29
diinjeksikan adalah 12,5 µg100µL fosfat buffer salin PBS. Total RNA diekstraksi dari otot tempat injeksi, insang, limpa dan ginjal ikan mas yang
diinjeksi dengan pAct-GFP pada saat 24 jam pasca injeksi hari pertama dan 1 minggu pasca injeksi. Sementara itu untuk uji vaksin DNA pAct-GP25, total
RNA diekstraksi dari jaringanorgan yang sama dengan pada pAct-GFP, tetapi dilakukan pada 24 jam, 2 minggu dan hari 4 minggu setelah injeksi. Ekstraksi
RNA dilakukan menggunakan Isogen Nippon Gen, Japan. Sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakan kit Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads
Amersham Pharmacia Biotech, USA. Masing-masing dosis disuntikkan ke 10 ekor ikan dan selanjutnya ikan dipelihara pada tiga akuarium yang berbeda.
a. Isolasi RNA
Ikan yang telah divaksinasi diperiksa kandungan RNA-nya pada bagian bekas suntikan. Bagian bekas suntikan tersebut dipotong dengan skalpel steril,
dikeluarkan secara aseptis dan langsung dimasukkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 200 µl ISOGEN yang disimpan on-ice. Untuk meminimalkan
pengaruh RNase, semua alat dan bahan isolasi RNA diperlakukan dengan air yang mengandung dietylpyrocarbonate DEPC. Sebelumnya alat-alat yang
akan digunakan dalam isolasi telah disterilisasi pada suhu 123
o
C selama 15 menit. Jaringan bekas suntikan digerus sampai hancur dengan menggunakan
grinder, setelah hancur lalu ditambahkan ISOGEN sampai volume akhir 800 µl
dan disimpan pada suhu ruang selama 5 menit agar terlisis sempurna. Setelah itu ditambahkan 200 µl kloroform, divorteks selama 15 detik pada kecepatan
sedang, lalu disimpan pada suhu ruang selama 2-3 menit. Selanjutnya tabung mikro disentrifugasi pada 12000 rpm, pada suhu ruang selama 5 menit.
Supernatan yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 400 µl isopropanol, dihomogenasi menggunakan vorteks pelan sampai homogen
dan selanjutnya disimpan pada suhu ruang selama 5-10 menit. Tabung disentrifugasi pada 12000 rpm, suhu 4
o
C selama 15 menit. Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 1 ml etanol 70 dingin dan disentrifugasi pada 12000 rpm,
suhu 4
o
C selama 15 menit. Supernatan dibuang, lalu dikering udarakan. Setelah kering ditambahkan DEPC sebanyak 50 µl. Konsentrasi RNA total hasil isolasi
diukur menggunakan alat pengukur konsentrasi RNADNA merek Gene-Quant. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.
30
b. Sintesis cDNA dan Amplifikasi PCR
Konsentrasi RNA dibuat 3 mikrogram dalam 30 µl DEPC, kemudian dihomogenasi menggunakan vorteks dengan kecepatan rendah. Sebelumnya
telah disiapkan inkubator dengan suhu 65
o
C, lalu tabung mikro dimasukkan ke dalam inkubator selama 10 menit. Selanjutnya tabung mikro dimasukkan ke
dalam es selama 2 menit. Kemudian RNA dimasukkan ke dalam tabung ” First Strand Reaction Mix Beads” white tube yang telah berisi 2 butir bola putih.
Kemudian ditambahkan
3 µl
primer ”dT3`RACE-VECT”
5`- GTAATACGAATAACTATAGGGCACGCGTGG-
TCGACGGCCCGGGCTGGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3` dengan konsentrasi 1 µg3 µl lalu dibiarkan selama 1 menit, setelah itu dihomogenasi menggunakan
vorteks dengan kecepatan rendah. Tabung mikro dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37
o
C, diinkubasi selama 1 jam. Hasil sintesis cDNA ditambahkan 50 µl SDW steril
.
Dalam proses amplifikasi PCR untuk cDNA gen GP25 digunakan primer GP. Satu mikrogram cDNA digunakan sebagai sampel untuk PCR, kemudian
dicampur dengan 1 µl primer forward maupun reverse 10 pmol µl, 1 µl dNTP, 1 µl Ex Taq buffer, 0.05 µl Ex Taq polymerase TAKARA, Shiga, Jepang
kemudian ditambahkan SDW sampai volume akhir menjadi 10 µl. Proses polimerisasi dijalankan pada mesin PCR pada suhu 95
o
C selama 7 menit sebanyak 1 siklus; 95
o
C selama 30 detik; 62
o
C selama 30 detik; 72
o
C selama 1 menit sebanyak 35 siklus; 72
o
C selama 5 menit sebanyak 1 siklus; dan 4
o
C tak hingga. Hasil PCR dielektroforesis di agarose 0,7 untuk melihat ada tidaknya
gen GP25 yang teramplifikasi
Tahap III: Uji Tantang Skala Laboratorium
Uji tantang dilakukan dalam dua tahap. Uji tantang tahap I dilakukan pada bulan Desember 2008 sampai Februari 2009, sedangkan uji tantang tahap
II dilakukan pada pertengahan bulan November sampai bulan Desember 2009. Ikan terlebih dahulu dibius dengan minyak cengkeh House Brand PD.Eltra Raya
Perkasa, Tangerang dosis 0,04 ppt sebelum divaksinasi, diambil darahnya maupun diuji tantang dengan virus.
31
Preparasi Virus
Sebanyak 1 gram insang yang terinfeksi KHV digerus kemudian disuspensikan dengan 9 ml larutan PBS. Suspensi insang ini disentrifugasi
dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit pada suhu 4
o
C. Supernatan yang dihasilkan diambil dan disaring dengan kertas milipore 0,
45 µm. Supernatan ini diencerkan 1000 kali dengan PBS 1:1000.
Uji Tantang Tahap I
Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas strain wildan dari daerah Cianjur. Ikan yang berukuran 10-15 gram tersebut diadaptasikan selama dua
minggu sebelum perlakuan. Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 60 ekor per perlakuan. Ikan dibagi menjadi dua kelompok, masing-masing kelompok
sebanyak 30 ekor. Kelompok ikan pertama digunakan untuk pengamatan haematologi dan kelompok ikan kedua digunakan untuk pengamatan RPS.
Perlakuan yang diberikan adalah vaksinasi dengan dosis 2,5 µg100 µl, 7,5
µg100 µl dan 12,5 µg100 µl serta kontrol negatif ikan tidak divaksinasi dan tidak diuji tantang dan kontrol positif ikan tidak divaksinasi dan diuji tantang.
Selama masa adaptasi maupun perlakuan ikan diberi pakan berupa pelet sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore.
Vaksinasi dilakukan selama 42 hari dan setelah itu ikan diuji tantang dengan virus KHV. Pengambilan dan pemeriksaan sampel darah dilakukan
setiap minggu sampai satu bulan setelah uji tantang.
a. Pengamatan RPS Relative Percent Survival
