kering ke dalam tabung pemisah. Agar pengisian rata, tabung setelah diisi kemudian divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu.
Adsorben lainnya harus diisikan sebagai suspensi, terutama jika zat ini menggelembung dengan pelarut pengembang. Yang umum dilakukan adalah,
adsorben dibuat seperti bubur dengan pelarut elusi, kemudian dimasukan ke dalam tabung pemisah. Sebagai bahan sorbsi digunakan bahan yang sama dengan
kromatografi lapis tipis yaitu silika gel, aluminium oksida, poliamida, selulosa, arang aktif, dan gula tepung.
Pada kromatografi kolom, zat yang berinteraksi lemah dengan fasa diam akan keluar dari kolom dengan lebih cepat. Zat yang keluar dari kolom disebut sebagai
eluat. Eluat yang keluar kemudian ditampung dengan menggunakan sejumlah tabung reaksi sehingga menghasilkan beberapa fraksi.
F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas dalam isolasi senyawa bahan alam.
1. Kelebihan KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi mempunyai banyak keuntungan jika dibandingkan dengan kromatografi konvensional, yaitu :
a. Kecepatan Dengan KCKT waktu analisis dapat dilakukan hanya dalam 15-30 menit.
Bahkan untuk analisis yang tidak rumit, dapat dicapai waktu analisis
kurang dari 15 menit.
b. Daya Pisah Jika dibandingkan dengan kromatografi konvensional, KCKT memiliki
daya pisah yang lebih baik. Dalam KCKT dapat dilakukan elusi dengan metode gradien yang dapat meningkatkan daya pisah komponen-
komponen senyawa dalam sampel. c. Kepekaan
Detektor serapan UV yang biasa dipakai dalam KCKT dapat mendeteksi berbagai jenis senyawa dalam jumlah nanogram 10
-9
g. Detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi dalam jumlah pikogram
10
-12
g. d. Kolom yang dapat dipakai kembali
Berbeda dengan Kromatografi konvensional, kolom KCKT dapat dipakai kembali. Banyak analisis dapat dilakukan pada kolom yang sama sebelum
kolom itu harus diganti. Akan tetapi, kolom tersebut turun mutunya, laju penurunan mutu itu bergantung pada jenis cuplikan yang disuntikkan,
kemurnian pelarut dan jenis pelarut yang dipakai.
e. Mudah memperoleh kembali cuplikan Sebagian besar detektor yang dipakai pada KCKT tidak merusak sehingga
komponen cuplikan dapat dikumpulkan dengan mudah ketika mereka melewati detektor.
2. Sistem Peralatan KCKT
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas: wadah fasa gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel tempat injeksi, kolom, detektor, wadah penampung
buangan fasa gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
Gambar 2. Sistem peralatan KCKT
1. Wadah Fasa gerak dan Fasa gerak Wadah fasa gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fasa gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fasa gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut .
Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fasa diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fasa normal fasa diam lebih polar dari pada fasa gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fasa terbalik fasa diam kurang polar dari pada fasa gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari adanya partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fasa gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik komposisi fasa gerak tetap selama elusi atau dengan cara bergradien komposisi fasa gerak berubah-ubah selama
elusi yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fasa gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fasa terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fasa normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fasa normal ini kurang umum dibanding dengan fasa terbalik.
2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fasa gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fasa gerak dengan kecepatan
alir 3 mLmenit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fasa gerak dengan kecepatan 20 mLmenit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fasa gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fasa gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fasa gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fasa gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fasa gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel sample loop internal atau eksternal.
Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel
Gambar 3. Posisi injektor pada saat penyuntikkan sampel
4. Kolom dan Fasa diam Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fasa diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solutanalit.
Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
1. Konsumsi fasa gerak kolom mikrobor hanya 80 atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fasa gerak lebih lambat 10 -100 μ Lmenit. 2. Adanya aliran fasa gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. 3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Maka dari itu,
kolom konvensional lebih banyak digunakan dalam analisis KCKT karena dapat digunakan secara berulang.
Kebanyakan fasa diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol Si-OH. Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
lain.
Oktadesil silika ODS atau C
18
merupakan fasa diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil
nitril lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.
5. Detektor KCKT Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu, detektor
universal yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: 1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi. 3. Stabil dalam pengoperasiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas kisaran dinamis linier.
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak.
G. Evaporative Light Scattering Detector ELSD
