BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian eksperimental experimental research. Penelitian dimaksudkan untuk mengetahui pengaruh atau
hubungan antara variabel bebas dengan variabel terikat. Dalam penelitian ini yang termasuk variabel bebas adalah: ibuprofen, usus halus kelinci yang dikeringkan dan
usus halus kelinci segar. Sedangkan variabel terikat adalah laju absorpsi.
3.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan pembuatan usus halus kelinci yang dikeringkan dan usus halus kelinci yang segar. Setelah itu dilakukan pengecatan
membran usus halus kelinci yang dikeringkan dan usus halus kelinci yang segar. Kemudian dilanjutkan dengan pemeriksaan laju absorpsi pada usus halus kelinci yang
dikeringkan dan usus halus kelinci yang segar serta dilakukan pengecatan membran untuk usus halus kelinci segar dan yang dikeringkan pada waktu pengujian.
Hewan terbagi dalam tiga kelompok dan tiap kelompok terdiri dari tiga pengulangan dengan uraian sebagai berikut:
1. Kelompok pertama diberi ibuprofen baku yang dilarutkan dalam larutan buffer fosfat pH 6,4 isotonis dengan konsentrasi 2 mmolL.
2. Kelompok kedua diberi ibuprofen tablet Generik yang dilarutkan dalam buffer fosfat pH 6,4 dengan konsentrasi 2 mmolL.
3. Kelompok ketiga diberi ibuprofen tablet merk dagang Proris® yang dilarutkan dengan buffer fosfat pH 6,4 dengan konsentrasi 2 mmolL.
Universitas Sumatera Utara
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biofarmasetika dan Farmakokinetika dan Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, Fakultas Farmasi, Universitas
Sumatera Utara, Medan, Provinsi Sumatera Utara, Indonesia.
3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat freeze dryer Virtis, alat uji absorpsi alat Crane dan Wilson yang telah dimodifikasi, beaker gelas, gelas ukur, kotak
kelinci, labu ukur, neraca analitik Metler Toledo, pH meter Hanna, pipet volume, spektrofotometer UV-visibel Shimadzu UV-Mini 1240, stopwatch, tabung oksigen
dan regulator, tabung reaksi, termometer, termostat, satu set alat bedah, vial dan alat lain yang dibutuhkan.
3.3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah akuades, carbogen, d-glukosa monohidrat E.Merck, ibuprofen baku, ibuprofen tablet Generik Kimia Farma,
kalium dihidrogenfosfat E.Merck, kalium klorida E.Merck, kalsium klorida E.Merck, magnesium klorida E.Merck, natrium bikarbonat E.Merck, natrium
dihidrogenfosfat E.Merck, natrium klorida E.Merck, dan ibuprofen tablet merk dagang Proris
R
Pharos.
3.4 Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah kelinci jantan dengan berat 1,5-2 kg.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Prosedur Kerja 3.5.1 Pembuatan pereaksi
3.5.1.1 Pembuatan air bebas karbondioksida
Air murni dididihkan selama 5 menit atau lebih dan didiamkan sampai dingin dan tidak boleh menyerap karbondioksida dari udara Ditjen POM, 1995.
3.5.1.2 Pembuatan kalium dihidrogenfosfat 0,2 M
Dilarutkan 27,218 g kalium dihidrogenfosfat P dalam air bebas
karbondioksida P hingga 1000 ml Ditjen POM, 1979. 3.5.1.3 Pembuatan larutan natrium hidroksida 0,2 N
Dilarutkan 8,001 natrium hidroksida P dalam air hingga 1000 ml Ditjen POM, 1979.
3.5.1.4 Pembuatan dapar fosfat pH 6,4 isotonis
Dicampur 50,0 ml kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dengan 11,6 ml natrium hidroksida 0,2 N dan diencerkan dengan air bebas karbondioksida P secukupnya
hingga 200 ml Ditjen POM, 1979.
3.5.1.5 Pembuatan larutan thyrode
Dilarutkan 8,0 g natrium klorida; 0,2 g kalium klorida; 0,2 g kalsium klorida; 0,1 g magnesium klorida; 0,05 g natrium dihidrogenfosfat; 1,0 g natrium bikarbonat;
dan 2,0 g d-glukosa monohidrat dalam 1000 ml akuades Anonim
1
, 2009.
3.5.2 Pembuatan kurva serapan ibuprofen dalam medium dapar fosfat pH 6,4 isotonis
Ditimbang seksama 50 mg ibuprofen dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 250 ml kemudian ditambahkan dapar fosfat pH 6,4 isotonis sampai garis tanda. Di
pipet 0,45 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, lalu ditambahkan dapar fosfat pH 6,4 isotonis sampai garis tanda. Maka diperoleh larutan dengan
konsentrasi 9 mcgml. Serapan diukur pada panjang gelombang 200-400 nm dengan
Universitas Sumatera Utara
menggunakan spektrofotometer UV. Panjang gelombang yang dipilih adalah panjang
gelombang dimana ibuprofen memperlihatkan serapan paling tinggi. 3.5.3 Pembuatan kurva kalibrasi ibuprofen dalam medium dapar fosfat pH 6,4
isotonis
Ditimbang seksama 50 mg ibuprofen dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 250 ml kemudian ditambahkan larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis sampai garis
tanda. Dari larutan tersebut di pipet 0,075 ml; 0,2 ml; 0,325 ml; 0,45 ml; 0,575 ml; 0,7 ml; 0,825 ml. Dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, kemudian masing-
masing diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis sampai garis tanda. Serapan diukur pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh dari kurva
serapan ibuprofen menggunakan spektrofotometer UV dan sebagai blanko digunakan dapar fosfat pH 6,4 isotonis. Kurva kalibrasi antara jumlah serapan dan konsentrasi
dibuat dari data yang diperoleh, lalu dihitung persamaan regresi dan koefisien korelasinya.
3.5.4 Pembuatan larutan obat ibuprofen baku dengan konsentrasi 2 mmolL
Ditimbang seksama 20,628 mg ibuprofen baku, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml. Dilarutkan dengan dapar fosfat pH 6,4 isotonis, dicukupkan sampai
garis tanda sehingga diperoleh konsentrasi 2 mmolL.
3.5.5 Pembuatan larutan obat ibuprofen tablet generik dengan konsentrasi 2 mmolL.
Ditimbang seksama 27,6054 mg ibuprofen generik yang telah diserbukkan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml. Dilarutkan dengan dapar fosfat pH 6,4
isotonis, dicukupkan sampai garis tanda sehingga diperoleh konsentrasi 2 mmolL.
3.5.6 Pembuatan larutan obat ibuprofen tablet merk dagang Proris® dengan konsentrasi 2 mmolL.
Ditimbang seksama 29,044 mg Proris® yang telah diserbukkan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml. Dilarutkan dengan dapar fosfat pH 6,4 isotonis,
dicukupkan sampai garis tanda sehingga diperoleh konsentrasi 2 mmolL.
Universitas Sumatera Utara
3.5.7 Pembuatan usus halus kelinci 3.5.7.1 Pembuatan usus halus kelinci segar
Hewan percobaan berupa kelinci jantan dipuasakan selama 20-24 jam. Setelah itu kelinci tersebut dianestesi, kemudian dilakukan pembedahan pada bagian perut
tetapi jangan sampai mengenai tulang dada. Setelah usus halus dikeluarkan dan dibersihkan bagian dalamnya dari kotoran dan bagian luar dari jaringan yang
mengikat pembuluh darah halus, dan sebagainya dengan bantuan pinset dan gunting, dan dicuci dengan larutan thyrode dingin. Lalu diangkat dan dibalik dengan
menggunakan batang pengaduk berpenampang 2 mm. Lalu diikat pada bagian ujung dengan benang dan dilepaskan dari batang pengaduk, dicelupkan ke dalam larutan
Thyrode dingin.
3.5.7.2 Pembuatan usus halus kelinci yang dikeringkan
Hewan percobaan berupa kelinci jantan dipuasakan selama 20-24 jam. Setelah itu kelinci tersebut dianestesi, kemudian dilakukan pembedahan pada bagian perut
tetapi jangan sampai mengenai tulang dada. Setelah usus halus dikeluarkan dan dibersihkan bagian dalamnya dari kotoran dan bagian luar dari jaringan yang
mengikat pembuluh darah halus, dan sebagainya dengan bantuan pinset dan gunting, dan dicuci dengan larutan thyrode dingin. Lalu diangkat dan dibalik dengan
menggunakan batang pengaduk berpenampang 2 mm. Lalu diikat pada bagian ujung dengan benang dan dilepaskan dari batang pengaduk, dicelupkan ke dalam larutan
Thyrode dingin. Kemudian dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer pada suhu -40
°C.
Universitas Sumatera Utara
3.5.8 Pengecatan membran 3.5.8.1 Pengecatan membran usus halus kelinci segar
Pengecatan membran usus halus kelinci segar dilakukan dengan teknik
pengecatan menggunakan hematoksilin-eosin. 3.5.8.2 Pengecatan membran usus halus kelinci yang dikeringkan
Pengecatan membran usus halus kelinci yang dikeringkan dilakukan dengan teknik pengecatan menggunakan hematoksilin-eosin.
3.5.9 Penentuan absorpsi ibuprofen 3.5.9.1 Penentuan absorpsi ibuprofen dalam usus halus kelinci segar dalam
larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis
Usus halus terbalik kelinci dengan panjang efektif masing-masing 7 cm diikat pada kanula dan masing-masing diisi dengan cairan serosa 3 ml ke dalamnya berupa
larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis yang tidak mengandung bahan obat. Usus Halus terbalik bagian atas yang digunakan sebagai kontrol, dimasukkan ke dalam tabung
berisi 75 ml cairan mukosa berupa larutan buffer posfat pH 6,4 isotonis yang tidak mengandung bahan obat. Sedangkan untuk usus halus terbalik bagian bawah yang
digunakan sebagai percobaan, dimasukkan ke dalam tabung berisi 75 ml cairan mukosa berupa larutan buffer posfat pH 6,4 isotonis yang mengandung bahan obat
ibuprofen baku dengan konsentrasi 2 mmol. Selanjutnya dimasukkan tabung ke dalam termostat dengan temperatur 37 ± 0,5°C. Selama berlangsung percobaan dijaga
agar seluruh bagian usus tetap terendam dalam cairan mukosa serta terus menerus dialiri aliran oksigen dengan kecepatan kira-kira 1 gelembung per detik.
Pada menit 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 150 cairan serosa diambil 1 ml melalui kanula dan selanjutnya diencerkan dengan larutan buffer fosfat pH 6,4 isotonis
hingga 25 ml. Dimasukkan kembali sebanyak 1 ml untuk setiap pengambilan cairan
Universitas Sumatera Utara
serosa. Serapan larutan yang diperiksa, diukur pada panjang gelombang maksimum yaitu 222,5 nm dengan spektrofotometer ultraviolet. Dilakukan cara yang sama
dengan cara diatas untuk larutan obat ibuprofen tablet Generik dan ibuprofen tablet merk dagang Proris®.
3.5.9.2 Penentuan absorpsi ibuprofen dalam usus halus kelinci yang dikeringkan dalam larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis
Usus halus terbalik kelinci yang telah dikeringkan dengan panjang efektif masing-masing 7 cm diikat pada kanula dan masing-masing diisi dengan cairan
serosa 3 ml ke dalamnya berupa larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis yang tidak mengandung bahan obat. Usus Halus terbalik bagian atas yang digunakan sebagai
kontrol, dimasukkan ke dalam tabung berisi 75 ml cairan mukosa berupa larutan buffer posfat pH 6,4 isotonis yang tidak mengandung bahan obat. Sedangkan untuk
usus halus terbalik bagian bawah yang digunakan sebagai percobaan, dimasukkan ke dalam tabung berisi 75 ml cairan mukosa berupa larutan buffer posfat pH 6,4 isotonis
yang mengandung bahan obat ibuprofen baku dengan konsentrasi 2 mmol. Selanjutnya dimasukkan tabung ke dalam termostat dengan temperatur 37 ± 0,5
o
C. Selama berlangsung percobaan dijaga agar seluruh bagian usus tetap terendam dalam
cairan mukosa serta terus menerus dialiri aliran oksigen dengan kecepatan kira-kira 1 gelembung per detik.
Pada menit 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 150 cairan serosa diambil 1 ml melalui kanula dan selanjutnya diencerkan dengan larutan buffer fosfat pH 6,4 isotonis
hingga 25 ml. Dimasukkan kembali sebanyak 1 ml untuk setiap pengambilan cairan serosa. Serapan larutan yang diperiksa, diukur pada panjang gelombang maksimum
yaitu 222,5 nm dengan spektrofotometer ultraviolet. Dilakukan cara yang sama
Universitas Sumatera Utara
dengan cara diatas untuk larutan obat ibuprofen tablet Generik dan ibuprofen tablet merk dagang Proris®.
3.6 Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 15. Data hasil penelitian di tentukan homogenitas dan normalitasnya untuk menentukan
analisis statistik yang digunakan. Hasil analisis dapat dilihat pada lampiran 16 pada halaman 66.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Ibuprofen dalam Larutan Dapar Fosfat pH 6,4 Isotonis
Untuk mengetahui panjang gelombang maksimum ibuprofen dalam larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis maka dilakukan pengukuran pada larutan induk baku
ibuprofen 9 mcgml dengan menggunakan alat spektrofotometer ultraviolet. Dari pengukuran diperoleh panjang gelombang ibuprofen dalam larutan dapar fosfat pH
6,4 isotonis adalah 222,5 nm. Panjang gelombang yang diperoleh mendekati dengan panjang gelombang ibuprofen yang tertera pada U. S. P 29 yaitu 221 nm. Hasil
pengukuran dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 46.
4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Penentuan Persamaan Regresi Ibuprofen Baku dalam Larutan Dapar Fosfat pH 6,4 Isotonis
Untuk menentukan kurva kalibrasi dari ibuprofen baku dalam larutan dapar fosfat pH 6,4 isotonis dilakukan pengukuran absorbansi dari larutan induk ibuprofen
pada konsentrasi 1,5; 4; 6,5; 9; 11,5; 14; dan 16,5 mcgml sehingga diperoleh absorbansi dari masing-masing konsentrasi dan persamaan regresi y = 0,0468x –
0,00755.
4.3 Pengecatan Membran Usus Halus Kelinci
Untuk mengetahui pengaruh freeze dryer pada usus halus kelinci, maka dilakukan pengecatan membran hematoksilin-eosin pada usus halus kelinci segar dan
usus halus kelinci yang dikeringkan. Dari pengecatan membran hematoksilin-eosin
Universitas Sumatera Utara
Kategori