Metode Penelitian
Sebanyak 36 tikus betina bunting dibagi dalam 3 kelompok percobaan yaitu K kelompok kontrol yang tidak diberi perlakuan apapun, M kelompok minyak yang
disuntik dengan minyak jagung dengan dosis 0 mg bSTkg BB, dan H kelompok hormon yang disuntik dengan hormon somatotropin dengan dosis 9 mg bSTkg BB
Azain et al 1993. Penyuntikan dilakukan secara intra muskular IM pada bagian otot paha belakang kiri dan kanan secara bergantian setiap hari, dimulai pada usia
kebuntingan hari ke 4 sampai dengan hari ke 12.
Fetus dikorbankan pada usia kebuntingan 13, 17, dan 21 hari untuk mengukur pertumbuhan dan perkembangan plasenta melalui pengukuran bobot, kandungan
DNA, dan RNA baik dari kelompok M atau H masing-masing dengan jumlah 4 ekor.
Cara Kerja
Pembedahan tikus dilakukan untuk mengeluarkan plasenta bersama dengan fetus. Plasenta yang akan dianalisis dimasukkan kedalam alkohol 70 dan kemudian
dikeringkan dengan cara dimasukkan ke dalam oven sehingga diperoleh bahan kering bebas lemak BKBL. Dengan menggunakan mortar, plasenta dihaluskan hingga
menjadi tepung dan hasilnya yang digunakan untuk pengujian DNA dan RNA. Metode penentuan kadar DNA dan RNA, dilakukan sesuai yang dilakukan
oleh Manalu dan Sumaryadi 1998.
1. Prosedur penentuan kadar Deoxyribo Nucleic Acid DNA
Prinsip dari metode ini adalah terjadinya hidrolisis DNA dalam TCA. Hidrolisis ini akan mengakibatkan terjadinya reaksi pewarnaan spesifik dengan p-
nitrofenilhidrazin dan NaOH serta pemecahan ikatan deoksiribose oleh pemanasan. Pengembangan warna berakhir dengan penambahan n-butilasetat dan konsentrasi
DNA yang didasarkan kepekatan warna larutan dapat dibaca dengan spektrofotometer U-2001 Merk Hitachi dengan panjang gelombang 560 µm.
Tahap awal dari penentuan kadar DNA adalah tahap ekstraksi sampel. Sampel berupa bahan kering bebas lemak BKBL ditimbang sebanyak ±12.5 mg dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Setiap sampel ditambahkan TCA 5 sebanyak
2.5 ml, tabung reaksi ditutup dengan tutup beraluminium foil, kemudian dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 20 menit. Setelah itu, didinginkan dalam
penangas air dingin selama 5 menit kemudian disentrifuge dengan kecepatan 1500 rpm selama 20 menit. Proses sentrifuge ini menghasilkan supernatan 1. Supernatan
ini dituang ke dalam tabung reaksi dan disimpan. Endapan yang diperoleh diekstraksi ulang. Dari hasil ekstraksi ini diperoleh supernatan 2. Supernatan 1 dan 2
dicampurkan, kemudian diencerkan dengan TCA 5 hingga volumenya menjadi 7.5 ml, kemudian disimpan dalam refrigeratorice box selama satu malam.
Tahap berikutnya adalah pewarnaan dan pengujian kadar DNA. Hal pertama yang dilakukan adalah mempersiapkan tabung reaksi yang telah dilabel untuk
pembuatan blank, standar dan juga semua sampel. Standar DNA dibuat dengan konsentrasi seperti pada Tabel 2. Selanjutnya untuk masing-masing tabung diisi
dengan reagen seperti yang disajikan pada Tabel 3.
Tabel 2. Konsentrasi standar DNA Konsentrasi
μgml Standar
Absorbent
Blank 1 ml H
2
O 0 5
12.5 μl stock + 987.5 μl H
2
O 0.003 10 25
μl stock + 975 μl H
2
O 0.069 20 50
μl stock + 950 μl H
2
O 0.088 50 125
μl stock + 875 μl H
2
O 0.145 100 250
μl stock + 750 μl H
2
O 0.194 200 500
μl stock + 500 μl H
2
O 0.317 400 1000
μl 1 ml 0.443
Tabel 3. Konsentrasi reagen untuk uji kadar DNA Tabung
p-nitrofenil Hidrazin
TCA 5 Vol. akhir
Blank Standar 400
1 ml 0.1 ml
1 ml 2.1 ml
Standar 200 1 ml
0.1 ml 1 ml
2.1 ml .
Standar 5 1 ml
0.1 ml 1 ml
2.1 ml Sampel 1
1 ml 0.1 ml
1 ml 2.1 ml
Sampel 2 1 ml
0.1 ml 1 ml
2.1 ml .
Sampel 36 1 ml
0.1 ml 1 ml
2.1 ml
Semua tabung ditutup dengan aluminium foil dan diletakkan kembali pada penangas air mendidih selama 20 menit, kemudian didinginkan selama 5 menit.
Selanjutnya ditambahkan n-butilasetat 2.5 ml dan dikocok selama 7 kali, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Aliquots yang terbentuk
diambil 1.5 ml dan ditambahkan 0.5 ml NaOH 2 N pada setiap tabung. Larutan diencerkan dengan ditambahkan H
2
O sebanyak 0.5 ml. Larutan divorteks, selanjutnya dibaca dengan spektrofotometer U-2001 Merk Hitachi dengan panjang gelombang
560 µm. Sebelumnya alat dipanaskan 15 menit dan setiap 25 sampel distandarisasi lagi untuk blanko.
Faktor pengenceran sampel adalah 12.5 mg BKBL7.5 ml TCA 5 = 1.67 mg BKBLml. Sampel yang dibaca sebanyak 1 ml = 1 x 1.67 = 1.67 mg BKBL. Misal
hasil baca spektrofotometer = Y μgml. Jadi konsentrasi DNA sampel = Y1.67
μgmg BKBL.
2. Prosedur penentuan kadar Ribo Nucleic Acid RNA
