ml medium cair LB dan medium LCT+YE. Kedua medium ekpresi
tersebut telah ditambahkan 50 µgml ampisilin dan 50 µgml kloramfenikol. Selanjutnya kultur pada medium ekpresi diinkubasi pada shaker inkubator 37ºC,
150 rpm. Setelah optical density OD kedua medium mencapai 0.5-0.6 pada panjang gelombang 600 nm maka kedua medium masing-masing dibagi menjadi
2 bagian. Untuk memisahkan perlakuan induksi dan non induksi. Induksi dilakukan dengan penambahan IPTG pada medium dengan konsentrasi akhir 1
mM, dan diinkubasi kembali selama 4 jam. Inkubasi atau waktu induksi dihentikan dengan meletakkan medium pada cairan es. Setelah itu, sel pada
medium dipanen dengan setrifugasi pada kecepatan 11,000 rpm suhu 4ºC selama
15 menit. Supernatan 1 S1 yang merupakan medium ekspresi dibuang, sedangkan pellet 1 P1 yang tertinggal ditambahkan dengan 500 µl 25 buffer
Tris HCl pH 7.5 kemudian divorteks untuk homogenisasi. Sebanyak 50 µl
23 campuran pellet dan buffer tersebut diambil dan disimpan pada lemari pendingin.
Campuran pellet 1 P1 dan buffer ini disebut juga dengan total suspensi T. Sisa total suspensi T kemudian dipisahkan kembali untuk memperoleh supernatan 2
S2 dan pellet 2 P2 seperti yang akan dijelaskan pada tahapan purifikasi.
d. Optimasi produksi enzim pada medium ekpresi terpilih
Kategori