31
Preparasi Virus
Sebanyak 1 gram insang yang terinfeksi KHV digerus kemudian disuspensikan dengan 9 ml larutan PBS. Suspensi insang ini disentrifugasi
dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit pada suhu 4
o
C. Supernatan yang dihasilkan diambil dan disaring dengan kertas milipore 0,
45 µm. Supernatan ini diencerkan 1000 kali dengan PBS 1:1000.
Uji Tantang Tahap I
Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas strain wildan dari daerah Cianjur. Ikan yang berukuran 10-15 gram tersebut diadaptasikan selama dua
minggu sebelum perlakuan. Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 60 ekor per perlakuan. Ikan dibagi menjadi dua kelompok, masing-masing kelompok
sebanyak 30 ekor. Kelompok ikan pertama digunakan untuk pengamatan haematologi dan kelompok ikan kedua digunakan untuk pengamatan RPS.
Perlakuan yang diberikan adalah vaksinasi dengan dosis 2,5 µg100 µl, 7,5
µg100 µl dan 12,5 µg100 µl serta kontrol negatif ikan tidak divaksinasi dan tidak diuji tantang dan kontrol positif ikan tidak divaksinasi dan diuji tantang.
Selama masa adaptasi maupun perlakuan ikan diberi pakan berupa pelet sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore.
Vaksinasi dilakukan selama 42 hari dan setelah itu ikan diuji tantang dengan virus KHV. Pengambilan dan pemeriksaan sampel darah dilakukan
setiap minggu sampai satu bulan setelah uji tantang.
a. Pengamatan RPS Relative Percent Survival
Setelah diuji tantang maka mortalitas ikan dicatat setiap hari. Persentase mortalitas dideterminasi dari masing-masing perlakuan dan kelangsungan hidup
relatif dihitung untuk masing-masing perlakuan vaksinasi dan dibandingkan dengan kontrol Johnson et al. 1982 dalam Leong, 1986; Ellis 1988; Corbeil et al.
1999. Perhitungan dilakukan dengan rumus: RPS = 1 - M
n
X 100 M
Dimana: RPS = relative percentage survival tingkat kelangsungan hidup relatif
Mn = mortalitas ikan perlakuan ke-n Mo = mortalitas ikan kontrol
32
b. Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan darah dilakukan setiap satu minggu sekali yang dimulai satu minggu setelah vaksinasi. Setiap sampling dilakukan pengambilan 3 ekor
ikan untuk masing-masing perlakuan. Pengambilan sampel darah dilakukan dengan menggunakan spuit pada vena caudalis yang telah dibasahi dengan
antikoagulan Na-sitrat 3,8 untuk mencegah pembekuan darah. Darah yang telah terambil diberi antikoagulan dengan perbandingan 1:4 dengan jumlah
darah yang diambil. Selanjutnya dilakukan pengamatan jumlah lekosit total, diferensial leukosit dan indeks fagositik.
c. Penghitungan Jumlah Leukosit Total
Penghitungan leukosit total dilakukan dengan cara mengencerkan darah terlebih dahulu dengan menggunakan larutan Turk’s. Penambahan larutan
Turk’s yang bersifat asam akan menyebabkan sel darah mengalami lisis sehingga yang tertinggal hanya sel darah putih saja. Pencampuran dilakukan di
dalam pipet pencampur berskala maksimum 11. Pipet ini berisi bulir berwarna putih yang berfungsi sebagai pengaduk. Untuk menghitung sel darah putih,
darah dihisap dengan pipet pencampur sampai skala 0,5 dan selanjutnya ditambah dengan larutan Turk’s. Pipet digoyang membentuk angka delapan
selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Sebelum dilakukan penghitungan, dua tetes pertama dari campuran
tersebut dibuang dan selanjutnya diteteskan pada haemacytometer tipe Neubauer dan ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah putih dihitung
dengan bantuan mikroskop pada pembesaran 400 kali. Penghitungan dilakukan pada 5 kotak besar haemacytometer dengan rumus sebagai berikut Nabib
Pasaribu 1989 Σ leukosit = rataan Σ sel terhitung x ____1___________ x pengenceran
Volume kotak besar
d. Aktivitas Fagositosis
