Alat – Alat Prosedur Penelitian

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat – Alat

1. Gelas ukur 50 ml100 ml Pyrex 2. Gelas Beaker 250 ml1000 ml Pyrex 3. Labu Erlenmeyer 250 ml Pyrex 4. Corong kaca 5. Corong pisah 500 ml Pyrex 6. Kolom kromatografi Pyrex 7. Tabung reaksi Pyrex 8. Plat tetes 9. Bejana maserasi 10 l SchottDuran 10. Rotari evaporator Büchi R-114 11. Kertas aluminium 7,6 m x 300 mm Total Wrap 12. Statif dan klem 13. Lampu UV 254 nm 356 nm UVGL 58 14. Spatula 15. Neraca analitis Mettler AE 200 16. Pipet tetes 17. Penangas air Büchi B-480 18. Botol vial 19. Vakum Büchi B-169 20. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 21. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 22. Spektrometer 1 23. Spektrofotometer UV-Visible H-NMR JeolDelta2NMR-500MHz 24. Kertas Saring UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.2 Bahan – Bahan

1. Tumbuhan Lagundi V. trifolia L.

2. Metanol Teknis 3. n-Heksana Teknis 4. Etil asetat Teknis 5. Aquadest 6. Aseton Teknis 7. Kloroform 8. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA 9. FeCl 3 10. NaOH 10 5 11. Mg-HCl 12. H 2 SO 13. Pelat KLT silika gel 60 F 4p 254 tinggi 20 cm E.Merck.Art 554

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan lagundi yang diperoleh dari daerah Hutatinggir Desa Saribudolok kabupaten Simalungun. Daun tumbuhan Lagundi dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan lagundi sebanyak 2000 gram.

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Lagundi

Serbuk daun tumbuhan Lagundi diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Skrining fitokimia 2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan lagundi, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut : Prosedur : - Dimasukkan ± 10 gram daun tumbuhan Lagundi V. trifolia L. yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam gelas erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 ml - Didiamkan - Disaring - Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I : dengan FeCl 3 b. Tabung II : dengan H 5 menghasilkan larutan berwarna hitam 2 SO 4p c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah bata menghasilkan larutan hitam d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna hitam

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F 254 Prosedur: Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40; 50:50 vv. Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang panjangnya 20 cm yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk UNIVERSITAS SUMATERA UTARA perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80 :20vv; 70:30vv; 60:40 ; dan 50:50vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun tumbuhan lagundi terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n- heksana : etil asetat 60:40vv LAMPIRAN C.

3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Tumbuhan Lagundi V. trifolia L.

Serbuk daun tumbuhan lagundi ditimbang sebanyak 2000 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 12 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 3 hari. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 10 gram.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 vv dan 60:40 vv. Prosedur : Dirangkai alat kolom kromatografi. Kemudian kolom kromatografi dibilas dengan metanol untuk membersihkan kolom kromatografi.Lalu dimasukkan pelarut kedalam kolom kromatografi denganmenggunakan n-hekasana 100. Kemudian dimasukkan serbuk silika gel kedalam kolom kromatografi. Didiamkan selama 1 malam agar silika gel padat dan UNIVERSITAS SUMATERA UTARA homogen. Dimasukkan 10 gram ekstrak pekat metanol daun tumbuhan Lagundi kedalam kolom kromatografi yang telah berisi silika gel,kemudian ditampung pelarut n-heksana 100 yang ada didalam kolom kromatografi. Lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv secara berlahan-lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom kromatografi sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 60:40vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta.

3.3.5 Pemurnian Rekristalisasi

Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi harus dimurnikan. Prosedur : Pasta yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat, diaduk hingga semua pasta larut sempurna. Kemudian ditambahkan n–heksana secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas, lalu diuapkan sisa pelarut dari pasta hingga diperoleh pasta yang benar – benar bebas dari pelarut.

3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40 vv. Prosedur : Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida. UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.7.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut Lampiran E.

3.3.7.2. Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 Analisis dengan alat Spektrometer H-NMR 1 H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut Lampiran H.

3.3.7.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR

Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang Lampiran G. UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

3.4 Bagan Skrining Fitokimia