Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan Glutation
ABSTRACT
SITI ASTUTI. Characteristic of Sheep Spermatozoa during Freezing process
with which Medium Diluents added Glutathione. Under direction NI WAYAN
KURNIANI KARJA
The aim of the study was to the characteristics of sheep spermatozoa
during the freezing process by using the added glutathione (GSH). Semen sheep
divided into 3 group: semen control group; semen was diluted edded by 1 mM
GSH; semen was diluted by NSF 3 mM. Characteristics of sheep before freezing,
after equilibration, and after freezing evaluated. Motility of spermatozoa in 3 mM
6 hours after thawing, higher than the control and 1 mM (p0.05). Plasma membrane
integrity immediately after thawing in the 1 mM GSH group higher than 3 mM
GSH group (p0.05). The addition of 3 mM glutathione to the freezing extender affected the
motility of spermatozoa after 6 hours post-thawing and the plasma membrane
integrity intact after 3 hours post-thawing.
Key word: Sheep, spermatozoa, freezing, glutathione
RINGKASAN
SITI ASTUTI. Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan
dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan Glutation. Dibimbing oleh
NI WAYAN KURNIANI KARJA.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik spermatozoa
domba selama proses pembekuan dengan menggunkan medium pengencer yang
ditambahkan glutation (GSH). Semen domba dibagi menjadi 3 kelompok yaitu
kelompok kontrol dimana semen diencerkan dengan NSF 1 tanpa penambahan
GSH, kelompok GSH 1 mM adalah kelompok semen yang diencerkan dengan
NSF 1 ditambahkan 1 mM GSH, dan kelompok GSH 3 mM adalah kelomopk
semen yang diencerkan dengan NSF1 yang ditambahkan 3 mM GSH. Evaluasi
karakteristik semen domba dilakukan sebelum pembekuan, setelah ekuilibrasi,
dan setelah pembekuan. Hanya motilitas spermatozoa pada kelompok 3 mM 6 jam
setelah thawing lebih tinggi dari kontrol dan kelompok GSH 1 mM (p0.05). Intergritas
membran plasma segera setelah thawing pada kelompok GSH 1 mM lebih tinggi
dari kelompok GSH 3 mM (p0.05). Penambahan
glutation dengan dosis 3 mM dalam medium pengencer semen domba
memberikan pengaruh yang baik terhadap motilitas spermatozoa setelah 6 jam
post-thawing dan terhadap integritas membran plasma utuh setelah 3 jam postthawing, namun tidak berpengaruh pada viabilitas dan abnormal spermatozoa.
Kata kunci: spermatozoa, domba, pembekuan, glutation
KARAKTERISTIK SPERMATOZOA DOMBA SELAMA
PROSES PEMBEKUAN DENGAN MEDIUM PENGENCER
YANG DITAMBAHKAN GLUTATION
SITI ASTUTI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul: Karakteristik
Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan dengan Medium Pengencer yang
Ditambahkan Glutation adalah benar-benar hasil karya sendiri dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya-karya yang diterbitkan maupun
yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantum
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, September 2012
Siti Astuti
NIM B04080201
ABSTRACT
SITI ASTUTI. Characteristic of Sheep Spermatozoa during Freezing process
with which Medium Diluents added Glutathione. Under direction NI WAYAN
KURNIANI KARJA
The aim of the study was to the characteristics of sheep spermatozoa
during the freezing process by using the added glutathione (GSH). Semen sheep
divided into 3 group: semen control group; semen was diluted edded by 1 mM
GSH; semen was diluted by NSF 3 mM. Characteristics of sheep before freezing,
after equilibration, and after freezing evaluated. Motility of spermatozoa in 3 mM
6 hours after thawing, higher than the control and 1 mM (p0.05). Plasma membrane
integrity immediately after thawing in the 1 mM GSH group higher than 3 mM
GSH group (p0.05). The addition of 3 mM glutathione to the freezing extender affected the
motility of spermatozoa after 6 hours post-thawing and the plasma membrane
integrity intact after 3 hours post-thawing.
Key word: Sheep, spermatozoa, freezing, glutathione
RINGKASAN
SITI ASTUTI. Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan
dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan Glutation. Dibimbing oleh
NI WAYAN KURNIANI KARJA.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik spermatozoa
domba selama proses pembekuan dengan menggunkan medium pengencer yang
ditambahkan glutation (GSH). Semen domba dibagi menjadi 3 kelompok yaitu
kelompok kontrol dimana semen diencerkan dengan NSF 1 tanpa penambahan
GSH, kelompok GSH 1 mM adalah kelompok semen yang diencerkan dengan
NSF 1 ditambahkan 1 mM GSH, dan kelompok GSH 3 mM adalah kelomopk
semen yang diencerkan dengan NSF1 yang ditambahkan 3 mM GSH. Evaluasi
karakteristik semen domba dilakukan sebelum pembekuan, setelah ekuilibrasi,
dan setelah pembekuan. Hanya motilitas spermatozoa pada kelompok 3 mM 6 jam
setelah thawing lebih tinggi dari kontrol dan kelompok GSH 1 mM (p0.05). Intergritas
membran plasma segera setelah thawing pada kelompok GSH 1 mM lebih tinggi
dari kelompok GSH 3 mM (p0.05). Penambahan
glutation dengan dosis 3 mM dalam medium pengencer semen domba
memberikan pengaruh yang baik terhadap motilitas spermatozoa setelah 6 jam
post-thawing dan terhadap integritas membran plasma utuh setelah 3 jam postthawing, namun tidak berpengaruh pada viabilitas dan abnormal spermatozoa.
Kata kunci: spermatozoa, domba, pembekuan, glutation
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 11 Agustus 1989 di Jayapura-Papua.
Penulis merupakan anak kedua dari enam bersaudara dari pasangan Bapak Patong
dan Ibu Supenti.
Penulis menempuh pendidikan yang dimulai dari pendidikan dasar (SD)
dan lulus pada tahun 2001 di SDN 01 Arsopura, Distrik Skanto Kabupaten
Keerom. Pendidikan lanjutan menengah pertama (SMP) diselesaikan Penulis pada
tahun 2004 di SMPN 02 Arso Distrik Skanto Kabupaten Keerom. Pendidikan
lanjutan menengah atas (SMA) diselesaikan pada tahun 2007 di SMAN 02 Distrik
Skanto, Kabupaten Keerom. Penulis diterima menjadi mahasiswa di Institut
Pertanian Bogor pada tahun 2008 melalui jalur Beasiswa Undangan Daerah
(BUD) dan pada tahun berikutnya. Penulis diterima sebagai mahasiswa
kedokteran hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif pada beberapa organisasi
kemahasiswaan seperti organisasi mahasiswa daerah (OMDA) Papua sebagai
anggota, Himpro Ruminansia sebagai anggota sub divisi pendidikan (2009-2010),
dan Ikatan Mahasiswa Kedokteran Hewan Indonesia (IMAKAHI) cabang IPB
sebagai anggota sub divisi zoonosis (2010-2011).
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penulisan skripsi yang berjudul Karakteristik Spermatozoa Domba
Selama Proses Pembekuan dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan
Glutation dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada;
1. Drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP,Ph.D sebagai dosen pembimbing yang
telah memberikan bimbingan, saran, dan motivasi.
2. Hibah bersaing Institut Pertanian Bogor No. 15/13.24.4/SPP/PHB/2011
yang membiayai penelitian ini.
3. Seluruh dosen pengajar Fakultas Kedokteran Hewan atas semua ilmu yang
telah bapak dan ibu berikan kepada Penulis
4. Laboratorium Fertilisasi In Vitro dan Unit Rehabilitas Reproduksi (URR)
Fakultas Kedokteran Hewan, IPB berserta segenep staf.
5. Pemerintah Daerah Kabupaten Keerom atas dukungan financial selama
Penulis menempuh studi di IPB.
6. Bapak, Ibu, kakak dan adik-adik (Eva, Ali, Midah, Nanda, Gilang), serta
sahabat dekat (Saenal) terima kasih atas doa dan semangat yang diberikan.
7. Teman sepenelitian Dhia, serta kakak S2 (Ari dan Fitrah) terima kasih atas
bantuan dan semangat yang diberikan.
8. Sahabat-sahabatku (Burki, Hastin, Nisa, Gita, Sri, Ana, Ruri, dan Afifah)
terima kasih atas doa dan semangat yang diberikan.
9. Rekan- rekan Avenzoar 45 yang tidak bisa disebutkan satu-persatu.
10. Teman-teman Matoa House (Dika, Dian, Neni, Wiwi, Resa, Clara) terima
kasih atas doa dan dukunganya.
11. Teman-teman BUD Keerom (Zack, Iwan, Irma, Abia) terima kasih atas
doa dan dukungannya.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini jauh dari sempurna, untuk itu penulis
mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. Penulis berharap agar skripsi ini
bermanfaat bagi pihak-pihak yang membutuhkan dan dapat menambah ilmu
pengetahuan.
Bogor, September 2012
Siti Astuti
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
KARAKTERISTIK SPERMATOZOA DOMBA SELAMA
PROSES PEMBEKUAN DENGAN MEDIUM PENGENCER
YANG DITAMBAHKAN GLUTATION
SITI ASTUTI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi
Nama
NRP
: Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses
Pembekuan dengan Medium Pengencer yang
Ditambahkan Glutation
: Siti Astuti
: B04080201
Disetujui,
drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP, Ph.D
Pembimbing
Diketahui,
drh. H. Agus Setiyono, MS, Ph.D, APVet
Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Tanggal lulus:
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL…………………………………………………………...
xii
DAFTAR GAMBAR………………………………………………………..
xiii
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………..
xiv
PENDAHULUAN
Latar Belakang…………………………………………………………....
Tujuan…………………………………………………………………….
Hipotesa Penelitian……………………………………………………….
1
2
2
TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Semen……………………………………………………...
Spermatozoa……………………………………………………………...
Pembekuan Semen………………………………………………………..
Pengenceran Semen………………………………………………………
Laktosa………………………………………………………………..
Kuning Telur………………………………………………………….
Gliserol……………………………………………………………….
Antibiotik……………………………………………………………..
Reactive Oxygen Species (ROS)…………………………………………
Glutation………………………………………………………………….
3
3
4
5
5
6
6
7
7
8
BAHAN DAN METODE
Waktu Penelitian ………………………………………………………....
Alat dan Bahan……………………………………………………….......
Metode Penelitian
Persiapan Bahan Pengencer…………………………………………..
Koleksi Spermatozoa…………………………………………………
Kriopreservasi Spermatozoa………………………………………….
Evaluasi Karakteristik Spermatozoa Domba……………………………..
Penilaian Motilitas Spermatozoa………………………………………....
Penilaian Integritas Membran Plasma Spermatozoa…………………......
Penilaian Viabilitas dan Morfologi Abnormalitas Spermatozoa…………
Analisis Data………………………………………………………….......
10
10
10
10
11
11
12
12
12
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Semen Domba Segera Setelah Koleksi………………….....
Persentase Motilitas Spermatozoa……………………………………......
Persentase Integritas Membran Plasma Spermatozoa……………………
Persentase Viabilitas Spermatozoa……………………………………….
Persentase Morfologi Abnormal Spermatozoa…………………………...
14
15
16
18
20
SIMPULAN DAN SARAN…………………………………………………
22
x
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………....
23
LAMPIRAN………………………………………………………………....
27
xi
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Karakteristik semen segera setelah koleksi………………………………
14
2
Persentase motilitas spermatozoa domba selama proses pembekuan……
15
3
Persentase integritas membran plasma spermatozoa selama proses
17
pembekuan………………………………………………………………..
4
Persentase viabilitas spermatozoa selama proses pembekuan………...... 19
5
Persentase abnormal spermatozoa domba selama proses pembekuan…...
20
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Integritas membran plasma spermatozoa domba……………………... 18
2
Spermatozoa dengan pewarnaan eosin-nigrosin……………………… 19
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
Hasil uji data motilitas……………………………………………...
Hasil uji data integritas membran plasma……………………….....
Hasil uji data viabilitas…………………………………………......
Hasil uji data abnormalitas…………………………………………
28
29
30
31
xiv
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu faktor penyebab kegagalan dalam program inseminasi buatan
(IB) ialah kualitas semen yang digunakan untuk IB. Beberapa faktor yang dapat
mempengaruhi kualitas semen setelah dibekukan adalah pengelolahan semen,
pemilihan jenis pengencer, dan pemilihan jenis krioprotektan (Herdis et al. 2003).
Dalam pengolahan semen harus dilakukan seoptimal mungkin sehingga
kualitasnya dapat dipertahankan. Kontak antara spermatozoa dan udara yang
mengandung oksigen selama koleksi dan pengolahan semen dapat mengakibatkan
peningkatan aktivitas metabolisme oksidatif di dalam sel, sebagai akibatnya
konsentrasi radikal bebas sebagai salah satu produk metabolismenya juga akan
meningkat (Holt 2000).
Selama proses pembuatan semen beku yang meliputi proses pendinginan,
pembekuan dan thawing juga dapat mengakibatkan kerusakan fisik dan kimia
pada membran sel spermatozoa yang dapat mempengaruhi kelangsungan hidup
sperma dan motilitasnya. Selama proses pembekuan, selain akan terjadi
perubahan suhu dan tekanan osmotik (Baumber et al. 2003), juga terjadi
peroksidasi lipida dan setelah proses pembekuan aktivitas peroksida lipida
meningkat pada bagian
tengah membran (midpiece) (Gadea et al. 2007).
Meningkatnya peroksida lipida diawali dengan terbentuknya reactive oxygen
species (ROS) (Gadella 2008). Reactive oxygen species atau radikal bebas adalah
molekul yang elektronnya terletak pada lapisan paling luar, tidak mempunyai
pasangan dan molekul ini sangat reaktif mempunyai spesifitas yang rendah dan
mampu bereaksi dengan molekul-molekul disekitarnya. Radikal bebas sangat
berbahaya bagi kelangsungan hidup spermatozoa karena dapat mengambil
elektron dari asam lemak tak jenuh fosfolipid membran plasma sel. Jika tidak
dicegah dapat mengakibatkan reaksi rantai peroksida lipid yang berlangsung
terus-menerus dan dapat merusak seluruh membran plasma spermatozoa (Holt
2000). Banyak studi yang telah dilakukan untuk meminimalkan kerusakan
tersebut diantaranya adalah dengan penambahan antioksidan ke dalam bahan
pengencer semen.
2
Antioksidan merupakan senyawa yang bersifat nukloephilik yang dapat
memutuskan atau menekan reaksi radikal bebas dan mampu untuk mengakhiri
siklus reaksi (Hammersdet 1993). Glutation (GSH) merupakan salah satu senyawa
antioksidan berupa komponen sulfihidril non-protein di dalam sel yang dapat
menetralisirkan radikal bebas hidroksil yang sangat reaktif yang menyebabkan
terjadinya peroksidasi lipid pada membran sel (Holt 2000). Fungsi dasar GSH
dalam sperma mamalia sebagai mekanisme pencegahan ROS dan membantu
melawan efek stres dari oksidatif dalam sperma (Luberda 2005).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik spermatozoa domba
selama proses pembekuan dengan medium pengencer yang ditambahkan GSH.
Hipotesa Penelitian
Penambahan GSH dalam medium pengencer semen domba dapat
mempertahankan kualitas spermatozoa (motilitas, membran plasma utuh,dan
viabilitas) selama proses pembekuan.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Semen
Semen merupakan cairan yang mengandung spermatozoa dan plasma semen
yang dihasilkan dari sekresi oleh kelanjar-kelanjar kelamin jantan (Herdis et al.
2003). Adapun perbedaan warna, konsistensi, dan konsentrasi dari semen
mempunyai hubungan yang erat satu sama lain. Warna semen domba yang normal
berwarna krem, derajat kekeruhan tergantung atas konsentrasi spermatozoa yang
dikandung. Semen domba normal mempunyai konsistensi yang kental.
Konsistensi atau derajat kekentalan dapat dilihat dengan cara menggoyangkan
tabung penampung berisi semen segar secara perlahan. Semen dengan konsistensi
kental akan terlihat pada saat memiringkan tabung gelas penampung dan
selanjutnya kembali pada posisi normal, maka proses kembalinya larutan semen
tersebut ke posisi tegak akan lama, dibandingkan dengan semen dengan
konsistensi encer (Rasad 2011). Selain itu, derajat keasaman (pH) juga sangat
menentukan status kehidupan spermatozoa di dalam semen. Derajat keasaman
pada domba berkisar 5.7- 7.3. Semakin rendah atau semakin tinggi pH semen dari
pH normal akan membuat spermatozoa lebih cepat mati (Suyadi et al. 2004).
Secara mikroskopis, semen yang berkualitas baik adalah mempunyai gerakan
masa dan motilitas dengan daya gerak maju yang progresif. Semakin aktif dan
semakin banyak spermatozoa yang bergerak ke depan, maka gerakan massa akan
semakin baik (Sujoko et al. 2009).
Spermatozoa
Tempat pembentukan spermatozoa terjadi di testis bagian tubulus
seminiferus. Spermatozoa merupakan hasil akhir dari sel kelamin jantan yang
telah mengalami pendewasaan. Proses pembentukan spermatozoa di dalam
tubulus seminiferus dikenal dengan nama spermatogenesis. Spermatogenesis
dibagi dalam dua fase yaitu 1) spermatositogenesis, dimana spermatogania
mengalami pembelahan secara mitosis dan meiosis. Pembelahan secara mitosis
yang menghasilkan keturunan sel yang disebut dengan spermatosit, sedangkan
pembelahan meiosis, dimana spermatosit akan mengalami dua pembelahan,
4
pengurangan setengah jumlah kromosom, dan pengurangan jumlah deoxyribo
nucleid acid (DNA) per sel sehingga menghasilkan spermatid dan 2)
spermiogenesis, dimana spermatid akan berubah menjadi spermatozoa (Schatten
& Constantinescu 2007).
Secara normal spermatozoa terdiri dari kepala dan ekor yang diselaputi oleh
membran sel, yang mempunyai struktur sangat kompleks dalam susunan mozaik
yang teratur dan memiliki peran biologik spesifik pada permukaannya (Jones et al
1993). Membran sel berfungsi untuk mempertahankan integritas sel dan
membentuk interfase dinamis antara sel dengan lingkungan sekitarnya (Schatten
& Constantinescu 2007). Secara umum membran spermatozoa tersusun dari lipid,
protein dan karbohidrat serta zat lain yang bergabung bersama secara non kovalen
dan sangat sensitif terhadap faktor-faktor ekstrinsik seperti suhu, kekuatan ionik
dan polaritas pelarut (Kelso et al. 1997). Lipid merupakan komponen utama
penyusun struktur membran spermatozoa, yang berperan penting dalam menjaga
stabilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa secara keseluruhan, termasuk
kemampuan spermatozoa untuk mengkapasitasi serta membuahi sel telur (Darnell
et al. 1990). Membran akrosom pada kepala sperma berfungsi untuk kapasitasi,
reaksi akrosom dan penembusan ovum pada proses fertilisasi. Membran bagian
belakang akrosom (post acrosomal region) berfungsi untuk mengadakan kontak
pertama dan menjadi satu dengan oolema ovum pada proses fertilisasi, sedangkan
membran pada bagian tengah (midpiece) ekor berfungsi untuk mendapatkan
substrat untuk energi spermatozoa dan menghantarkan gelombang gerak, serta
membran bagian utama (principle piece) berfungsi untuk pergerakan spermatozoa.
Pada bagian luar membran plasma sel terdapat karbohidrat yang berikatan dengan
lipid (glikolipid) atau dengan protein (glikoprotein) yang disebut selubung sel
(Schatten & Constantinescu 2007).
Pembekuan Semen
Manfaat dari keberhasilan program kriopreservasi atau pembekuan
spermatozoa adalah untuk melestarikan plasma nutfah yang mendekati kepunahan
dan mendukung program teknologi IB pada ternak (Gazali & Tambing 2002).
Salah satu parameter dari keberhasilan program kriopreservasi spermatozoa selain
5
dilihat dari kualitas semen setelah thawing tetapi juga dari jumlah spermatozoa
yang berhasil pulih dari proses pembekuan yang di sebut recovery rate
(Arifiantini et al. 2007). Dalam proses pembekuan semen adanya hambatan yang
disebabkan oleh kejutan dingin (cold shock) dan perubahan interaseluler akibat
pengeluaran air dari sel dan terbentuknya kristal-kristal es (Herdis et al. 2003)
akan menyebabkan kerusakan sel. Kejutan dingin terjadi karena adanya
penurunan suhu yang cepat sampai di bawah 0 ºC sehingga menurunkan viabilitas
sel. Pengaruh utama dari kejutan dingin terhadap sel spermatozoa ialah penurunan
motilitas dan daya hidup, sedangkan pembentukan kristal es dalam proses
kriopreservasi menyebabkan menumpuknya elekrolit di dalam sel. Penumpukan
elektrolit akan merusak dinding sel spermatozoa saat pencairan kembali sehingga
permeabilitas membran plasma menurun dan menyebabkan kematian sel (Watson
2000).
Pengenceran Semen
Pengencer semen merupakan larutan yang bersifat isotonis yang memiliki
tekanan osmotik sama dengan plasma darah. Dalam pengencer semen terkandung
bahan-bahan yang bersifat buffer, mengandung bahan nutrisi untuk kelangsungan
hidup bagi spermatozoa, dan mampu melindungi dari cold shock (Herdis et al.
2003). Adapun menurut Bearden & Fuquay (1997) pengencer semen memiliki
beberapa syarat yang telah ditetapkan yaitu 1) bersifat isotonis terhadap semen, 2)
memiliki kemampuan sebagai penyangga sehingga dapat mempertahankan
sperma terhadap perubahan pH, 3) dapat melindungi sperma dari cekaman dingin
selama proses ekuilibrasi, pendinginan, dan pembekuan, 4) mengandung nurtisi
untuk proses metabolisme sperma, 5) mengandung antibiotik untuk mencegah
kontaminasi bakteri.
Laktosa
Laktosa adalah salah satu karbohidrat golongan disakarida yang terdiri atas
dua unit monosakarida, yakni satu unit glukosa dan satu unit galaktosa yang
keduanya dapat dimetabolisme oleh spermatozoa melalui glikolisis dan siklus
Krebs untuk menghasilkan energi berupa adenosin trifosfat (ATP) (Souhoka et al.
6
2009). Adenosin trifosfat dimanfaatkan oleh spermatozoa sebagai sumber energi
dalam proses pergerakan sehingga dapat tetap motil dan sekaligus untuk
mempertahankan daya hidupnya. Menurut Lehninger (1994) laktosa merupakan
salah satu senyawa pereduksi dan memiliki struktur yang stabil. Sebagai senyawa
pereduksi,
laktosa
memiliki
fungsi
untuk
meredam
senyawa-senyawa
pengoksidasi, sehingga berperan dalam meminimumkan terjadinya reaksi
oksidasi. Laktosa juga dapat berfungsi sebagai krioprotektan ekstraseluler yang
berperan dalam melindungi spermatozoa selama pembekuan (Rizal et al. 2003),
laktosa dapat melindungi membran plasma sel spermatozoa dari kerusakan secara
mekanik selama proses pengolahan semen, terutama saat pendinginan, freezing
dan thawing (Molinia et al. 1994). Menurut Maxwell & Salamon (2000) laktosa
lebih efektif dalam menurunkan suhu kristalisasi selama pembekuan dibandingkan
dengan golongan monosakarida lainnya, sehingga pembentukan kristal es dapat
diminimalkan.
Kuning Telur
Kuning telur berfungsi sebagai sumber energi dan agen protektif (Souhoka
et al. 2009). Kuning telur mengandung glukosa sebagai sumber energi bagi
spermatozoa disamping protein dan vitamin-vitamin yang larut dalam air atau
minyak (Gazali & Tambing 2002). Kandungan lechitin dalam kuning telur,
lechitin dapat melindungi membaran plasma sel spermatozoa dari kejutan dingin
(cold shock) saat semen disimpan pada suhu dingin (Sudaryani 2003). Selain itu,
kuning telur juga mampu mempertahankan dan melindungi integritas selubung
lipoprotein sel spermatozoa (Paulenza et al. 2002).
Gliserol
Krioprotektan ialah zat kimia nonelektrolit yang berperan dalam
mengurangi pengaruh mematikan selama pembekuan baik berupa pengaruh
larutan maupun adanya pembentukan kristal es sehingga viabilitas sel dapat
dipertahankan. Dalam proses preservasi semen terjadi kejutan dingin yang dapat
merusak membran sel spermatozoa dan bisa menyebabkan kematian spermatozoa.
(Souhoka et al. 2009). Krioprotektan yang sering digunakan dalam pembekuan
7
semen adalah gliserol karena mampu mengikat air yang cukup kuat dengan tiga
gugus hidroksil yang dimilikinya. Gliserol dapat berdifusi ke dalam sel lebih
cepat, mampu mengubah kristal es yang berukuran besar dan tajam, dan
melenturkan membran sel sehingga tidak mudah rapuh, serta gliserol dapat
mengurangi daya merusaknya terhadap spermatozoa dengan jalan memodifikasi
kristal es yang terbentuk (Supriatna & Pasaribu 1992).
Walaupun
gliserol
dapat
memberikan
perlindungan
terhadap
sel
spermatozoa, namun dapat juga merusak struktur spermatozoa selama proses
pembekuan semen, menyebabkan kejutan osmotik, dan menurunkan nilai
antibiotika dalam pengencer semen, serta menurunkan volume sel sperma
sebanyak setengah dari volume larutan isotonik sesudah pencairan kembali. Oleh
karena itu, kandungan gliserol di dalam pengencer semen bergantung pada
metode pendinginan atau pembekuan, komposisi pengencer, dan cara penambahan
(Gazali & Tambing 2002).
Antibiotik
Perlunya penambahan antibiotik dalam pengencer semen domba. Biasanya
antibiotik yang sering digunakan dalam penambahan bahan pengencer semen
beku antara lain gentamycin, lincomycin, spectinomycin, streptomycin, dan
penisilin. Penambahan antibiotik dalam pengencer dimaksudkan untuk mencegah
pertumbuhan mikroorganisme (Hafez 2000).
Reactive Oxygen Species (ROS)
Reactive oxygen species merupakan senyawa yang secara alamiah
diproduksi dalam metabolise seluler. Produksi ROS berlebih disebabkan karena
ketersedian oksigen dalam jumlah banyak yang terdapat dalam spermatozoa. Hal
ini dapat menimbulkan kerusakan spermatozoa akibat peroksidasi lipid.
Peroksidasi lipid ditimbulkan karena adanya radikal bebas. Bebarapa contoh
radikal-radikal bebas tersebut ialah superoksida, hidoksil, dan peroksil. Radikalradikal bebas tersebut bersifat sangat reaktif dan bila bereaksi dengan asam lemak
tak jenuh akan membentuk peroksidasi lipid (Gazali & Tambing 2002). Reaksi
peroksidasi lipid ini sangat berbahaya bagi kelangsungan hidup spermatozoa
8
dikarenakan merusak bagian dari membran plasma sel dan dapat mengakibatkan
kematian spermatozoa (Holt 2000). Selain itu, peroksidasi lipid yang terjadi
secara terus-menerus dapat menyebabkan ketidak stabilan membran, mengubah
viskositas membran, dan merangsang aktivitas fosfolipase A2 (Gazali & Tambing
2002).
Pada sel mamalia efek toksik yang disebabkan oleh perokidasi lipid ialah
menghambat metabolisme oksidatif, menghambat proses glikolisis, menghambat
kerja enzim sulfhidril, dan menyebabkan denaturasi DNA. Ciri kerusakan sel
spermatozoa akibat peroksida lipid ialah rendahnya motilitas spermatozoa,
kerusakan enzim intraseluler, dan kerusakan membran plasma terutama bagian
akrosom (White 1993).
Glutation
Glutation mempunyai kandungan senyawa molekul tiol tripeptida terdiri
dari tiga asam amino yaitu, L-glutamin, L-cystien, dan L-glysin (Luberda 2005).
Glutation merupakan antioksidan yang mempunyai potensi melindungi sistem
biologi akibat adanya suatu proses atau reaksi yang merugikan dengan jalan
mereduksi dan menekan reaksi radikal bebas (Hammersdet 1993). Glutation
merupakan antioksidan primer yang berfungsi untuk mencegah pembentukan
radikal bebas baru, glutation berkerja dengan mengubah radikal bebas baru
menjadi molekul yang kurang berdampak negatif sebelum radikal bebas tersebut
mempunyai kesempatan untuk bereaksi (Wijaya 1996). Menurut Sugiyanta (2007)
Glutation
digunakan
mendetoksikasi
sebagai
peroksida
dari
kofaktor
serangan
oleh
enzim
radikal
peroksidase
bebas
molekuler
untuk
dan
transhydrogenase untuk mengurangi oksidasi pada DNA, protein, dan
biomolekuler lainya. Glutation peroksidase dapat membentuk pertahanan terhadap
oksidan atau radikal bebas di dalam tubuh dan mencegah kerusakan sel dengan
cara mengkatalisa peroksida menjadi air dan oksigen. Glutation yang
didistribusikan ke dalam sel, mempunyai peranan penting dalam mekanisme
pertahanan interseluler terhadap stres oksidatif yang disebabkan oleh produksi
ROS berlebih selama proses pembekuan dan thawing spermatozoa (Ansari et al.
2010). Lebih lanjut dilaporkan oleh Ansari et al (2010), bahwa penambahan GSH
9
kedalam semen kerbau dapat meningkatkan kualitas spermatozoa setelah postthawing (motilitas, viabilitas, dan intergritas sperma). Sedangkan Bilodeau et al.
(2001) dan Gadea et al. (2007) melaporkan bahwa penambahan GSH dalam
pengencer semen sapi berperan menjaga kualitas semen.
10
BAHAN DAN METODE
Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli sampai dengan bulan September
2011. Kegiatan ini dilakukan di Laboratorium Fertilitas In Vitro, Unit Rehabilitas
Reproduksi (URR), Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, gelas ukur,
Erlenmeyer, kertas saring, timbangan mikro, pipet tetes, pipet mikro, vagina
buatan dan perlengkapannya, pH meter, bunsen, kontainer nitrogen cair,
waterbath, lemari es, styrofoam, gelas objek, cover glas, mikroskop cahaya,
straw, dan syringe. Bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu, semen domba,
Pengencer Niwa dan Sasaki Freezing (NSF), medium fertilisasi in vitro dan N2
cair.
Metode Penelitian
Persiapan Bahan Pengencer
Komposisi bahan pengencer yang digunakan dalam penelitian ini adalah
medium NSF yang terdiri dari NSF I dan NSF II. NSF I mengandung 20% (v/v)
kuning telur, 8.8% (w/v) laktosa dan 200 μg/ml ampicilin, glutation 1 mM atau 3
mM, sedangkan NSF II terdiri dari 92.42% (v/v) medium NSF I tanpa glutation,
1.48% (v/v) Orvus Es Paste (OEP), 6% (v/v) gliserol, glutation 1 mM atau 3 mM.
Koleksi Spermatozoa
Semen diperoleh dari dua domba jantan yang sudah dewasa kelamin.
Penampungan semen dilakukan dengan menggunakan vagina buatan yang terbuat
dari karet khusus yang dilengkapi dengan inner liner pada bagian dalamnya untuk
selanjutnya diberi air dengan suhu 40-42 °C dan udara melalui katup, diberi
pelumas dengan kedalaman tidak lebih dari 3 cm sehingga vagina buatan
menyerupai kondisi sebenarnya, kemudian pada salah satu bagian ujung vagina
buatan dipasang tabung penampung semen. Segera setelah koleksi, semen dibawa
11
ke laboratorium untuk di proses. Sebelum proses pembekuan semen dilakukan,
terlebih dahulu dilakukan evaluasi terhadap karakteristik semen yang meliputi
pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis. Pemeriksaan makroskopis terdiri dari
pemeriksaan terhadap volume semen, pH, warna, dan konsistensi, sedangkan
pemeriksaan mikrososkopis meliputi pemeriksaan terhadap motilitas, viabilitas,
membran plasma utuh (MPU), dan morfologi abnormal spermatozoa.
Kriopreservasi Spermatozoa
Kriopreservasi merupakan suatu teknik penyimpanan spermatozoa dalam
keadaan beku (suhu -196 ºC). Semen dibagi menjadi 3 kelompok yaitu; kelompok
K adalah kelompok kontrol dimana semen diencerkan dengan NSF I tanpa
penambahan GSH; kelompok GSH 1 mM adalah kelompok semen yang
diencerkan dengan NSF I ditambah 1 mM GSH; dan kelompok GSH 3 mM
adalah kelompok semen yang diencerkan dengan NSF I yang ditambah 3 mM
GSH. Semen dari setiap kelompok semen diekuilibrasi pada suhu 4 ºC selama 2
jam. Pada akhir dari waktu ekuilibrasi, setiap kelompok semen kemudian
ditambahkan NSF II, dan selanjutnya diekulibrasi kembali pada suhu yang sama
selama 5 menit. Perbandingan penambahan medium NSF I dengan NSF II sebesar
1:1 dengan konsentrasi akhir setelah penambahan medium NSF II adalah 100 x
106 spermatozoa/ml. Spermatozoa segera dimasukkan ke dalam straw berukuran
0.25 ml (IMV, France), kemudian diletakkan pada sebuah styrofoam plate dalam
uap nitrogen selama 20 menit sebelum dimasukkan ke dalam nitrogen cair.
Thawing dilakukan dengan cara meletakkan straw di udara pada suhu kamar
selama 30 detik, kemudian mencelupkannya ke dalam bak berisi air pada
temperatur 37 ºC selama 30 detik, kemudian spermatozoa dimasukkan ke dalam
medium pengencer IVF diinkubator 5% C02 temperatur 38.5 ºC. Dilakukan
evaluasi terhadap karakteristik spermatozoa setelah thawing (post-thawing).
Pemeriksa post-thawing dilakukan pada waktu 0 jam, 3 jam, dan 6 jam.
Evaluasi Karakteristik Spermatozoa Domba
Evaluasi karakteristik semen domba dilakukan sebelum pembekuan, setelah
ekulibrasi, dan setelah pembekuan. Pemeriksaan yang dilakukan meliputi
12
motilitas progresif spermatozoa, integritas fungsional dari membran spermatozoa
dengan hypoosmotic swelling test (HOS-Test), serta viabilitas dan morfologi
abnormal spermatozoa yang dideterminasi dengan pewarnaan eosin-negrosin.
Penilaian Motilitas Spermatozoa
Penilaian persentase motilitas spermatozoa ditentukan dengan cara
menempatkan satu tetes spermatozoa yang telah diencerkan dengan larutan 0.9%
NaCl pada gelas objek yang ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan terhadap
spermatozoa yang bergerak progresif dilakukan secara subjektif pada enam lapang
pandang yang berbeda di bawah mikroskop dengan pembesaran 400 X. Penilaian
berdasarkan persentase mulai dari nol sampai seratus persen.
Penilaian Integritas Membran Plasma Spermatozoa
Penilaian persentase integritas membran plasma spermatozoa diperiksa
menggunakan HOS-Test dengan komposisi larutan HOS untuk 10 ml air mili-Q
ditambahkan dengan 0.135 g fruktosa dan 0.0735 g trisodium citat 2H2O. Sampel
semen sebanyak 20 μl diencerkan dengan 80 μl larutan HOS dan dibiarkan selama
10 menit pada suhu kamar. Sepuluh μl sampel semen diletakkan pada gelas objek
yang ditutup dengan gelas penutup dan evaluasi dilakukan di bawah mikroskop
dengan perbesaran 400 X. Perhitungan dilakukan pada lima kotak teracak
terhadap spermatozoa yang mempunyai ekor melingkar (membran plasma utuh)
maupun yang mempunyai ekor lurus (membran plasma tidak utuh).
Penilaian Viabilitas dan Morfologi Abnormalitas Spermatozoa
Penilaian viabilitas dan abnormal spermatozoa dengan menggunakan
metode pewarnaan eosin-negrosin. Sebanyak 10 μl sampel semen dan 40 μl eosinnegrosin dicampurkan di atas gelas obyek kemudian dibuat preparat ulas dan
dikeringkan menggunakan bunsen selama 15 detik sebelum dilakukan
pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 X. Perhitunggan
dilakukan secara pandangan berbeda sampai jumlah spermatozoa 200.
Spermatozoa yang mati akan menyerap zat warna sehingga bagian kepala akan
terlihat merah, spermatozoa hidup ditandai dengan bagian kepala tidak terwarnai
13
sehingga terlihat transparan, dan spermatozoa yang mempunyai morfologi
abnormal bisa dilihat bagian kepala lebih besar dibandingkan dengan spermatozoa
yang lain serta bagian kepala dan ekor bercabang.
Analisis Data
Penelitian ini dirancang dengan menggunkan rancangan acak lengkap
(RAL) dengan tiga perlakuan dan empat kali pengulangan. Data dianalisis
menggunkan uji Anova.
14
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Semen Domba Segera Setelah Koleksi
Pemeriksaan karakteristik semen domba segera setelah koleksi yang
dilakukan dalam penelitian ini meliputi pemeriksaan secara makroskopis dan
mikroskopis. Hasil pemeriksaan karakteristik semen domba segera disajikan pada
Tabel 1.
Tabel 1 Karakteristik semen segar setelah koleksi
Karakteristik
Rata-rataan
Warna
Kosistensi
Volume (ml)
pH
Putih susu- Kream
Kental
0.63±0.25
6.8± 0.12
Motilitas (%)
Viabilitas (%)
Abnormal (%)
MPU (%)
75±0
82.3±6.18
1.2 ± 1.07
88.8 ± 4.26
Makroskopis
Mikroskopis
Hasil pemeriksaan makroskopis menunjukan warna semen domba berwarna
putih susu-krem, hal ini sesuai dengan penelitian Qomariyah et al. (2001) yang
menyatakan warna semen domba berwarna putih susu atau krem. Konsistensi dari
semen domba yang diperoleh dari penelitian ini mempunyai konsistensi yang
kental sama halnya dengan penelitian Hastono et al. (2001). Menurut Garner &
Hafez (2000) volume semen domba perejakulasi berkisar 0.8- 1.2 ml, sehingga
dilihat dari hasil yang diperoleh volume semen dalam penelitian ini lebih rendah.
Adanya perbedaan volume semen bisa dikarenakan oleh perbedaan umur, ukuran
badan, tingkat makanan, frekuensi penampungan, dan cara penampungan
(Murtidjo 1993). Derajat keasaman (pH) dalam penelitian ini masih dalam kisaran
normal nilai semen domba yaitu 5.9-7.3 (Garner & Hafez 2000).
Hasil evaluasi pemeriksaan semen domba secara mikroskopis diperoleh
persentase motilitas 75± 0, dengan persentase rataan dari viabilitas semen domba
pada penelitian ini 82.3± 6.18. Sedangkan persentase abnormal dari semen domba
15
yang diperoleh dari penelitian ini adalah 1.2 ± 1.07. Menurut Garner & Hafez
(2000) bahwa kisaran abnormal spermatozoa domba antara 5-20%, sehingga
dilihat dari hasil penelitian ini maka nilai abnormal spermatozoa yang didapatkan
masih di bawah kisaran normal. Hasil rata-rataan persentase MPU pada penelitian
ini 88.8 ± 4.26. Dari hasil evaluasi tersebut di atas, semen domba yang dikoleksi
layak untuk dibekukan karena memenuhi syarat motilitas progresif lebih dari 65%
dan abnormalitas kurang dari 20%.
Persentase Motilitas Spermatozoa
Motilitas spermatozoa berperan dalam penentuan kualitas semen karena
berkaitan erat dengan kemampuan spermatozoa untuk fertilisasi. Pengukuran
persentase motilitas dilakukan secara subjektif yang dilihat di bawah mikroskop
dengan perbesaran 400 X dengan cara membandingkan spermatozoa yang
bergerak progresif dengan semua spermatozoa yang teramati dinyatakan dalam
nilai persentase dari nol sampai seratus persen (0-100%) (Bearden et al. 2004).
Persentase motilitas spermatozoa domba selama proses pembekuan dalam
penelitian ini disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2 Persentase motilitas spermatozoa domba selama proses pembekuan
Kelompok
Persentase motilitas± SD
Setelah
ekuilibrasi
0 jam
K
Segera
setelah
diencerkan
75±0
67.5±2.9
38.8±2.5
30±0
21.3±6.3a
GSH 1 mM
75±0
71.1±2.5
42.5±2.9
33.8±2.5
22.5±2.9a
GSH 3 mM
75±0
71.1±2.5
40±4.1
33.8±2.5
28.8±4.8b
Post -thawing
3 jam
6 jam
Ket: (K) Kontrol, (GSH 1 mM) penambahan glutation dengan konsentrasi 1 mM, (GSH 3 mM)
penambahan glutation dengan konsentrasi 3 mM. Superskrip berbeda pada kolom yang sama
menunjukan perbedaan nyata (p< 0.05).
Persentase motilitas spermatozoa segera setelah diencerkan dan setelah
ekuilibrasi tidak berbeda diantara kelompok perlakuan (p>0.05). Terjadi
penurunan motilitas yang signifikan antara spermatozoa sebelum dan setelah
dibekukan. Motilitas spermatozoa segera setelah semen beku dicairkan kembali 0
16
jam dan 3 jam tidak berbeda diantara kelompok perlakukan (p>0.05), akan tetapi
6 jam setelah thawing, motilitas spermatozoa pada kelompok GSH 3 mM lebih
tinggi dari kontrol dan kelompok GSH 1 mM (p0.05). Integritas membran plasma segera setelah thawing
pada kelompok GSH 1 mM lebih tinggi dari kelompok kontrol dan kelompok
GSH 3 mM (p
SITI ASTUTI. Characteristic of Sheep Spermatozoa during Freezing process
with which Medium Diluents added Glutathione. Under direction NI WAYAN
KURNIANI KARJA
The aim of the study was to the characteristics of sheep spermatozoa
during the freezing process by using the added glutathione (GSH). Semen sheep
divided into 3 group: semen control group; semen was diluted edded by 1 mM
GSH; semen was diluted by NSF 3 mM. Characteristics of sheep before freezing,
after equilibration, and after freezing evaluated. Motility of spermatozoa in 3 mM
6 hours after thawing, higher than the control and 1 mM (p0.05). Plasma membrane
integrity immediately after thawing in the 1 mM GSH group higher than 3 mM
GSH group (p0.05). The addition of 3 mM glutathione to the freezing extender affected the
motility of spermatozoa after 6 hours post-thawing and the plasma membrane
integrity intact after 3 hours post-thawing.
Key word: Sheep, spermatozoa, freezing, glutathione
RINGKASAN
SITI ASTUTI. Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan
dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan Glutation. Dibimbing oleh
NI WAYAN KURNIANI KARJA.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik spermatozoa
domba selama proses pembekuan dengan menggunkan medium pengencer yang
ditambahkan glutation (GSH). Semen domba dibagi menjadi 3 kelompok yaitu
kelompok kontrol dimana semen diencerkan dengan NSF 1 tanpa penambahan
GSH, kelompok GSH 1 mM adalah kelompok semen yang diencerkan dengan
NSF 1 ditambahkan 1 mM GSH, dan kelompok GSH 3 mM adalah kelomopk
semen yang diencerkan dengan NSF1 yang ditambahkan 3 mM GSH. Evaluasi
karakteristik semen domba dilakukan sebelum pembekuan, setelah ekuilibrasi,
dan setelah pembekuan. Hanya motilitas spermatozoa pada kelompok 3 mM 6 jam
setelah thawing lebih tinggi dari kontrol dan kelompok GSH 1 mM (p0.05). Intergritas
membran plasma segera setelah thawing pada kelompok GSH 1 mM lebih tinggi
dari kelompok GSH 3 mM (p0.05). Penambahan
glutation dengan dosis 3 mM dalam medium pengencer semen domba
memberikan pengaruh yang baik terhadap motilitas spermatozoa setelah 6 jam
post-thawing dan terhadap integritas membran plasma utuh setelah 3 jam postthawing, namun tidak berpengaruh pada viabilitas dan abnormal spermatozoa.
Kata kunci: spermatozoa, domba, pembekuan, glutation
KARAKTERISTIK SPERMATOZOA DOMBA SELAMA
PROSES PEMBEKUAN DENGAN MEDIUM PENGENCER
YANG DITAMBAHKAN GLUTATION
SITI ASTUTI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul: Karakteristik
Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan dengan Medium Pengencer yang
Ditambahkan Glutation adalah benar-benar hasil karya sendiri dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya-karya yang diterbitkan maupun
yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantum
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, September 2012
Siti Astuti
NIM B04080201
ABSTRACT
SITI ASTUTI. Characteristic of Sheep Spermatozoa during Freezing process
with which Medium Diluents added Glutathione. Under direction NI WAYAN
KURNIANI KARJA
The aim of the study was to the characteristics of sheep spermatozoa
during the freezing process by using the added glutathione (GSH). Semen sheep
divided into 3 group: semen control group; semen was diluted edded by 1 mM
GSH; semen was diluted by NSF 3 mM. Characteristics of sheep before freezing,
after equilibration, and after freezing evaluated. Motility of spermatozoa in 3 mM
6 hours after thawing, higher than the control and 1 mM (p0.05). Plasma membrane
integrity immediately after thawing in the 1 mM GSH group higher than 3 mM
GSH group (p0.05). The addition of 3 mM glutathione to the freezing extender affected the
motility of spermatozoa after 6 hours post-thawing and the plasma membrane
integrity intact after 3 hours post-thawing.
Key word: Sheep, spermatozoa, freezing, glutathione
RINGKASAN
SITI ASTUTI. Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan
dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan Glutation. Dibimbing oleh
NI WAYAN KURNIANI KARJA.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik spermatozoa
domba selama proses pembekuan dengan menggunkan medium pengencer yang
ditambahkan glutation (GSH). Semen domba dibagi menjadi 3 kelompok yaitu
kelompok kontrol dimana semen diencerkan dengan NSF 1 tanpa penambahan
GSH, kelompok GSH 1 mM adalah kelompok semen yang diencerkan dengan
NSF 1 ditambahkan 1 mM GSH, dan kelompok GSH 3 mM adalah kelomopk
semen yang diencerkan dengan NSF1 yang ditambahkan 3 mM GSH. Evaluasi
karakteristik semen domba dilakukan sebelum pembekuan, setelah ekuilibrasi,
dan setelah pembekuan. Hanya motilitas spermatozoa pada kelompok 3 mM 6 jam
setelah thawing lebih tinggi dari kontrol dan kelompok GSH 1 mM (p0.05). Intergritas
membran plasma segera setelah thawing pada kelompok GSH 1 mM lebih tinggi
dari kelompok GSH 3 mM (p0.05). Penambahan
glutation dengan dosis 3 mM dalam medium pengencer semen domba
memberikan pengaruh yang baik terhadap motilitas spermatozoa setelah 6 jam
post-thawing dan terhadap integritas membran plasma utuh setelah 3 jam postthawing, namun tidak berpengaruh pada viabilitas dan abnormal spermatozoa.
Kata kunci: spermatozoa, domba, pembekuan, glutation
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 11 Agustus 1989 di Jayapura-Papua.
Penulis merupakan anak kedua dari enam bersaudara dari pasangan Bapak Patong
dan Ibu Supenti.
Penulis menempuh pendidikan yang dimulai dari pendidikan dasar (SD)
dan lulus pada tahun 2001 di SDN 01 Arsopura, Distrik Skanto Kabupaten
Keerom. Pendidikan lanjutan menengah pertama (SMP) diselesaikan Penulis pada
tahun 2004 di SMPN 02 Arso Distrik Skanto Kabupaten Keerom. Pendidikan
lanjutan menengah atas (SMA) diselesaikan pada tahun 2007 di SMAN 02 Distrik
Skanto, Kabupaten Keerom. Penulis diterima menjadi mahasiswa di Institut
Pertanian Bogor pada tahun 2008 melalui jalur Beasiswa Undangan Daerah
(BUD) dan pada tahun berikutnya. Penulis diterima sebagai mahasiswa
kedokteran hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif pada beberapa organisasi
kemahasiswaan seperti organisasi mahasiswa daerah (OMDA) Papua sebagai
anggota, Himpro Ruminansia sebagai anggota sub divisi pendidikan (2009-2010),
dan Ikatan Mahasiswa Kedokteran Hewan Indonesia (IMAKAHI) cabang IPB
sebagai anggota sub divisi zoonosis (2010-2011).
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penulisan skripsi yang berjudul Karakteristik Spermatozoa Domba
Selama Proses Pembekuan dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan
Glutation dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada;
1. Drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP,Ph.D sebagai dosen pembimbing yang
telah memberikan bimbingan, saran, dan motivasi.
2. Hibah bersaing Institut Pertanian Bogor No. 15/13.24.4/SPP/PHB/2011
yang membiayai penelitian ini.
3. Seluruh dosen pengajar Fakultas Kedokteran Hewan atas semua ilmu yang
telah bapak dan ibu berikan kepada Penulis
4. Laboratorium Fertilisasi In Vitro dan Unit Rehabilitas Reproduksi (URR)
Fakultas Kedokteran Hewan, IPB berserta segenep staf.
5. Pemerintah Daerah Kabupaten Keerom atas dukungan financial selama
Penulis menempuh studi di IPB.
6. Bapak, Ibu, kakak dan adik-adik (Eva, Ali, Midah, Nanda, Gilang), serta
sahabat dekat (Saenal) terima kasih atas doa dan semangat yang diberikan.
7. Teman sepenelitian Dhia, serta kakak S2 (Ari dan Fitrah) terima kasih atas
bantuan dan semangat yang diberikan.
8. Sahabat-sahabatku (Burki, Hastin, Nisa, Gita, Sri, Ana, Ruri, dan Afifah)
terima kasih atas doa dan semangat yang diberikan.
9. Rekan- rekan Avenzoar 45 yang tidak bisa disebutkan satu-persatu.
10. Teman-teman Matoa House (Dika, Dian, Neni, Wiwi, Resa, Clara) terima
kasih atas doa dan dukunganya.
11. Teman-teman BUD Keerom (Zack, Iwan, Irma, Abia) terima kasih atas
doa dan dukungannya.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini jauh dari sempurna, untuk itu penulis
mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. Penulis berharap agar skripsi ini
bermanfaat bagi pihak-pihak yang membutuhkan dan dapat menambah ilmu
pengetahuan.
Bogor, September 2012
Siti Astuti
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
KARAKTERISTIK SPERMATOZOA DOMBA SELAMA
PROSES PEMBEKUAN DENGAN MEDIUM PENGENCER
YANG DITAMBAHKAN GLUTATION
SITI ASTUTI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi
Nama
NRP
: Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses
Pembekuan dengan Medium Pengencer yang
Ditambahkan Glutation
: Siti Astuti
: B04080201
Disetujui,
drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP, Ph.D
Pembimbing
Diketahui,
drh. H. Agus Setiyono, MS, Ph.D, APVet
Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Tanggal lulus:
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL…………………………………………………………...
xii
DAFTAR GAMBAR………………………………………………………..
xiii
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………..
xiv
PENDAHULUAN
Latar Belakang…………………………………………………………....
Tujuan…………………………………………………………………….
Hipotesa Penelitian……………………………………………………….
1
2
2
TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Semen……………………………………………………...
Spermatozoa……………………………………………………………...
Pembekuan Semen………………………………………………………..
Pengenceran Semen………………………………………………………
Laktosa………………………………………………………………..
Kuning Telur………………………………………………………….
Gliserol……………………………………………………………….
Antibiotik……………………………………………………………..
Reactive Oxygen Species (ROS)…………………………………………
Glutation………………………………………………………………….
3
3
4
5
5
6
6
7
7
8
BAHAN DAN METODE
Waktu Penelitian ………………………………………………………....
Alat dan Bahan……………………………………………………….......
Metode Penelitian
Persiapan Bahan Pengencer…………………………………………..
Koleksi Spermatozoa…………………………………………………
Kriopreservasi Spermatozoa………………………………………….
Evaluasi Karakteristik Spermatozoa Domba……………………………..
Penilaian Motilitas Spermatozoa………………………………………....
Penilaian Integritas Membran Plasma Spermatozoa…………………......
Penilaian Viabilitas dan Morfologi Abnormalitas Spermatozoa…………
Analisis Data………………………………………………………….......
10
10
10
10
11
11
12
12
12
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Semen Domba Segera Setelah Koleksi………………….....
Persentase Motilitas Spermatozoa……………………………………......
Persentase Integritas Membran Plasma Spermatozoa……………………
Persentase Viabilitas Spermatozoa……………………………………….
Persentase Morfologi Abnormal Spermatozoa…………………………...
14
15
16
18
20
SIMPULAN DAN SARAN…………………………………………………
22
x
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………....
23
LAMPIRAN………………………………………………………………....
27
xi
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Karakteristik semen segera setelah koleksi………………………………
14
2
Persentase motilitas spermatozoa domba selama proses pembekuan……
15
3
Persentase integritas membran plasma spermatozoa selama proses
17
pembekuan………………………………………………………………..
4
Persentase viabilitas spermatozoa selama proses pembekuan………...... 19
5
Persentase abnormal spermatozoa domba selama proses pembekuan…...
20
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Integritas membran plasma spermatozoa domba……………………... 18
2
Spermatozoa dengan pewarnaan eosin-nigrosin……………………… 19
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
Hasil uji data motilitas……………………………………………...
Hasil uji data integritas membran plasma……………………….....
Hasil uji data viabilitas…………………………………………......
Hasil uji data abnormalitas…………………………………………
28
29
30
31
xiv
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu faktor penyebab kegagalan dalam program inseminasi buatan
(IB) ialah kualitas semen yang digunakan untuk IB. Beberapa faktor yang dapat
mempengaruhi kualitas semen setelah dibekukan adalah pengelolahan semen,
pemilihan jenis pengencer, dan pemilihan jenis krioprotektan (Herdis et al. 2003).
Dalam pengolahan semen harus dilakukan seoptimal mungkin sehingga
kualitasnya dapat dipertahankan. Kontak antara spermatozoa dan udara yang
mengandung oksigen selama koleksi dan pengolahan semen dapat mengakibatkan
peningkatan aktivitas metabolisme oksidatif di dalam sel, sebagai akibatnya
konsentrasi radikal bebas sebagai salah satu produk metabolismenya juga akan
meningkat (Holt 2000).
Selama proses pembuatan semen beku yang meliputi proses pendinginan,
pembekuan dan thawing juga dapat mengakibatkan kerusakan fisik dan kimia
pada membran sel spermatozoa yang dapat mempengaruhi kelangsungan hidup
sperma dan motilitasnya. Selama proses pembekuan, selain akan terjadi
perubahan suhu dan tekanan osmotik (Baumber et al. 2003), juga terjadi
peroksidasi lipida dan setelah proses pembekuan aktivitas peroksida lipida
meningkat pada bagian
tengah membran (midpiece) (Gadea et al. 2007).
Meningkatnya peroksida lipida diawali dengan terbentuknya reactive oxygen
species (ROS) (Gadella 2008). Reactive oxygen species atau radikal bebas adalah
molekul yang elektronnya terletak pada lapisan paling luar, tidak mempunyai
pasangan dan molekul ini sangat reaktif mempunyai spesifitas yang rendah dan
mampu bereaksi dengan molekul-molekul disekitarnya. Radikal bebas sangat
berbahaya bagi kelangsungan hidup spermatozoa karena dapat mengambil
elektron dari asam lemak tak jenuh fosfolipid membran plasma sel. Jika tidak
dicegah dapat mengakibatkan reaksi rantai peroksida lipid yang berlangsung
terus-menerus dan dapat merusak seluruh membran plasma spermatozoa (Holt
2000). Banyak studi yang telah dilakukan untuk meminimalkan kerusakan
tersebut diantaranya adalah dengan penambahan antioksidan ke dalam bahan
pengencer semen.
2
Antioksidan merupakan senyawa yang bersifat nukloephilik yang dapat
memutuskan atau menekan reaksi radikal bebas dan mampu untuk mengakhiri
siklus reaksi (Hammersdet 1993). Glutation (GSH) merupakan salah satu senyawa
antioksidan berupa komponen sulfihidril non-protein di dalam sel yang dapat
menetralisirkan radikal bebas hidroksil yang sangat reaktif yang menyebabkan
terjadinya peroksidasi lipid pada membran sel (Holt 2000). Fungsi dasar GSH
dalam sperma mamalia sebagai mekanisme pencegahan ROS dan membantu
melawan efek stres dari oksidatif dalam sperma (Luberda 2005).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik spermatozoa domba
selama proses pembekuan dengan medium pengencer yang ditambahkan GSH.
Hipotesa Penelitian
Penambahan GSH dalam medium pengencer semen domba dapat
mempertahankan kualitas spermatozoa (motilitas, membran plasma utuh,dan
viabilitas) selama proses pembekuan.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Semen
Semen merupakan cairan yang mengandung spermatozoa dan plasma semen
yang dihasilkan dari sekresi oleh kelanjar-kelanjar kelamin jantan (Herdis et al.
2003). Adapun perbedaan warna, konsistensi, dan konsentrasi dari semen
mempunyai hubungan yang erat satu sama lain. Warna semen domba yang normal
berwarna krem, derajat kekeruhan tergantung atas konsentrasi spermatozoa yang
dikandung. Semen domba normal mempunyai konsistensi yang kental.
Konsistensi atau derajat kekentalan dapat dilihat dengan cara menggoyangkan
tabung penampung berisi semen segar secara perlahan. Semen dengan konsistensi
kental akan terlihat pada saat memiringkan tabung gelas penampung dan
selanjutnya kembali pada posisi normal, maka proses kembalinya larutan semen
tersebut ke posisi tegak akan lama, dibandingkan dengan semen dengan
konsistensi encer (Rasad 2011). Selain itu, derajat keasaman (pH) juga sangat
menentukan status kehidupan spermatozoa di dalam semen. Derajat keasaman
pada domba berkisar 5.7- 7.3. Semakin rendah atau semakin tinggi pH semen dari
pH normal akan membuat spermatozoa lebih cepat mati (Suyadi et al. 2004).
Secara mikroskopis, semen yang berkualitas baik adalah mempunyai gerakan
masa dan motilitas dengan daya gerak maju yang progresif. Semakin aktif dan
semakin banyak spermatozoa yang bergerak ke depan, maka gerakan massa akan
semakin baik (Sujoko et al. 2009).
Spermatozoa
Tempat pembentukan spermatozoa terjadi di testis bagian tubulus
seminiferus. Spermatozoa merupakan hasil akhir dari sel kelamin jantan yang
telah mengalami pendewasaan. Proses pembentukan spermatozoa di dalam
tubulus seminiferus dikenal dengan nama spermatogenesis. Spermatogenesis
dibagi dalam dua fase yaitu 1) spermatositogenesis, dimana spermatogania
mengalami pembelahan secara mitosis dan meiosis. Pembelahan secara mitosis
yang menghasilkan keturunan sel yang disebut dengan spermatosit, sedangkan
pembelahan meiosis, dimana spermatosit akan mengalami dua pembelahan,
4
pengurangan setengah jumlah kromosom, dan pengurangan jumlah deoxyribo
nucleid acid (DNA) per sel sehingga menghasilkan spermatid dan 2)
spermiogenesis, dimana spermatid akan berubah menjadi spermatozoa (Schatten
& Constantinescu 2007).
Secara normal spermatozoa terdiri dari kepala dan ekor yang diselaputi oleh
membran sel, yang mempunyai struktur sangat kompleks dalam susunan mozaik
yang teratur dan memiliki peran biologik spesifik pada permukaannya (Jones et al
1993). Membran sel berfungsi untuk mempertahankan integritas sel dan
membentuk interfase dinamis antara sel dengan lingkungan sekitarnya (Schatten
& Constantinescu 2007). Secara umum membran spermatozoa tersusun dari lipid,
protein dan karbohidrat serta zat lain yang bergabung bersama secara non kovalen
dan sangat sensitif terhadap faktor-faktor ekstrinsik seperti suhu, kekuatan ionik
dan polaritas pelarut (Kelso et al. 1997). Lipid merupakan komponen utama
penyusun struktur membran spermatozoa, yang berperan penting dalam menjaga
stabilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa secara keseluruhan, termasuk
kemampuan spermatozoa untuk mengkapasitasi serta membuahi sel telur (Darnell
et al. 1990). Membran akrosom pada kepala sperma berfungsi untuk kapasitasi,
reaksi akrosom dan penembusan ovum pada proses fertilisasi. Membran bagian
belakang akrosom (post acrosomal region) berfungsi untuk mengadakan kontak
pertama dan menjadi satu dengan oolema ovum pada proses fertilisasi, sedangkan
membran pada bagian tengah (midpiece) ekor berfungsi untuk mendapatkan
substrat untuk energi spermatozoa dan menghantarkan gelombang gerak, serta
membran bagian utama (principle piece) berfungsi untuk pergerakan spermatozoa.
Pada bagian luar membran plasma sel terdapat karbohidrat yang berikatan dengan
lipid (glikolipid) atau dengan protein (glikoprotein) yang disebut selubung sel
(Schatten & Constantinescu 2007).
Pembekuan Semen
Manfaat dari keberhasilan program kriopreservasi atau pembekuan
spermatozoa adalah untuk melestarikan plasma nutfah yang mendekati kepunahan
dan mendukung program teknologi IB pada ternak (Gazali & Tambing 2002).
Salah satu parameter dari keberhasilan program kriopreservasi spermatozoa selain
5
dilihat dari kualitas semen setelah thawing tetapi juga dari jumlah spermatozoa
yang berhasil pulih dari proses pembekuan yang di sebut recovery rate
(Arifiantini et al. 2007). Dalam proses pembekuan semen adanya hambatan yang
disebabkan oleh kejutan dingin (cold shock) dan perubahan interaseluler akibat
pengeluaran air dari sel dan terbentuknya kristal-kristal es (Herdis et al. 2003)
akan menyebabkan kerusakan sel. Kejutan dingin terjadi karena adanya
penurunan suhu yang cepat sampai di bawah 0 ºC sehingga menurunkan viabilitas
sel. Pengaruh utama dari kejutan dingin terhadap sel spermatozoa ialah penurunan
motilitas dan daya hidup, sedangkan pembentukan kristal es dalam proses
kriopreservasi menyebabkan menumpuknya elekrolit di dalam sel. Penumpukan
elektrolit akan merusak dinding sel spermatozoa saat pencairan kembali sehingga
permeabilitas membran plasma menurun dan menyebabkan kematian sel (Watson
2000).
Pengenceran Semen
Pengencer semen merupakan larutan yang bersifat isotonis yang memiliki
tekanan osmotik sama dengan plasma darah. Dalam pengencer semen terkandung
bahan-bahan yang bersifat buffer, mengandung bahan nutrisi untuk kelangsungan
hidup bagi spermatozoa, dan mampu melindungi dari cold shock (Herdis et al.
2003). Adapun menurut Bearden & Fuquay (1997) pengencer semen memiliki
beberapa syarat yang telah ditetapkan yaitu 1) bersifat isotonis terhadap semen, 2)
memiliki kemampuan sebagai penyangga sehingga dapat mempertahankan
sperma terhadap perubahan pH, 3) dapat melindungi sperma dari cekaman dingin
selama proses ekuilibrasi, pendinginan, dan pembekuan, 4) mengandung nurtisi
untuk proses metabolisme sperma, 5) mengandung antibiotik untuk mencegah
kontaminasi bakteri.
Laktosa
Laktosa adalah salah satu karbohidrat golongan disakarida yang terdiri atas
dua unit monosakarida, yakni satu unit glukosa dan satu unit galaktosa yang
keduanya dapat dimetabolisme oleh spermatozoa melalui glikolisis dan siklus
Krebs untuk menghasilkan energi berupa adenosin trifosfat (ATP) (Souhoka et al.
6
2009). Adenosin trifosfat dimanfaatkan oleh spermatozoa sebagai sumber energi
dalam proses pergerakan sehingga dapat tetap motil dan sekaligus untuk
mempertahankan daya hidupnya. Menurut Lehninger (1994) laktosa merupakan
salah satu senyawa pereduksi dan memiliki struktur yang stabil. Sebagai senyawa
pereduksi,
laktosa
memiliki
fungsi
untuk
meredam
senyawa-senyawa
pengoksidasi, sehingga berperan dalam meminimumkan terjadinya reaksi
oksidasi. Laktosa juga dapat berfungsi sebagai krioprotektan ekstraseluler yang
berperan dalam melindungi spermatozoa selama pembekuan (Rizal et al. 2003),
laktosa dapat melindungi membran plasma sel spermatozoa dari kerusakan secara
mekanik selama proses pengolahan semen, terutama saat pendinginan, freezing
dan thawing (Molinia et al. 1994). Menurut Maxwell & Salamon (2000) laktosa
lebih efektif dalam menurunkan suhu kristalisasi selama pembekuan dibandingkan
dengan golongan monosakarida lainnya, sehingga pembentukan kristal es dapat
diminimalkan.
Kuning Telur
Kuning telur berfungsi sebagai sumber energi dan agen protektif (Souhoka
et al. 2009). Kuning telur mengandung glukosa sebagai sumber energi bagi
spermatozoa disamping protein dan vitamin-vitamin yang larut dalam air atau
minyak (Gazali & Tambing 2002). Kandungan lechitin dalam kuning telur,
lechitin dapat melindungi membaran plasma sel spermatozoa dari kejutan dingin
(cold shock) saat semen disimpan pada suhu dingin (Sudaryani 2003). Selain itu,
kuning telur juga mampu mempertahankan dan melindungi integritas selubung
lipoprotein sel spermatozoa (Paulenza et al. 2002).
Gliserol
Krioprotektan ialah zat kimia nonelektrolit yang berperan dalam
mengurangi pengaruh mematikan selama pembekuan baik berupa pengaruh
larutan maupun adanya pembentukan kristal es sehingga viabilitas sel dapat
dipertahankan. Dalam proses preservasi semen terjadi kejutan dingin yang dapat
merusak membran sel spermatozoa dan bisa menyebabkan kematian spermatozoa.
(Souhoka et al. 2009). Krioprotektan yang sering digunakan dalam pembekuan
7
semen adalah gliserol karena mampu mengikat air yang cukup kuat dengan tiga
gugus hidroksil yang dimilikinya. Gliserol dapat berdifusi ke dalam sel lebih
cepat, mampu mengubah kristal es yang berukuran besar dan tajam, dan
melenturkan membran sel sehingga tidak mudah rapuh, serta gliserol dapat
mengurangi daya merusaknya terhadap spermatozoa dengan jalan memodifikasi
kristal es yang terbentuk (Supriatna & Pasaribu 1992).
Walaupun
gliserol
dapat
memberikan
perlindungan
terhadap
sel
spermatozoa, namun dapat juga merusak struktur spermatozoa selama proses
pembekuan semen, menyebabkan kejutan osmotik, dan menurunkan nilai
antibiotika dalam pengencer semen, serta menurunkan volume sel sperma
sebanyak setengah dari volume larutan isotonik sesudah pencairan kembali. Oleh
karena itu, kandungan gliserol di dalam pengencer semen bergantung pada
metode pendinginan atau pembekuan, komposisi pengencer, dan cara penambahan
(Gazali & Tambing 2002).
Antibiotik
Perlunya penambahan antibiotik dalam pengencer semen domba. Biasanya
antibiotik yang sering digunakan dalam penambahan bahan pengencer semen
beku antara lain gentamycin, lincomycin, spectinomycin, streptomycin, dan
penisilin. Penambahan antibiotik dalam pengencer dimaksudkan untuk mencegah
pertumbuhan mikroorganisme (Hafez 2000).
Reactive Oxygen Species (ROS)
Reactive oxygen species merupakan senyawa yang secara alamiah
diproduksi dalam metabolise seluler. Produksi ROS berlebih disebabkan karena
ketersedian oksigen dalam jumlah banyak yang terdapat dalam spermatozoa. Hal
ini dapat menimbulkan kerusakan spermatozoa akibat peroksidasi lipid.
Peroksidasi lipid ditimbulkan karena adanya radikal bebas. Bebarapa contoh
radikal-radikal bebas tersebut ialah superoksida, hidoksil, dan peroksil. Radikalradikal bebas tersebut bersifat sangat reaktif dan bila bereaksi dengan asam lemak
tak jenuh akan membentuk peroksidasi lipid (Gazali & Tambing 2002). Reaksi
peroksidasi lipid ini sangat berbahaya bagi kelangsungan hidup spermatozoa
8
dikarenakan merusak bagian dari membran plasma sel dan dapat mengakibatkan
kematian spermatozoa (Holt 2000). Selain itu, peroksidasi lipid yang terjadi
secara terus-menerus dapat menyebabkan ketidak stabilan membran, mengubah
viskositas membran, dan merangsang aktivitas fosfolipase A2 (Gazali & Tambing
2002).
Pada sel mamalia efek toksik yang disebabkan oleh perokidasi lipid ialah
menghambat metabolisme oksidatif, menghambat proses glikolisis, menghambat
kerja enzim sulfhidril, dan menyebabkan denaturasi DNA. Ciri kerusakan sel
spermatozoa akibat peroksida lipid ialah rendahnya motilitas spermatozoa,
kerusakan enzim intraseluler, dan kerusakan membran plasma terutama bagian
akrosom (White 1993).
Glutation
Glutation mempunyai kandungan senyawa molekul tiol tripeptida terdiri
dari tiga asam amino yaitu, L-glutamin, L-cystien, dan L-glysin (Luberda 2005).
Glutation merupakan antioksidan yang mempunyai potensi melindungi sistem
biologi akibat adanya suatu proses atau reaksi yang merugikan dengan jalan
mereduksi dan menekan reaksi radikal bebas (Hammersdet 1993). Glutation
merupakan antioksidan primer yang berfungsi untuk mencegah pembentukan
radikal bebas baru, glutation berkerja dengan mengubah radikal bebas baru
menjadi molekul yang kurang berdampak negatif sebelum radikal bebas tersebut
mempunyai kesempatan untuk bereaksi (Wijaya 1996). Menurut Sugiyanta (2007)
Glutation
digunakan
mendetoksikasi
sebagai
peroksida
dari
kofaktor
serangan
oleh
enzim
radikal
peroksidase
bebas
molekuler
untuk
dan
transhydrogenase untuk mengurangi oksidasi pada DNA, protein, dan
biomolekuler lainya. Glutation peroksidase dapat membentuk pertahanan terhadap
oksidan atau radikal bebas di dalam tubuh dan mencegah kerusakan sel dengan
cara mengkatalisa peroksida menjadi air dan oksigen. Glutation yang
didistribusikan ke dalam sel, mempunyai peranan penting dalam mekanisme
pertahanan interseluler terhadap stres oksidatif yang disebabkan oleh produksi
ROS berlebih selama proses pembekuan dan thawing spermatozoa (Ansari et al.
2010). Lebih lanjut dilaporkan oleh Ansari et al (2010), bahwa penambahan GSH
9
kedalam semen kerbau dapat meningkatkan kualitas spermatozoa setelah postthawing (motilitas, viabilitas, dan intergritas sperma). Sedangkan Bilodeau et al.
(2001) dan Gadea et al. (2007) melaporkan bahwa penambahan GSH dalam
pengencer semen sapi berperan menjaga kualitas semen.
10
BAHAN DAN METODE
Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli sampai dengan bulan September
2011. Kegiatan ini dilakukan di Laboratorium Fertilitas In Vitro, Unit Rehabilitas
Reproduksi (URR), Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, gelas ukur,
Erlenmeyer, kertas saring, timbangan mikro, pipet tetes, pipet mikro, vagina
buatan dan perlengkapannya, pH meter, bunsen, kontainer nitrogen cair,
waterbath, lemari es, styrofoam, gelas objek, cover glas, mikroskop cahaya,
straw, dan syringe. Bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu, semen domba,
Pengencer Niwa dan Sasaki Freezing (NSF), medium fertilisasi in vitro dan N2
cair.
Metode Penelitian
Persiapan Bahan Pengencer
Komposisi bahan pengencer yang digunakan dalam penelitian ini adalah
medium NSF yang terdiri dari NSF I dan NSF II. NSF I mengandung 20% (v/v)
kuning telur, 8.8% (w/v) laktosa dan 200 μg/ml ampicilin, glutation 1 mM atau 3
mM, sedangkan NSF II terdiri dari 92.42% (v/v) medium NSF I tanpa glutation,
1.48% (v/v) Orvus Es Paste (OEP), 6% (v/v) gliserol, glutation 1 mM atau 3 mM.
Koleksi Spermatozoa
Semen diperoleh dari dua domba jantan yang sudah dewasa kelamin.
Penampungan semen dilakukan dengan menggunakan vagina buatan yang terbuat
dari karet khusus yang dilengkapi dengan inner liner pada bagian dalamnya untuk
selanjutnya diberi air dengan suhu 40-42 °C dan udara melalui katup, diberi
pelumas dengan kedalaman tidak lebih dari 3 cm sehingga vagina buatan
menyerupai kondisi sebenarnya, kemudian pada salah satu bagian ujung vagina
buatan dipasang tabung penampung semen. Segera setelah koleksi, semen dibawa
11
ke laboratorium untuk di proses. Sebelum proses pembekuan semen dilakukan,
terlebih dahulu dilakukan evaluasi terhadap karakteristik semen yang meliputi
pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis. Pemeriksaan makroskopis terdiri dari
pemeriksaan terhadap volume semen, pH, warna, dan konsistensi, sedangkan
pemeriksaan mikrososkopis meliputi pemeriksaan terhadap motilitas, viabilitas,
membran plasma utuh (MPU), dan morfologi abnormal spermatozoa.
Kriopreservasi Spermatozoa
Kriopreservasi merupakan suatu teknik penyimpanan spermatozoa dalam
keadaan beku (suhu -196 ºC). Semen dibagi menjadi 3 kelompok yaitu; kelompok
K adalah kelompok kontrol dimana semen diencerkan dengan NSF I tanpa
penambahan GSH; kelompok GSH 1 mM adalah kelompok semen yang
diencerkan dengan NSF I ditambah 1 mM GSH; dan kelompok GSH 3 mM
adalah kelompok semen yang diencerkan dengan NSF I yang ditambah 3 mM
GSH. Semen dari setiap kelompok semen diekuilibrasi pada suhu 4 ºC selama 2
jam. Pada akhir dari waktu ekuilibrasi, setiap kelompok semen kemudian
ditambahkan NSF II, dan selanjutnya diekulibrasi kembali pada suhu yang sama
selama 5 menit. Perbandingan penambahan medium NSF I dengan NSF II sebesar
1:1 dengan konsentrasi akhir setelah penambahan medium NSF II adalah 100 x
106 spermatozoa/ml. Spermatozoa segera dimasukkan ke dalam straw berukuran
0.25 ml (IMV, France), kemudian diletakkan pada sebuah styrofoam plate dalam
uap nitrogen selama 20 menit sebelum dimasukkan ke dalam nitrogen cair.
Thawing dilakukan dengan cara meletakkan straw di udara pada suhu kamar
selama 30 detik, kemudian mencelupkannya ke dalam bak berisi air pada
temperatur 37 ºC selama 30 detik, kemudian spermatozoa dimasukkan ke dalam
medium pengencer IVF diinkubator 5% C02 temperatur 38.5 ºC. Dilakukan
evaluasi terhadap karakteristik spermatozoa setelah thawing (post-thawing).
Pemeriksa post-thawing dilakukan pada waktu 0 jam, 3 jam, dan 6 jam.
Evaluasi Karakteristik Spermatozoa Domba
Evaluasi karakteristik semen domba dilakukan sebelum pembekuan, setelah
ekulibrasi, dan setelah pembekuan. Pemeriksaan yang dilakukan meliputi
12
motilitas progresif spermatozoa, integritas fungsional dari membran spermatozoa
dengan hypoosmotic swelling test (HOS-Test), serta viabilitas dan morfologi
abnormal spermatozoa yang dideterminasi dengan pewarnaan eosin-negrosin.
Penilaian Motilitas Spermatozoa
Penilaian persentase motilitas spermatozoa ditentukan dengan cara
menempatkan satu tetes spermatozoa yang telah diencerkan dengan larutan 0.9%
NaCl pada gelas objek yang ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan terhadap
spermatozoa yang bergerak progresif dilakukan secara subjektif pada enam lapang
pandang yang berbeda di bawah mikroskop dengan pembesaran 400 X. Penilaian
berdasarkan persentase mulai dari nol sampai seratus persen.
Penilaian Integritas Membran Plasma Spermatozoa
Penilaian persentase integritas membran plasma spermatozoa diperiksa
menggunakan HOS-Test dengan komposisi larutan HOS untuk 10 ml air mili-Q
ditambahkan dengan 0.135 g fruktosa dan 0.0735 g trisodium citat 2H2O. Sampel
semen sebanyak 20 μl diencerkan dengan 80 μl larutan HOS dan dibiarkan selama
10 menit pada suhu kamar. Sepuluh μl sampel semen diletakkan pada gelas objek
yang ditutup dengan gelas penutup dan evaluasi dilakukan di bawah mikroskop
dengan perbesaran 400 X. Perhitungan dilakukan pada lima kotak teracak
terhadap spermatozoa yang mempunyai ekor melingkar (membran plasma utuh)
maupun yang mempunyai ekor lurus (membran plasma tidak utuh).
Penilaian Viabilitas dan Morfologi Abnormalitas Spermatozoa
Penilaian viabilitas dan abnormal spermatozoa dengan menggunakan
metode pewarnaan eosin-negrosin. Sebanyak 10 μl sampel semen dan 40 μl eosinnegrosin dicampurkan di atas gelas obyek kemudian dibuat preparat ulas dan
dikeringkan menggunakan bunsen selama 15 detik sebelum dilakukan
pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 X. Perhitunggan
dilakukan secara pandangan berbeda sampai jumlah spermatozoa 200.
Spermatozoa yang mati akan menyerap zat warna sehingga bagian kepala akan
terlihat merah, spermatozoa hidup ditandai dengan bagian kepala tidak terwarnai
13
sehingga terlihat transparan, dan spermatozoa yang mempunyai morfologi
abnormal bisa dilihat bagian kepala lebih besar dibandingkan dengan spermatozoa
yang lain serta bagian kepala dan ekor bercabang.
Analisis Data
Penelitian ini dirancang dengan menggunkan rancangan acak lengkap
(RAL) dengan tiga perlakuan dan empat kali pengulangan. Data dianalisis
menggunkan uji Anova.
14
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Semen Domba Segera Setelah Koleksi
Pemeriksaan karakteristik semen domba segera setelah koleksi yang
dilakukan dalam penelitian ini meliputi pemeriksaan secara makroskopis dan
mikroskopis. Hasil pemeriksaan karakteristik semen domba segera disajikan pada
Tabel 1.
Tabel 1 Karakteristik semen segar setelah koleksi
Karakteristik
Rata-rataan
Warna
Kosistensi
Volume (ml)
pH
Putih susu- Kream
Kental
0.63±0.25
6.8± 0.12
Motilitas (%)
Viabilitas (%)
Abnormal (%)
MPU (%)
75±0
82.3±6.18
1.2 ± 1.07
88.8 ± 4.26
Makroskopis
Mikroskopis
Hasil pemeriksaan makroskopis menunjukan warna semen domba berwarna
putih susu-krem, hal ini sesuai dengan penelitian Qomariyah et al. (2001) yang
menyatakan warna semen domba berwarna putih susu atau krem. Konsistensi dari
semen domba yang diperoleh dari penelitian ini mempunyai konsistensi yang
kental sama halnya dengan penelitian Hastono et al. (2001). Menurut Garner &
Hafez (2000) volume semen domba perejakulasi berkisar 0.8- 1.2 ml, sehingga
dilihat dari hasil yang diperoleh volume semen dalam penelitian ini lebih rendah.
Adanya perbedaan volume semen bisa dikarenakan oleh perbedaan umur, ukuran
badan, tingkat makanan, frekuensi penampungan, dan cara penampungan
(Murtidjo 1993). Derajat keasaman (pH) dalam penelitian ini masih dalam kisaran
normal nilai semen domba yaitu 5.9-7.3 (Garner & Hafez 2000).
Hasil evaluasi pemeriksaan semen domba secara mikroskopis diperoleh
persentase motilitas 75± 0, dengan persentase rataan dari viabilitas semen domba
pada penelitian ini 82.3± 6.18. Sedangkan persentase abnormal dari semen domba
15
yang diperoleh dari penelitian ini adalah 1.2 ± 1.07. Menurut Garner & Hafez
(2000) bahwa kisaran abnormal spermatozoa domba antara 5-20%, sehingga
dilihat dari hasil penelitian ini maka nilai abnormal spermatozoa yang didapatkan
masih di bawah kisaran normal. Hasil rata-rataan persentase MPU pada penelitian
ini 88.8 ± 4.26. Dari hasil evaluasi tersebut di atas, semen domba yang dikoleksi
layak untuk dibekukan karena memenuhi syarat motilitas progresif lebih dari 65%
dan abnormalitas kurang dari 20%.
Persentase Motilitas Spermatozoa
Motilitas spermatozoa berperan dalam penentuan kualitas semen karena
berkaitan erat dengan kemampuan spermatozoa untuk fertilisasi. Pengukuran
persentase motilitas dilakukan secara subjektif yang dilihat di bawah mikroskop
dengan perbesaran 400 X dengan cara membandingkan spermatozoa yang
bergerak progresif dengan semua spermatozoa yang teramati dinyatakan dalam
nilai persentase dari nol sampai seratus persen (0-100%) (Bearden et al. 2004).
Persentase motilitas spermatozoa domba selama proses pembekuan dalam
penelitian ini disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2 Persentase motilitas spermatozoa domba selama proses pembekuan
Kelompok
Persentase motilitas± SD
Setelah
ekuilibrasi
0 jam
K
Segera
setelah
diencerkan
75±0
67.5±2.9
38.8±2.5
30±0
21.3±6.3a
GSH 1 mM
75±0
71.1±2.5
42.5±2.9
33.8±2.5
22.5±2.9a
GSH 3 mM
75±0
71.1±2.5
40±4.1
33.8±2.5
28.8±4.8b
Post -thawing
3 jam
6 jam
Ket: (K) Kontrol, (GSH 1 mM) penambahan glutation dengan konsentrasi 1 mM, (GSH 3 mM)
penambahan glutation dengan konsentrasi 3 mM. Superskrip berbeda pada kolom yang sama
menunjukan perbedaan nyata (p< 0.05).
Persentase motilitas spermatozoa segera setelah diencerkan dan setelah
ekuilibrasi tidak berbeda diantara kelompok perlakuan (p>0.05). Terjadi
penurunan motilitas yang signifikan antara spermatozoa sebelum dan setelah
dibekukan. Motilitas spermatozoa segera setelah semen beku dicairkan kembali 0
16
jam dan 3 jam tidak berbeda diantara kelompok perlakukan (p>0.05), akan tetapi
6 jam setelah thawing, motilitas spermatozoa pada kelompok GSH 3 mM lebih
tinggi dari kontrol dan kelompok GSH 1 mM (p0.05). Integritas membran plasma segera setelah thawing
pada kelompok GSH 1 mM lebih tinggi dari kelompok kontrol dan kelompok
GSH 3 mM (p