Vaksinasi Ikan Koi Menggunakan Vaksin DNA Anti- KHV dengan Dosis Berbeda
VAKSINASI IKAN KOI MENGGUNAKAN VAKSIN DNA
ANTI-KHV DENGAN DOSIS BERBEDA
SITI ZUBAIDAH
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Vaksinasi Ikan Koi
Menggunakan Vaksin DNA Anti-KHV Dengan Dosis Berbeda” adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Siti Zubaidah
NIM C14090055
ABSTRAK
SITI ZUBAIDAH.Vaksinasi Ikan Koi Menggunakan Vaksin DNA Anti-KHV
Dengan Dosis Berbeda. Dibimbing oleh SRI NURYATI dan ENI KUSRINI.
Salah satu upaya penanggulangan wabah KHV yang biasa menyerang ikan
koi dan ikan mas adalah dengan pemberian vaksin DNA, karena vaksin DNA
dapat merangsang kekebalan spesifik dan kekebalan yang ditimbulkan relatif
tinggi, serta aman digunakan. Penelitian ini bertujuan menguji beberapa dosis
vaksin DNA terhadap benih ikan koi sehingga didapatkan dosis yang tepat yang
dapat memberikan relative percents survival (RPS) dan imunitas terbaik.
Perlakuan yang diberikan adalah vaksinasi dengan dosis berbeda melalui teknik
injeksi secara intra muskular, sebagai berikut: Perlakuan A (7,5 µg/100 µL),
B (10 µg/100 µL), C (12,5 µg/100 µL), serta kontrol positif (ikan tidak
divaksinasi tetapi diuji tantang) dan kontrol negatif (ikan tidak divaksinasi dan
tidak diuji tantang). Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian
vaksin dengan dosis berbeda mampu memberikan nilai kelangsungan hidup dan
RPS yang tidak berbeda nyata (p>0,05), yaitu nilai kelangsungan hidup sebesar
97,22 % dan memberikan nilai RPS sebesar 95,8 %. Selain itu dari uji gambaran
darah yang dilakukan, diperoleh hasil bahwa pada perlakuan dosis 12,5 µg/ 100
mL memberikan nilai terbaik pada hampir semua parameter.
Kata kunci: ikan koi, vaksin DNA, KHV, kelangsungan hidup, dosis.
ABSTRACT
SITI ZUBAIDAH. Koi Fish Vaccination Using Anti-KHV DNA vaccine with
different doses. Guided by SRI NURYATI and ENI KUSRINI.
An effort to overcome the KHV outbreak that usually attack koi fish and
common carp is administation of DNA vaccine, because DNA vaccines can
stimulate specific immune responses and induced immunity in relatively high
level, and safe to use. The aim of this research was to get the effective dose of
DNA vaccine than can provide the best relative percents survival (RPS) and
immunity. The treatments were vaccinated with different doses by the
intramuscular injection technique, as follows: Treatment A (7.5 μg/100 mL),
B (10 μg/100 mL), C (12.5 μg/100 mL), and the positive control (unvaccinated
but were challenged by KHV) and negative control (unvaccinated and were not
challenged by KHV). Results of this study showed that administation of the
vaccine with different doses was able to provide survival value and RPS were not
significantly different (p>0.05), the survival value of 97.22% and give RPS values
of 95.8%. In addition based on the blood analysis, the result showed that the
treatment dose of 12.5 mg/100 mL provides the best value in almost all
parameters.
Keywords: koi fish, DNA vaccines, KHV, survival, dose.
VAKSINASI IKAN KOI MENGGUNAKAN VAKSIN DNA
ANTI-KHV DENGAN DOSIS BERBEDA
SITI ZUBAIDAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Perikanan
pada
Departemen Budidaya Perairan
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi
Nama
NIM
Program Studi
: Vaksinasi Ikan Koi Menggunakan Vaksin DNA AntiKHV dengan Dosis Berbeda
: Siti Zubaidah
: C14090055
: Teknologi dan Managemen Perikanan Budidaya
Disetujui oleh
Dr Sri Nuryati, SPi MSi
Pembimbing I
Eni Kusrini, SPi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Sukenda, MSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian
yang dilaksanakan sejak Januari hingga April 2013 di Balai Penelitian dan
Pengembangan Budidaya Ikan Hias Depok dan Laboratorium Kesehatan Ikan
BDP, IPB ini berjudul “Vaksinasi Ikan Koi Menggunakan Vaksin DNA AntiKHV Dengan Dosis Berbeda”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Sri Nuryati, SPi MSi dan Ibu
Eni Kusrini, SPi MSi selaku pembimbing, serta Bapak Dr Ir Agus Oman Sudrajat,
MSi selaku penguji luar komisi yang telah banyak memberi saran. Ucapan terima
kasih penulis sampaikan pula kepada Pak Imam dan Pak Ruhman beserta
jajarannya di Kementerian Agama yang telah banyak memberi dukungan kepada
penulis selama masa perkuliahan berlangsung. Selanjutnya, penghargaan penulis
sampaikan kepada Ibu Lili Sholichah, SPi dari BPPBIH Depok atas bantuannya
selama penelitian berlangsung. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada
ayah, ibu, serta seluruh keluarga (Kak Sidik, Faisal, dan Fisca), atas segala doa
dan kasih sayangnya. Tidak lupa pula penulis juga menyampaikan ungkapan
terima kasih kepada Pak Ranta, Mas Rahman, Pak Marjanta, Mba Yuli, Wiwik,
Reza, Susan, Seto, Nanda, Devi, Fierco, Dillah, Wahyu, teman-teman BDP 4548, teman-teman CSS 46 dan CSS IPB serta teman-teman LKI.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013
Siti Zubaidah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL. ............................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR.. ......................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN. ....................................................................................... viii
PENDAHULUAN. ..................................................................................................1
Latar Belakang. ....................................................................................................1
Tujuan Penelitian.. ...............................................................................................2
METODE. ................................................................................................................2
Materi Uji .............................................................................................................2
Analisis Data ........................................................................................................3
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................7
Hasil .....................................................................................................................7
Pembahasan ........................................................................................................14
KESIMPULAN DAN SARAN ..............................................................................18
Kesimpulan ........................................................................................................18
Saran ...................................................................................................................18
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................18
DAFTAR RIWAYAT HIDUP ...............................................................................29
DAFTAR TABEL
1 Kelangsungan hidup relatif (RPS) ikan koi yang diberi vaksin DNA
anti-KHV dengan dosis berbeda. ..................................................................... 7
2 Gejala klinis harian tiap perlakuan pascauji tantang.........................................8
3 Kisaran parameter kualitas air selama penelitian...........................................14
DAFTAR GAMBAR
1 Nilai kelangsungan hidup ikan koi sebelum dan sesudah uji tantang
dengan KHV.....................................................................................................7
2 Gejala klinis ikan koi yang terserang KHV. .................................................... 8
3 Hasil uji PCR ikan koi yang terinfeksi KHV. .................................................. 9
4 Total eritrosit. ................................................................................................... 9
5 Total leukosit .................................................................................................. 10
6 Kadar hematokrit ............................................................................................ 10
7 Kadar haemoglobin ........................................................................................ 11
8 Nilai indeks fagositik ..................................................................................... 11
9 Nilai persentase monosit ................................................................................ 12
10 Nilai persentase limfosit ................................................................................. 12
11 Nilai persentase neutrofil ............................................................................... 13
12 Histologi insang ikan kontrol negatif dan positif ........................................... 13
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
terhadap persentase jumlah sel darah merah ikan koi ....... 20
terhadap persentase jumlah sel darah putih ikan koi ....... 21
terhadap persentase kadar hematokrit darah ikan koi ....... 22
terhadap kadar haemoglobin darah ikan koi ..................... 23
terhadap persentase indeks fagositik darah ikan koi ......... 24
terhadap persentase monosit darah ikan koi ..................... 25
terhadap persentase limfosit darah ikan koi .................. 26
terhadap persentase neutrofil darah ikan koi ................. 27
terhadap tingkat kelangsungan hidup ikan koi .................. 28
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia mempunyai potensi dan peluang di sektor perikanan dalam
meraih devisa yang lebih besar dibandingkan sektor non migas. Salah satu
sumber devisa yang dapat diandalkan adalah sektor perikanan budidaya, baik
laut, payau, maupun tawar. Budidaya perikanan air tawar selangkah lebih maju
dibandingkan dengan laut dan payau. Komoditas ikan mas merupakan salah
satu komoditas budidaya ikan air tawar yang selama ini telah berkembang pesat
di masyarakat. Selain ikan-ikan konsumsi yang di budidayakan, ikan hias juga
memberikan sumbangan besar bagi devisa negara, diantaranya ikan hias yang
bernilai ekonomis tinggi, yaitu koi (Cyprinus carpio).
Dalam perkembangannya, budidaya ikan mas dan koi tidak luput dari
kendala yang disebabkan oleh serangan penyakit. Salah satu wabah yang dapat
merugikan pembudidaya bahkan sampai gulung tikar adalah serangan Koi
Herpesvirus (KHV). Sejak awal tahun 2002 kedua jenis ikan tersebut terserang
penyakit KHV, yang diakibatkan oleh masuknya ikan koi impor pembawa virus
KHV. Wabah KHV telah menyebar ke seluruh sentra budidaya ikan mas dan
ikan koi, dan menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar. Akibatnya,
aktivitas perdagangan ikan hidup dari satu daerah ke daerah lain terganggu.
KHV ini dapat menyebabkan gagal panen atau panen dini. Puluhan atau
bahkan ratusan kasus kematian ikan mas dan koi akibat infeksi KHV tersebut
hingga saat ini sangat meresahkan pembudidaya kedua jenis ikan tersebut,
termasuk pelaku usaha lainnya. Infeksi KHV terjadi pada saat musim hujan atau
pada saat suhu rendah yang berkisar 17oC-24oC. Penyakit ini sangatlah menular,
menyerang semua stadia ikan, dan bersifat ganas sehingga dapat menyebabkan
kematian massal sekitar 80%-100%. Menurut Hedrick et al. (2005), infeksi
KHV ditandai dengan ciri eksternal, yaitu pembengkakan dan nekrosis pada
filamen insang, produksi lendir berlebih ataupun perubahan warna kulit,
sedangkan ciri internalnya adalah terjadinya pembengkakan pada limpa dan
ginjal. Selain itu biasanya diikuti oleh infeksi sekunder berupa luka atau bercak
putih di permukaan tubuh yang disebabkan oleh Aeromonas hydrophila
dan/atau Flexibacter columnaris (Mudjiutami et al., 2006). Berbagai upaya
telah dilakukan untuk menanggulangi penyakit tersebut, di antaranya adalah
pembentukan posko penanggulangan wabah, sarasehan, pelatihan daerah
terinfeksi dengan Surat Keputusan Menteri Departemen Kelautan dan
Perikanan nomor 28 dan 40 tahun 2002, serta vaksinasi.
Vaksin yang diberikan selama ini adalah vaksin yang berasal dari virus
yang dilemahkan dan hasil penelitian yang telah dilakukan oleh para peneliti di
bidangnya. Pada penelitian ini akan digunakan vaksin yang dibuat dari DNA anti
virus KHV pada ikan mas. DNA vaksin tersebut diharapkan dapat efektif dalam
mencegah serangan penyakit KHV yang setiap tahun selalu muncul terhadap
ikan koi. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan terhadap ikan mas di
BBPBAT Sukabumi, dengan penggunaan vaksin 10-3 dapat memberikan nilai
kelangsungan hidup ikan sebesar 73,33% lebih tinggi dibandingkan perlakuan
lainnya (Laelawati, 2008). Penelitian lainnya yang dilakukan di IPB telah
2
membuktikan bahwa vaksinasi tiga kali seminggu mampu memberikan nilai
kelangsungan hidup relatif ikan mas sebesar 84,6% (Khodijah, 2012).
Vaksin DNA merupakan salah satu metode pencegahan penyakit melalui
vaksinasi dengan prinsip kerja meningkatkan sistem kekebalan spesifik pada
inang. Vaksin DNA diperkirakan menjadi vaksin masa depan karena memiliki
beberapa keunggulan, yaitu mudah dikembangkan dan diproduksi, tidak
menimbulkan infeksi, bersifat stabil sehingga memudahkan dalam penyimpanan
dan mampu mengaktivasi sistem kekebalan tubuh baik humoral maupun seluler
(Lorenzen & Lapatra, 2005). Vaksin DNA cukup efektif mencegah penyakit viral
haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) pada ikan salmon (Lorenzen & Lapatra,
2005) dan KHV pada ikan mas dan koi (Nuryati, 2010) sehingga dapat
menghasilkan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji beberapa dosis vaksin DNA terhadap
benih ikan koi sehingga didapatkan dosis yang tepat yang dapat memberikan
RPS dan imunitas terbaik.
METODE
Materi Uji
Kultur bakteri pembawa vaksin
Bakteri Escherichia coli pembawa vaksin DNA (Nuryati, 2010) yang
disimpan dalam gliserol pada suhu (-)80oC diambil menggunakan tusuk gigi steril
dan digoreskan kuadran pada media padat LB polipepton + ampisilin untuk
mendapatkan koloni tunggal. Sel bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 16
jam, lalu disimpan pada suhu 4oC hingga akan digunakan. Untuk perbanyakan
plasmid, bakteri dikultur di media cair menggunakan shaker incubator dengan
kecepatan 240 rpm selama 16 - 18 jam dan selanjutnya dipanen.
Pemanenan bakteri dan pelleting bakteri bertujuan untuk memisahkan sel
bakteri dengan media kultur. Sebanyak 20 mL bakteri hasil kultur dituangkan
secara parsial ke dalam masing-masing microtube bervolume 1,5 mL, lalu
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm dan suhu 4oC selama 30 detik. Hasil
pelleting bakteri dicuci dengan 1 mL PBS (phospate buffer saline) sebanyak 3 kali.
Setelah dicuci dengan PBS, bakteri dimatikan dengan perlakuan panas pada suhu
80oC selama 5 menit dan diresuspensi kembali dengan PBS sebanyak 1 mL
kemudian diisolasi plasmidnya (Yuliyanti, 2011).
Vaksinasi dan uji tantang
Ikan uji yang digunakan adalah benih koi hasil produksi di BPPBIH
Depok yang memiliki bobot rata-rata 16,98±0,20 gram dengan panjang rata-rata
12,62±0,71 cm sebanyak 240 ekor yang ditebar ke dalam 20 akuarium berukuran
(45 x 40 x 40) cm3. Kemudian vaksin yang digunakan adalah vaksin DNA antiKHV hasil temuan Nuryati et. al (2010). Sebelum divaksin benih ikan koi
diadaptasikan terlebih dahulu terhadap kondisi lingkungan selama satu bulan,
kemudian vaksin DNA diambil dengan syring dan diinjeksikan ke ikan sebanyak
3
0,1 mL dengan frekuensi satu kali. Adapun rancangan perlakuan pada penelitian
ini adalah sebagai berikut :
Perlakuan A
: ikan diberi vaksin DNA secara intra muskular dengan dosis
7,5 µg /100 µL sebanyak satu kali dan diuji tantang dengan
filtrat KHV
Perlakuan B
: ikan diberi vaksin DNA secara intra muskular dengan dosis
10 µg /100 µL sebanyak satu kali dan diuji tantang dengan
filtrat KHV
Perlakuan C
: ikan diberi vaksin DNA secara intra muskular dengan dosis
12,5 µg /100 µL sebanyak satu kali dan diuji tantang
dengan filtrat KHV
Kontrol positif
: ikan tanpa diberi vaksin DNA dan diuji tantang dengan
filtrat KHV, dan
Kontrol negatif
: ikan tanpa diberi vaksin DNA dan tidak diuji tantang
dengan filtrat KHV.
Setelah ikan dipelihara selama 28 hari, perlakuan A, B, C dan kontrol
positif diuji tantang. Uji tantang dilakukan dengan menginjeksi virus aktif
sebanyak 0,1 mL secara intra muskular (otot punggung) ke semua ikan uji
(Nuryati et al., 2010). Masa uji tantang untuk melihat gejala klinis dan
kelangsungan hidup ikan yang diberi vaksin DNA dilakukan selama 28 hari.
Analisis Data
Parameter penelitian
Kelangsungan hidup
Penghitungan jumlah ikan yang mati dilakukan pada awal terinfeksi KHV
sampai akhir penelitian. Tingkat kelangsungan hidup hidup ikan dihitung dengan
menggunakan rumus :
Keterangan :
SR : Tingkat kelangsungan hidup (%)
Nt : Jumlah ikan yang hidup pada akhir pemeliharaan (ekor)
N0 : Jumlah ikan yang hidup pada awal pemeliharaan (ekor)
Kelangsungan hidup relatif (relative percent survival/RPS)
Kematian ikan dicatat sebelum dan sesudah uji tantang untuk menghitung
kelangsungan hidup relatif (RPS). RPS dihitung dengan menggunakan rumus :
Keterangan :
RPS
: Relative percent survival (%)
Mn
: Mortalitas pada perlakuan N (%)
Mk
: Mortalitas pada perlakuan kontrol positif (%)
4
Gejala klinis
Pengamatan gejala klinis dilakukan setiap hari pada saat pemberian pakan
selama masa vaksinasi dan pasca uji tantang. Pengamatan gejala klinis meliputi
respon makan, tingkah laku ikan, dan kelainan kondisi fisik ikan.
Metode pengukuran hematologi
Pengambilan darah
Pengambilan darah dilakukan sebanyak tiga kali selama penelitian, yaitu
saat aklimatisasi, pemeliharaan setelah vaksinasi dan uji tantang. Sebelum
pengambilan darah, ikan terlebih dahulu dibius dengan minyak cengkeh dosis
0,04 ppt. Pada pengambilan darah, ikan diletakkan dengan kepala menghadap
sebelah kiri, sebelumnya alat suntik sudah dibilas dengan Na-sitrat 3,8%,
kemudian darah diambil sekitar 0,5-1 mL pada bagian vena kaudalis yaitu
pembuluh darah yang terletak tepat dibagian ventral tulang punggung. Jarum
ditusukkan di antara anus dan sirip anal, lalu jarum ditarik sedikit kemudian darah
dihisap sampai batas yang diinginkan. Setelah itu alat suntik dicabut kemudian
darah ditempatkan ke dalam microtube berukuran 1,5 mL. Ikan yang diambil
darahnya masing-masing satu ekor tiap perlakuan dan dibuat dua ulangan untuk
setiap parameter gambaran darah.
Perhitungan kadar haemoglobin
Pengukuran kadar Haemoglobin (Hb) dilakukan dengan metode Sahli.
Pertama darah dihisap dengan pipet sahli sampai skala 20 mm3 atau pada skala
0,02 mL, kemudian darah dipindahkan ke dalam tabung Hb-meter yang telah diisi
HCl 0,1 N sampai skala 10, kemudian diaduk dan dibiarkan selama 3-5 menit.
Setelah itu akuades ditambahkan sampai warna darah dan HCl tersebut seperti
warna larutan standar yang ada dalam Hb-meter tersebut. Skala dibaca dengan
melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung sahli yang dilihat
pada skala jalur g% (kuning) yang berarti banyaknya haemoglobin dalam gram
per 100 mL darah.
Perhitungan kadar hematokrit (Chinabut et al. 1991)
Darah dihisap dengan tabung mikrohematokrit sampai mencapai ¾ bagian
tabung, lalu ujung tabung ditutup dengan crytoseal sedalam kira-kira 1 mm,
sehingga terbentuk sumbat crytoseal. Kemudian tabung mikrohematokrit
disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit dengan posisi tabung
yang bervolume sama berhadapan agar putaran sentrifus seimbang. Nilai kadar
hematokrit ditentukan dengan persentase panjang bagian darah yang mengendap
(a) serta panjang total volume darah yang terdapat di dalam tabung (b) : (a/b) x
100%. Kadar hematokrit ini mencerminkan banyaknya sel darah (digambarkan
dengan endapan/padatan) dalam cairan darah.
Penghitungan total eritrosit (Blaxhall dan Daisley 1973)
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah
sampai skala 0,5. Kemudian ditambahkan larutan Hayem’s (berfungsi untuk
mematikan sel-sel darah putih) sampai skala 101, pengadukan darah di dalam
pipet dilakukan dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti
membentuk angka delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata.
5
Setelah itu tetesan pertama larutan darah dalam pipet dibuang, dan tetesan
berikutnya diletakkan pada haemacytometer tipe Neubauer kemudian ditutup
dengan gelas penutup. Jumlah sel darah merah dihitung dengan bantuan
mikroskop dengan perbesaran 400 x. Jumlah eritrosit total dihitung pada 5 kotak
besar haemacytometer dengan faktor pengenceran 202. Berikut ini adalah rumus
perhitungan total eritrosit:
Penghitungan total leukosit (Blaxhall dan Daisley 1973)
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna putih sampai
skala 0,5. Kemudian ditambahkan larutan Turk’s (berfungsi untuk mematikan selsel darah merah) sampai skala 11, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan
dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka
delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan
pertama larutan darah dalam pipet dibuang, dan tetesan berikutnya diletakkan
pada haemacytometer tipe Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup.
Jumlah sel darah putih dihitung dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran
400 x. Jumlah leukosit total dihitung sebanyak 5 kotak besar haemacytometer
dengan faktor pengenceran 22. Berikut ini adalah rumus perhitungan total
leukosit:
Pembuatan preparat ulas darah/differensial leukosit (Svobodova &
Vyukusova 1991)
Sebelumnya gelas objek yang akan digunakan direndam dalam methanol
untuk menghilangkan lemak yang menempel. Pembuatan preparat ulas darah
dilakukan dengan menempatkan setetes darah pada gelas objek, gelas objek kedua
diletakkan dengan sudut 45o terhadap gelas objek pertama, kemudian digeser ke
belakang sehingga menyentuh darah, kemudian gelas objek kedua digeser
berlawanan arah sehingga membentuk lapisan tipis darah. Selanjutnya preparat
dikeringudarakan kemudian difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Kemudian
preparat dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan kembali sebelum diwarnai
dengan pewarna Giemsa selama 15 menit. Lalu preparat dicuci kembali dengan
akuades untuk mengurangi kelebihan warna dan dikeringkan dengan tisu. Setelah
itu diamati di bawah mikroskop. Persentase sel-sel leukosit dihitung dengan cara
mengamati sebanyak 100 sel leukosit yang berbeda dan masing-masing jenis
leukosit yang terhitung dikelompokkan dan dipersentasi menurut jenisnya,
satuannya adalah persen (%).
Indeks fagositik
Sebanyak 50 μL darah dimasukkan kedalam mikrotiter plate, ditambahkan
50 μL suspensi Staphylococcus aureus dalam PBS (108 sel/mL), dihomogenkan
dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 20 menit. Setelah itu sebanyak 5 μL
dibuat sediaan ulas darah dan dikeringudarakan. Lalu difiksasi dengan methanol
selama 5 menit dan dikeringkan. Kemudian direndam dalam pewarna Giemsa
6
selama 15 menit. Lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tisu.
Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x. Jumlah sel
yang menunjukkan proses fagositosis dihitung dari 100 sel fagosit yang teramati.
Pengamatan histologi
Proses pembuatan preparat histologi melalui beberapa tahapan, antara
lain : fiksasi, dehidrasi, embedding, pemotongan, dan pewarnaan jaringan, serta
pengamatan mikroskopik.
Kualitas air
Pengukuran kualitas air dalam penelitian ini meliputi pengukuran suhu
harian yang diamati pada pagi dan sore hari, dan pengukuran pH, DO, alkalinitas,
NH3, NO2, No3, dan PO4 yang dilakukan pada masa aklimatisasi, vaksinasi dan
pasca uji tantang. Pergantian air sebanyak 50% dan penyifonan dilakukan setiap
hari, agar kualitas air tetap terjaga.
Pengumpulan data
Data yang dikumpulkan pada penelitian ini adalah data kelangsungan
hidup, RPS, gejala klinis, gambaran darah, histologi, kualitas air, dan data hasil uji
PCR.
Analisis data
Penelitian yang digunakan menggunakan rancangan acak lengkap, analisis
data menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) dengan uji F pada selang
kepercayaan 95%, dengan menggunakan program Ms. Excel dan SPSS 17.0.
Apabila berpengaruh nyata, untuk mengetahui perbedaan antar perlakukan diuji
dengan uji Tukey. Parameter yang dianalisis adalah nilai kelangsungan hidup,
RPS dan data gambaran darah, sedangkan data histologi, gejala klinis, uji PCR,
dan kualitas air dianalisis secara deskriptif.
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Nilai Kelangsungan Hidup
(%)
Kelangsungan hidup dan RPS
Kelangsungan hidup pada penelitian ini diamati pada akhir pengamatan
yaitu pada saat pasca uji tantang. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1 dan Tabel 1,
penggunaan vaksin DNA dengan dosis 7,5 µg/100 µL, 10 µg/100 µL, dan 12,5
µg/100 µL pada benih ikan koi menunjukkan nilai kelangsungan hidup yang
tidak berbeda nyata (Lampiran 9), yaitu sebesar 97,22±0,58% dan RPS
95,83±0,58% yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol positif (33,33±2,0).
120.00
100.00
97.22
97.22
97.22
b
b
b
b
100.00
80.00
60.00
40.00
33.33
a
20.00
0.00
k+
k-
Sebelum Uji Tantang
A
B
C
Pasca Uji Tantang
Keterangan
* Huruf yang berbeda menunjukan hasil yang berbeda nyata (P
ANTI-KHV DENGAN DOSIS BERBEDA
SITI ZUBAIDAH
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Vaksinasi Ikan Koi
Menggunakan Vaksin DNA Anti-KHV Dengan Dosis Berbeda” adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Siti Zubaidah
NIM C14090055
ABSTRAK
SITI ZUBAIDAH.Vaksinasi Ikan Koi Menggunakan Vaksin DNA Anti-KHV
Dengan Dosis Berbeda. Dibimbing oleh SRI NURYATI dan ENI KUSRINI.
Salah satu upaya penanggulangan wabah KHV yang biasa menyerang ikan
koi dan ikan mas adalah dengan pemberian vaksin DNA, karena vaksin DNA
dapat merangsang kekebalan spesifik dan kekebalan yang ditimbulkan relatif
tinggi, serta aman digunakan. Penelitian ini bertujuan menguji beberapa dosis
vaksin DNA terhadap benih ikan koi sehingga didapatkan dosis yang tepat yang
dapat memberikan relative percents survival (RPS) dan imunitas terbaik.
Perlakuan yang diberikan adalah vaksinasi dengan dosis berbeda melalui teknik
injeksi secara intra muskular, sebagai berikut: Perlakuan A (7,5 µg/100 µL),
B (10 µg/100 µL), C (12,5 µg/100 µL), serta kontrol positif (ikan tidak
divaksinasi tetapi diuji tantang) dan kontrol negatif (ikan tidak divaksinasi dan
tidak diuji tantang). Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian
vaksin dengan dosis berbeda mampu memberikan nilai kelangsungan hidup dan
RPS yang tidak berbeda nyata (p>0,05), yaitu nilai kelangsungan hidup sebesar
97,22 % dan memberikan nilai RPS sebesar 95,8 %. Selain itu dari uji gambaran
darah yang dilakukan, diperoleh hasil bahwa pada perlakuan dosis 12,5 µg/ 100
mL memberikan nilai terbaik pada hampir semua parameter.
Kata kunci: ikan koi, vaksin DNA, KHV, kelangsungan hidup, dosis.
ABSTRACT
SITI ZUBAIDAH. Koi Fish Vaccination Using Anti-KHV DNA vaccine with
different doses. Guided by SRI NURYATI and ENI KUSRINI.
An effort to overcome the KHV outbreak that usually attack koi fish and
common carp is administation of DNA vaccine, because DNA vaccines can
stimulate specific immune responses and induced immunity in relatively high
level, and safe to use. The aim of this research was to get the effective dose of
DNA vaccine than can provide the best relative percents survival (RPS) and
immunity. The treatments were vaccinated with different doses by the
intramuscular injection technique, as follows: Treatment A (7.5 μg/100 mL),
B (10 μg/100 mL), C (12.5 μg/100 mL), and the positive control (unvaccinated
but were challenged by KHV) and negative control (unvaccinated and were not
challenged by KHV). Results of this study showed that administation of the
vaccine with different doses was able to provide survival value and RPS were not
significantly different (p>0.05), the survival value of 97.22% and give RPS values
of 95.8%. In addition based on the blood analysis, the result showed that the
treatment dose of 12.5 mg/100 mL provides the best value in almost all
parameters.
Keywords: koi fish, DNA vaccines, KHV, survival, dose.
VAKSINASI IKAN KOI MENGGUNAKAN VAKSIN DNA
ANTI-KHV DENGAN DOSIS BERBEDA
SITI ZUBAIDAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Perikanan
pada
Departemen Budidaya Perairan
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi
Nama
NIM
Program Studi
: Vaksinasi Ikan Koi Menggunakan Vaksin DNA AntiKHV dengan Dosis Berbeda
: Siti Zubaidah
: C14090055
: Teknologi dan Managemen Perikanan Budidaya
Disetujui oleh
Dr Sri Nuryati, SPi MSi
Pembimbing I
Eni Kusrini, SPi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Sukenda, MSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian
yang dilaksanakan sejak Januari hingga April 2013 di Balai Penelitian dan
Pengembangan Budidaya Ikan Hias Depok dan Laboratorium Kesehatan Ikan
BDP, IPB ini berjudul “Vaksinasi Ikan Koi Menggunakan Vaksin DNA AntiKHV Dengan Dosis Berbeda”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Sri Nuryati, SPi MSi dan Ibu
Eni Kusrini, SPi MSi selaku pembimbing, serta Bapak Dr Ir Agus Oman Sudrajat,
MSi selaku penguji luar komisi yang telah banyak memberi saran. Ucapan terima
kasih penulis sampaikan pula kepada Pak Imam dan Pak Ruhman beserta
jajarannya di Kementerian Agama yang telah banyak memberi dukungan kepada
penulis selama masa perkuliahan berlangsung. Selanjutnya, penghargaan penulis
sampaikan kepada Ibu Lili Sholichah, SPi dari BPPBIH Depok atas bantuannya
selama penelitian berlangsung. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada
ayah, ibu, serta seluruh keluarga (Kak Sidik, Faisal, dan Fisca), atas segala doa
dan kasih sayangnya. Tidak lupa pula penulis juga menyampaikan ungkapan
terima kasih kepada Pak Ranta, Mas Rahman, Pak Marjanta, Mba Yuli, Wiwik,
Reza, Susan, Seto, Nanda, Devi, Fierco, Dillah, Wahyu, teman-teman BDP 4548, teman-teman CSS 46 dan CSS IPB serta teman-teman LKI.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013
Siti Zubaidah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL. ............................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR.. ......................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN. ....................................................................................... viii
PENDAHULUAN. ..................................................................................................1
Latar Belakang. ....................................................................................................1
Tujuan Penelitian.. ...............................................................................................2
METODE. ................................................................................................................2
Materi Uji .............................................................................................................2
Analisis Data ........................................................................................................3
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................7
Hasil .....................................................................................................................7
Pembahasan ........................................................................................................14
KESIMPULAN DAN SARAN ..............................................................................18
Kesimpulan ........................................................................................................18
Saran ...................................................................................................................18
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................18
DAFTAR RIWAYAT HIDUP ...............................................................................29
DAFTAR TABEL
1 Kelangsungan hidup relatif (RPS) ikan koi yang diberi vaksin DNA
anti-KHV dengan dosis berbeda. ..................................................................... 7
2 Gejala klinis harian tiap perlakuan pascauji tantang.........................................8
3 Kisaran parameter kualitas air selama penelitian...........................................14
DAFTAR GAMBAR
1 Nilai kelangsungan hidup ikan koi sebelum dan sesudah uji tantang
dengan KHV.....................................................................................................7
2 Gejala klinis ikan koi yang terserang KHV. .................................................... 8
3 Hasil uji PCR ikan koi yang terinfeksi KHV. .................................................. 9
4 Total eritrosit. ................................................................................................... 9
5 Total leukosit .................................................................................................. 10
6 Kadar hematokrit ............................................................................................ 10
7 Kadar haemoglobin ........................................................................................ 11
8 Nilai indeks fagositik ..................................................................................... 11
9 Nilai persentase monosit ................................................................................ 12
10 Nilai persentase limfosit ................................................................................. 12
11 Nilai persentase neutrofil ............................................................................... 13
12 Histologi insang ikan kontrol negatif dan positif ........................................... 13
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
Analisis statistik
terhadap persentase jumlah sel darah merah ikan koi ....... 20
terhadap persentase jumlah sel darah putih ikan koi ....... 21
terhadap persentase kadar hematokrit darah ikan koi ....... 22
terhadap kadar haemoglobin darah ikan koi ..................... 23
terhadap persentase indeks fagositik darah ikan koi ......... 24
terhadap persentase monosit darah ikan koi ..................... 25
terhadap persentase limfosit darah ikan koi .................. 26
terhadap persentase neutrofil darah ikan koi ................. 27
terhadap tingkat kelangsungan hidup ikan koi .................. 28
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia mempunyai potensi dan peluang di sektor perikanan dalam
meraih devisa yang lebih besar dibandingkan sektor non migas. Salah satu
sumber devisa yang dapat diandalkan adalah sektor perikanan budidaya, baik
laut, payau, maupun tawar. Budidaya perikanan air tawar selangkah lebih maju
dibandingkan dengan laut dan payau. Komoditas ikan mas merupakan salah
satu komoditas budidaya ikan air tawar yang selama ini telah berkembang pesat
di masyarakat. Selain ikan-ikan konsumsi yang di budidayakan, ikan hias juga
memberikan sumbangan besar bagi devisa negara, diantaranya ikan hias yang
bernilai ekonomis tinggi, yaitu koi (Cyprinus carpio).
Dalam perkembangannya, budidaya ikan mas dan koi tidak luput dari
kendala yang disebabkan oleh serangan penyakit. Salah satu wabah yang dapat
merugikan pembudidaya bahkan sampai gulung tikar adalah serangan Koi
Herpesvirus (KHV). Sejak awal tahun 2002 kedua jenis ikan tersebut terserang
penyakit KHV, yang diakibatkan oleh masuknya ikan koi impor pembawa virus
KHV. Wabah KHV telah menyebar ke seluruh sentra budidaya ikan mas dan
ikan koi, dan menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar. Akibatnya,
aktivitas perdagangan ikan hidup dari satu daerah ke daerah lain terganggu.
KHV ini dapat menyebabkan gagal panen atau panen dini. Puluhan atau
bahkan ratusan kasus kematian ikan mas dan koi akibat infeksi KHV tersebut
hingga saat ini sangat meresahkan pembudidaya kedua jenis ikan tersebut,
termasuk pelaku usaha lainnya. Infeksi KHV terjadi pada saat musim hujan atau
pada saat suhu rendah yang berkisar 17oC-24oC. Penyakit ini sangatlah menular,
menyerang semua stadia ikan, dan bersifat ganas sehingga dapat menyebabkan
kematian massal sekitar 80%-100%. Menurut Hedrick et al. (2005), infeksi
KHV ditandai dengan ciri eksternal, yaitu pembengkakan dan nekrosis pada
filamen insang, produksi lendir berlebih ataupun perubahan warna kulit,
sedangkan ciri internalnya adalah terjadinya pembengkakan pada limpa dan
ginjal. Selain itu biasanya diikuti oleh infeksi sekunder berupa luka atau bercak
putih di permukaan tubuh yang disebabkan oleh Aeromonas hydrophila
dan/atau Flexibacter columnaris (Mudjiutami et al., 2006). Berbagai upaya
telah dilakukan untuk menanggulangi penyakit tersebut, di antaranya adalah
pembentukan posko penanggulangan wabah, sarasehan, pelatihan daerah
terinfeksi dengan Surat Keputusan Menteri Departemen Kelautan dan
Perikanan nomor 28 dan 40 tahun 2002, serta vaksinasi.
Vaksin yang diberikan selama ini adalah vaksin yang berasal dari virus
yang dilemahkan dan hasil penelitian yang telah dilakukan oleh para peneliti di
bidangnya. Pada penelitian ini akan digunakan vaksin yang dibuat dari DNA anti
virus KHV pada ikan mas. DNA vaksin tersebut diharapkan dapat efektif dalam
mencegah serangan penyakit KHV yang setiap tahun selalu muncul terhadap
ikan koi. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan terhadap ikan mas di
BBPBAT Sukabumi, dengan penggunaan vaksin 10-3 dapat memberikan nilai
kelangsungan hidup ikan sebesar 73,33% lebih tinggi dibandingkan perlakuan
lainnya (Laelawati, 2008). Penelitian lainnya yang dilakukan di IPB telah
2
membuktikan bahwa vaksinasi tiga kali seminggu mampu memberikan nilai
kelangsungan hidup relatif ikan mas sebesar 84,6% (Khodijah, 2012).
Vaksin DNA merupakan salah satu metode pencegahan penyakit melalui
vaksinasi dengan prinsip kerja meningkatkan sistem kekebalan spesifik pada
inang. Vaksin DNA diperkirakan menjadi vaksin masa depan karena memiliki
beberapa keunggulan, yaitu mudah dikembangkan dan diproduksi, tidak
menimbulkan infeksi, bersifat stabil sehingga memudahkan dalam penyimpanan
dan mampu mengaktivasi sistem kekebalan tubuh baik humoral maupun seluler
(Lorenzen & Lapatra, 2005). Vaksin DNA cukup efektif mencegah penyakit viral
haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) pada ikan salmon (Lorenzen & Lapatra,
2005) dan KHV pada ikan mas dan koi (Nuryati, 2010) sehingga dapat
menghasilkan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji beberapa dosis vaksin DNA terhadap
benih ikan koi sehingga didapatkan dosis yang tepat yang dapat memberikan
RPS dan imunitas terbaik.
METODE
Materi Uji
Kultur bakteri pembawa vaksin
Bakteri Escherichia coli pembawa vaksin DNA (Nuryati, 2010) yang
disimpan dalam gliserol pada suhu (-)80oC diambil menggunakan tusuk gigi steril
dan digoreskan kuadran pada media padat LB polipepton + ampisilin untuk
mendapatkan koloni tunggal. Sel bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 16
jam, lalu disimpan pada suhu 4oC hingga akan digunakan. Untuk perbanyakan
plasmid, bakteri dikultur di media cair menggunakan shaker incubator dengan
kecepatan 240 rpm selama 16 - 18 jam dan selanjutnya dipanen.
Pemanenan bakteri dan pelleting bakteri bertujuan untuk memisahkan sel
bakteri dengan media kultur. Sebanyak 20 mL bakteri hasil kultur dituangkan
secara parsial ke dalam masing-masing microtube bervolume 1,5 mL, lalu
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm dan suhu 4oC selama 30 detik. Hasil
pelleting bakteri dicuci dengan 1 mL PBS (phospate buffer saline) sebanyak 3 kali.
Setelah dicuci dengan PBS, bakteri dimatikan dengan perlakuan panas pada suhu
80oC selama 5 menit dan diresuspensi kembali dengan PBS sebanyak 1 mL
kemudian diisolasi plasmidnya (Yuliyanti, 2011).
Vaksinasi dan uji tantang
Ikan uji yang digunakan adalah benih koi hasil produksi di BPPBIH
Depok yang memiliki bobot rata-rata 16,98±0,20 gram dengan panjang rata-rata
12,62±0,71 cm sebanyak 240 ekor yang ditebar ke dalam 20 akuarium berukuran
(45 x 40 x 40) cm3. Kemudian vaksin yang digunakan adalah vaksin DNA antiKHV hasil temuan Nuryati et. al (2010). Sebelum divaksin benih ikan koi
diadaptasikan terlebih dahulu terhadap kondisi lingkungan selama satu bulan,
kemudian vaksin DNA diambil dengan syring dan diinjeksikan ke ikan sebanyak
3
0,1 mL dengan frekuensi satu kali. Adapun rancangan perlakuan pada penelitian
ini adalah sebagai berikut :
Perlakuan A
: ikan diberi vaksin DNA secara intra muskular dengan dosis
7,5 µg /100 µL sebanyak satu kali dan diuji tantang dengan
filtrat KHV
Perlakuan B
: ikan diberi vaksin DNA secara intra muskular dengan dosis
10 µg /100 µL sebanyak satu kali dan diuji tantang dengan
filtrat KHV
Perlakuan C
: ikan diberi vaksin DNA secara intra muskular dengan dosis
12,5 µg /100 µL sebanyak satu kali dan diuji tantang
dengan filtrat KHV
Kontrol positif
: ikan tanpa diberi vaksin DNA dan diuji tantang dengan
filtrat KHV, dan
Kontrol negatif
: ikan tanpa diberi vaksin DNA dan tidak diuji tantang
dengan filtrat KHV.
Setelah ikan dipelihara selama 28 hari, perlakuan A, B, C dan kontrol
positif diuji tantang. Uji tantang dilakukan dengan menginjeksi virus aktif
sebanyak 0,1 mL secara intra muskular (otot punggung) ke semua ikan uji
(Nuryati et al., 2010). Masa uji tantang untuk melihat gejala klinis dan
kelangsungan hidup ikan yang diberi vaksin DNA dilakukan selama 28 hari.
Analisis Data
Parameter penelitian
Kelangsungan hidup
Penghitungan jumlah ikan yang mati dilakukan pada awal terinfeksi KHV
sampai akhir penelitian. Tingkat kelangsungan hidup hidup ikan dihitung dengan
menggunakan rumus :
Keterangan :
SR : Tingkat kelangsungan hidup (%)
Nt : Jumlah ikan yang hidup pada akhir pemeliharaan (ekor)
N0 : Jumlah ikan yang hidup pada awal pemeliharaan (ekor)
Kelangsungan hidup relatif (relative percent survival/RPS)
Kematian ikan dicatat sebelum dan sesudah uji tantang untuk menghitung
kelangsungan hidup relatif (RPS). RPS dihitung dengan menggunakan rumus :
Keterangan :
RPS
: Relative percent survival (%)
Mn
: Mortalitas pada perlakuan N (%)
Mk
: Mortalitas pada perlakuan kontrol positif (%)
4
Gejala klinis
Pengamatan gejala klinis dilakukan setiap hari pada saat pemberian pakan
selama masa vaksinasi dan pasca uji tantang. Pengamatan gejala klinis meliputi
respon makan, tingkah laku ikan, dan kelainan kondisi fisik ikan.
Metode pengukuran hematologi
Pengambilan darah
Pengambilan darah dilakukan sebanyak tiga kali selama penelitian, yaitu
saat aklimatisasi, pemeliharaan setelah vaksinasi dan uji tantang. Sebelum
pengambilan darah, ikan terlebih dahulu dibius dengan minyak cengkeh dosis
0,04 ppt. Pada pengambilan darah, ikan diletakkan dengan kepala menghadap
sebelah kiri, sebelumnya alat suntik sudah dibilas dengan Na-sitrat 3,8%,
kemudian darah diambil sekitar 0,5-1 mL pada bagian vena kaudalis yaitu
pembuluh darah yang terletak tepat dibagian ventral tulang punggung. Jarum
ditusukkan di antara anus dan sirip anal, lalu jarum ditarik sedikit kemudian darah
dihisap sampai batas yang diinginkan. Setelah itu alat suntik dicabut kemudian
darah ditempatkan ke dalam microtube berukuran 1,5 mL. Ikan yang diambil
darahnya masing-masing satu ekor tiap perlakuan dan dibuat dua ulangan untuk
setiap parameter gambaran darah.
Perhitungan kadar haemoglobin
Pengukuran kadar Haemoglobin (Hb) dilakukan dengan metode Sahli.
Pertama darah dihisap dengan pipet sahli sampai skala 20 mm3 atau pada skala
0,02 mL, kemudian darah dipindahkan ke dalam tabung Hb-meter yang telah diisi
HCl 0,1 N sampai skala 10, kemudian diaduk dan dibiarkan selama 3-5 menit.
Setelah itu akuades ditambahkan sampai warna darah dan HCl tersebut seperti
warna larutan standar yang ada dalam Hb-meter tersebut. Skala dibaca dengan
melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung sahli yang dilihat
pada skala jalur g% (kuning) yang berarti banyaknya haemoglobin dalam gram
per 100 mL darah.
Perhitungan kadar hematokrit (Chinabut et al. 1991)
Darah dihisap dengan tabung mikrohematokrit sampai mencapai ¾ bagian
tabung, lalu ujung tabung ditutup dengan crytoseal sedalam kira-kira 1 mm,
sehingga terbentuk sumbat crytoseal. Kemudian tabung mikrohematokrit
disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit dengan posisi tabung
yang bervolume sama berhadapan agar putaran sentrifus seimbang. Nilai kadar
hematokrit ditentukan dengan persentase panjang bagian darah yang mengendap
(a) serta panjang total volume darah yang terdapat di dalam tabung (b) : (a/b) x
100%. Kadar hematokrit ini mencerminkan banyaknya sel darah (digambarkan
dengan endapan/padatan) dalam cairan darah.
Penghitungan total eritrosit (Blaxhall dan Daisley 1973)
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah
sampai skala 0,5. Kemudian ditambahkan larutan Hayem’s (berfungsi untuk
mematikan sel-sel darah putih) sampai skala 101, pengadukan darah di dalam
pipet dilakukan dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti
membentuk angka delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata.
5
Setelah itu tetesan pertama larutan darah dalam pipet dibuang, dan tetesan
berikutnya diletakkan pada haemacytometer tipe Neubauer kemudian ditutup
dengan gelas penutup. Jumlah sel darah merah dihitung dengan bantuan
mikroskop dengan perbesaran 400 x. Jumlah eritrosit total dihitung pada 5 kotak
besar haemacytometer dengan faktor pengenceran 202. Berikut ini adalah rumus
perhitungan total eritrosit:
Penghitungan total leukosit (Blaxhall dan Daisley 1973)
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna putih sampai
skala 0,5. Kemudian ditambahkan larutan Turk’s (berfungsi untuk mematikan selsel darah merah) sampai skala 11, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan
dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka
delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan
pertama larutan darah dalam pipet dibuang, dan tetesan berikutnya diletakkan
pada haemacytometer tipe Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup.
Jumlah sel darah putih dihitung dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran
400 x. Jumlah leukosit total dihitung sebanyak 5 kotak besar haemacytometer
dengan faktor pengenceran 22. Berikut ini adalah rumus perhitungan total
leukosit:
Pembuatan preparat ulas darah/differensial leukosit (Svobodova &
Vyukusova 1991)
Sebelumnya gelas objek yang akan digunakan direndam dalam methanol
untuk menghilangkan lemak yang menempel. Pembuatan preparat ulas darah
dilakukan dengan menempatkan setetes darah pada gelas objek, gelas objek kedua
diletakkan dengan sudut 45o terhadap gelas objek pertama, kemudian digeser ke
belakang sehingga menyentuh darah, kemudian gelas objek kedua digeser
berlawanan arah sehingga membentuk lapisan tipis darah. Selanjutnya preparat
dikeringudarakan kemudian difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Kemudian
preparat dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan kembali sebelum diwarnai
dengan pewarna Giemsa selama 15 menit. Lalu preparat dicuci kembali dengan
akuades untuk mengurangi kelebihan warna dan dikeringkan dengan tisu. Setelah
itu diamati di bawah mikroskop. Persentase sel-sel leukosit dihitung dengan cara
mengamati sebanyak 100 sel leukosit yang berbeda dan masing-masing jenis
leukosit yang terhitung dikelompokkan dan dipersentasi menurut jenisnya,
satuannya adalah persen (%).
Indeks fagositik
Sebanyak 50 μL darah dimasukkan kedalam mikrotiter plate, ditambahkan
50 μL suspensi Staphylococcus aureus dalam PBS (108 sel/mL), dihomogenkan
dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 20 menit. Setelah itu sebanyak 5 μL
dibuat sediaan ulas darah dan dikeringudarakan. Lalu difiksasi dengan methanol
selama 5 menit dan dikeringkan. Kemudian direndam dalam pewarna Giemsa
6
selama 15 menit. Lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tisu.
Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x. Jumlah sel
yang menunjukkan proses fagositosis dihitung dari 100 sel fagosit yang teramati.
Pengamatan histologi
Proses pembuatan preparat histologi melalui beberapa tahapan, antara
lain : fiksasi, dehidrasi, embedding, pemotongan, dan pewarnaan jaringan, serta
pengamatan mikroskopik.
Kualitas air
Pengukuran kualitas air dalam penelitian ini meliputi pengukuran suhu
harian yang diamati pada pagi dan sore hari, dan pengukuran pH, DO, alkalinitas,
NH3, NO2, No3, dan PO4 yang dilakukan pada masa aklimatisasi, vaksinasi dan
pasca uji tantang. Pergantian air sebanyak 50% dan penyifonan dilakukan setiap
hari, agar kualitas air tetap terjaga.
Pengumpulan data
Data yang dikumpulkan pada penelitian ini adalah data kelangsungan
hidup, RPS, gejala klinis, gambaran darah, histologi, kualitas air, dan data hasil uji
PCR.
Analisis data
Penelitian yang digunakan menggunakan rancangan acak lengkap, analisis
data menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) dengan uji F pada selang
kepercayaan 95%, dengan menggunakan program Ms. Excel dan SPSS 17.0.
Apabila berpengaruh nyata, untuk mengetahui perbedaan antar perlakukan diuji
dengan uji Tukey. Parameter yang dianalisis adalah nilai kelangsungan hidup,
RPS dan data gambaran darah, sedangkan data histologi, gejala klinis, uji PCR,
dan kualitas air dianalisis secara deskriptif.
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Nilai Kelangsungan Hidup
(%)
Kelangsungan hidup dan RPS
Kelangsungan hidup pada penelitian ini diamati pada akhir pengamatan
yaitu pada saat pasca uji tantang. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1 dan Tabel 1,
penggunaan vaksin DNA dengan dosis 7,5 µg/100 µL, 10 µg/100 µL, dan 12,5
µg/100 µL pada benih ikan koi menunjukkan nilai kelangsungan hidup yang
tidak berbeda nyata (Lampiran 9), yaitu sebesar 97,22±0,58% dan RPS
95,83±0,58% yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol positif (33,33±2,0).
120.00
100.00
97.22
97.22
97.22
b
b
b
b
100.00
80.00
60.00
40.00
33.33
a
20.00
0.00
k+
k-
Sebelum Uji Tantang
A
B
C
Pasca Uji Tantang
Keterangan
* Huruf yang berbeda menunjukan hasil yang berbeda nyata (P