Identifikasi Bakteri Pereduksi Merkuri

Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif terletak pada susunan kimia dinding selnya. Pada bakteri Gram positif dinding sel tersusun atas peptidoglikan dan komponen khusus berupa asam-asam teikhoat dan teikhuronat serta polisakarida; sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif juga tersusun atas peptidoglikan sedang komponen-komponen khusus berupa lipoprotein, selaput luar dan lipopolisakarida Tedja, 2009. Perbedaan komponen dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif menyebabkan interaksi yang berbeda terhadap logam berat Giller et al., 1998. Bakteri Gram negatif menunjukkan toleransi yang lebih besar terhadap logam daripada Gram positif karena memiliki struktur dinding sel yang lebih kompleks yang mampu mengikat dan mengimobilisasi ion logam termasuk Hg 2+ . Hasil penelitian menemukan 7 isolat bakteri Gram positif dan 3 isolat bakteri Gram negatif. Penelitian ini membuktikan bahwa kelompok bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat mereduksi merkuri tergantung enzim yang dimiliki bakteri tersebut Gadd, 1992. Hasil uji pewarnaan spora pada bakteri Gram positif menunjukkan 4 isolat yang memiliki spora yaitu: Bacillus spp. ICBB 9116, Bacillus spp. ICBB 9118, Bacillus spp. ICBB 9121 memiliki spora di bagian tengah, dan Bacillus spp. ICBB 9122 memiliki spora di bagian tepi. Pewarnaan spora bertujuan membedakan sel vegetatif dengan spora. Spora bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan dibentuk bakteri untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan seperti langkanya sumber karbon, energi, atau fosfat, bahan yang bersifat toksik, suhu yang tidak sesuai, lingkungan yang kering hipotonik. Spora terbentuk dalam sel bakteri serta seringkali disebut sebagai endospora, dalam sel bakteri hanya terdapat 1 spora dan tidak berfungsi untuk reproduksi. Spora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif Bibiana, 1994. Berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, hasil identifikasi 10 isolat unggul bpm, diperoleh bahwa 4 isolat tersebut termasuk dalam kelompok Bacillus sp. yaitu ICBB 9116, ICBB 9118, ICBB 9121, dan ICBB 9122. Termasuk salah satu kelompok bakteri yang banyak diteliti karena dapat mereduksi Hg 2+ menjadi Hg dengan mekanisme detoksifikasi Nakamura et al., 1990; Blake et al., 1993; Sadhukhan et al., 1997; Petrova et al., 2002; Green- Ruiz, 2005; Madigan, 2006; Jaysankar, 2008; Shovitri et al., 2010. Hasil penelitian menemukan 2 isolat bpm yang termasuk dalam kelompok Brevibacillus sp. yaitu ICBB 9123 dan ICBB 9124. Termasuk kelompok bakteri yang mampu mereduksi Hg 2+ menjadi Hg dengan mekanisme detoksifikasi Jaysankar, 2008. Micrococcos luteus ICBB 9120 adalah satu-satunya bakteri pereduksi merkuri dari kelompok gram positif bentuk sel bulat yang ditemukan dalam penelitian ini. Ciri khusus Micrococcos luteus adalah uji katalase positif, uji manitol negatif, uji glukosa negatif dan warna koloni kuning. Termasuk kelompok bakteri mampu mereduksi Hg 2+ menjadi Hg dengan mekanisme detoksifikasi Nakamura et al., 1990; Blake et al., 1993; Sadhukhan et al., 1997; Petrova et al., 2002. Bakteri pereduksi merkuri yang ditemukan dari kelompok gram negatif dan bentuk sel batang yaitu: Pseudomonas sp. ICBB 9115, Eschericia coli ICBB 9117, dan Morganella morganii ICBB 9119. Ciri khusus Pseudomonas sp adalah uji oksidase positif dan uji glukosa negatif. Termasuk kelompok bakteri yang mampu mereduksi Hg 2+ menjadi Hg dengan mekanisme detoksifikasi Nakamura et al., 1990; Blake et al., 1993; Sadhukhan et al., 1997; Handayani, 2001; Petrova et al., 2002; Sulastri, 2002; Madigan, 2006; Jaysankar, 2008; Santi, 2009. Eschericia coli ICBB 9117 adalah bakteri pereduksi merkuri gram negatif dengan bentuk sel batang. Ciri khusus Eschericia coli adalah uji laktosa positif, uji indol positif, dan uji sitrat negatif. Termasuk kelompok bakteri yang mampu mereduksi Hg 2+ menjadi Hg dengan mekanisme detoksifikasi Sadhukhan et al., 1997. Morganella morganii ICBB 9119 adalah bakteri pereduksi merkuri gram negatif dengan bentuk sel batang. Morganella morganii memiliki ciri khusus yaitu uji laktosa negatif, uji indol positif, uji H 2 S negatif dan termasuk kelompok bakteri yang mampu mereduksi Hg 2+ menjadi Hg dengan mekanisme detoksifikasi. Morganella sp. merupakan salah satu bakteri penghasil histamin yang banyak ditemukan pada ikan tuna tongkol Mangunwardoyo et al., 2007. a b c d e f g h i j Gambar 7. Koloni ke-10 bakteri pereduksi merkuri isolat Bacillus sp. ICBB 9115 a, Bacillus sp. ICBB 9118 b, Bacillus sp. ICBB 9123 c, Bacillus sp. ICBB 9124 d, Brevibacillus sp. ICBB 9123 e, Brevibacillus sp. ICBB 9124 f, Micrococcos luteus ICBB 9120 g, Eschericia coli ICBB 9117 h, i Morganella morganii ICBB 9119 i, Pseudomonas sp. ICBB 9115 j. a b c d e f g h i j Gambar 8. Bentuk sel bakteri pereduksi merkuri isolat Bacillus sp. ICBB 9116 a, Bacillus sp. ICBB 9118 b, Bacillus sp. ICBB 9121 c, Bacillus sp. ICBB 9122 d, Micrococcos luteus ICBB 9120 e, Brevibacillus sp. ICBB 9123 f, Brevibacillus sp. ICBB 9124 g, Eschericia coli ICBB 9117 h, Pseudomonas sp. ICBB 9115 i, dan Morganella morganii ICBB 9119 j.. 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm Tabel 3. Uji morfologi dan fisiologi sepuluh isolat unggul bakteri pereduksi merkuri ICBB 9116 ICBB 9118 ICBB 9121 ICBB 9122 ICBB 9120 ICBB 9123 ICBB 9124 ICBB 9115 ICBB 9117 ICBB 9119 B e n t u k s e l Batang Batang Batang Batang Bulat Batang Batang Batang Batang Batang P e w a r n a a n G r a m + + + + + + + – – – E n d o s p o r a Tengah Tengah Tengah Tepi Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada A e r o b + + + + + + + + + + B e n t u k K o l o n i Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat I r e g u l a r I r e g u l a r Bulat D i a m e t e r k o l o n i 1mm 1mm 1mm 1mm 1mm 1mm 1mm 1mm 1mm 1mm W a r n a k o l o n i Krem Krem Krem Krem Kuning Krem Kuning Krem S a l e m O r a n g e E l e v a s i k o l o n i R a t a Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung R a t a R a t a T e p i a n k o l o n i B e r l e k u k Rata Rata Rata Rata Rata Rata G e l o m b a n g G e l o m b a n g Rata P e r m . K o l o n i K e r i n g C a h a ya L e n d i r C a h a ya C a h a ya C a h a ya C a h a ya C a h a ya K e r i n g K e r i n g M o t i l i t a s – – + – – + + – – + U j i K a t a l a s e – + – – + + + – + + U j i O k s i d a s e – + + + + + – + – – U j i N i t r a t – + + + – – – – + – U j i L ys i n – – – – – + – – – – U j i H 2 S – – – – – – – – – – U j i M a n n i t o l + – + – – + – – + – U j i I n d o l e + + + + + – – + + + U j i U r e a s e – – – – – + + – – – U j i V P – – – – – + – + – – U j i M R – – – + – – – – – – U j i S i t r a t – – – – – + + – – – U j i G l u k o s a + – + + – + + – + – U j i F r u k t o s a + + + – + + + – + + U j i X yl o s e + – + – – + + – + – U j i S u k r o s a + – + – – + – – + – U j i La k t o s a + – + – – – – – + – U j i I n o s i t o l – – – – – – – – + – U j i S o r b i t o l – – + – – + – – + – U j i A r a b i n o s a + – + – + – + – + – U j i G a l a k t o s a + + + – + + + – – – U j i M a l t o s a – – + – – – – – + – U j i D u l s i t o l – – – – – – – – – – Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Micrococcos luteus Brevibacillus sp. Brevibacillus sp. Pseudomonas sp. Eschericia coli Morganella morganii 4.4. Pertumbuhan BPM pada Berbagai Kondisi Lingkungan 4.4.1. Pengaruh Suhu terhadap Pertumbuhan Bakteri Pereduksi Merkuri Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat Pseudomonas sp. ICBB 9115, Eschericia coli ICBB 9117, Morganella morganii ICBB 9119, Micrococcos luteus ICBB 9120, Brevibacillus sp. ICBB 9123, dan Brevibacillus sp. ICBB 9124 menunjukkan suhu pertumbuhan optimum pada suhu ruang 27 o C. Sedangkan isolat Bacillus sp. ICBB 9116, Bacillus sp. ICBB 9118, Bacillus sp. ICBB 9121, dan Bacillus sp. ICBB 9122 menunjukkan suhu pertumbuhan optimum pada suhu 45 o C. Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan bakteri, pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim. Suhu yang rendah dapat menyebabkan aktivitas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim Bibiana, 1994 dan Tedja, 2009 Tabel 4. Tabel 4. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan sepuluh isolat BPM Isolat Suhu 4 o C Suhu ruang 27 o C Suhu 45 o C OD [sel] OD [sel] OD [sel] ICBB 9116 0.007 0.38 0.52 1.12 1.39 7.05 ICBB 9118 0.006 0.31 0.69 1.07 1.49 7.85 ICBB 9121 0.005 0.23 0.89 1.09 1.58 8.36 ICBB 9122 0.012 0.35 0.95 1.01 1.56 8.30 ICBB 9123 0.024 0.47 1.04 5.64 0.02 0.45 ICBB 9124 0.004 0.37 1.47 7.81 0.32 2.01 ICBB 9120 0.011 0.57 1.53 8.74 0.46 3.35 ICBB 9115 0.008 0.51 1.35 6.89 0.44 2.98 ICBB 9117 0.011 0.75 1.42 7.28 0.53 3.07 ICBB 9119 0.014 0.88 1.57 8.96 0.61 3.77 Keterangan : [sel] : konsentrasi sel x 10 8 Untuk menghitung jumlah bakteri dapat digunakan dua cara yaitu: 1 jumlah bakteri secara keseluruhan bakteri yang hidup dan yang mati total cell count, dan 2 jumlah bakteri yang hidup viable count. Penghitungan bakteri secara keseluruhan terbagi atas dua cara yaitu: menghitung langsung secara mikroskopik dan menghitung dengan cara kekeruhan Bibiana, 1994. Dalam penelitian ini digunakan cara menghitung keseluruhan bakteri berdasarkan kekeruhan dengan menggunakan spektrofotometer. Jumlah bakteri dalam suspensi ditentukan dengan menentukan kerapatan optik OD = optical density. Kurva standar bakteri menyuguhkan data perbandingan antara nilai OD absorbans dengan konsentrasi sel bakteri yang ditumbuhkan. Gambar 9 dan 10 menunjukkan kurva standar isolat bakteri Brevibacillus sp. ICBB 9123 dan Brevibacillus sp. ICBB 9124 yang ditumbuhkan pada media Luria Bertani dengan konsentrasi 500 ppm HgCl 2 pada suhu ruang. Gambar 9. Kurva standar isolat Brevibacillus sp. ICBB 9123 Gambar 10. Kurva standar isolat Brevibacillus sp. ICBB 9124 Pertumbuhan sel dicirikan dengan waktu yang dibutuhkan untuk menggandakan massa atau jumlah sel. Umumnya pertumbuhan sel dinyatakan melalui massa sel, karena lebih mudah, cepat dan sederhana. Massa sel dalam penelitian ini dianalisa melalui kerapatan optik kekeruhan cairan media kultivasi. Secara kualitatif pertumbuhan biomassa bakteri ditunjukkan dengan kerapatan optik. Metode ini merupakan cara yang baik untuk melihat pertumbuhan bakteri tanpa harus y = 0,2074x + 0,0002 R² = 0,9971 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0,6 1,2 2,4 4,8 9,6 O D 6 2 n m Konsentrasi sel 10 8 y = 0,1982x - 0,0698 R² = 0,9972 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0,54 1,09 2,18 4,35 8,70 O D 6 2 n m konsentrasi sel 10 8 mengganggu kultur bakteri Black, 2005. Pola pertumbuhan biomassa setiap bakteri berbeda satu dengan lainnya, terdiri atas: 1 fase adaptasi yaitu sel-sel bakteri menyesuaikan dengan lingkungannya, pada fase awal terjadi sintesis enzim oleh sel yang diperlukan untuk metabolisme metabolit; 2 fase eksponensial yaitu sel-sel bakteri sedang aktif memproduksi enzim-enzim yang dibutuhkan untuk metabolismenya, dimana terlihat peningkatan kekeruhan cairan kultivasi yang tinggi; dan 3 fase kematian disebabkan karena ketahanan hidup sel menurun akibat akumulasi berbagai produk metabolit dan inhibitor, sehingga terjadi lisis sel dan massa sel berkurang Laily, 2004 dan Tedja, 2009. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ke-8 isolat bpm yaitu Pseudomonas sp. ICBB 9115, Bacillus sp. ICBB 9116, Eschericia coli ICBB 9117, Bacillus sp. ICBB 9118, Bacillus sp. ICBB 9121, Bacillus sp. ICBB 9122, Brevibacillus sp. ICBB 9123, dan Brevibacillus sp. ICBB 9124 memiliki bentuk pola pertumbuhan yang sama. Memiliki fase adaptasi pada 6 jam sd jam 12, fase eksponensial pada 12 jam sd 24 jam, dan fase kematian pada 24 jam dapat dilihat pada Gambar 10. Gambar 11. Kurva pertumbuhan delapan isolat BPM Ke-2 isolat lainnya yaitu: Micrococcos luteus ICBB 9120 dan Morganella morganii ICBB 9119 memiliki fase eksponensial yang lebih panjang. Isolat Micrococcos luteus ICBB 9120 memiliki fase eksponensial pada 12 jam sd 72 jam dan isolat Morganella morganii ICBB 9119 memiliki fase eksponensial pada 12 jam 0,5 1 1,5 2 2,5 6 12 24 48 72 P op u las i B ak te ri OD 620 n m Waktu jam Bacillus spp. ICBB 9116 Bacillus spp. ICBB 9118 Brevibacillus spp. ICBB 9123 Pseudomonas sp. ICBB 9115 Eschericia coli ICBB 9117 Bacillus spp. ICBB 9121 sd 96 jam. Perbedaan ini berdasarkan kepada kemampuan masing-masing bakteri dalam menghasilkan enzim-enzim untuk metabolismenya Tedja, 2009 dapat dilihat pada Gambar 12. Gambar 12. Kurva pertumbuhan isolat Morganella sp. dan Micrococcos sp.

4.4.2. Pengaruh pH terhadap Pertumbuhan Bakteri Pereduksi Merkuri

Pertumbuhan dan aktivitas bakteri pereduksi merkuri bpm sangat dipengaruhi oleh pH lingkungan. Pengaruh pH terhadap pertumbuhan bakteri dapat melalui dua cara, yakni melalui 1 fungsi sistem enzimatis dalam sel bakteri dan 2 pembentukan energi dalam sel. Perubahan pH secara langsung mempengaruhi struktur enzim dan protein lain dalam sel, karena aktivitas fisiologis intraselular selalu berada dalam kondisi mendekati netral. Oleh karena itu, sel bakteri perlu melakukan penyesuaian apabila kondisi lingkungan di luar sel terlalu masam atau terlalu basa Yusron, 2009. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kelima isolat bpm menunjukkan pertumbuhan optimum pada pH 7 yaitu: ICBB 9116, ICBB 9118, ICBB 9121, ICBB 9122, dan ICBB 9124; sedangkan kelima isolat lainya yaitu: ICBB 9120, ICBB 9123, ICBB 9115, ICBB 9117, dan ICBB 9119 menunjukkan pertumbuhan optimum pada pH 9. Keempat isolat bpm kelompok Gram positif bentuk batang berspora yaitu: Bacillus sp. ICBB 9116, Bacillus sp. ICBB 9118, Bacillus sp. ICBB 9121, dan Bacillus sp. ICBB 9122 menunjukkan pertumbuhan pada pH 5 setelah inkubasi 24 jam dan pertumbuhan optimum pada pH 7. Hasil penelitian ini mendukung Green- 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 6 12 24 48 72 96 120 144 P op u las i B ak te ri OD 620 n m Waktu jam Morganella morganii ICBB 9119 Micrococcos luteus ICBB 9120 Ruiz 2005 yang mengatakan bahwa pemberian pH antara 4.5 – 7.0 pada 25°C menggunakan isolat Bacillus sp. dapat mempercepat adsorpsi merkuri terjadi pada 20 menit pertama. Kedua bpm Gram positif bentuk batang tidak berspora menunjukan perbedaan pertumbuhan terhadap pengaruh pH. Isolat Brevibacillus sp. ICBB 9123 menunjukkan pertumbuhan optimum pada pH 9 dan Brevibacillus sp. ICBB 9124 pada pH 7. Isolat bpm bentuk bulat tidak berspora yaitu Micrococcos luteus ICBB 9120 menunjukkan pertumbuhan pada pH 7 dan pertumbuhan optimum pada pH 9. Ketiga bpm Gram negatif bentuk batang yaitu: Pseudomonas sp. ICBB 9115, Eschericia coli ICBB 9117, dan Morganella morganii ICBB 9119 menunjukkan pertumbuhan pada pH 5 dan pH 7, serta pertumbuhan optimum terlihat pada pH 9 Tabel 5. Tabel 5. Pertumbuhan sepuluh isolat BPM pada berbagai nilai pH OD = 620 nm Isolat pH 5 pH 7 pH 9 Bacillus sp. ICBB 9116 1.27 1.44 0.95 Bacillus sp. ICBB 9118 1.34 1.75 1.58 Bacillus sp. ICBB 9121 1.49 1.85 1.72 Bacillus sp. ICBB 9122 1.47 1.66 0.94 Brevibacillus sp. ICBB 9123 0.60 1.39 1.42 Brevibacillus sp. ICBB 9124 0.41 1.31 0.70 Micrococcos luteus ICBB 9120 1.66 1.92 2.07 Pseudomonas sp. ICBB 9115 1.36 1.79 1.82 Eschericia coli ICBB 9117 1.58 1.74 1.79 Morganella morganii ICBB 9119 1.58 1.92 1.93

4.5. Uji Aktivitas Bakteri Pereduksi Merkuri

Hasil penelitian menemukan 10 isolat bpm dari PESK Talawaan- Tatelu yang mampu hidup pada media LB yang ditambahkan HgCl 2 sampai konsentrasi 500 ppm mgl yaitu: Pseudomonas sp. ICBB 9115, Bacillus sp. ICBB 9116, Eschericia coli ICBB 9117, Bacillus sp. ICBB 9118, Morganella morganii ICBB 9119, Micrococcos luteus ICBB 9120, Bacillus sp. ICBB 9121, Bacillus sp. ICBB 9122, Brevibacillus sp. ICBB 9123, dan Brevibacillus sp. ICBB 9124. Ke-10 isolat bpm diduga mampu beradaptasi dengan lingkungan asalnya dan telah mampu merubah pola metabolismenya untuk mendegradasi merkuri dengan cara mensintesis protein reduksi merkuri Misra, 2002. Bakteri yang resisten terhadap merkuri menghasilkan enzim organomerkuri lyase produk gen mer B yang dapat memutuskan ikatan C-Hg dan enzim merkuri reduktase produk gen mer A yang mereduksi Hg 2+ menjadi Hg yang terjadi di dalam sitoplasma. Hasil reduksi Hg akan dilepaskan keluar sel Gadd, 1990; Gupta, et al., 1999; Brown et al., 2002. Hasil reduksi merkuri ke-10 bpm dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6. Hasil reduksi merkuri kesepuluh isolat BPM dalam tabung reaksi ISOLAT Kadar merkuri ppm 34.75 69.76 178.04 284.88 350.33 Bacillus sp. ICBB 9116 1.39 5.68 32.75 62.25 77.80 Bacillus sp. ICBB 9118 0.48 2.31 12.35 48.95 67.95 Brevibacillus sp. ICBB 9123 1.77 1.63 91.38 101.23 127.00 Brevibacillus sp. ICBB 9124 1.25 3.35 23.88 87.54 103.25 Pseudomonas sp. ICBB 9115 1.32 7.59 43.20 71.20 141.20 Morganella morganii ICBB 9119 0.52 3.19 16.20 62.30 69.70 Micrococcos luteus ICBB 9120 0.47 3.78 49.05 96.50 108.10 Eschericia coli ICBB 9117 1.67 9.89 35.45 64.25 162.30 Bacillus sp. ICBB 9121 0.63 4.01 23.09 58.04 73.03 Bacillus sp. ICBB 9122 1.23 14.31 51.97 89.77 165.89 Pada kondisi lapang, merkuri berada dalam tiga tingkat valensi yang berbeda. Hal ini sangat tergantung pada kondisi redoks yang memungkinkan sebagai Hg dan Hg 2+ yang sering dijumpai di dalam tanah. Redoks potensial, pH dan konsentrasi Hg 2+ merupakan peubah kunci dalam menetapkan spesifikasi bentuk merkuri di dalam larutan tanah. Percepatan laju reduksi Hg 2+ oleh bakteri memungkinkan untuk digunakan dalam teknik bioremediasi in situ di tanah atau air yang tercemar Barkay et al., 1991. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada media kontrol tanpa isolat terjadi reduksi Hg. Pada pemberian Hg dalam HgCl 2 50 ppm terjadi penurunan Hg sebanyak 2.19 ppm dari 36.94 ppm menjadi 34.75. Pada pemberian Hg dalam HgCl 2 100 ppm terjadi penurunan Hg sebanyak 4.12 ppm dari 73.88 ppm menjadi 69.76 ppm. Pada