PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (ANNONA MURICATA L.) TERHADAP GAMBARAN HISTOPATOLOGI JARINGAN PARU TIKUS PUTIH BETINA YANG DIINDUKSI KARSINOGEN 7,12 DIMETHYLBENZ[α]ANTHRANCENE (DMBA)

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (ANNONA

MURICATA L.) TERHADAP GAMBARAN HISTOPATOLOGI

JARINGAN PARU TIKUS PUTIH BETINA YANG DIINDUKSI KARSINOGEN 7,12 DIMETHYLBENZ[α]ANTHRANCENE (DMBA)

Oleh

AMANDA SAMURTI PERTIWI

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA KEDOKTERAN

Pada

Fakultas Kedokteran Universitas Lampung

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2013

ABSTRACT

THE EFFECT OF SOURSOP LEAF (ANNONA MURICATA L.) EXTRACT TO HISTOPATHOLOGY OF THE FEMALE RAT LUNG INDUCED BY

7,12 DIMETHYLBENZ[α]ANTHRANCENE CARCINOGEN (DMBA)

By

AMANDA SAMURTI PERTIWI

Cancer is the process of uncontrolled body cells proliferation. The cancer treatments such as surgery, radiotherapy and chemotherapy have side effects so that natural anticancer is needed. For example, soursop (Annona muricata L.) which contains antioxidant dan anticancer material.

The aim for this research is to detemine the effect of soursop leaf extract to histopathology of female rat lung induced by DMBA. This study was an experimental design with 4 group of intervention. Each group contains 5 female Sprague dawley rats. Group I (negative control) given 1 ml/days of aquadest; group II (positive control) given 20 mg/kgBB of DMBA twice a week; group III (1sttreatment) given 20 mg/kgBB of DMBA twice a week + 20 mg/kgBB/days of soursop extract; and group IV (2ndtreatment) given 20 mg/kgBB of DMBA twice a week + 40 mg/kgBB/days of soursop extract. During the study, rats were fed with pellets. In this study, the statistical test is using Kruskal Wallistest (p<0,05) and Post-Hoc Mann Whitneytest (p<0,05).

The results showed on first group were 3 normal of lung histopathology and 2 mild damage of lung; second group were 1 moderate damage and 4 severe damage of lung; third group were 2 mild damage, 2 moderate damage and 1 severe damage of lung; fourth group were 3 mild damage and 2 moderate damage of lung. In fourth group showed significant changes of lung histopathology compared to second group.

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (ANNONA MURICATA L.) TERHADAP GAMBARAN HISTOPATOLOGI JARINGAN PARU TIKUS PUTIH BETINA YANG DIINDUKSI KARSINOGEN 7,12 DIMETHYLBENZ[α]ANTHRANCENE (DMBA)

Oleh

AMANDA SAMURTI PERTIWI

Kanker merupakan proses proliferasi sel-sel tubuh yang tidak terkendali. Pengobatan kanker berupa pembedahan, radioterapi, dan kemoterapi memiliki efek samping sehingga perlu penggunaan bahan alami, salah satunya tanaman sirsak (Annona muricata L.) yang memiliki kandungan antioksidan dan antikanker.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih betina yang diinduksi DMBA. Desain penelitian ini adalah eksperimental dengan 4 kelompok perlakuan. Masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus putih betina Sprague dawley. Kelompok I (kontrol negatif) diberikan akuades 1 ml/hari; kelompok II (kontrol positif) diberikan DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu; kelompok III (perlakuan 1) diberikan DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu + ekstrak daun sirsak 20 mg/kgBB/hari; dan kelompok IV (perlakuan 2) diberikan DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu + ekstrak daun sirsak 40 mg/kgBB/hari. Selama penelitian, tikus diberi makan pelet. Uji yang digunakan adalah uji Kruskal-wallis (p<0,05) dan uji Post-Hoc Mann Whitney (p<0,05).

Hasil penelitian menunjukkan pada kelompok I ditemukan 3 gambaran normal dan 2 gambaran kerusakan ringan; kelompok II ditemukan 1 gambaran kerusakan sedang dan 4 gambaran kerusakan berat; kelompok III ditemukan 2 gambaran kerusakan ringan, 2 gambaran kerusakan sedang, dan 1 gambaran kerusakan berat; kelompok IV ditemukan 3 gambaran kerusakan ringan dan 2 kerusakan sedang. Kelompok IV menunjukkan adanya perubahan gambaran histopatologi paru yang signifikan bila dibandingkan dengan kelompok II.

\

o

U

I

MENGESAHKAN

Tim Penguji

Ketua

:

dr. Tiwuk Susantiningsih, M.Biomed

Seketaris

Penguji

:

dr.

Dewi Nur

Fiana

Bulon Fembimbing :,

dr. Novita Carolia,

M.Sc

Nama Mahasiswa No. Pokok Mahasiswa Fakultas

JARINGAN PARU TIKUS PLTNH BETINA YANG DIINDUI(SI KARSINOGEN 7,12 DIM ETHYLBENZ[o]ANTHMNCENE (DMBA)

Amanda Samurti Peftiwi

1018011038

Kedokteran

MENYETUJUI

1. Komisi Pembimbing

dr. Tiwuk Susantiningsih, M.Biomed NIP 19801018 200604 2 001

Dewi Nur

Fiana 19830221 20L0t22002

dr,

NIP

, _..4,

,' '".'.'1'*.. _{Dekan Fakultas Kedokteran}

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... iii

DAFTAR GAMBAR ... iv

DAFTAR LAMPIRAN ... v

BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 4

1.3 Tujuan Penelitian ... 5

1.3.1 Tujuan Umum ... 5

1.3.2 Tujuan Khusus ... 5

1.4 Manfaat Penelitian ... 6

1.4.1 Manfaat Teoritis ... 6

1.4.2 Manfaat Praktis ... 6

1.5 Kerangka Teori... 7

1.6 Kerangka Konsep ... 9

1.7 Hipotesis ... 10

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Paru ... 11

2.1.1 Anatomi Organ Paru ... 11

2.1.2 Histologi Paru ... 13

2.2 Tanaman Sirsak (Annona muricata L.) ... 18

2.2.1 Deskripsi tanaman Sirsak ... 18

2.2.2 Klasifikasi Taksonomi ... 19

2.2.3 Kandungan Annonaceous Acetogenin ... 20

2.3 Ekstraksi ... 21

2.4 Tikus (Rattus norvegicus) ... 23

2.5 7,12‎Dimethylbenz[α]anthrancene (DMBA) ... 25

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian ... 26

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ... 26

3.3 Populasi dan Sampel ... 27

3.3.1 Populasi ... 27

3.3.2 Sampel ... 27

3.4 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 29

3.4.2 Definisi Operasional... 30

3.5 Alat dan Bahan Penelitian ... 32

3.5.1 Alat Penelitian ... 32

3.5.2 Bahan Penelitian... 32

3.6 Prosedur Penelitian... 33

3.6.1 Persiapan Hewan Percobaan ... 33

3.6.2 Ekstraksi Daun Sirsak Dalam Etanol 70% ... 34

3.6.3 Pembuatan Larutan DMBA... 35

3.6.4 Induksi DMBA, Ekstrak Daun Sirsak, dan Pengambilan Sampel ... 36

3.6.5 Pembuatan Preparat dari Jaringan Paru Tikus ... 37

3.7 Analisis Data ... 39

3.8 Diagram Alir ... 40

3.9 Etika Penelitian ... 41

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil ... 42

4.2 Pembahasan ... 47

BAB V. SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan ... 52

5.2 Saran ... 53

DAFTAR PUSTAKA ... 54

iv

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Kerangka Teori ... 8

2. Kerangka Konsep ... 9

3. Anatomi Paru ... 12

4. Gambaran Histologi Paru ... 14

5. Tanaman Sirsak ... 19

6. Alur Penelitian ... 40

7. Histopatologi Jaringan Paru Tikus dengan Pewarnaan Hematoxylin-Eosin Perbesaran 100x ... 44

8. Tikus Penelitian di Tempatkan dalam Kandang ... 65

9. Daun Sirsak (Basah dan Kering) ... 65

10. Daun Sirsak Kering di Blender ... 66

11. Daun Sirsak Kering yang telah di Blender ... 66

12. Daun Sirsak dalam Larutan Etanol 70% ... 67

13. Rendaman Daun Sirsak di Saring ... 67

14. Rotary Evaporator untuk Mengentalkan Maserat menjadi Ekstrak ... 68

15. Ekstrak Daun Sirsak ... 68

16. Alat-Alat untuk Mengencerkan Ekstrak Daun Sirsak ... 69

17. Proses Penimbangan Tikus ... 69

18. Alat-Alat untuk Melarutkan DMBA ... 70

19. Proses Menakar Minyak Jagung untuk Melarutkan DMBA ... 70

20. Menimbang DMBA yang akan di Larutkan... 71

21. Menuangkan DMBA dan Minyak Jagung ke Gelas Kaca ... 71

22. Proses Mencampur DMBA dengan Minyak Jagung dan Memasukan ke Botol Kaca ... 72

23. Perlakuan terhadap Tikus ... 72

24. Proses Pembedahan Tikus ... 73

25. Fiksasi dan Trimming ... 73

26. Dehidrasi dan Clearing ... 74

27. Impregnasi ... 74

28. Embedding ... 74

29. Cutting dengan Mikrotom ... 75

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Definisi Operasional... 31

2. Data Hasil Pengamatan Pada Masing-Masing Kelompok ... 42

3. Data Hasil Analisis Uji Mann Whitney ... 46

4. Persentase Kerusakan Paru Pada Masing-Masing Kelompok ... 61

v

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Surat Keterangan Lulus Kaji Etik ... 60

2. Hasil Pengamatan Preparat pada tiap Kelompok ... 61

3. Grafik Perbandingan Skala Kerusakan Alveolus ... 62

4. Uji Kruskal-Wallis ... 62

5. Uji Post-Hoc Mann Whitney ... 63

6. Dokumentasi Kegiatan ... 65

BAB I PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Kanker merupakan suatu proses proliferasi sel-sel di dalam tubuh yang tidak terkendali. Salah satu jenis kanker yang mempunyai tingkat insidensi tinggi di dunia adalah kanker paru. Organisasi kesehatan dunia WHO menyatakan bahwa lima besar penyakit kanker di dunia adalah kanker paru, kanker payudara, kanker usus besar, kanker lambung, dan kanker hati (WHO, 2013).

Di perkirakan setiap tahun, 12 juta orang di seluruh dunia menderita kanker dan 7,6 juta di antaranya meninggal dunia. Jika tidak dikendalikan, pada tahun 2030, diperkirakan 26 juta orang akan menderita kanker dan 17 juta orang meninggal karena kanker. Hal ini menjadi lebih cepat di negara miskin dan berkembang (WHO, 2013).

Berdasarkan Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) pada tahun 2010, di Indonesia kanker menjadi penyebab kematian nomor 3 dengan kejadian 7,7% dari seluruh penyebab kematian karena penyakit tidak menular, setelah stroke dan penyakit jantung. Setiap tahun 100 kasus baru terjadi diantara 100.000 penduduk, dikarenakan meningkatnya pengguna rokok (57 juta orang), konsumsi alkohol,

2

kegemukan atau obesitas. Aktivitas fisik atau olahraga yang kurang juga berperan dalam meningkatkan angka kejadian kanker di Indonesia (Balitbangkes Depkes RI, 2005).

Kanker merupakan penyakit dengan banyak faktor penyebab yang terbentuk dalam jangka waktu lama dan mengalami kemajuan melalui stadium yang berbeda-beda. Kanker dapat terjadi karena adanya perubahan DNA sel atau disebut juga mutasi. Mutasi ini dapat terjadi pada sekuens DNA yang mengatur siklus sel yaitu protoonkogen yang nantinya menjadi onkogen. Selain itu dapat juga terjadi pada sekuens DNA yang berperan melakukan apoptosis seperti p53 (Bonita et al., 2001; Norat et al., 2005).

Zat-zat yang dapat menyebabkan mutasi disebut dengan mutagen. Salah satu mutagen adalah polisiklik aromatis hidrokarbon (PAH) yang merupakan kelompok dari senyawa berukuran besar dengan dua atau lebih cincin aromatik yang umumnya terbuat dari atom karbon dan hidrogen yang bersifat karsinogen. PAH ditemukan pada saat pembakaran bahan organik yang tidak sempurna. 7,12

dimethylbenz[α]anthrancene (DMBA) merupakan salah satu dari tiga produk degradasi PAH yang berpotensi sebagai bahan sitotoksik, mutagenik, agen imunosupresif, dan karsinogen. Beberapa penelitian menyatakan bahwa DMBA adalah mutagen dan dapat menginduksi pertumbuhan kanker (CEPA, 1997; Hartono, 2013).

Pengobatan pada kanker umumnya meliputi pembedahan, radioterapi, dan kemoterapi. Radiokemoterapi memiliki kelemahan yaitu meningkatkan efek samping seperti mukositis, leukopeni, dan infeksi berat. Toksisitas

radiokemoterapi yang begitu besar dapat berakibat fatal. Pada pengobatan kemoterapi, senyawa kimia yang diberikan tidak hanya menyerang sel kanker tetapi juga menyerang sel sehat sehingga timbul efek samping seperti mual, muntah, tenggorokan kering, sulit menelan, tangan gemetar, kulit kering, rambut rontok, lelah, perdarahan, resiko infeksi, diare, maupun konstipasi (Amin, 2006; Siregar, 2007).

Kecenderungan penggunaan obat yang berasal dari alam semakin meningkat, salah satunya adalah tanaman sirsak atau Annona muricata L. yang banyak

tersebar di Indonesia (Amelia dkk., 2012). Beberapa literatur menyebutkan bahwa

Annona muricata L. memiliki zat aktif annonaceous acetogenins yang memiliki

aktivitas antikanker. Acetogenins merupakan inhibitor dari kompleks I

mitokondria atau NADH dehidrogenase yang dapat menurunkan produksi ATP

sehingga mengakibatkan kematian sel kanker. Selain itu acetogenins juga

mengaktifasi jalur apoptosis dengan mengaktifkan p53 yang bisa menghentikan siklus sel sehingga mencegah proliferasi yang tidak terkendali. Selain

annonaceous acetogenins, tumbuhan ini juga memiliki kandungan seperti:

flavonoid, terpenoid, tannin, procyanidin, saponin, reticulin, phytosterol, dan

senyawa polyphenol yang memiliki efek antioksidan serta antikanker (Retnani,

2011; Adewole & Ojewole, 2008).

Dari uraian di atas maka penulis tertarik untuk menguji pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran histopatologi

4

1.2. Perumusan Masalah

Pengobatan kanker paru yang telah digunakan selama ini berupa pembedahan, kemoterapi, dan radioterapi memiliki banyak efek samping. Belakangan ini pengobatan yang menggunakan bahan dari alam semakin meningkat. Salah satunya di dapatkan bahwa daun sirsak mengandung beberapa senyawa yang berperan dalam menghambat proses pembentukan kanker seperti acetogenins,

flavonoid, terpenoid, tannin, procyanidin, saponin, reticulin, phytosterol, dan

senyawa polyphenol, sehingga timbul pertanyaan apakah terdapat pengaruh

pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.)

terhadap gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih betina yang diinduksi karsinogen DMBA.

1.3.2 Tujuan Khusus

a. Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata

L.) dengan dosis 20mg/kgBB sekali sehari selama 4 minggu terhadap

gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih betina yang diinduksi karsinogen DMBA.

b. Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata

L.) dengan dosis 40mg/kgBB sekali sehari selama 4 minggu terhadap

gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih betina yang diinduksi karsinogen DMBA.

6

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Teoritis

Untuk pengembangan ilmu pengetahuan farmakologi mengenai efek ekstrak daun sirsak sebagai antikanker.

1.4.2 Manfaat Praktis

a. Bagi peneliti

Untuk mengembangkan jiwa peneliti dan mengaplikasikan ilmu yang telah didapat selama masa pembelajaran di perguruan tinggi.

b. Bagi peneliti lain

Sebagai referensi bagi peneliti lain mengenai ekstrak obat herbal sebagai antikanker.

c. Bagi masyarakat

- Penelitian ini merupakan salah satu upaya pemanfaatan tumbuhan daun sirsak dalam mengobati kanker.

- Meningkatkan status daun sirsak, dari jamu tradisional menjadi obat fitofarmaka untuk terapi kanker.

1.5. Kerangka Teori

Senyawa DMBA termasuk dalam polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH) dan ditemukan pada pecahan tar dari asap rokok, gas pembuangan mobil, maupun asap dari tungku perapian. Senyawa ini dalam metabolisme hewan pengerat akan bereaksi dengan sitokrom p-450 untuk membentuk ikatan kovalen dengan DNA pada sel yang aktif membelah sehingga menyebabkan DNA adduct yang dapat

menyebabkan kerusakan DNA sehingga terjadi proses onkogenesis (Pretysta, 2012). Pada penelitian sebelumnya dinyatakan, daun sirsak memiliki senyawa

acetogenin yang bersifat sitotoksik terhadap beberapa jenis sel kanker, seperti

kanker paru, usus besar, pancreas, dan prostat. Senyawa ini merupakan inhibitor NADH pada enzim ubiquinone oxidoreductase. Enzim ini merupakan enzim

esensial dalam sistem transport elektron yang memimpin ke proses fosforilasi oksidatif di dalam mitokondria. Senyawa ini dihubungkan dengan transfer elektron terminal antara bagian Fe-S dan ubiquinone. Hasilnya gradient proton

antar membran yang diciptakan oleh kompleks I selama reduksi NADH oleh

ubiquinone dan transfer elektron yang memungkinkan untuk reduksi pernafasan

dari O2 ke H2O dihambat, sehingga mengurangi level ATP secara signifikan.

Dengan berkurangnya ATP maka akan menghambat pertumbuhan sel dan mengganggu kinerja sel sehingga sel mengalami apoptosis (Wijaya, 2012). Senyawa flavonoid, triterpenoid dan senyawa aktif lainnya juga diduga berperan dalam menghambat siklus sel kanker, menginduksi apoptosis selektif terhadap sel kanker, dan mendetoksifikasi karsinogen.

8

Keterangan:

= Menginduksi = Dihambat = Mengandung

1.6. Kerangka Konsep

Variabel independen pada penelitian ini adalah dosis ekstrak daun sirsak yang terdiri dari dosis 20 mg/kgBB dan 40 mg/kgBB. Variabel independen ini akan mempengaruhi variabel dependen, yaitu gambaran histopatologi jaringan paru tikus yang diinduksi oleh karsinogen DMBA.

Gambar 2. Kerangka Konsep

Variabel independen Variabel dependen

Dosis ekstrak daun sirsak (Annona

muricata L.)

Gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih

betina yang diinduksi DMBA

10

1.7. Hipotesis

Terdapat pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap

gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih betina yang diinduksi karsinogen DMBA.

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan menggunakan hewan coba berupa tikus putih betina galur Sprague dawley.

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Lampung dan Balai Penyelidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional III selama 4 (empat) minggu.

27

3.3. Populasi dan Sampel

3.3.1. Populasi

Populasi adalah tikus putih betina Sprague Dawley. Sampel yang digunakan pada

penelitian ini adalah 20 tikus putih betina galur Sprague Dawley berusia 2 bulan

dengan berat antara 100-200 gram yang telah diinduksi DMBA dengan dosis dan kurun waktu tertentu. Tikus-tikus ini diperoleh dari Fakultas Peternakan Institute Pertanian Bogor. DMBA diperoleh dari LABTIAP, Serpong.

3.3.2. Sampel

a. Kriteria Sampel

Kriteria Inklusi

a. Tikus putih betina Sprague dawley

b. Sehat (gerak aktif, rambut tidak kusam dan rontok) c. Berat badan antara 100-200 gram

d. Berusia sekitar 5-7 minggu

Kriteria Eksklusi

b. Besar Sampel

Sampel penelitian ini ditentukan menurut rumus Federer untuk uji eksperimental rancangan acak lengkap, yaitu:

t (n-1) 15

dimana (t) adalah kelompok perlakuan, dan (n) adalah jumlah sampel perkelompok perlakuan.

t (n - 1) 15 4(n-1) ≥ 15 4n-4 ≥ 15 4n ≥ 15+4

4n ≥ 19 n ≥ 19/4 n ≥ 4,75 n ≥ 5

Dalam penelitian ini digunakan 20 ekor tikus putih Sprague Dawley betina yang

terbagi dalam 4 kelompok (masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus), yaitu :

Kelompok I : tikus tidak diinduksi DMBA, hanya diberi akuades 1 ml per hari selama 4 minggu

29

Kelompok II : tikus diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu

Kelompok III : tikus diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu dan diberi ekstrak daun sirsak dosis 20 mg/kgBB 1 kali sehari selama 4 minggu

Kelompok IV : tikus diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu dan diberi ekstrak daun sirsak dosis 40 mg/kgBB 1 kali sehari selama 4 minggu

3.4. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

3.4.1. Variabel Penelitian

a. Variabel Bebas (Independent variable)

Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak daun sirsak (Annona muricata

L.).

b. Variabel Terikat (Dependent variable)

Variabel terikat pada penelitian ini adalah gambaran histopatologi jaringan paru tikus putih betina yang diinduksi karsinogen DMBA.

3.4.2. Definisi Operasional Variabel

Untuk memudahkan penelitian dan agar penelitian tidak menjadi terlalu luas, maka dibuat definisi operasional sebagai berikut:

31

Tabel 1. Definisi Operasional

Variabel Definisi Skala

Dosis ekstrak daun sirsak

Ada 4 kelompok dengan perlakuan yang berbeda : - Kelompok I (kontrol negatif) = akuades 1 ml/hari

selama 4 minggu

- Kelompok II (kontrol positif) = induksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu

- Kelompok III (perlakuan coba) = induksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu + ekstrak daun sirsak 20 mg/kgBB/hari selama 4 minggu

- Kelompok IV (perlakuan coba) = induksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu + ekstrak daun sirsak 40 mg/kgBB/hari selama 4 minggu

Kategorik (nominal)

Gambaran histopatologi paru

Melihat gambaran mikroskopis jaringan paru tikus dengan menggunakan skala kategorik pada 5 lapang pandang dengan skoring 0-3 untuk melihat derajat kerusakan alveolus paru (Kirana, 2009).

0 = Tidak terjadi perubahan struktur histologis (normal) 1 = Kerusakan alveolus paru >0% - 30% (kerusakan

ringan)

2 = Kerusakan alveolus paru 31% - 60% (kerusakan sedang)

3 = Kerusakan alveolus paru >60% (kerusakan berat)

Kategorik (ordinal)

3.5. Alat dan Bahan Penelitian

3.5.1. Alat Penelitian

Peralatan yang digunakan untuk ekstrak adalah alat-alat gelas, blender, rotary

evaporator, dan kertas saring. Alat yang dibutuhkan dalam pemeliharaan tikus

berupa kandang, tempat minum dan makan, timbangan digital, sonde lambung berujung Nasogastric tube (NGT). Untuk pengambilan jaringan, digunakan

alat-alat bedah minor. Sedangkan alat-alat untuk pembuatan serta pengamatan preparat histopatologi adalah wadah untuk jaringan paru, object glass, cover glass, spidol,

label, tissue cassette, automatic tissue processor, tissue embedding console,

inkubator, mikrotom, mikroskop cahaya dan digital electronic eyepiece camera

serta satu unit komputer untuk pengambilan foto preparat histopatologi.

3.5.2. Bahan Penelitian

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirsak (Annona

muricata L.). Hewan percobaan yang digunakan untuk pengujian efek

kemopreventif kanker payudara adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina

galur Sprague dawley. Tikus tersebut diperoleh dari Fakultas Peternakan, Institut

33

Bahan yang digunakan pada ekstrak daun sirsak adalah etanol 70%. Bahan kimia yang digunakan untuk penginduksian tikus ialah 7,12-dymethyilbenz(a)antracene

(DMBA) dan minyak jagung. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam pemeriksaan mikroskopis jaringan paru adalah kertas tisu, Ketamine-xylazine,

buffered neutral formaline (BNF) 10%, xylol, alkohol, alkohol absolut, alkohol

95%, alkohol 80%, alkohol 70%, parafin, Mayer’s‎ Hematoxyllin, lithium karbonat, eosin, larutan albumin, air hangat, larutan periodic acid 1%, schiff

reagent, sodium bisulfit 10%, 1 N HCl dan akuades.

3.6. Prosedur Penelitian

3.6.1. Persiapan Hewan Percobaan

Tikus betina ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup terbuat dari kawat ram dan dialasi sekam, pakan berupa pelet dan air minum diberikan ad libitum.

Lingkungan kandang dibuat agar tidak lembab, ventilasi yang cukup serta penyinaran yang cukup dimana lamanya terang 14 jam dan lama gelap 10 jam. Sebelum melakukan percobaan tikus diadaptasi dalam kandang selama 7 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya. Kesehatan tikus dipantau setiap hari dan berat tikus ditimbang setiap minggu.

3.6.2. Ekstraksi Daun Sirsak Dalam Etanol 70%

Pembuatan ekstrak daun sirsak menggunakan bahan berupa daun sirsak yang telah di keringkan sebanyak 500 gram. Kemudian daun sirsak di giling dan di ayak dengan ayakan yang sesuai. Setelah di giling dan di ayak, daun sirsak di rendam dalam larutan etanol 70%. Setiap hari rendaman diaduk-aduk dan disaring sampai didapatkan maserat yang jernih. Maserat di kentalkan dengan rotary evaporator

sampai diperoleh ekstrak daun sirsak.

Dosis ekstrak daun sirsak yang akan di berikan adalah 20mg/kgBB pada kelompok III dan 40mg/kgBB pada kelompok IV setiap hari selama 4 minggu. Berat tikus rata-rata yang digunakan adalah 200 gram, sehingga perhitungan dosis ekstrak daun sirsak pada penelitian ini adalah :

Dosis ekstrak daun sirsak untuk kelompok III

Dosis ekstrak daun sirsak untuk kelompok IV

35

kemudian dari masing-masing dosis ini dilarutkan dalam 1 ml akuades untuk diberikan secara per oral dengan menggunakan sonde lambung.

3.6.3. Pembuatan Larutan DMBA

Pelarut yang digunakan untuk senyawa DMBA adalah minyak jagung karena DMBA larut dalam pelarut ini. Minyak jagung merupakan senyawa inert yang

digunakan untuk melarutkan DMBA dan tidak memiliki sifat karsinogenik (Singletary et al., 2007). Berdasarkan penelitian oleh Meiyanto (2007) telah

ditetapkan dosis serta frekuensi DMBA yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu 20 mg/kg BB, dua kali seminggu selama 4 minggu. Selain itu disebutkan pula bahwa pemberian DMBA dengan dosis 20 mg/kg BB sebanyak 10 kali dalam 4 minggu telah dapat mengakibatkan perubahan secara mikroskopis.

Berat tikus rata-rata yang digunakan adalah 200 gram, sehingga perhitungan dosis pada penelitian ini adalah :

kemudian 4 mg DMBA ini dilarutkan dalam 1 ml minyak jagung untuk diberikan secara per oral dengan menggunakan sonde lambung.

3.6.4. Induksi Kanker Dengan DMBA, Ekstrak Daun Sirsak, dan Pengambilan Sampel

Mula-mula tikus ditimbang untuk mengetahui volume larutan DMBA dan ekstrak daun sirsak yang akan diberikan. Bahan yang akan digunakan untuk larutan DMBA adalah serbuk DMBA yang dilarutkan dalam minyak jagung. Induksi menggunakan sonde oral, seminggu dua kali dengan dosis 20 mg/kgBB yang dilarutkan dalam minyak jagung dan diberikan selama 4 minggu. Setiap tikus pada kelompok II, III, dan IV dengan berat ± 200gr mendapatkan 1ml larutan DMBA dengan konsentrasi 4 mg/ml.

Bahan yang akan digunakan untuk larutan ekstrak daun sirsak adalah ekstrak daun sirsak yang dilarutkan dalam akuades. Ekstrak daun sirsak diberikan dengan dosis 20 mg/kgBB pada kelompok III dan 40 mg/kgBB pada kelompok IV, dengan menggunakan sonde lambung. Setiap tikus dengan berat ± 200gr mendapatkan 1ml larutan ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 4mg/ml untuk kelompok III dan konsentrasi 8mg/ml untuk kelompok IV.

Selama penginduksian senyawa DMBA, tikus setiap hari diinduksi ekstrak daun sirsak. Penginduksian DMBA dan ekstrak daun sirsak dilakukan selama 4 minggu. Sonde untuk tikus kontrol dibedakan dengan tikus perlakuan untuk mencegah adanya kontaminasi. Berat badan tikus ditimbang sebelum, selama, dan setelah intervensi.

37

Terminasi tikus dilakukan setelah perlakuan terakhir. Tikus diterminasi dengan anastesi terlebih dahulu menggunakan ketamine-xylazine dosis 7100mg/kg + 5-10mg/kg secara IP, kemudian di euthanasia dengan metode cervical dislocation.

Setelah itu jaringan paru tikus di ambil melalui pembedahan.

3.6.5. Pembuatan Preparat Dari Jaringan Paru Tikus

a. Fiksasi

Jaringan yang akan dibuat sediaan histopatologi difiksasi dalam larutan Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% minimal 48 jam hingga mengeras (matang). Sampel organ yang terfiksasi dengan sempurna ditrimming setebal ± 0,5 cm. Potongan kemudian dimasukan dalam tissue cassette untuk dimasukan dalam tissue

processor automatic.

b. Dehidrasi

Proses dehidrasi dimaksudkan untuk menarik air dari jaringan dan mencegah terjadinya pengerutan sampel yang diuji. Dehidrasi dilakukan dengan cara merendam sampel dalam larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat (75%, 95%, dan alkohol absolut). Proses perendaman pada masing-masing konsentrasi alkohol dilakukan selama 2 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan mesin otomatis yaitu automatic tissueprocessor.

c. Clearing

Proses clearing atau penjernihan dilakukan 2 tahap dengan menggunakan xylol I

dan xylol II. Penggunaan xylol dimaksudkan untuk melarutkan alkohol dan parafin.

d. Infiltrasi

Infiltrasi atau impregnasi adalah proses pengisian parafin ke dalam pori-pori jaringan. Pengisian pori-pori ini dimaksudkan untuk mengeraskan jaringan agar mudah dipotong dengan pisau mikrotom. Parafin yang digunakan adalah parafin histoplast.

e. Embedding dan Blocking

Embedding atau blocking adalah proses penanaman jaringan dalam blok parafin.

Parafin yang digunakan parafin histoplast. Proses embedding dilakukan dengan

menggunakan alat tissue embedding console.

f. Sectioning

Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom

dengan ketebalan 4 – 5 μm. Pemotongan dilakukan dengan alat rotary microtome spencer. Sediaan kemudian di letakan pada gelas objek dan disimpan dalam

inkubator dengan suhu 37°C selama 24 jam. g. Pewarnaan Hematoxyllin-Eosin

Sebelum melakukan pewarnaan, preparat histopatologi dideparafinisasi dengan larutan xylol (I dan II) selama dua menit. Kemudian dilakukan proses rehidrasi dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam alkohol bertingkat (Alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%). Perendaman dalam alkohol 95% dan 80% dilakukan selama 1 menit. Kemudian sediaan dicuci dengan air yang mengalir (air kran)

39

selama 1 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Mayer’s‎Hematoxyllin dengan tahapan sebagai berikut :

a) Preparat direndam dalam larutan Mayer’s‎Hematoxyllin selama 8 menit; b) Dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 30 detik;

c) Dicelupkan ke dalam larutan larutan lithium karbonat selama 15 – 30 detik; d) Dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 2 menit;

e) Preparat direndam dalam larutan Eosin selama 2 - 3 menit; f) Cuci dengan air mengalir (air kran) selama 30 – 60 detik;

g) Preparat dicelupkan ke dalam larutan alkohol 95% dan alkohol absolut sebanyak 10 kali celupan, absolut II selama dua menit, xylol I selama satu menit dan xylol II selama dua menit.

h. Mounting

Setelah tahapan pewarnaan, sediaan ditetesi perekat permount dan ditutup dengan

cover glass.

3.7. Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan yang bermakna di antara semua kelompok perlakuan, kemudian untuk mengetahui perbedaan di antara dua kelompok perlakuan digunakan uji statistik Mann Whitney. Derajat kemaknaan yang digunakan α = 0,05 (Dahlan, 2010).

3.8. Diagram Alir

Gambar 6. Alur Penelitian

Aklimatisasi hewan coba di laboratorium

Klp 1 Klp 2 Klp 3

Klp K

Induksi DMBA 20mg/kgBB 2 kali seminggu (selama

4 minggu) + ekstrak daun sirsak

40mg/kgBB/hari (selama 4 minggu) Induksi DMBA

20mg/kgBB 2 kali seminggu (selama

4 minggu) + ekstrak daun sirsak

20mg/kgBB/hari (selama 4 minggu) Induksi DMBA

20mg/kgBB 2 kali seminggu (selama 4 minggu) Induksi akuades 1 ml/hari (selama 4 minggu)

Terminasi, pengambilan sampel jaringan paru tikus

Pembuatan preparat dari jaringan paru tikus, pemeriksaan mikroskopik

41

3.9. Etika Penelitian

Sebelum penelitian dilakukan, peneliti akan mengajukan etical approval ke Unit

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat diambil simpulan sebagai berikut:

1. Pemberian ekstrak daun sirsak dapat mencegah terjadinya kerusakan alveolus paru akibat pemberian 7,12-dimetilbenz(α)anthracene (DMBA).

2. Dosis ekstrak daun sirsak yang paling efektif mencegah terjadinya kerusakan alveolus paru akibat pemberian 7,12-dimetilbenz(α)anthracene (DMBA) dalam penelitian ini adalah 40 mg/kgBB/hari.

3. Dosis ekstrak daun sirsak 20 mg/kgBB/hari belum dapat memberikan hasil yang signifikan dalam mencegah terjadinya kerusakan alveolus paru akibat pemberian 7,12-dimetilbenz(α)anthracene (DMBA).

53

5.2. Saran

Saran bagi peneliti lain antara lain:

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap efek toksik dari ekstrak daun sirsak.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek antikanker ekstrak daun sirsak menggunakan dosis bertingkat yang berbeda-beda untuk menemukan dosis dengan efek antikanker terbaik.

3. Perlu dilakukan penelitian terhadap efek-efek lain yang dimiliki zat-zat aktif yang terkandung dalam tanaman sirsak.

4. Peneliti lain dapat menggunakan bagian-bagian tumbuhan sirsak lainnya seperti bunga, biji, batang, buah, dan akar yang diharapkan juga memiliki efek sebagai antikanker alami.

54

DAFTAR PUSTAKA

Adewole SO, Ojewole JAO. 2008. Protective effects of Annona muricata L. (annonaceae) leaf aqueous extract on serum lipid profiles & oxidative stress in hepatocytes of streptozotocin-treated diabetic rats. African journal of traditional, complementary and alternative medicines. 6(1):30-41.

Amelia F, Angeline E, Wahyu K. 2012. Tablet salut enterik ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) sebagai anti kanker kolon yang potensial. (Skripsi). Yogyakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada.

Amin Z. 2006. Kanker paru. Dalam: Sudoyo AW, Setyohadi B, Alwi I, Simadibrata MK, Setiati S. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Edisi ke-4. Jakarta: Interna Publishing. hlm.1984–92.

Anonim1. 2012. Anatomi dan fisiologi (bagian 2).

http://sbhbaturetno.blogspot.com/2013/05/anatomi-dan-fisiologi-bag-2.html. diakses pada tanggal 29 Oktober 2013 pukul 15.30.

Anonim2. 2013. Soursop tree.

http://www.handleysail.com/copperm/displayimage.php?album=131&pos=27. diakses pada tanggal 10 Oktober 2013 pukul 20.15.

Ansel CH. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Jakarta: UI Press. hlm.45-52.

Balitbangkes Depkes RI. 2005. Surveillance of major non communicable disease in south east asian region : report of an international country consultation. http://www.ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/BPK/.../46‎. diakses pada tanggal 12 Oktober 2013 pukul 15.30.

Baskar R, Rajeswari V, Kumar TS. 2007. In vitro antioxidant studies in leaves of annona species. Indian J Exp Biol. 45(5):480-5.

Bernasconi G. 1995. Teknologi Kimia I. Penerjemah: Handojo L. Jakarta: PT. Prandya Paramitha.

Bonita R, Dwyer DC, Leowski J. 2001. Surveillance of Risk Factors for Non

Communicable Disease. WHO.

http://www.ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/BPK/.../46‎. diakses pada tanggal 12 Oktober 2013 pukul 15.15.

California Evironmental Protection Agency (CEPA). 1997. Public health goal for benzo[α]pyrene in drinking water. pesticide and evironmental health hazard assessment. http://www.oehha.ca.gov/water/phg/pdf/Styrene020410.pdf‎. diakses pada tanggal 13 Oktober 2013 pukul 16.00.

Dahlan MS. 2011. Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan Edisi 5. Jakarta: Salemba Medika. hlm.12-26.

Depkes RI. Pedoman pengendalian tikus.

https://www.google.co.id/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&c ad=rja&ved=0CCcQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.depkes.go.id%2Fdow nloads%2FPengendalian%2520Tikus.pdf&ei=YN9MUtOJJseOrQeJr4DIDA& usg=AFQjCNFJvr7s0D1l7dZQcEYXkSvSqtYFHw&sig2=q4rXCZjIfyTXaH Dt1w6zkQ&bvm=bv.53537100,d.bmk. _{diunduh pada 09 November 2013}

pukul 09.30.

Guenther E. 2006. Minyak Atsiri. Jakarta: penerbit UI. hlm.20-34

Harkness JE, Wagner JE. 1983. Biology and medicine of rabbits and rodents. Philadelphia: Lea and Fabriger. http://books.google.co.id/books?id=n-vShPc7tR4C&pg=PA241&lpg=PA241&dq=Harkness+JE,+Wagner+JE.+198 3.+Biology+and+Medicine+of+Rabbits+and+Rodents.+Philadelphia:+Lea+an d+Febiger.&source=bl&ots=PI_BIvecrE&sig=8u8J8KY5qCwxoSgDoKtqjOp Dx8&hl=en&sa=X&ei=fdrgUuCFB46Frge_roH4BQ&ved=0CCkQ6AEwAA #v=onepage&q=Harkness%20JE%2C%20Wagner%20JE.%201983.%20Biolo gy%20and%20Medicine%20of%20Rabbits%20and%20Rodents.%20Philadel phia%3A%20Lea%20and%20Febiger.&f=false. diakses pada 10 November 2013 pukul 13.15.

56

Hartono IA, Indra MR, Rahayu P. 2013. Pengaruh pemberian ekstrak metanol daun kelor (Moringa oleifera) terhadap jumlah CSCs (cancer stem cells) pada

tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi DMBA (7,12

dimetilbenz[α]anthrancene). (Skripsi). Malang: Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya.

Junqueira LC, Carneiro J. 2007. Histologi Dasar Teks dan Atlas Edisi ke-10. Jakarta : EGC. hlm.241-5.

Kirana R. 2009. Pengaruh pemberian the hijau (Camelia sinensis) terhadap kerusakan struktur histologis alveolus paru mencit yang dipapar asap rokok. (Skripsi). Surakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret.

Meiyanto E, Supardjan, Da’i M, Agustina D. 2007. Pentagamavunon-o induces apoptosis on T47D breast cancer cell line through caspase-3 activation. Jurnal Kedokteran Yarsi. 15(2):75-9.

Moore KL, Dalley AF, Agur AMR. 2009. Clinically Oriented Anatomy. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins. hlm.45–7.

Norat T, Bingham S, Navarro C, Quiros JR, Sanchez MJ, Berglund G, Mattison I, Hallmans G, Palmqvist R, Day NE, Khaw KT, Key TJ, Joaquin MS, Hemon B, Saracci R, Kaaks R, Riboli E. 2005. Meat, fish, and colorectal cancer risk : the European prospective investigation into cancer and nutrition. J. Natt. Cancer Institute. 97:906-16.

Pretysta YN. 2012. Pengaruh sari kedelai (Glycine max L.) terhadap gambaran histopatologi sel kanker paru pada tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi 7,12-dimetilbenz(α)antrasen (DMBA). (Skripsi). Jember: Fakultas Kedokteran Universitas Jember.

Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. 2003. Flavonoids: promising anticancer agent. Medicinal Research Review. 23(4):519-34.

Retnani V. 2011. Pengaruh suplementasi ekstrak daun Annona muricata terhadap kejadian displasia epitel kelenjar payudara tikus Sprague dawley yang di induksi 7,12 dimetilbenz[α]anthrancene. (Skripsi). Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.

Sharma V, Paliwal R, Janmeda P, Sharma S. 2012. Chemopreventive efficacy of

Moringa oleifera pods against 7,12-dimethylbenz[α]anthracene induced hepatic carcinogenesis in mice. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 13: 2563–9.

Singletary KW, Jung KJ, Giusti M. 2007. Anthocyanin-rich grape extract blocks breast cell DNA damage. J. Med. Food. 10:244-51.

Siregar GA. 2007. Deteksi dini dan penatalaksanaan kanker usus besar. (Skripsi). Medan: Fakultas Kedokteran Universitas Sumatra Utara.

Sloane E. 2003. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC. hlm. 269.

Sugianto SB, Meiyanto E, Nugroho AE, Jenie UA. 2003. Aktivitas antikarsinogenik senyawa yang berasal dari tumbuhan. Majalah Farmasi Indonesia. 14(4):216-25.

Voight R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Penerjemah: Soendari NS. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

WHO. 2013. Preventing Chronic Disease a Vital Investment. http://www.who.int/chp/chronic_disease_report/en/. Diakses tanggal 29 Oktober 2013 pukul 15.00.

Wijaya M. 2012. Ekstraksi annonaceous acetogenin dari daun sirsak, Annona muricata, sebagai senyawa bioaktif antikanker. (Skripsi). Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Yu H, Yan J, Jiao Y. 2005. Photochemical reaction of 7,12-

dimethylbenz[α]anthracene (DMBA) and formation of DNA covalent adducts.

USA: Department of Chemistry Jackson State University.

Yustina SH. 2008. Daya antibakteria campuran ekstrak etanol buah adas (Foeniculum vulgare Mill) dan kulit batang pulasari (Alyxia reindwartii BL). (Skripsi). Yogyakarta: Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

5.2. Saran

Saran bagi peneliti lain antara lain:

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap efek toksik dari ekstrak daun sirsak.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek antikanker ekstrak daun sirsak menggunakan dosis bertingkat yang berbeda-beda untuk menemukan dosis dengan efek antikanker terbaik.

3. Perlu dilakukan penelitian terhadap efek-efek lain yang dimiliki zat-zat aktif yang terkandung dalam tanaman sirsak.

4. Peneliti lain dapat menggunakan bagian-bagian tumbuhan sirsak lainnya seperti bunga, biji, batang, buah, dan akar yang diharapkan juga memiliki efek sebagai antikanker alami.

DAFTAR PUSTAKA

Adewole SO, Ojewole JAO. 2008. Protective effects of Annona muricata L. (annonaceae) leaf aqueous extract on serum lipid profiles & oxidative stress in hepatocytes of streptozotocin-treated diabetic rats. African journal of traditional, complementary and alternative medicines. 6(1):30-41.

Amelia F, Angeline E, Wahyu K. 2012. Tablet salut enterik ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) sebagai anti kanker kolon yang potensial. (Skripsi). Yogyakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada.

Amin Z. 2006. Kanker paru. Dalam: Sudoyo AW, Setyohadi B, Alwi I, Simadibrata MK, Setiati S. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam Edisi ke-4. Jakarta: Interna Publishing. hlm.1984–92.

Anonim1. 2012. Anatomi dan fisiologi (bagian 2). http://sbhbaturetno.blogspot.com/2013/05/anatomi-dan-fisiologi-bag-2.html. diakses pada tanggal 29 Oktober 2013 pukul 15.30.

Anonim2. 2013. Soursop tree.

http://www.handleysail.com/copperm/displayimage.php?album=131&pos=27. diakses pada tanggal 10 Oktober 2013 pukul 20.15.

Ansel CH. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Jakarta: UI Press. hlm.45-52.

Balitbangkes Depkes RI. 2005. Surveillance of major non communicable disease in south east asian region : report of an international country consultation. http://www.ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/BPK/.../46‎. diakses pada tanggal 12 Oktober 2013 pukul 15.30.

Baskar R, Rajeswari V, Kumar TS. 2007. In vitro antioxidant studies in leaves of annona species. Indian J Exp Biol. 45(5):480-5.

Bernasconi G. 1995. Teknologi Kimia I. Penerjemah: Handojo L. Jakarta: PT. Prandya Paramitha.

Bonita R, Dwyer DC, Leowski J. 2001. Surveillance of Risk Factors for Non

Communicable Disease. WHO.

http://www.ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/BPK/.../46‎. diakses pada tanggal 12 Oktober 2013 pukul 15.15.

California Evironmental Protection Agency (CEPA). 1997. Public health goal for benzo[α]pyrene in drinking water. pesticide and evironmental health hazard assessment. http://www.oehha.ca.gov/water/phg/pdf/Styrene020410.pdf‎. diakses pada tanggal 13 Oktober 2013 pukul 16.00.

Dahlan MS. 2011. Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan Edisi 5. Jakarta: Salemba Medika. hlm.12-26.

Depkes RI. Pedoman pengendalian tikus.

https://www.google.co.id/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&c ad=rja&ved=0CCcQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.depkes.go.id%2Fdow nloads%2FPengendalian%2520Tikus.pdf&ei=YN9MUtOJJseOrQeJr4DIDA& usg=AFQjCNFJvr7s0D1l7dZQcEYXkSvSqtYFHw&sig2=q4rXCZjIfyTXaH Dt1w6zkQ&bvm=bv.53537100,d.bmk. _{diunduh pada 09 November 2013} pukul 09.30.

Guenther E. 2006. Minyak Atsiri. Jakarta: penerbit UI. hlm.20-34

Harkness JE, Wagner JE. 1983. Biology and medicine of rabbits and rodents. Philadelphia: Lea and Fabriger. http://books.google.co.id/books?id=n-vShPc7tR4C&pg=PA241&lpg=PA241&dq=Harkness+JE,+Wagner+JE.+198 3.+Biology+and+Medicine+of+Rabbits+and+Rodents.+Philadelphia:+Lea+an d+Febiger.&source=bl&ots=PI_BIvecrE&sig=8u8J8KY5qCwxoSgDoKtqjOp Dx8&hl=en&sa=X&ei=fdrgUuCFB46Frge_roH4BQ&ved=0CCkQ6AEwAA #v=onepage&q=Harkness%20JE%2C%20Wagner%20JE.%201983.%20Biolo gy%20and%20Medicine%20of%20Rabbits%20and%20Rodents.%20Philadel phia%3A%20Lea%20and%20Febiger.&f=false. diakses pada 10 November 2013 pukul 13.15.

Hartono IA, Indra MR, Rahayu P. 2013. Pengaruh pemberian ekstrak metanol daun kelor (Moringa oleifera) terhadap jumlah CSCs (cancer stem cells) pada tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi DMBA (7,12

dimetilbenz[α]anthrancene). (Skripsi). Malang: Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya.

Junqueira LC, Carneiro J. 2007. Histologi Dasar Teks dan Atlas Edisi ke-10. Jakarta : EGC. hlm.241-5.

Kirana R. 2009. Pengaruh pemberian the hijau (Camelia sinensis) terhadap kerusakan struktur histologis alveolus paru mencit yang dipapar asap rokok. (Skripsi). Surakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret.

Meiyanto E, Supardjan, Da’i M, Agustina D. 2007. Pentagamavunon-o induces apoptosis on T47D breast cancer cell line through caspase-3 activation. Jurnal Kedokteran Yarsi. 15(2):75-9.

Moore KL, Dalley AF, Agur AMR. 2009. Clinically Oriented Anatomy. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins. hlm.45–7.

Norat T, Bingham S, Navarro C, Quiros JR, Sanchez MJ, Berglund G, Mattison I, Hallmans G, Palmqvist R, Day NE, Khaw KT, Key TJ, Joaquin MS, Hemon B, Saracci R, Kaaks R, Riboli E. 2005. Meat, fish, and colorectal cancer risk : the European prospective investigation into cancer and nutrition. J. Natt. Cancer Institute. 97:906-16.

Pretysta YN. 2012. Pengaruh sari kedelai (Glycine max L.) terhadap gambaran histopatologi sel kanker paru pada tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi 7,12-dimetilbenz(α)antrasen (DMBA). (Skripsi). Jember: Fakultas Kedokteran Universitas Jember.

Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. 2003. Flavonoids: promising anticancer agent. Medicinal Research Review. 23(4):519-34.

Retnani V. 2011. Pengaruh suplementasi ekstrak daun Annona muricata terhadap kejadian displasia epitel kelenjar payudara tikus Sprague dawley yang di induksi 7,12 dimetilbenz[α]anthrancene. (Skripsi). Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.

Sharma V, Paliwal R, Janmeda P, Sharma S. 2012. Chemopreventive efficacy of

Moringa oleifera pods against 7,12-dimethylbenz[α]anthracene induced

hepatic carcinogenesis in mice. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 13: 2563–9.

Singletary KW, Jung KJ, Giusti M. 2007. Anthocyanin-rich grape extract blocks breast cell DNA damage. J. Med. Food. 10:244-51.

Siregar GA. 2007. Deteksi dini dan penatalaksanaan kanker usus besar. (Skripsi). Medan: Fakultas Kedokteran Universitas Sumatra Utara.

Sloane E. 2003. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC. hlm. 269.

Sugianto SB, Meiyanto E, Nugroho AE, Jenie UA. 2003. Aktivitas antikarsinogenik senyawa yang berasal dari tumbuhan. Majalah Farmasi Indonesia. 14(4):216-25.

Voight R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Penerjemah: Soendari NS. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

WHO. 2013. Preventing Chronic Disease a Vital Investment. http://www.who.int/chp/chronic_disease_report/en/. Diakses tanggal 29 Oktober 2013 pukul 15.00.

Wijaya M. 2012. Ekstraksi annonaceous acetogenin dari daun sirsak, Annona

muricata, sebagai senyawa bioaktif antikanker. (Skripsi). Jakarta: Fakultas

Kedokteran Universitas Indonesia.

Yu H, Yan J, Jiao Y. 2005. Photochemical reaction of 7,12-

dimethylbenz[α]anthracene (DMBA) and formation of DNA covalent adducts.

USA: Department of Chemistry Jackson State University.

Yustina SH. 2008. Daya antibakteria campuran ekstrak etanol buah adas

(Foeniculum vulgare Mill) dan kulit batang pulasari (Alyxia reindwartii BL).