Pembuatan Medium Inokulum, Inokulasi Aspergillus niger L-51,

32 derajat kejenuhan yaitu 0-15; 15-30; 30-45; 45-60 dan 60- 80. Skema proses pengendapan protein enzim dengan penambahan ammonium sulfat ditunjukkan pada Gambar 11. Adapun proses pengerjaannya yaitu ekstrak kasar enzim yang diperoleh diukur voumenya, selanjutnya dilakukan penambahan garam ammonium sulfat yang telah dihaluskan secara perlahan sambil diaduk dengan magnetik stirer pada suhu 4 o C. Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan amonium sulfat selanjutnya dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dengan bufer fosfat 0,1 M pH 6,0 dan diuji aktivitasnya dengan metode Mandels, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry untuk mengetahui fraksi-fraksi yang mengandung enzim selulase dengan aktivitas spesifik yang tinggi. Filtrat yang didapat dari fraksi 0-15 digunakan untuk diendapkan kembali dengan fraksi kejenuhan 15-30 dengan prosedur yang sama dan seterusnya sampai fraksi 60-80. Setelah diketahui fraksi-fraksi yang mengandung enzim selulase dengan aktivitas spesifik tertinggi, maka langkah selanjutnya adalah melakukan fraksinasi ulang pada tingkat fraksi tersebut, sehingga enzim dapat terendapkan secara maksimal Yandri et al., 2010. 33 Gambar 11. Skema pengendapan protein enzim dengan ammonium sulfat. 2. Dialisis Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat dengan aktivitas spesifik tertinggi dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,01 M pH 6 selama 24 jam pada suhu dingin Pohl, 1990. Selama dialisis, dilakukan pergantian bufer setiap 6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinyu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat diabaikan. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Mandels, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry. + NH 4 2 SO 4 0-15 + NH 4 2 SO 4 15-30 Ekstrak Kasar Enzim EndapanF1 Filtrat EndapanF2 Filtrat EndapanF3 Filtrat + NH 4 2 SO 4 30-45 EndapanF4 Filtrat + NH 4 2 SO 4 45-60 + NH 4 2 SO 4 60-80 EndapanF5 Filtrat 34

3. Uji Aktivitas Enzim Selulase

a. Pembuatan standar glukosa metode Mandels Standar glukosa dibuat dengan variasi konsentrasi 0-1,4 mgmL. Sebanyak 0,25 mL akuades, 0,25 larutan glukosa konsentrasi 0-1,4 mgmL dalam bufer fosfat pH 5,0 dicampur lalu diinkubasi selama 60 menit pada suhu 50 o C. Kemudian ditambahkan 1 mL pereaksi DNS dan dididihkan selama 10 menit pada penangas air. Selanjutnya ditambahkan 1,5 mL akuades lalu didinginkan. Setelah dingin, serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada 510 nm. Selanjutnya, absorbansi masing- masing larutan diplotkan terhadap konsentrasinya sehingga diperoleh nilai slope, intercept, dan R 2 . b. Uji aktivitas enzim selulase metode Mandels Mandels et al., 1976 Metode ini didasarkan pada glukosa yang terbentuk Mandels et al., 1976. Sebanyak 0,25 mL enzim, 0,25 larutan CMC 0,5 dalam bufer fosfat pH 5,0 dicampur lalu diinkubasi selama 60 menit pada suhu 50 o C. Kemudian ditambahkan 1 mL pereaksi DNS dan dididihkan selama 10 menit pada penangas air. Selanjutnya ditambahkan 1,5 mL akuades lalu didinginkan. Setelah dingin, serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada 510 nm. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan mengunakan kurva standar glukosa. Penentuan aktivitas enzim selulase dengan menggunakan metode Mandels ini dilakukan pada tahap isolasi, pemurnian, penentuan K M dan V maks , dan karakterisasi enzim.