PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (ANNONA MURICATA L.) TERHADAP KADAR MALONDIALDEHID PADA JARINGAN HATI TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI DMBA

ABSTRACT

THE EFFECT OF SOURSOP LEAF (ANNONA MURICATA L.) EXTRACT TO MALONDIALDEHYDE’S CONCENTRATION OF RAT LIVER

INDUCED BY DMBA

By

ANNISA RATYA

Liver cancer can be caused by oxidative stress due to the increase of free radical. Free radical reacts with lipid, resulting lipid peroxidation that will produce malondialdehyde. Soursop leaf extract have anticancer and antioxidant effect. The aim for this research is to determine the effect of soursop leaf extract (Annona muricata L.) to malondialdehyde’s concentration of rat liver that induced by DMBA. This study was an experimental design with 4 groups of intervention. Each group contains 5 female Sprague dawley rats treated for 4 weeks, group K (given 1 ml/days of aquadest), A (induced 20 mg/kgBW of DMBA twice a week and given 1 ml/days of aquadest), B (given 20 mg/kgBW twice a week and 20 mg/kgBW/days of soursop leaf extract), and C (given 20 mg/kgBW twice a week and 40 mg/kgBW/days of soursop leaf extract). The rat is terminated to have its liver taken for a malondialdehyd’s concentration test. The results showed that the concentrations of group K’s malondialdehyde mean = 1,9580 nmol/mg; A = 2,3700 nmol/mg; B = 1,7180 nmol/mg; and C = 1,6680 nmol/mg. Statistical test showed significant differences in between the treatment group (p <0.05), except between groups B and C showed that a dose of 20 mg/kgBW was effective dose that can be given to decrease malondialdehyde’s concentration of rat liver induced by DMBA and given soursop leaf extract.

ABSTRAK

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (ANNONA MURICATA L.) TERHADAP KADAR MALONDIALDEHID PADA

JARINGAN HATI TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI DMBA

Oleh

ANNISA RATYA

Kanker hati dapat disebabkan adanya stres oksidatif karena radikal bebas. Radikal bebas bereaksi dengan lemak, sehingga terjadi peroksidasi lemak yang akan menghasilkan malondialdehid. Ekstrak daun sirsak bersifat antikanker dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap kadar malondialdehid hati tikus yang diinduksi DMBA. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan 4 kelompok perlakuan. Masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus betina galur Sprague dawley yang diberi perlakuan selama 4 minggu, yaitu kelompok K (diberikan aquades 1 ml/hari), A (diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2x/minggu dan diberikan aquades 1 ml/hari), B (diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2x/minggu dan ekstrak daun sirsak 20 mg/kgBB/hari), dan C (diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2x/minggu dan ekstrak daun sirsak 40 mg/kgBB/hari). Tikus diterminasi untuk diambil jaringan hati, lalu diperiksa kadar malondialdehidnya. Hasil penelitian menunjukkan kadar malondialdehid rerata K yaitu 1,9580 nmol/mg; A yaitu 2,3700 nmol/mg; B yaitu 1,7180 nmol/mg; dan C yaitu 1,6680 nmol/mg. Secara statistik terdapat perbedaan yang bermakna pada antar kelompok perlakuan (p<0,05), kecuali antara kelompok B dan C yang menunjukkan bahwa dosis 20 mg/kgBB merupakan dosis efektif yang dapat diberikan untuk menurunkan kadar malondialdehid hati tikus yang diinduksi DMBA dan diberikan ekstrak daun sirsak.

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) TERHADAP KADAR MALONDIALDEHID PADA JARINGAN HATI

TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI DMBA

Oleh ANNISA RATYA

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar SARJANA KEDOKTERAN

Pada

Fakultas Kedokteran Universitas Lampung

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2014

Untuk Mama dan Papa atas segala kasih sayang, doa, motivasi, dan kesabarannya. Semoga Allah selalu melindungi, dunia maupun akhirat.

“ Jadilah orang yang : Paling kokoh sikapnya, Paling lapang dadanya, Paling dalam pemikirannya, Paling luas cara pandangnya,

Paling rajin amalannya,

Paling solid penataan organisasinya,

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 29 Oktober 1993, sebagai anak pertama dari tiga bersaudara, dari Bapak Iwan Setiawan dan Ibu Siti Rahmawati.

Pendidikan Taman Kanak-kanak (TK) diselesaikan di TK Perwanida Cianjur pada tahun 1999, Sekolah Dasar (SD) diselesaikan di SDN Ibu Dewi II Cianjur pada tahun 2005, Sekolah Menengah Pertama (SMP) diselesaikan di SMP Negeri 1 Cianjur pada tahun 2008, dan Sekolah Menengah Atas (SMA) diselesaikan di SMA Negeri 1 Cianjur pada tahun 2011.

Tahun 2011, penulis terdaftar sebagai mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Lampung melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) Tertulis. Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum Anatomi pada tahun 2013 dan asisten Clinical Skill Lab pada tahun 2014. Penulis pernah aktif pada organisasi Forum Studi Islam (FSI) FK Unila dan menjadi Sekretaris Bidang Akademik pada tahun 2012, selain itu penulis juga aktif pada organisasi BEM FK Unila sebagai EA BEM pada tahun 2011, lalu menjadi Staff Ahli Dinas Pendidikan dan Profesi pada tahun 2012, dan

menjadi Wakil Gubernur BEM FK UNILA KABINET NEURAL pada tahun 2013.

Perlombaan yang pernah penulis ikuti adalah lomba poster ilmiah tingkat nasional di Universitas Muhammadiyah Jakarta pada tahun 2012 bersama Jeanna Salima dan Benny Setiyadi dan mendapat juara III, menjadi finalis poster ilmiah di Universitas Sumatera Utara pada tahun 2013, peserta lomba poster ilmiah dan karya tulis ilmiah di Universitas Udayana pada tahun 2013, olimpiade kedokteran di Universitas Sriwijaya pada tahun 2013 dengan tema kardiovaskuler, semifinalis karya tulis ilmiah Temu Ilmiah Nasional (TEMILNAS) pada tahun 2013, finalis lomba poster publik di Universitas Sriwijaya pada tahun 2013, peserta Gadjah Mada Indonesian Medical Science Olympiad (GIMSCO) pada tahun 2013, dan mendapat peringkat ke-2 mahasiswa berprestasi tingkat fakultas pada tahun 2014. Penulis juga mendapat penghargaan sebagai mahasiswi terpemimpinan dalam acara FK Unila Award 2014 oleh BEM FK Unila.

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Analisis Kualitatif Ekstrak Etanol Daun Sirsak ... 12 2. Definisi Operasional ... 27 3. Metode Pengukuran Kadar MDA ... 35 4. Kadar Malondialdehid Rerata pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA dan Diberi Ekstrak Daun Sirsak ... 42 5. Hasil Analisis Post Hoc LSD Kadar Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA dan Diberi Ekstrak Daun Sirsak ... 44

SANWACANA

Alhamdulillah, puji syukur Penulis ucapkan kehadirat Allah S.W.T., karena atas rahmat dan hidayah-Nya skripsi ini dapat diselesaikan. Shalawat serta salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad S.A.W.

Skripsi dengan judul “Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata L.) terhadap Kadar Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA” adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana Kedokteran di Universitas Lampung.

Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. Sutyarso, M.Biomed., selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung sekaligus pembahas yang telah bersedia meluangkan waktu, memberi kritik, saran serta nasihat yang bermanfaat dalam penyelesaian skripsi ini;

2. dr. Tiwuk Susantiningsih, M.Biomed, selaku Pembimbing Utama yang telah memberikan kesempatan untuk bergabung dalam penelitian, meluangkan waktu diantara kesibukan-kesibukannya baik melalui telepon, sms, ataupun berkunjung ke rumahnya, sabar dalam menghadapi

3. dr. Evi Kurniawaty, M.Sc, selaku Pembimbing Kedua atas kesediaannya untuk meluangkan waktu baik itu di kampus maupun di rumah, memberikan bimbingan, saran, kritik, serta nasihat dalam proses penyelesaian skripsi ini;

4. dr. Ety Apriliana, M.Biomed, selaku Pembimbing Akademik sejak semester awal hingga akhir di Fakultas Kedokteran yang telah meluangkan waktu diantara kesibukannya;

5. Papa, Iwan Setiawan, Ir. MM, yang selalu mendoakan, membimbing, menguatkan, dan tidak pernah lupa mengingatkan saya untuk selalu mengingat Allah S.W.T. Semoga Allah selalu melindungi dan menjadikan ladang pahala di akhirat kelak;

6. Mama, Siti Rahmawati, Amd.Keb, yang selalu mendengar segala keluh kesah, mendoakan, membimbing, dan memberikan kasih sayangnya. Semoga Allah selalu melindungi dan menjadikan ladang pahala di akhirat kelak;

7. Adik-adik saya, Athira Azzahra dan Muhamad Aufa Ahsan, yang selalu memberikan doa, dukungan, semangat, canda, dan kasih sayangnya. Juga keluarga besar saya di Pulau Jawa yang selalu memberikan dorongan dan doa;

8. Seluruh staf pengajar Program Studi Pendidikan Dokter Unila atas ilmu yang telah diberikan kepada penulis untuk menambah wawasan yang menjadi landasan untuk mencapai cita-cita;

9. Seluruh Staf Tata Usaha, Akademik, pegawai, dan karyawan FK Unila; Pak Makmun, Mba Lisa, Mba Luthfi, Mba Qori, Mba Ida, Mba Yulis, Mas Heri, Pak Iskandar, Mas Bayu dan civitas akademik lainnya yang telah memberikan doa, semangat, motivasi, dan nasihat selama pembelajaran di FK Unila;

10.Bu Nuriah, yang sangat sabar mengajari dan membimbing mengenai prosedur selama proses penelitian. Terima kasih telah menuntun kami yang masih tidak bisa apa-apa hingga kami bisa;

11.Teman-teman Annonaceous (Berta, Anggia, Karimah, dan Taufiq), atas kerja sama, bantuan, suka, duka, perjalanan, menjadi penghuni laboratorium biomolekuler dan biokimia, dan banyak hal lainnya yang tak terlupakan. Terima kasih juga kepada Sakinah, Intan Hulaima, dan Zahra Wafiyatunisa yang telah membantu selama penelitian, dan keluarga dr. Tiwuk yang turut membantu kelancaran penelitian;

12.Teman-teman sejak awal propti, Cici Yuliana Sari, Magista Vivi Anisa, Jeanna Salima, Gita Augesti, Putri Fitriana, Putri Rinawati, Bianti Nuraini, dan Aulia Agristika. Terima kasih atas kebersamaan, kerjasama, cerita, dan candaannya yang membuat suasana menjadi lebih ceria dan ramai; 13.Teman-teman yang tak kenal lelah untuk berbagi, melakukan perjalanan,

saling membantu, bercanda tawa, diam, suka, duka, bercerita, dan hal lain yang tidak bisa digantikan, Berta Yolanda Selviana, Ani Yuli Yanti, Anggia Shinta, Taufiqurrohman, I Gusti Putu, Satria Dharma, dan M. Agung Prasetya Adyana Yoga;

Beserta keluarga Ibu Kurniati atas doa dan dukungannya;

15.Sahabat-sahabat SMP dan SMA saya yang ada di Pulau Jawa, Tri Hartono, Rudi Asdi Yanto, Mutiara Nur Ramadhan, Bella Nur Kemala, Mira Nur Pratiwi, Isma Nur Azizah, Wianne Carima, Rivan Dwi Utomo, dan teman ECLAT lainnya yang telah bersedia menjadi seorang teman dan motivator; 16.Keluarga Anatomi FK Unila, dr. Anggraini Janar Wulan, M. Sc, dr. Rekha Nova Iyos, dr. Catur Ari Wibowo, Pak Habudin, Roseane Maria, Belda Evina, Anisa Nuraisa Djausal, Fauzia Andini, Selvia Farahdina, Desta Eko Indrawan, Prianggara Rostu, dan asdos anatomi lainnya. Juga teman-teman asisten CSL FK Unila. Terima kasih atas kerja sama, keceriaan, motivasi, dan ilmunya;

17.Para pejuang BEM FK Unila Kabinet Neural 2013-2014, Tiwi, Mahe, Lian, Taufiq, Alyssa, Yolanda, Novita, Vivi, Gede, Ani, Nisrina, Sandra, Ranti, Ayu, Faras, Suci, Jeanna, Inaz, Bulan, Aryati, Tanti, Fatwa, Ika, Baji, Anda, Anshori, Rania, Agam, Fathia, Edo, Sartika, Lana, Hani, Ria, Ratna, Vika, Enjel, Hana, Wayan, Kautsar, Eko Doni, Dina, Gemayang, Ira, Yesti, Eki, Yuda, Hendra, Indri, Dicky, Nindri, Nahdia, Ika, Rahma, Andrian, Devita, Belinda, Leo, Aulia, Debo, Ferina, Dina, Ridho, Anggun, Melati, Ivan, Radita, dan EA BEM FK Unila Kabinet Neural (Devita, Dara, Tiffany, Tarrini, Widya, Ulfa, Vita, Putri Ria, Rosi, Irfa, Rika, Nisa, Dian O, Astri, Amalia, Fauziah, Faridah, Ajeng, Hanifah, Azzren, Christine, Salsa, Siti Masruroh, Nurulia, Zahra, Nida, Wahid, Ria, Indrani,

Tara, Laras, Chania, Eka, Dessy, Nisa, Andi Nabilah, Sutria, Kandita, Nur Anggraini, Natasyah, Agung, Marliando, Ega, Farishal, Yoga, Jefri, Restu, Raka, Bayu, Andika, Fuad, Marco, Benny, dan Billy). Bukan institusi yang membesarkanmu, tapi kamulah yang membesarkan institusi. SAI Kedokteran;

18.Sahabat penggerak LUNAR. Kembangkan sayap, terbanglah tinggi, dan lihatlah dunia;

19.Teman sejawat 2011 yang tentu saja bisa disebutkan satu per satu, Yolanda, Anya, Tryvanie, Ayu Aprilia, Ayu Lestari, Dila, Ario, Andini, Devi, Rozi, Nurul, Oci, Pad, Ferina, Fini, Lita, Lala, Sabrine, Pau, Adit, Ane, Aulia, Fatwa, Purin, Likha, Jeanna, Caca, Ratih, Tanti, Rama, Felis, Filla, Gede, Vandy, Sugma, Novita, Lian, Stevan, Robby, Angga, Wayan, Fadil, Olin, Belda, Gusti, Gusti Ayu, Ibor, Tiara, Bela, Andina, Agatha, Anggia, Yogi, Dina, Sarah, Anggidian, Selvi, Topaz, Sandra, Dwitya, Gita, Gita Dewita, Danar, Gulbud, Giok, Belinda, Marizka, Hein, Jaya, Anwar, Fitri, Asih, Azatu, Diah, Nor, Diano, Syafiq, Neola, Cici, Andina, Melly, Kartika, Mirdes, Ika, Dika, Imay, Nayuv, Okta, Bian, Fabella, Erot, Karimah, Niluh, Ani, Tegar, Bulan, Naomi, Lina, Dea, Resty, Berta, Pufit, Yuda, Agung, Fariz, Gilang, Sakinah, Bono, Rifka, Tata, Aryati, Ririn, Ega, Zuy, Restyana, Tiwi Aminah, Taufiq, Baji, Raissa, Tagor, Gista, Fira, Desta, Mahe, Yusi, Vivi, Budiman, Satria, Yudo, Mirna, Rizqun, Dessy, Tiwi, Nyimas, Jihan, dan Mardi. Terima kasih atas segala suka duka, motivasi, keriuhan, dan kebersamaan yang terjalin selama 3,5 tahun ini;

dan yang lainnya atas bantuan, doa, dan kerja samanya;

21.Kakak-kakak dan adik-adik tingkat angkatan 2002-2014 (Kak Nora, Kak Ayu Zahera, adik-adik CSL 3 dan 4 angkatan 2012 tahun 2014, dan yang lainnya) yang sudah memberikan semangat kebersamaan dalam satu kedokteran.

Akhir kata, Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Akan tetapi, sedikit harapan semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amiin.

Bandar Lampung, Desember 2014 Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... iii

DAFTAR GAMBAR ... iv

DAFTAR LAMPIRAN ... v

I. PENDAHULUAN A.Latar Belakang ... 1

B.Perumusan Masalah ... 5

C.Tujuan Penelitian ... 6

D.Manfaat Penelitian ... 6

1. Manfaat Teoritis ... 6

2. Manfaat Praktis ... 6

E. Kerangka Pemikiran ... 7

1. Kerangka Teori ... 7

2. Kerangka Konsep ... 9

F. Hipotesis ... 9

II. TINJAUAN PUSTAKA A.Daun Sirsak ... 10

1. Potensi ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) sebagai antikanker ... 12

B.DMBA (7,12-dimethylbenz[a]anthracene) ... 14

C.Malondialdehid (MDA) ... 17

D.Hati Tikus Putih ... 19

1. Anatomi Hati Tikus Putih ... 19

2. Histologi Hati Tikus Putih ... 21

III. METODE PENELITIAN A.Desain Penelitian ... 23

B.Tempat dan Waktu Penelitian ... 23

1. Kriteria Inklusi ... 24

2. Kriteria Eksklusi ... 24

3. Kriteria Drop Out ... 24

4. Besar Sampel ... 25

D.Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 26

1. Variabel Penelitian ... 26

2. Definisi Operasional ... 26

E. Alat dan Bahan Penelitian ... 27

1. Alat Penelitian ... 27

2. Bahan Penelitian ... 28

F. Prosedur Penelitian ... 28

1. Aklimatisasi dan Pemeliharaan Hewan Coba ... 28

2. Ekstraksi Daun Sirsak dalam Etanol 70% ... 29

3. Pembuatan Larutan DMBA ... 30

4. Induksi Kanker dengan DMBA ... 30

5. Induksi Ekstrak Daun Sirsak ... 31

6. Pengambilan dan Penyimpanan Hati ... 32

7. Persiapan dan Pembuatan Homogenat Hati ... 34

8. Pengukuran Kadar Malondialdehid ... 34

G.Diagram Alir ... 35

H.Pengolahan dan Analisis Data ... 36

1. Uji Normalitas Data ... 36

2. Uji Varians ... 37

3. Uji Parametrik ... 37

4. Uji Post Hoc LSD ... 38

I. Etika Penelitian ... 38

IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A.Hasil Penelitian ... 41

B.Pembahasan ... 46

V. SIMPULAN DAN SARAN A.Simpulan ... 52

B.Saran ... 52 DAFTAR PUSTAKA

iv

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Kerangka Teori Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak terhadap Kadar

Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA .... 8

2. Kerangka Konsep Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak terhadap Kadar Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA ... 9

3. Daun Sirsak ... 10

4. Struktur annonaceous acetogenin ... 14

5. Struktur DMBA ... 14

6. Struktur Malondialdehid ... 17

7. Hati Tikus Putih ... 19

8. Anatomi Umum Tikus Putih ... 20

9. Histologi Hati Tikus Putih Pembesaran 20x ... 21

10. Skema Pembuatan Homogenat Hati ... 34

11. Alir Penelitian Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak terhadap Kadar Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA .... 36

12. Kurva Standar Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA ... 41

13. Grafik Perbandingan Kadar Malondialdehid Rerata pada Jaringan Hati Tikus Putih yang Diinduksi DMBA dan Diberi Ekstrak Daun Sirsak ... 42

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

1. Surat Keterangan Lulus Kaji Etik 2. Tabel Dummy

3. Tabel Hasil Pengamatan 4. Uji Statistik

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kanker adalah penyakit multifaktorial yang timbul dari tidak seimbangnya protoonkogen, antionkogen, gen yang mengendalikan apoptosis, dan gen yang mengatur perbaikan Deoxyribonucleic Acid (DNA) sehingga pertumbuhan sel menjadi tidak terkendali dan dapat bermetastasis (Klug et al., 2010).

Saat ini, kanker merupakan salah satu masalah kesehatan terbesar di dunia (Singh et al., 2011) dan menjadi salah satu penyakit yang paling ditakuti pada abad 20 ini. (Balachandran & Govindarajan, 2005). Pada tahun 2012, kanker merupakan penyebab kematian nomor dua setelah penyakit kardiovaskuler diantara penyakit tidak menular (Non Communicable Disease = NCD ) yang mencapai 68% dari penyebab kematian di dunia (WHO, 2014).

Pada tahun 2012 diperkirakan 14,1 juta kasus kanker baru dan 8,2 juta kematian terkait kanker, selain itu 32,6 juta orang (dengan usia diatas 15 tahun) yang menderita kanker telah didiagnosis pada lima tahun

sebelumnya. Pada tahun 2025 diperkirakan terjadi peningkatan kasus kanker menjadi 19,3 juta kasus kanker baru per tahunnya, karena pertumbuhan penduduk dan bertambahnya usia berkaitan dengan risiko kanker. Sekitar 56,8% kasus kanker dan 64.9% kematian akibat kanker terjadi di negara-negara berkembang di dunia, termasuk Indonesia (Ferlay et al., 2013). Kejadian kanker di Asia Tenggara pada tahun 2017 diperkirakan jumlahnya meningkat dua kali lipat daripada tahun 2012, begitu pula Indonesia dengan jumlah kasus sekitar 2,9 juta pada 2012 dan 5 tahun kemudian diperkirakan akan meningkat menjadi sekitar 6,4 juta kasus kanker (IACR, 2014).

Infeksi yang terus-menerus dari berbagai mikroorganisme merupakan 18% dari penyebab kejadian kanker di seluruh dunia (Mackay et al., 2006). Hubungan persentase kanker dengan infeksi tiga kali lipat lebih tinggi pada negara berkembang (26%) dibandingkan negara maju (8%) (Parkin, 2006). Salah satu keganasan yang paling umum disebabkan oleh infeksi kronis adalah kanker hati (Thun et al., 2010).

Kanker hati adalah penyebab paling umum kematian kanker ke-2 di dunia (0,8 juta, 9,1% dari total) setelah kanker paru (1,6 juta, 19,4% dari total) (Ferlay et al., 2013). Di Asia Tenggara, kanker hati menduduki peringkat ke-3 kanker yang paling banyak didiagnosis secara umum dan menjadi penyebab kematian kanker ke-2 baik pada pria maupun wanita. Sementara di Indonesia, kanker hati merupakan kanker ke-5 yang paling sering didiagnosis, tetapi menjadi penyebab kematian akibat kanker ke-4 setelah kanker paru, kanker payudara, dan kanker kolorektal (IACR, 2014).

3

Senyawa seperti 7,12-dimetilbenz[a]antrasena (DMBA) adalah zat kimia yang termasuk dalam polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) yang dapat ditemukan di alam sebagai hasil dari proses pembakaran yang tidak sempurna. DMBA telah digunakan secara luas sebagai model karsinogen dalam penelitian kanker (Singh et al., 2011) dan merupakan salah satu karsinogen kimia yang dikenal paling kuat (Samy et al., 2006) karena DMBA dikenal bersifat mutagenik, teratogenik, karsinogenik, sitotoksik, dan imunosupresif (Curfs et al., 2004).

DMBA akan memicu produksi antioksidan dan peningkatan radikal bebas sehingga menstimulasi pertumbuhan sel (Widayati, 2012). Jika radikal bebas melebihi kapasitas antioksidan, maka akan terjadi stres oksidatif pada sel yang dapat memicu karsinogenesis (Izyumov et al., 2010).

Berbagai jaringan yang dapat mengalami kerusakan akibat radikal bebas diantaranya adalah DNA, lemak, dan protein (Murray et al., 2009). Apabila radikal bebas bereaksi dengan komponen asam lemak tidak jenuh dari membran sel, maka terjadi reaksi berantai yang dikenal dengan peroksidasi lemak. Peroksidasi lemak tersebut akan menyebabkan terputusnya rantai asam lemak menjadi senyawa toksik seperti malondialdehid (Chalid, 2009). Malondialdehyde (MDA) merupakan suatu produk akhir peroksidasi lemak yang digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lemak serta dapat menggambarkan derajat stres oksidatif (Asni et al., 2009).

Di beberapa negara Asia dan Afrika, 80% dari populasinya bergantung pada obat tradisional untuk pelayanan kesehatan primer (WHO, 2012). Sekitar

60% pasien kanker mencari pengobatan alternatif. Jenis obat alternatif yang paling sering digunakan oleh pasien adalah terapi herbal, dengan asumsi bahwa produk herbal cenderung lebih aman dan memiliki efek samping yang lebih sedikit (Utami et al., 2013), sementara pada kenyataannya obat kemoterapi memang banyak menimbulkan berbagai efek samping, tidak menjamin akan terjadinya kesembuhan total, dan memungkinkan untuk terjadinya rekuren (El-Serag et al., 2008).

Daun sirsak adalah tanaman tradisional dengan sifat antikanker yang telah lama diteliti dan digunakan sebagai terapi herbal di Indonesia (Idihastuti, 2012). Daun sirsak ini mudah ditemukan di seluruh negara tropis, termasuk Indonesia. Beberapa dokter di Indonesia mulai mengkombinasikan pengobatan medis dan tradisional, salah satunya adalah dengan menggunakan kombinasi antara kemoterapi dan ekstraksi dari bahan bioaktif yang berasal dari daun sirsak (Syariefa, 2011).

Daun sirsak memiliki banyak efek farmakologi, yaitu berpotensi sebagai antibakteri (Vijayameena et al., 2013), antiinflamasi (Ojewole, 2005), hipoglikemik dan antioksidan (Adewole & Ojewole, 2009), antiparasit (Levrier et al., 2013), antifungi (Li et al., 2013), hepatoprotektif (Arthur et al., 2011), dan kemopreventif (Prakash et al., 2013).

Daun sirsak menunjukkan sitotoksisitas dan selektivitas yang luar biasa terhadap sel kanker (Gholse & Yadav, 2012). Zat aktif pada tanaman sirsak yang mampu berperan sebagai antikanker adalah annonaceous acetogenins, senyawa tanin, dan flavonoid (Retnani, 2011).

5

Ekstrak daun sirsak lebih menghambat proses onkogenesis daripada infusa, karena kandungan metabolit aktif pada ekstrak dengan metode maserasi akan lebih baik dibanding dengan zat-zat pada metode infusa (Setiyadi et al., 2014). Ekstrak daun sirsak telah menunjukkan toksisitas selektif untuk sel tumor pada dosis yang sangat rendah (Gholse & Yadav, 2012), tetapi dosis sangat tinggi dapat menyebabkan kerusakan ginjal sehingga menyebabkan gagal ginjal dan memiliki efek negatif pada fungsi rahim, sehingga untuk penggunaan jangka panjang fungsi ginjal harus dipantau dan tidak digunakan selama kehamilan (Arthur et al., 2011). Dari uraian di atas maka penulis tertarik untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap kadar malondialdehid pada jaringan hati tikus putih yang diinduksi DMBA.

B. Perumusan Masalah

Apakah pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) memiliki pengaruh terhadap kadar malondialdehid pada jaringan hati tikus putih yang diinduksi DMBA ?

C. Tujuan Penelitian

Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap kadar malondialdehid pada jaringan hati tikus putih yang diinduksi DMBA.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat Teoritis

Untuk pengembangan ilmu pengetahuan biomedik, biokimia, dan farmakologi mengenai pengaruh ekstrak daun sirsak terhadap kadar malondialdehid pada jaringan hati tikus yang diinduksi DMBA.

2. Manfaat Praktis a. Bagi peneliti

Sebagai wujud pengaplikasian ilmu yang telah didapat selama masa pembelajaran di perguruan tinggi sehingga dapat mengembangkan wawasan keilmuan peneliti.

b. Bagi peneliti lain

Sebagai referensi bagi peneliti lain mengenai ekstrak daun sirsak sebagai antikanker.

c. Bagi masyarakat

Memberikan informasi kepada masyarakat tentang manfaat daun sirsak dalam mengobati kanker.

7

E. Kerangka Pemikiran

1. Kerangka Teori

7,12-dimetilbenz[a]antrasena (DMBA) adalah zat kimia yang termasuk dalam polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) yang dapat ditemukan di alam sebagai hasil dari proses pembakaran yang tidak sempurna (Dimitrova-Shumkovska et al., 2010) dan dikenal bersifat mutagenik, teratogenik, karsinogenik, sitotoksik, dan immunosupresif (Curfs et al., 2004). Senyawa ini dapat membentuk metabolit reaktif dan menyebabkan suatu ikatan DNA dengan karsinogen (DNA adduct) pada sel hati. DNA adduct akan memacu terjadinya mutasi genetik dan abnormalitas gen (Meiyanto et al., 2011). DMBA merupakan salah satu stresor dalam bentuk senyawa kimia yang dapat menyebabkan peningkatan radikal bebas sehingga terjadi gangguan homeostasis sel (Widayati, 2012). Berbagai jaringan yang dapat mengalami kerusakan akibat radikal bebas diantaranya adalah Deoxyribonucleic Acid (DNA), lipid, dan protein (Murray et al., 2009). Apabila radikal bebas melebihi kapasitas antioksidan, maka akan terjadi stres oksidatif pada sel yang dapat memicu karsinogenesis (Izyumov et al., 2010). Interaksi radikal bebas dengan basa dari DNA dapat merubah struktur kimia DNA, apabila tidak diperbaiki akan mengalami mutasi yang dapat diturunkan, terutama bila terjadi kerusakan DNA pada sel somatik dapat mengarah pada inisiasi keganasan (Murray et al., 2009). Apabila radikal bebas

bereaksi dengan komponen asam lemak dari membran sel, maka terjadi reaksi berantai yang dikenal dengan peroksidasi lemak (Chalid, 2009). Peroksidasi lemak tersebut akan menyebabkan terputusnya rantai asam lemak menjadi berbagai senyawa toksik seperti malondialdehid (MDA) yang digunakan sebagai biomarker biologis peroksidasi lemak serta dapat menggambarkan derajat stres oksidatif (Asni et al., 2009). Daun sirsak dengan zat aktif yang mampu berperan sebagai antikanker, yaitu annonaceous acetogenins, senyawa tanin, dan flavonoid (Retnani, 2011) menunjukkan sitotoksisitas dan selektivitas yang luar biasa terhadap sel kanker dengan menginduksi apoptosis, menghambat proliferase sel, dan sebagai antioksidan eksogen (Gholse & Yadav, 2012).

Gambar 1. Kerangka Teori Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak terhadap Kadar Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang

9

2. Kerangka Konsep

Variabel independen pada penelitian ini adalah dosis ekstrak daun sirsak yang terdiri dari dosis 20 mg/kgBB dan 40 mg/kgBB. Variabel independen ini akan mempengaruhi variabel dependen, yaitu kadar malondialdehid jaringan hati tikus yang diinduksi DMBA.

Gambar 2. Kerangka Konsep Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak terhadap Kadar Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang

Diinduksi DMBA

F. Hipotesis

Pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) dapat mempengaruhi kadar malondialdehid pada jaringan hati tikus putih yang diinduksi DMBA.

Variabel independen Variabel dependen

Dosis ekstrak daun sirsak Kadar malondialdehid jaringan hati tikus putih yang

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Daun Sirsak

Gambar 3. Daun Sirsak (Purwatresna, 2012)

Tanaman sirsak memiliki sebaran penanaman yang sangat luas. Ia tumbuh baik di dataran rendah sampai ketinggian 1000 meter di atas permukaan laut (Redaksi Trubus, 2012). Tanaman ini telah menyebar di seluruh pelosok Indonesia (Sunarjono, 2005) dan dapat tumbuh pada daerah tropis dan subtropis (Orwa et al., 2009) yang berifat tahunan (Subagja, 2013). Tanaman ini dapat tumbuh pada semua jenis tanah dengan derajat keasaman (pH) antara 5-7 , suhu udara yang sesuai antara 22-320C , dan memerlukan sinar matahari antara 50-70% (Sunarjono, 2005).

11

Taksonomi tanaman sirsak (Annona muricata L.) yaitu sebagai berikut : Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyldonae Famili : Annonaceae Genus : Annona

Species : Annona muricata L. (Herliana & Rifai, 2011).

Daun sirsak berbentuk bulat telur agak tebal. Permukaan bagian atasnya halus berwarna hijau tua dan bagian bawahnya berwarna lebih muda (Pradana, 2013).

Kini daun sirsak mulai gencar ditingkatkan pemanfaatannya maupun penggunaannya. Memang rasa daun sirsak jauh dari kata lezat jika dibandingkan dengan buahnya. Namun daun sirsak ternyata banyak dimanfaatkan sebagai obat herbal seperti untuk penyakit kulit, rematik, batuk, flu, kanker (Orwa et al., 2009), dan hipertensi (Lans, 2006).

Daun sirsak memiliki kandungan acetogenins, annocatacin, annocatalin, annohexocin, annoanacin, annomuricin, dan anonol yang bermanfaat bagi tubuh, yaitu mulai dari meningkatkan daya tahan tubuh hingga mampu mengobati penyakit tertentu seperti kanker, nyeri rematik, menghambat pertumbuhan virus dan bakteri, menghambat terjadinya mutasi gen, mengobati cacingan, mengobati hepatitis, flu, kejang, dan lain sebagainya (Dewi & Hermawati, 2013).

1. Potensi ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) sebagai antikanker

Berbagai senyawa yang diisolasi dari daun sirsak diketahui efektif melawan proliferase sel. Senyawa tersebut menunjukkan efek sitotoksik baik dengan merusak DNA atau dengan menghalangi pembentukan mitosis selama tahap pembelahan sel (George et al., 2012).

Tabel 1. Analisis Kualitatif Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Minari & Okeke, 2014)

No. Komponen fitokimia Ekstrak etanol

1 Saponin -

2 Terpenoid +

3 Steroid +

4 Flavonoid +

5 Cardiac glicoside +

6 Tanin +

7 Fenol +

8 Flobatanin -

9 Alkaloid +

10 Reducing sugar +

Keterangan : (+) : ada fitokimia; (-): tidak ada fitokimia

Flavonoid dan tanin merupakan senyawa fenolik pada tanaman. Flavonoid meningkatkan efek vitamin C dan berfungsi sebagai antioksidan (Vijayameena et al., 2013). Senyawa fenolik ini berpengaruh terhadap pembersihan radikal bebas dan memiliki potensi antineoplasma (George et al., 2012). Selain itu, terdapat efek antiproliferasi dari polifenol herbal di berbagai sel kanker manusia (Bishayee et al., 2013).

13

Pengaruh preventif ekstrak etanol daun sirsak terhadap kerusakan DNA yang diinduksi DMBA dapat dikarenakan adanya berbagai metabolit sekunder (tanin, terpenoid, cardiac glikosida (CGs), dan flavonoid). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki aktivitas antikanker (Kuno et al., 2012).

Terdapat kelompok senyawa aktif acetogenins pada daun anggota famili Annonaceae yang berkhasiat sitotoksik. Prinsip dasar acetogenins adalah menghambat sintesis adenosine trifosfat (ATP) oleh mitokondria sel yang dibutuhkan oleh sel kanker (Redaksi Trubus, 2012).

Acetogenins yang merupakan kumpulan senyawa aktif seperti muricatosin A, muricatosin B, annomuricin E, muricapentocin, annopentocin A, annopentocin B, dan annopentocin C masuk dan menempel di reseptor dinding sel untuk merusak ATP di dinding mitokondria. Sel kanker memiliki kemampuan untuk membelah cepat, yakni setiap 2-5 jam. Sedangkan sel normal biasanya 7-14 hari. Pembelahan yang cepat memerlukan energi yang cukup besar berasal dari ATP. Jika pasokan energi berkurang, aktivitas sel kanker melambat dan akhirnya terjadi apoptosis. Acetogenins sangat selektif, hanya menyerang sel kanker, yaitu yang memiliki kelebihan ATP. Senyawa ini tidak menyerang sel-sal lain yang normal di dalam tubuh. Mitokondria sendiri merupakan organel tempat berlangsungnya respirasi sel, metabolisme lemak, dan penghasil energi ATP (Redaksi Trubus, 2012).

Gambar 4. Struktur annonaceous acetogenin (Kojima & Tanaka, 2009)

Selain itu, salah satu senyawa annonaceous acetogenins, yaitu bullatacin, secara khusus membunuh sel kanker yang resisten terhadap obat-obatan dengan menghambat produksi ATP, sehingga menghilangkan sumber energi sel kanker. Selektivitas yang luar biasa terhadap sel kanker terutama terdapat pada daunnya (Gholse & Yadav, 2012).

B. DMBA (7,12-dimethylbenz[a]anthracene)

15

DMBA memiliki 4 cincin benzena dan termasuk dalam tujuh polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) yang dapat menyebabkan kanker pada manusia. Secara alami DMBA dapat ditemukan di alam sebagai hasil dari proses pembakaran yang tidak sempurna, seperti dalam asap tembakau, asap pembakaran kayu, asap pembakaran gas, bensin, minyak, batubara atau daging. Senyawa DMBA dapat ditemukan di dalam air, tanah maupun udara (Budi & Widyarini, 2010).

DMBA adalah bahan karsinogen yang kuat dan spesifik yang banyak digunakan dalam laboratorium penelitian kanker sebagai inisiator dan promosi tumor, sehingga membuat pertumbuhan tumor menjadi cepat (Miyata et al., 2001). DMBA yang dikenal sebagai sitotoksik, karsinogenik, dan mutagenik sebagai analog dari PAH akan mengaktivasi sitokrom P450 yang bisa menyebabkan mutasi DNA dan menyebabkan terjadinya kanker (Buters et al., 2003).

Oleh CYP, DMBA diubah menjadi DMBA–3,4–diol–1,2–epoksida (DMBA-DE), metabolit bersifat genotoksik, reaktif oksidatif dan hematotoksik-imunosupresif. Pembentukan DMBA-DE tergantung pada aktivitas enzim CYP (1A1/1B1). Peningkatan jumlah DMBA-DE dalam tubuh sebanding dengan peningkatan jumlah dan aktivitas enzim CYP1A1. Meningkatnya onkogen dan menurunnya ekspresi tumor supressor gen (antionkogen) akibat DMBA-DE meningkatkan kejadian kanker (Akrom, 2012).

Metabolit aktif dari DMBA akan berikatan dengan DNA (DNA adduct), selanjutnya ikatan dengan DNA akan turun hingga 50% 16 jam pasca

paparan dengan DMBA. Namun demikian, apabila paparan DMBA dilakukan terus menerus selama 42 hari, maka akan terjadi ikatan yang menetap antara metabolit aktif DMBA dan DNA yang akan memicu munculnya kanker (Budi & Widyarini, 2010). Pembentukan nodul tumor diawali dengan pembentukan DNA adduct oleh DMBA-DE (Akrom, 2012). Mekanisme aktivasi DMBA melibatkan CYPlAl menjadi intermediate reaktif yang dapat merusak DNA, yaitu terbentuknya epoksida dihidrodiol. Epoksida dehidrodiol akan mengikat DNA secara kovalen menjadi bentuk adduct yang stabil (Hamid & Meiyanto, 2009). Epoksida dehidrodiol, metabolit aktif yang dihasilkan selama aktivasi metabolik DMBA akan mengikat dan menyebabkan kerusakan pada DNA (Manoharan & Selvan, 2012). Jalur epoksida dehidrodiol inilah yang bertanggung jawab terhadap inisiasi tumor karsinogenik DMBA dibanding bentuk kation radikal (Hamid & Meiyanto, 2009).

Langkah awal dalam tumorigenesis bergantung pada enzim sitokrom P450 yang memetabolisme DMBA ke dalam epoksida mutagenik sedang yang siap membentuk DNA adduct. DNA adduct ini berhubungan dengan mutasi DNA dan transformasi maligna yang diperkirakan terlibat dalam karsinogenesis yang dimediasi oleh PAH (Currier et al., 2005). Banyaknya paparan radikal bebas seperti DMBA yang terdapat di lingkungan menyebabkan sangat besar kemungkinan radikal bebas tersebut berikatan dengan sel di dalam tubuh. DMBA dimetabolisme di hati dan akan menjadi

17

senyawa yang reaktif setelah mengalami metabolisme, hal ini dapat menyebabkan kerusakan hati (Sari, 2008).

DMBA dimetabolisme di hati tikus menjadi metabolit 7–hydoxy–DMBA oleh karena metabolit tersebut yang bersifat reaktif oksidan terhadap DNA sel. Beberapa studi memperlihatkan bahwa senyawa DMBA yang tidak mengalami biotransformasi menjadi 7–hydoxy–DMBA gagal dalam menyebabkan karsinoma (Nair & Varalakshmi, 2011). Pelepasan molekul biologis aktif dari sel Kupffer yang telah aktif, terlibat dalam mekanisme toksikologi dan hepatokarsinogenik (Koul et al., 2014).

C. Malondialdehid (MDA)

Gambar 6. Struktur Malondialdehid (Royal Society of Chemistry, 2014)

Senyawa radikal bebas yang berlebihan menyebabkan stres oksidatif sehingga terjadi kerusakan atau kematian sel. Radikal bebas mengoksidasi dan menyerang komponen lemak membran sel. Kerusakan oksidatif pada senyawa lipid terjadi ketika senyawa radikal bebas bereaksi dengan senyawa polyunsaturated fatty acid (PUFA) (Winarsi, 2007).

Hal ini disebabkan karena PUFA merupakan sasaran utama bagi radikal bebas. Fosfolipid dan glikolipid merupakan membran lemak bilayer

terpenting yang mengandung asam lemak tak jenuh dan mudah terkena serangan radikal, sehingga menimbulkan reaksi berantai yang disebut peroksidasi lemak (Panut, 2012).

Peroksidasi lemak merupakan suatu rangkaian proses yang terdiri atas 3 tahapan, yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi. Peroksidasi lemak dapat diakhiri dengan adanya reaksi antara satu radikal dengan radikal lainnya atau antioksidan (Winarsi, 2007). Produk oksidasi lemak yang diinduksi oleh stres oksidatif akan membentuk radikal bebas oksigan, salah satunya adalah malondialdehid (MDA). MDA sebagai salah satu produk peroksidasi lemak yang bersifat toksik terhadap sel merupakan senyawa dialdehid yang memiliki tiga rantai karbon (Donne et al., 2006).

Peroksidasi lemak merupakan hasil kerja radikal bebas yang diketahui paling awal dan paling mudah pengukurannya. Oleh karena itu, reaksi ini paling sering dilakukan untuk mempelajari stres oksidatif. MDA sebagai salah satu produk peroksidasi lemak telah diakui sebagai salah satu penanda biologis stres oksidatif yang dipercaya. Adanya peningkatan MDA menunjukkan peningkatan aktivitas peroksidasi lemak (Donne et al., 2006). Senyawa PAH menghasilkan tingkat yang tinggi dalam meningkatkan peroksidasi lemak pada sel hati. Hati merupakan organ yang rentan terhadap metabolisme kimia sehingga menyebabkan hepatotoksisitas. Peningkatan perdoksidasi lemak mengindikasikan kerusakan pada hati (Ubani et al., 2012).

19

Meningkatkanya radikal bebas dapat berpengaruh pada perkembangan penyakit hati, seperti virus hepatitis dan kanker hati (Hanif et al., 2005).

D. Hati Tikus Putih

Klasifikasi tikus putih (Rattus novergicus) : Kingdom : Animalia

Filum : Chordata Subfilum : Vertebrata

Kelas : Mammalia

Ordo : Rodentia

Famili : Muridae Genus : Rattus

Spesies : Rattus novergicus (Sowash, 2009)

1. Anatomi Hati Tikus Putih

Gambar 7. Hati Tikus Putih (A. Lobus media; B. Lobus lateral dextra; C. Lobus lateral sinistra; D. Lobus kaudatus) (Vinerean, 2014)

Hati menempati urutan ketiga kranial dari rongga perut dan terdiri dari beberapa lobus. Hati tikus terdiri dari 4 lobus utama yang saling berhubungan di bagian belakang (Ishbah, 2012). Pada dasarnya dibagi menjadi lobus kiri, tengah, kanan, dan lobus kaudatus. Sebuah kapsul jaringan ikat tipis yang secara eksternal dilapisi oleh peritoneal menutupi permukaan parietal dan visceral hati. Lobus tengah terdapat celah tempat ligamentum falsiforme berada. Pada tikus putih, kantong empedu terletak di fisura lobus tengah. Lobus kanan berada di bagian anterior dan posterior dan lobus kaudatus terdiri dari dua atau lebih sublobus (Eustis et al., 1990)

Gambar 8. Anatomi Umum Tikus Putih (Conti et al., 2004)

Hati memiliki pasokan darah ganda, dari vena porta hepatika dan arteri hepatika. Arteri hepatika menyuplai darah yang teroksigenasi. Sekitar 75% darah dikirim ke hati melalui vena porta hepatika. Cabang-cabang

21

arteri hepatika dan vena porta terlihat di triad porta hepatika bersama dengan saluran empedu. Saluran-saluran empedu bergabung untuk membentuk saluran hati menuju ke kantong empedu pada tikus putih. Darah mengalir dari daerah porta ke vena sentral di bagian tengah masing-masing lobulus sementara empedu mengalir dari lobulus hepatik sentral ke daerah portal dan duktus hepatika (Harada et al., 1999).

2. Histologi Hati Tikus Putih

Gambar 9. Histologi Hati Tikus Putih Pembesaran 20x (Gambaran triad

porta yang terdiri dari duktus biliaris, vena porta, dan arteri hepatika) (Conti et al., 2004)

Septa interlobular pada hati yang terdiri dari jaringan ikat akan memisahkan tiap lobulus dan membentuk triad porta yang terdiri dari arteri hepatika, vena porta, dan duktus biliaris. Di pusat setiap lobulus hati, terdapat vena sentral yang merupakan cabang dari vena hepatika.

Pada permukaan apikal hepatosit terdapat kanalikuli biliaris yang saling berhubungan dan merupakan bagian pertama dari sistem duktus biliaris. Pada sinusiod terdapat sel Kuppfer yang berfungsi seperti makrofag dan bersifat fagosit pada hati (Conti et al., 2004; Thoolen et al., 2010).

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Desain Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan Post Test Only Control Group Design. Pengambilan data dilakukan hanya pada saat akhir penelitian setelah dilakukannya perlakuan dengan membandingkan hasil pada kelompok yang diberi perlakuan dengan kelompok yang tidak diberi perlakuan.

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini telah dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Lampung selama 4 bulan, yaitu dari bulan September sampai bulan Desember 2014.

C. Populasi dan Sampel

Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan dari pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap jaringan hati tikus putih

yang diinduksi DMBA, agar lebih efisien dari segi waktu dan biaya karena membutuhkan banyak sampel sementara jaringan masih bisa digunakan untuk penelitian lanjutan. Populasi adalah tikus (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley berusia 6-7 minggu dengan berat antara 100-200 gr yang diperoleh dari Institut Pertanian Bogor (IPB). Hewan ini memiliki sistem metabolisme yang mirip dengan manusia, dapat ditemukan dan ditangani dengan mudah, serta diharapkan pengambilan data dapat lebih akurat dibandingkan jika menggunakan mencit sebagai hewan coba, karena tubuh mencit yang relatif lebih kecil (Vanessa, 2014). Sampel adalah jaringan hati tikus populasi yang telah diinduksi dengan DMBA dengan dosis dan kurun. 1. Kriteria Inklusi

a. Tikus putih betina galur Sprague dawley

b. Sehat (gerak aktif, rambut tidak kusam, rontok, atau botak) c. Memiliki berat badan 100-200 gr

d. Berusia sekitar 6-7 minggu 2. Kriteria Ekslusi

a. Tikus sakit atau mati sebelum mendapat perlakuan 3. Kriteria Drop Out

a. Tikus mati

b. Tikus tampak sakit (gerakan tidak aktif, tidak mau makan, penampakan rambut kusam, rontok, atau botak)

25

4. Besar sampel

Pada uji eksperimental rancangan acak lengkap, besar sampel penelitian yang digunakan ditentukan dengan menggunakan rumus Federer :

(t)(n-1) ≥ 15

dengan (t) adalah jumlah kelompok perlakuan, dan (n) adalah jumlah ulangan pada masing-masing kelompok.

(t)(n-1) ≥ 15 (4)(n-1) ≥ 15 4n - 4 ≥ 15

4n ≥ 19 n ≥ 4,75

n ≥ 5

Dari perhitungan di atas, dibutuhkan jumlah sampel minimal sebanyak 5 ekor tikus untuk tiap kelompok.

Dalam penelitian ini digunakan 20 ekor tikus putih betina galur Sprague Dawley yang terbagi dalam 4 kelompok (masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor), yaitu: .

a. Kelompok kontrol negatif (K) : tikus yang hanya diberi aquades 1 ml per hari selama 4 minggu

b. Kelompok kontrol positif (A) : diinduksi DMBA 2 x 20 mg/kg BB seminggu selama 4 minggu dan diberi aquades 1 ml per hari selama 4 minggu

c. Kelompok perlakuan 1 (B) : diinduksi DMBA 2 x 20 mg/kg BB seminggu selama 4 minggu dan diberi ekstrak daun sirsak dosis 20 mg/kg BB sekali sehari selama 4 minggu

d. Kelompok perlakuan 2 (C) : diinduksi DMBA 2 x 20 mg/kg BB seminggu selama 4 minggu dan diberi ekstrak daun sirsak dosis 40 mg/kg BB sekali sehari selama 4 minggu

D. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel terikat: kadar malondialdehid jaringan hati tikus putih b. Variabel bebas: dosis ekstrak daun sirsak

2. Definisi Operasional

Untuk memudahkan pelaksanaan penelitian agar penelitian tidak menjadi terlalu luas maka dibuat definisi operasional pada tabel 2 sebagai berikut:

27

Tabel 2. Definisi Operasional

Variabel Definisi Skala

Dosis ekstrak daun sirsak

Ada 4 kelompok dengan perlakuan yang berbeda, yaitu:

1. Kelompok K (kontrol negatif) = pemberian aquades 1 ml setiap hari selama 4 minggu 2. Kelompok A (kontrol positif) = pemberian

DMBA 2x20 mg/kgBB seminggu (selama 4 minggu) + aquades 1 ml setiap hari selama 4 minggu

3. Kelompok B (perlakuan) = pemberian DMBA 2x20 mg/kgBB seminggu (selama 4 minggu) + ekstrak daun sirsak 20 mg/kgBB/hari selama 4 minggu

4. Kelompok C (perlakuan) = pemberian DMBA 2x20 mg/kgBB seminggu (selama 4 minggu) + ekstrak daun sirsak 40 mg/kgBB/hari selama 4 minggu

Kategorik

Kadar

malondoaldehid tikus

Pengamatan dilakukan dengan membandingkan kadar malondialdehid antara kelompok perlakuan coba dengan kelompok positif dan kelompok negatif

Numerik

E. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat Penelitian

Peralatan yang digunakan adalah gelas ukur 500 ml, blender, rotary evaporator, kertas saring, kandang, tempat minum dan makan, timbangan digital, sonde lambung berujung Nasogastric tube (NGT), alat bedah minor, pH meter, timbangan digital, tabung erlenmeyer 500 ml,

tabung penyimpanan, upright freezer – 800C Kaltis, gelas ukur 100 ml, micropestle, sentrifuge Eppendorf 5417R, tabung eppendorf ukuran 2 ml, waterbath Memmert, spektrofotometer S-30 Boeco, mikropipet ukuran 1000 µl, vortex Biosan, lemari es ±40C, dan magnetic stirrer.

2. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia daun sirsak 500 mg, tikus putih betina (Rattus novergicus) galur Sprague Dawley, etanol 70%, 7,12-dymethyilbenz(a)antracene (DMBA), minyak jagung, akuades, ketamine-xylazine, larutan Phospate Buffer Saline (PBS) 0,05 M (5,4376 gr Na2HPO4, 2,6469 gr KH2PO4, dan 2,250 gr NaCl), akuabides, Tetra Etoksi Propan (TEP), TCA (asam trikloro asetat), dan TBA (asam tiobarbiturat).

F. Prosedur Penelitian

1. Aklimatisasi dan Pemeliharaan Hewan Coba

Aklimatisasi hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley yang berusia 6-7 minggu dengan berat antara 100-200 gr selama 1 minggu untuk adaptasi di tempat pemeliharaan dalam menyeragamkan cara hidup dan makanannya sebelum dilakukan percobaan. Tikus ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup terbuat dari kawat ram dan dialasi sekam, makanan tikus berupa pelet. Pemberian makanan dan minuman diberikan ad libitum. Lingkungan kandang dibuat agar tidak

29

lembab, suhu kandang dijaga sekitar 250C, dan ada pertukaran gelap dan terang setiap 12 jam. Masing-masing kelompok tikus diletakkan dalam kandang tersendiri dan dijaga sedemikian rupa sehingga tidak saling berinteraksi. Kesehatan tikus dipantau setiap hari. Berat badan tikus ditimbang setiap minggu sampai tikus diterminasi.

2. Ekstraksi Daun Sirsak dalam Etanol 70%

Pembuatan ekstrak daun sirsak menggunakan bahan berupa daun sirsak pada bagian ke-5 setelah pucuk daun, daunnya tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda, yaitu yang berwarna hijau segar. Hal tersebut dikarenakan tanaman sirsak tumbuh di dataran rendah maka akan mendapatkan intensitas cahaya matahari yang lebih tinggi dan proses fotosintesis terpacu lebih tinggi, sehingga lebih banyak zat aktif terbentuk (Redaksi Trubus, 2012).

Daun sirsak yang telah dikeringkan sebanyak 500 gr, kemudian digiling dan diayak dengan ayakan yang sesuai. Setelah itu, daun sirsak direndam dalam larutan etanol 70%. Larutan etanol 70% digunakan untuk mengurangi toksisitas pada ekstrak daun sirsak terhadap hewan coba. Setiap hari rendaman diaduk dan disaring sampai didapatkan maserat yang jernih. Maserat dikentalkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kering. Dari 500 gr simplisia daun sirsak didapatkan ekstrak daun sirsak seberat 118,7 gr.

3. Pembuatan Larutan DMBA

Pelarut yang digunakan untuk senyawa DMBA adalah minyak jagung karena DMBA larut dalam pelarut ini. Minyak jagung merupakan senyawa inert yang digunakan untuk melarutkan DMBA dan tidak memiliki sifat karsinogenik (Singletary et al., 2007). Dosis serta frekuensi DMBA yang digunakan yaitu 20 mg/kgBB, dua kali seminggu selama 4 minggu, selain itu disebutkan pula bahwa pemberian DMBA dengan dosis 20 mg/kgBB sebanyak 10 kali dalam 4 minggu telah dapat mengakibatkan perubahan secara mikroskopis (Meiyanto, 2007). Hasil uji pendahuluan dengan menggunakan tikus yang diberi DMBA dengan dosis 20 mg/kgBB menunjukkan adanya benjolan pada paru-paru, hasil histopatologi dari benjolan tersebut menunjukkan bahwa kanker telah terbentuk (Hanafi, 2009).

4. Induksi Kanker dengan DMBA

Mula-mula tikus ditimbang untuk mengetahui volume larutan DMBA dan ekstrak daun sirsak yang akan diberikan. Bahan yang akan digunakan untuk larutan DMBA adalah serbuk DMBA yang dilarutkan dalam minyak jagung. Induksi menggunakan sonde oral, seminggu dua kali dengan dosis 20 mg/kgBB yang dilarutkan dalam minyak jagung dan diberikan selama 4 minggu. Berat tikus rata-rata yang digunakan adalah 200 gr, sehingga perhitungan dosis yang diberikan pada tikus adalah:

31

Kemudian 4 mg DMBA ini dilarutkan dalam 1 ml minyak jagung untuk diberikan secara per oral dengan menggunakan sonde lambung. Setiap tikus pada kelompok A, B, dan C dengan berat ± 200 gr mendapatkan 1 ml larutan DMBA dengan konsentrasi 4mg/ml.

5. Induksi Ekstrak Daun Sirsak

Ekstrak daun sirsak diberikan dengan dosis 20 mg/kgBB pada kelompok B dan 40 mg/kgBB pada kelompok C dengan menggunakan sonde lambung selama 4 minggu setiap harinya. Berat tikus rata-rata yang digunakan adalah 200 gr, sehingga perhitungan dosis ekstrak daun sirsak yang akan diberikan pada tikus adalah :

Dosis ekstrak daun sirsak untuk kelompok B

Dosis ekstrak daun sirsak untuk kelompok C

Kemudian dari masing-masing dosis ini dilarutkan dalam 1 ml akuades untuk diberikan secara per oral dengan menggunakan sonde lambung. Setiap tikus dengan berat ± 200 gr mendapatkan 1 ml larutan ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 4mg/ml untuk kelompok B dan konsentrasi 8 mg/ml untuk kelompok C.

Dosis tersebut diberikan untuk mengurangi toksisitas pada ginjal hewan coba dengan penggunaan jangka panjang (Dayeef et al., 2013). Selama penginduksian senyawa DMBA, tikus setiap hari diinduksi ekstrak daun sirsak. Penginduksian DMBA dan esktrak daun sirsak dilakukan selama 4 minggu. Sonde untuk tikus kontrol dibedakan dengan tikus perlakuan untuk mencegah adanya kontaminasi. Berat badan tikus ditimbang sebelum, selama, dan setelah intervensi.

6. Pengambilan dan Penyimpanan Hati

Terminasi tikus dilakukan setelah perlakuan terakhir. Tikus diterminasi dengan anastesi terlebih dahulu menggunakan ketamine:xylazine dosis 75-100mg/kg : 5-10 mg/kg (perbandingan 10:1) secara IP, kemudian di euthanasia dengan metode cervical dislocation (AVMA, 2013).

33

Pemberian ketamine:xylazine merupakan euthanasia metode noninhalasi dan biasa digunakan sebagai langkah pertama dari metode euthanasia dua langkah yang dapat menghilangkan kesadaran dengan cepat, yaitu sekitar tiga sampai lima detik setelah injeksi. Sementara cervical dislocation merupakan euthanasia metode fisik yang dapat digunakan pada tikus

dengan berat badan ≤ 200 gr, karena jika berat badan tikus lebih berat maka akan terdapat massa otot yang besar di area servikal sehingga menyulitkan dislokasi servikal. Cara melakukan dislokasi servikal pada tikus yaitu dengan meletakkan ibu jari dan jari telunjuk di setiap sisi leher pada dasar tengkorak untuk memberi tekanan ke bagian posterior dasar tulang tengkorak dan sumsum tulang belakang, sementara tangan lainnya pada bagian ekor lalu ditarik dengan cepat sehingga terjadi pemisahan vertebra servikal dari tengkorak dan terjadi pemisahan sumsum tulang belakang dari otak. Cervical dislocation hanya bisa dilakukan oleh tenaga ahli (AVMA, 2013).

Setelah itu jaringan hati tikus diambil lalu dimasukkan dalam tabung penyimpanan organ lalu masukkan dalam lemari es -40C selama 1 hari, setelah itu masukkan dalam upright freezer suhu – 800C. Jaringan yang disimpan pada freezer suhu – 800C akan tahan sampai 5 tahun (Stacey & Day, 2007; Tindall, 2007; Watt et al., 2007).

7. Persiapan dan Pembuatan Homogenat Hati

Sampel jaringan hati diambil dari upright freezer suhu –800C dan dimasukkan ke dalam lemari es dengan suhu -200C selama 1 hari, lalu dipindahkan ke lemari es dengan suhu -40C.

Gambar 10. Skema Pembuatan Homogenat Hati

8. Pengukuran Kadar Malondialdehid

Pengukuran kadar MDA dilakukan dengan metode Wills (1987). Prinsipnya adalah mereaksikan MDA dengan asam tiobarbiturat sehingga terbentuk senyawa berwarna yang memberikan serapan maksimal pada panjang gelombang 530 nm.

35

Tabel 3. Metode Pengukuran Kadar MDA

Bahan Blanko Standar (Duplo) (nmol/mg) Uji (Duplo)

0,625 1,25 2,5 5

Akuabides 400 µL 395 µL 390 µL 380 µL 360

µL 200 µL Standar

TEP (1:80.000)

- 5 µL 10 µL 20 µL 40 µL -

Supernatan - - - 200 µL

TCA 20% 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200

µL 200 µL Vortex Sentrifuge 3500 rpm selama 10 menit, ambil supernatan TBA 0,67% 400 µL 400 µL 400 µL 400 µL 400

µL 400 µL Inkubasi pada penangas air 950C selama 10 menit, lalu dinginkan hingga

suhu ruang selama 5 menit. Baca pada serapan panjang gelombang 530 nm

G. Diagram Alir

Pada penelitian ini akan menggunakan tikus putih sebanyak 20 ekor yang dibagi dalam 4 kelompok sebagai sampel untuk diambil jaringan hatinya. Tikus putih diaklimatisasi selama 1 minggu lalu diberi perlakuan selama 4 minggu, setelah itu diterminasi dan diambil jaringan hatinya. Setelah itu diukur kadar malondialdehidnya, berikut kerangka penelitiannya:

Gambar 11. Alir Penelitian Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirsak terhadap Kadar Malondialdehid pada Jaringan Hati Tikus Putih yang

Diinduksi DMBA

H. Pengolahan dan Analisis Data

1. Uji Normalitas Data

Analisis statistik dilakukan dengan bantuan program statistik. Hasil penelitian akan dianalisis apakah memiliki distribusi normal atau tidak secara statistik dengan uji normalitas Shapiro-Wilk karena jumlah sampel kurang dari 50. Jika distribusi data normal, maka didapatkan hasil

37

p>0,05. Jika tidak normal maka dilakukan transformasi data terlebih dahulu (Dahlan, 2013).

2. Uji Varians

Uji varians (Levene’s test) digunakan untuk mengetahui apakah dua atau lebih kelompok data mempunyai varians yang sama atau tidak. Jika didapatkan hasil p>0,05 maka varians data yang diuji adalah sama. Jika tidak sama maka dilakukan transformasi data (Dahlan, 2013).

3. Uji Parametrik

Syarat uji parametrik, yaitu:

a. Masalah skala pengukuran variabel : skala pengukuran variabel harus variabel numerik.

b. Distribusi data harus normal c. Varians data :

1. Kesamaan varians tidak menjadi syarat untuk uji kelompok yang berpasangan.

2. Kesamaan varians adalah syarat tidak mutlak untuk kelompok tidak berpasangan, artinya varians data boleh sama boleh juga berbeda. 3. Kesamaan varians adalah syarat mutlak untuk >2 kelompok tidak

berpasangan, artinya varians data harus sama.

Pada penelitian ini, terdapat masalah dengan skala variabel numerik dan terdapat >2 kelompok tidak berpasangan. Jika distribusi data normal dan varians data homogen, dilanjutkan dengan metode uji parametrik one way ANOVA. Namun, apabila distribusi data tidak normal dan varians

data tidak homogen, maka alternatifnya dipilih uji Kruskal-Wallis (Dahlan, 2013).

4. Uji Post Hoc LSD (Least Significant Difference)

Jika pada uji one way ANOVA menghasilkan nilai p<0,05 (hipotesis dianggap bermakna), maka akan dilanjutkan dengan melakukan analisis post-hoc LSD untuk mengetahui perbedaan antar kelompok yang lebih terinci sehingga didapatkan kelompok perlakuan mana yang mempunyai efek lebih baik terhadap kadar MDA. Untuk alternatif digunakan uji Mann-Whitney (Dahlan, 2013).

I. Etika Penelitian

Peneliti telah mengajukan etical approval ke Komisi Etika Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung dengan menerapkan prinsip 3R dan 5F dalam protokol penelitian menggunakan hewan coba agar terjamin kesejahteraannya. Prinsip 3R yaitu:

1. Replacement (menggantikan), ialah keperluan ntuk membuktikan suatu hipotesis, bila diperlukan penggunaan hewan coba maka menggunakan hewan yang paling rendah tingkatannya dan tidak dapat digantikan oleh makhluk hidup lain seperti sel atau biakan jaringan.

2. Reduction (pengurangan), ialah mengembangkan strategi penggunaan hewan dalam jumlah yang lebih sedikit untuk menghasilkan data yang optimal yang diharapkan dari penelitian. Prinsip ini juga meliputi

39

memaksimalkan informasi yang diperoleh dari suatu percobaan tanpa menambah jumlah hewan atau jumlah perlakuan (rasa kesakitan yang ditimbulkan oleh tindakan penelitian) sehingga manfaat yang diperoleh dapat dimaksimalkan tanpa menambah penderitaan dan jumlah hewan coba. Dalam penelitian ini sampel dihitung berdasarkan rumus Federer, yaitu t(n-1) ≥ 15, dengan n adalah jumlah hewan yang diperlukan dan t adalah jumlah kelompok perlakuan.

3. Refinfement (memperhalus), ialah upaya melakukan modifikasi di dalam manajemen pemeliharaan atau prosedur tindakan penelitian sedemikian rupa sehingga dapat meningkatkan kesejahteraan hewan atau mengurangi atau menghilangkan rasa sakit dan stress pada hewan coba (Sajuthi, 2012). Ketiga prinsip etika ini haruslah dikombinasikan dengan 5 prinsip freedom dalam kesejahteraan hewan, yakni:

1. Freedom from hunger and thirst (bebas dari rasa lapar dan haus), dapat dilakukan dengan pemberian pakan minum yang ad libitum dan kemudahan hewan dalam mengakses pakan dan minum kapanpun mereka kehendaki.

2. Freedom from discomfort (bebas dari rasa tidak nyaman), dapat dilakukan dengan memperhatikan kebutuhan hewan terhadap tempat tinggal yang sesuai atau pemberian naungan atau sarang yang sesuai. Selain itu faktor lingkungan yang harus diperhatikan meliputi temperatur, kelembaban, ventilasi dan pencahayaan yang harus sesuai dengan kondisi alamiah hewan yang bersangkutan.

3. Freedom from pain, injury and diseases (bebas dari rasa sakit, luka dan penyakit), dimana selama penelitian haruslah menjalankan program kesehatan yang telah ditetapkan, menggunakan sebisa mungkin teknik non-invasif, serta jika dibutuhkan haruslah menggunakan obat pengurang rasa sakit atau pemati rasa dan selalu menggunakan metode euthanasia yang dianjurkan dan telah disetujui oleh komisi etik

4. Freedom from fear and distress (bebas dari rasa takut dan stres), dapat dilakukan dengan menghindari prosedur atau teknik yang menyebabkan rasa takut dan stres pada hewan dan memberikan masa transisi dan adaptasi sebelum penelitian berlangsung.

5. Freedom to express natural behaviour (bebas untuk mengekspresikan tingkah-laku alamiah), dapat diupayakan melalui penyediaan luasan kandang yang cukup, kualitas kandang yang baik, dan teman dari hewan yang sejenis dengan memperhatikan sosialisasi, dan tingkah-laku spesifik. (Sajuthi, 2012).

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan secara statistik bahwa pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) dapat menurunkan kadar malondialdehid pada jaringan hati tikus putih yang diinduksi DMBA (p<0,05).

B. Saran

Saran bagi peneliti lain adalah:

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap kadar malondialdehid pada jaringan hati tikus putih yang diinduksi DMBA dengan menggunakan dosis bertingkat yang berbeda-beda.

2. Perlu dilakukan penelitian terhadap pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak terhadap kadar antioksidan atau efek antikanker lainnya.

DAFTAR PUSTAKA

Adewole SO, Ojewole JAO. 2009. Protective effects of annona muricata linn. (annonaceae) leaf aqueous extract on serum lipid profiles and oxidative stress in hepatocytes of streptozotocin-treated diabetic rats. Afr J Traditional.6(1):30 – 41.

Akrom. 2012. Mekanisme kemopreventif ekstrak heksan biji jinten hitam (nigella sativa lor) pada tikus sprague dawley diinduksi 7,12 dimethylbenz(a)antracene: kajian antioksidan dan imunomodulator [disertasi]. Yogyakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Arthur FKN, Woode E, Terlabi EO, Larbie C. 2011. Evaluation of acute and

subchronic toxicity of annona muricata (linn.) aqueous extract in animals. European journal of experimental biology.1(4):115- 24.

Asni E., Harahap IP, Prijanti AR, Wanandi SI, Jusman SWA, Sadikin M. 2009. Pengaruh hipoksia berkelanjutan terhadap kadar malondialdehid, glutation tereduksi, dan aktivitas katalase ginjal tikus. Maj Kedokt Indon.59(12):595-600.

AVMA. 2013. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Schaumburg: American Veterinary Medical Association.

Balachandran P, Govindarajan R. 2005. Cancer—an ayurvedic perspective. Pharmacological Research.51(1):19–30.

Baskar R, Rajeswari V, Kumar TS. 2007. In vitro antioxidant studies in leaves of Annona species. Indian Journal of Experimental Biology.45(5):480-5. Bilqistiputri F, Susantiningsih T, Mustofa S, Windarti I. 2014. Chemopreventive

breast tissue in female sprague-dawley rats induced by 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (dmba). Medical Journal of Lampung University.3(2):74-82.

Bishayee K, Ghosh S, Mukherjee A, Sadhukhan R, Mondal JK, Bukhsh AR. 2013. Quercetin induces cytochrome-c release and ros accumulation to promote apoptosis and arrest the cell cycle in g2/m, in cervical carcinoma: signal cascade and drug–dna interaction. Cell Prolif.46(2):153–63.

Budi RT, Widyarini S. 2010. Dampak induksi karsinogenesis glandula mammae dengan 7, 12-dimetilbenz(α)antrasen terhadap gambaran histopatologis lambung tikus sprague dawley. Jurnal Veteriner.11(1):17-23.

Buters J, Quintanilla-Martinez L, Schober W, Soballa VJ, Hintermair J, Wolff T, Gonzalez FJ, Greim H. 2003. Cyp1b1 determines susceptibility to low doses of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene induced ovarian cancers in mice: correlation of cyp1b1-mediated dna adducts with carcinogenicity. Carcinogenesis.24(2):327-34.

Chalid SY. 2009. Kandungan radikal bebas sate padang dan sate madura di sekitar kampus uin syarif hidayatullah jakarta. Jurnal Kimia Valensi.1(4):197-201. Conti CJ, Gimenez-Conti IB, Benavides F, Frijhoff, AF, Conti MA. 2004. Atlas of

laboratory mouse histology. Texas: Texas Histopages.

Curfs DMJ, Lutgens E, Gijbels MMJ, Kockx MM, Daemen MJAP, van Schooten FJ. 2004. Chronic exposure to the carcinogenic compound benzo[a]pyrene induces larger and phenoltypically different atherosclerotic plaques in apo e-knockout mice. Am J Pathol.164(1):101–8.

Currier N, Solomon SE, Demicco EG, Chang DLF, Farago M, Ying H, Dominguez I, Sonenshein GE, Cardiff RD, Xiao ZXJ, Sherr DH, Seldin DC. 2005. Oncogenic signaling pathways activated in dmba-induced mouse mammary tumors. Toxicologic Pathology.33(6):726–37.

Dahlan MS. 2013. Statistik untuk kedokteran dan kesehatan : deskriptif, bivariat, dan multivariat, dilengkapi dengan aplikasi menggunakan spss. Edisi ke-5. Jakarta: Salemba Medika.

Dayeef AYM, Karyono S, Sujuti H. 2013. The influence of annona muricata leave extract in damaging kidney cell and inducing caspase-9 activity. IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences (IOSR-JPBS).8(5):48-52.

Dewi HAC, Hermawati R. 2013. Khasiat ajaib daun sirsak. Malang: Padi. Dimitrova-Shumkovska J, Veenman L, Ristoski T, Leschiner S, Gavish M. 2010.

Decreases in binding capacity of the mitochondrial 18 kda translocator protein accompany oxidative stress and pathological signs in rat liver after dmba exposure. Toxicologic Pathology.38(6):957-68.

Donne ID, Rossi R, Colombo R, Giustarini D, Milzani A. 2006. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry.52(4):601–23. El–Serag HB, Marrero JA, Rudolph L, Reddy KR. 2008. Diagnosis and treatment

of hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology.134(9):1752–63. Eustis SL, Boorman GA, Harada T, Popp JA. 1990. Pathology of the fischer rat

reference and atlas. San Diego, California: Academic Press. hlm.71–92. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M,

Parkin DM, Forman D, Bray F. 2013. Globocan 2012, cancer incidence and mortality worldwide. IARC Cancer Base No. 11. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer.

Gao J, Lauer FT, Mitchell A, Burchiel SW. 2007. Microsomal expoxide hydrolase is required for 1,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)-induced immunotoxicity in mice. Toxicological Sciences.98(1):137-144.

George VC, Kumar DRN, Rajkumar V, Suresh PK, Kumar RA. 2012. Quantitative assessment of the relative antineoplastic potential of the n-butanolic leaf extract of annona muricata linn. In normal and immortalized human cell lines. Asian Pac J Cancer Prev.13(2):699-704.

Gholse YN, Yadav SR. 2012. Developments in nutraceuticals for chemoprevention: a review. International Journal Of Pharmacy & Technology.4(1):1950-73.

Gulcin I, Huyut Z, Elmastas M, Aboul-Enein HY. 2010. Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid. Arabian Journal of Chemistry.3(1):43-53.

Hamid AA, Aiyelaagbe OO, Usman LA, Ameen OM, Lawal A. 2010. Antioxidant : its medical and pharmacological applications. African Journal of Pure and Applied Chemistry.4(8):142-51.

Hamid IS, Meiyanto E. 2009. Modulasi cyp1a1 dan gst serta ekspresi p53 dan ras setelah induksi 7,12-dimethyl benz(ά)antrasen (dmba) dan pemberian anti karsinogenesis gynura procumbens dan curcuma zedoaria pada tikus galur sprague dawley. J Penelit Med Eksakta.8(3): 168-77.

Hanafi M. 2009. Uji efektifitas dan keamanan pada hewan uji turunan salisil amida sebagai analog ak-3a untuk obat antikanker. Serpong: Pusat Penelitian Kimia LIPI.

Hanif HA, Murad NA, Ngah WZW, Yusof YAM. 2005. Effects of zingiber officinale on superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, glutathione and malondialdehyde content in hepg2 cell line. Malaysian Journal of Biochemistry and Molecular Biology.11(1):36-41.

Harada T, Enomoto A, Boorman GA, Maronpot RR. 1999. Liver and gallbladder, in pathology of the mouse. Vienna: Cache River Press. hlm.119–83.

Herliana E, Rifai N. 2011. Khasiat dan manfaat daun sirsak menumpas kanker. Jakarta: Mata Elang Media. hlm. 12-6.

Hertzog DI, Tica OS. 2012. Molecular mechanisms underlying the anti-cancerous action of flavonoids. Current Health Sciences Journal.38(4):145-9.

IACR. 2014. Indonesia. Globocan 2012 : Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. France: International Agency for Research on Cancer.

Idihastuti P. 2012. Kemampuan penghambatan ekstrak daun sirsak (annona muricata linn.) terhadap viabilitas sel kanker mammae mencit [skripsi]. Surabaya: Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

Ishbah MF. 2012. Pengaruh sari kedelai sel (glycine max l) terhadap apoptosis kanker hepar pada tikus wistar (rattus norvegicus ) yang diinduksi. 7,12-dimetilbenz(a)antrasen (dmba) [skripsi]. Jember: Fakultas Kedokteran Universitas Jember.

Izyumov DS, Domnina LV, Nepryakhina OK, Avetisyan AV, Golyshev S A, Ivanova OY, Korotetskaya MV, Lyamzaev KG, Pletjushkina O Y, Popova EN, Chernyak BV. 2010. Mitochondria as source of reactive oxygen species under oxidative stress: Study with novel mitochondria-targeted antioxidants -the "skulachev-ion" derivatives. Biochemistry (Moscow). 75(2):123-9.

Karamac M. 2009. Chelation of cu(II), zn(II), and fe(II) by tannin constituents of selected edible nuts. Int J Mol Sci. 10(12):5485-97.

Klug WS, Cummings MR, Spencer CA, Palladino MA. 2010. Essentials of genetic. 7th ed. San Francisco: Pearson Education Inc.

Kojima N, Tanaka T. 2009. Medicinal chemistry of annonaceous acetogenins: design, synthesis, and biological evaluation of novel analogues. Molecules.14(9):3621-61.

Koleckar V, Kubikova K, Rehakova Z, Kuca K, Jun D, Jahodar L, Opletal L. 2008. Condensedand hydrolysable tannins as antioxidants influencing the health. Mini Rev Med Chem.8(5):436-47.

Koul A, Mohan V, Bharati S. 2014. Azadirachta indica mitigates dmba-induced hepatotoxicity : a biochemical and radiometric study. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics.51(1):37-45.

Kuno T, Tsukamoto T, Hara A, Tanaka T. 2012. Cancer chemoprevention through the induction of apoptosis by natural compounds. J Biophys Chem.3(2):156– 73.

Lans CA. 2006. Ethnomedicines used in trinidad and tobago for urinary problems and diabetes mellitus. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine 2. hlm.45-55.

Levrier C, Balastrier M, Beattie KD, Carroll AR, Martin F, Choomuenwai V, Davis RA. 2013. Pyridocoumarin, aristolactam and aporphine alkaloids from the australian rainforest plant goniothalamus australis. Phytochemistry 86. hlm.121–6.

Li HT, Wu HM, Chen HL, Liu CM, Chen CY. 2013. The pharmacological activities of (−)-anonaine. Molecules.18(7):8257-63.

Mackay J, Jemal A, Lee N, Parkin DM. 2006. The global cancer atlas online. Atlanta, GA: American Cancer Society. hlm.128.

Mangan Y. 2009. Solusi sehat mencegah dan mengatasi kanker. Jakarta: Agromedia Pustaka.

Manoharan S, Selvan MV. 2012. Chemopreventive potential of geraniol in 7,12-dimethylbenz(a) anthracene (dmba) induced skin carcinogenesis in swiss albino mice. J Environ Biol.33(2):255-60.

Meiyanto E, Susilowati S, Taminatun S, Murwanti R, Sugiyanto. 2007. Efek kemopreventif ekstrak gynura procumbens (lour), merr pada karsinogenesis kanker payudara tikus. MFI. 18(3):154-61.

Meiyanto E, Putri DA, Adhi P, Darma AP, Ikawati M. 2011. Potensi kemopreventif ekstrak etanolik kulit jeruk keprok (citrus reticulata) pada karsinogenesis sel hepar tikus galur sprague dawley terinduksi dmba. Jurnal Farmasi Indonesia Pharmacon. 12(1):9-13.

Minari JB, Okeke U. 2014. Chemopreventive effect of Annona muricata on DMBA-induced cell proliferation in the breast tissues of female albino mice. Egypt J Med Hum Genet. 15(4):327-34.

Miyata M, Furukawa M, Takahashi K, Gonzales FJ, Yamazoe Y. 2001. Mechanism of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced immunotoxicity: role of metabolic activation at the target organ. Jpn J Pharmacol.86(3):302-9.

Moghadamtousi SZ, Rouhollahi E, Karimian H, Fadaeinasab M, Abdulla MA, Kadir HA. 2014. Gastroprotective activity of Annona muricata leaves against ethanol-induced gastric injury in rats via hsp70/bax involvement. Drug Design, Development and Therapy 8. hlm.2099-111.

Levrier C, Balastrier M, Beattie KD, Carroll AR, Martin F, Choomuenwai V, Davis RA. 2013. Pyridocoumarin, aristolactam and aporphine alkaloids from the australian rainforest plant goniothalamus australis. Phytochemistry 86. hlm.121–6.

Li HT, Wu HM, Chen HL, Liu CM, Chen CY. 2013. The pharmacological activities of (−)-anonaine. Molecules.18(7):8257-63.

Mackay J, Jemal A, Lee N, Parkin DM. 2006. The global cancer atlas online. Atlanta, GA: American Cancer Society. hlm.128.

Mangan Y. 2009. Solusi sehat mencegah dan mengatasi kanker. Jakarta: Agromedia Pustaka.

Manoharan S, Selvan MV. 2012. Chemopreventive potential of geraniol in 7,12-dimethylbenz(a) anthracene (dmba) induced skin carcinogenesis in swiss albino mice. J Environ Biol.33(2):255-60.

Meiyanto E, Susilowati S, Taminatun S, Murwanti R, Sugiyanto. 2007. Efek kemopreventif ekstrak gynura procumbens (lour), merr pada karsinogenesis kanker payudara tikus. MFI. 18(3):154-61.

Meiyanto E, Putri DA, Adhi P, Darma AP, Ikawati M. 2011. Potensi kemopreventif ekstrak etanolik kulit jeruk keprok (citrus reticulata) pada karsinogenesis sel hepar tikus galur sprague dawley terinduksi dmba. Jurnal Farmasi Indonesia Pharmacon. 12(1):9-13.

Minari JB, Okeke U. 2014. Chemopreventive effect of Annona muricata on DMBA-induced cell proliferation in the breast tissues of female albino mice. Egypt J Med Hum Genet. 15(4):327-34.

Miyata M, Furukawa M, Takahashi K, Gonzales FJ, Yamazoe Y. 2001. Mechanism of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced immunotoxicity: role of metabolic activation at the target organ. Jpn J Pharmacol.86(3):302-9.

Moghadamtousi SZ, Rouhollahi E, Karimian H, Fadaeinasab M, Abdulla MA, Kadir HA. 2014. Gastroprotective activity of Annona muricata leaves against ethanol-induced gastric injury in rats via hsp70/bax involvement. Drug Design, Development and Therapy 8. hlm.2099-111.

Muqbil I, Banu N. 2006. Enhancement of pro-oxidant effect of 7,12 dimethylbenz (a) anthracene (dmba) in rats by pre-exposure to restraint stress. Cancer Letters.240(2):213-20.

Murray RK, Bender DA, Botham KM, Jenelly PJ, Rodwell VW, Weil PA. 2009. Harper’s Illustrated Biochemistry. 28th Ed. New York: McGraw-Hill.

Nair S, Varalakshmi KN. 2011. Anticancer, cytotoxic potential of moringa oleifera extracts on hela cell line. Journal of Natural Pharmaceuticals. 2(3):138-42.

Ojewole JAO. 2005. Antinociceptive, anti-inflammatory and antidiabetic effects of bryophyllum pinnatum (crassulaceae) leaf aqueous extract. J Ethnopharmacol.99(1):13-9.

Okwu DE. 2004. Phytochemicals and vitamin content of indigenous species Southeastern Nigeria. J Sustainable Agriculture and Environment.6(1):30-7.

Orwa C, Mutua A, Kindt R, Jamnadass R, Simons A. 2009. Agroforestree database: a tree reference and selection guide version 4.0. Kenya: World Agroforestry Centre.

Panut I. 2012. Hubungan antara malondialdehid dengan elfg pada pasien diabetes melitus tipe 2 rsupn dr. cipto mangunkusumo [skripsi]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.

Parkin DM. 2006. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer.118(12):3030–44.

Paulinus ON, Kinsley A, Ikechi G. 2013. Protective effect of ethanolic leaf extract of Annona muricata linn on some early events in cycas-induced colorectal carcinogenesis in rats. Journal of Pharmaceutical and Scientific Innovation.2(4):14-21.

Pertiwi AS. 2014. Pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih betina yang

diinduksi karsinogen 7,12 dimethylbenz[a]antrancene (dmba) [skripsi]. Bandar Lampung: Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.

Pradana I. 2013. Daun sakti penyembuh segala penyakit. Yogyakarta: Octopus Publishing House.

Prakash O, Kumar A, Kumar P, Ajeet. 2013. Anticancer potential of plants and natural products: a review. American Journal of Pharmacological Sciences.1(6):104-15.

Purwatresna E. 2012. Aktivitas antidiabetes ekstrak air dan etanol daun sirsak secara in vitro melalui inhibisi enzim α-glukosidase [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

Rahayu WP, Achmad A, Ekowati H. 2012. Aktivitas antiproliferatif jintan hitam (Nigella sativa) pada sel paru tikus yang diinduksi 7,12-dimetilbenz-[a]antrasena (dmba). Makara Journal of Health Research.16(2):51-6.

Redaksi Trubus. 2012. Aneka ramuan herbal. Depok: PT Trubus Swadaya.

Redaksi Trubus. 2012. Daun sirsak vs kanker. : Depok : PT Trubus Swadaya.

Retnani V. 2011. Pengaruh suplementasi ekstrak daun annona muricata terhadap kejadian displasia epitel kelenjar payudara tikus sprague dawley yang diinduksi 7,12 dimetilbenz(a)antrasena (dmba) [skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.

Royal Society of Chemistry. 2014. Malondialdehyde [Online Jurnal] [diunduh 7 September 2014]. Tersedia dari : http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.10499.html

Sajuthi D. 2012. Workshop on bioethics: Prinsip-prinsip kesejahteraan hewan (animal welfare) di dalam penelitian biomedis. Bogor : Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.

Samy RP, Gopalakrishnakone P, Ignacimuthu S. 2006. Anti-tumor promoting potential of luteolin against 7,12-dimethylbenz(a)anthraceneinduced mammary tumors in rats. Chem Biol Interact.164(1-2):1–14.

Sari W. 2008. Care yourself: hepatitis. Jakarta: Penebar Plus.

Setiyadi B, Susantiningsih T, Apriliana E, Windarti I. 2014. The chemopreventive effects of extracts compare with infuse of soursop leaves (annona muricata l.) in breast tissue of female sprague-dawley rats induced by dmba. Majority.3(2):39-47.

Sigma-Aldrich Co. 2014. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene [Online Jurnal] [diunduh 8 September 2014]. Tersedia dari: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d3254?lang=en&regio n=ID

Singh H, Bedi PS, Singh B. 2011. Hepatoprotective activity of turmeric and garlic against 7-12, dimethylbenzanthracene induced liver damage in wistar albino rats. European Journal of Medicinal Plants.1(4):162-70.

Singletary KW, Jung KJ, Giusti M. 2007. Anthocyanin-rich grape extract blocks breat cell dna damage. J Med Food.10(2):244-51.

Sowash JR. 2009. Rat dissection:1 [Online Jurnal] [diunduh 7 September 2014]. Tersedia dari: http://jrsowash.wikispaces.com/file/view/rat.student.pdf.

Sreelatha S, Padma PR. 2009. Antioxidant activity and total phenolic content of Moringa oleifera leaves in two stages of maturity. Plant Foods for Human Nutrition.64(4):303-11.

Stacey GN, Day JG. 2007. Long-term ex situ conservation of biological resources and the role of biologicl resource centers. Dalam: Day JG dan Stacey GN, penyunting. Methods in molecular biology cryopreservation and freeze-drying protocols. Edisi ke-2. New Jersey: Humana Press.

Subagja HP. 2013. Dahsyatnya sirsak dan manggis basmi segala penyakit. Jogjakarta: FlashBooks.

Sunarjono H. 2005. Sirsak dan srikaya : budi daya untuk menghasilkan buah prima. Bogor: Penebar Swadaya.

Syariefa E. 2011. Daun sirsak: olah tepat dan dosis aman. Trubus.2(498):10-27.

Thoolen B, Maronpot RR, Harada T, Nyska A, Rousseaux C, Nolte T, Malarkey DE, Kaufmann W, KuTtler K, Deschl U, Gregson R, Vinlove MP, Brix AE, Singh B, Belpoggi F, Ward JM. 2010. Proliferative and nonproliferative lesions of the rat and mouse hepatobiliary system. Toxicologic Pathology. 38(7 Suppl):5S-81S.

Thun MJ, DeLancey JO, Center MM, Jemal A, Ward EM. 2010. The global burden of cancer: priorities for prevention. Carcinogenesis.31(1):100–10.

Tindall BJ. 2007. Vacuum-drying and cryopreservation of prokaryotes. Dalam: Day JG dan Stacey GN, penyunting. Methods in molecular biology cryopreservation and freeze-drying protocols. Edisi ke-2. New Jersey: Humana Press.

Ubani CS, Oje OA, Chukwu IO. 2012. Effects of excravos light crude oil on liver enzyme markers activity and malondialdehyde levels of rats. Journal of Environmental and Occupational Science.1(3):161-6.

Usunomena U. 2014. Protective effects of Annona muricata ethanolic leaf extract against Dimethylnitrosamine (DMN)-induced hepatotoxicity. IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences.9(4):1-6.

Utami NMS, Yudo A, Wara SG, Satya N, Manuaba IBTW. 2013. Description of alternative medicine history in breast cancer and colorectal cancer patient in hospitals in denpasar. E-Jurnal Udayana Medica 1(2).

Vanessa R. 2014. Pemanfaatan minuman serbuk instan kayu manis (cinnamomum burmanii bi.) untuk menurunkan kadar kolesterol total darah tikus putih (rattus norvegicus) [skripsi]. Yogyakarta: Fakultas Teknobiologi Universitas Atma Jaya Yogyakarta.

Vijayameena C, Subhashini G, Loganayagi M, Ramesh B. 2013. Phytochemical screening and assessment of antibacterial activity for the bioactive compounds in annona muricata. Int J Curr Microbiol App Sci.2(1):1-8.

Vinerean HV. 2014. Rats- biology & husbandary. USA: Florida International University [Online Jurnal] [diunduh 8 September 2014]. Tersedia dari: http://research.fiu.edu/facilities/acf/documents/rats-biology-husbandry.pdf

Waji RA, Sugrani A. 2009. Flavonoid (quercetin) [makalah kimia organik bahan alam program s2 kimia]. Makasar: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin.

Watt SM, Austin E, Armitage S. 2007. Cryopreservation of hematopoietic stem/progenitor cells of therapeutic use. Dalam: Day JG dan Stacey GN, penyunting. Methods in molecular biology cryopreservation and freeze-drying protocols

WHO. 2012. Traditional medicine [Online Jurnal] [diunduh 1 September 2014]. Tersedia dari: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/

WHO. 2014. The top ten causes of death. fact sheet n°310 [Online Jurnal] [diunduh 1 September 2014]. Tersedia dari: http://who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/index2.html

Widayati E. 2012. Oxidasi biologi, radikal bebas, dan antioxidan. Jurnal Unissula 50(128).

Wills ED. 1987. Evaluation of lipid peroxidation on lipid and biological membranes. Biochemical Toxicology: A practical approach. Oxford: IRL Press.

Winarsi H. 2007. Antioksidan alami dan radikal bebas. Yogyakarta: Kanisius.

Zhang YJ, DeWitt DL, Murugesan S, Nair MG. 2004. Novel lipid-peroxidation- and- cyclooxygenase-inhibitory tannins from Picrorhiza kurrora seeds.

Chem Biodivers.1(3):426–41.

Zhao S, Liu JY, Chen SY, Shi LL, Liu YJ, Ma C. 2011. Antioxidant potential of polyphenols and tannins from burs of castanea mollissima blume. Molecules.16(19):8590-600.